Summary
In vitro modeller av koronar angiogenese kan brukes til oppdagelsen av cellulær og molekylære mekanismer for koronar angiogenese. In vitro explant kulturer av sinus venosus og endokardiet vev viser robust vekst som svar på VEGF-A og vise et lignende mønster av COUP-TFII uttrykk som i vivo.
Abstract
Her beskriver vi en in vitro kulturanalyse for å studere koronar angiogenese. Koronarfartøyene mater hjertemuskelen og er av klinisk betydning. Defekter i disse fartøyene representerer alvorlige helserisikoer som ved aterosklerose, noe som kan føre til hjerteinfarkt og hjertesvikt hos pasienter. Følgelig er koronarsykdom en av de viktigste dødsårsakene over hele verden. Til tross for sin kliniske betydning, relativt lite fremgang har blitt gjort på hvordan å regenerere skadede koronararterier. Likevel har det nylig gjort fremskritt for å forstå cellulær opprinnelse og differensieringsveier for koronarfartøyutvikling. Bruk av verktøy og teknologier som gjør det mulig for forskere å fluorescerende merke stamceller, følge deres skjebne, og visualisere avkom i vivo har vært medvirkende til å forstå koronar fartøyutvikling. In vivo studier er verdifulle, men har begrensninger i form av hastighet, tilgjengelighet og fleksibilitet i eksperimentell design. Alternativt kan nøyaktige in vitro-modeller av koronarangiogenese omgå disse begrensningene og tillate forskere å avhøre viktige biologiske spørsmål med hastighet og fleksibilitet. Mangelen på passende in vitro modellsystemer kan ha hindret fremdriften i å forstå cellulære og molekylære mekanismer for koronar fartøyvekst. Her beskriver vi et in vitro kultursystem for å dyrke koronarfartøy fra sinus venosus (SV) og endokardiet (Endo), de to stamfarvev ene og opp. Vi bekreftet også at kulturene nøyaktig rekapitulerer noen av de kjente in vivo-mekanismene. For eksempel viser vi at de angiogene spirene i kultur fra SV nedregulerer COUP-TFII-uttrykk som ligner på det som observeres in vivo. I tillegg viser vi at VEGF-A, en velkjent angiogen faktor in vivo, robust stimulerer angiogenese fra både SV- og Endo-kulturene. Samlet sett har vi utviklet en nøyaktig in vitro kulturmodell for å studere koronar angiogenese.
Introduction
Blodkar i hjertet kalles ofte koronarkar. Disse fartøyene består av arterier, årer og kapillærer. Under utvikling, svært forgrenede kapillærer er etablert først, som deretter ombygge til koronararterier og årer1,2,3,4,5. Disse første kapillærene er bygget av endotelstamceller som finnes i proepikardiet, sinus venosus (SV) og endokardiet (Endo) vev1,6,7,8. SV er tilsigsorganet av embryonisk hjerte og Endo er den indre foringen av hjertelumen. Endotelstamceller som finnes i SV og Endo bygger flertallet av koronarvaskulaturen, mens proepikardiet bidrar til en relativt liten del av det2. Prosessen der kapillærnettverket av koronarkar vokser i hjertet fra sine eksisterende forløperceller kalles koronar angiogenese. Koronarsykdom er en av de viktigste dødsårsakene over hele verden, og likevel mangler en effektiv behandling for denne sykdommen. Forstå detaljerte cellulære og molekylære mekanismer for koronar angiogenese kan være nyttig i å designe nye og effektive terapier for å reparere og regenerere skadede koronararterier.
Nylig har en økning i vår forståelse av hvordan koronarfartøy utvikler seg, delvis oppnås gjennom utvikling av nye verktøy og teknologier. Spesielt, in vivo avstamning merking og avansert bildeteknologi har vært svært nyttig i å avdekke cellulær opprinnelse og differensiering veier av koronar fartøy9,10,11,12. Til tross for fordelene med disse in vivo-verktøyene, er det begrensninger når det gjelder hastighet, fleksibilitet og tilgjengelighet. Derfor kan robuste in vitro-modellsystemer utfylle in vivo-systemer for å belyse cellulære og molekylære mekanismer for koronar angiogenese på en høy gjennomstrømningsmåte.
Her beskriver vi en in vitro-modell av koronar angiogenese. Vi har utviklet et in vitro explant kultursystem for å dyrke koronarfartøy fra to stamcellevev, SV og Endo. Med denne modellen viser vi at in vitro vev explant kulturer vokse koronar fartøy spirer når stimulert av vekst medium. I tillegg vokser eksplantkulturene raskt sammenlignet med kontroll når de stimuleres av vaskulær endotelvekstfaktor A (VEGF-A), et svært potent angiogent protein. Videre fant vi at de angiogene spirene fra SV-kulturen gjennomgår venøs dedifferensiering (tap av COUP-TFII-uttrykk), en mekanisme som ligner SV angiogenese in vivo1. Disse dataene tyder på at in vitro explant kultursystemet trofast gjeninnfører angigene hendelser som oppstår in vivo. Samlet, in vitro modeller av angiogenese som er beskrevet her er ideelle for sondering cellulær og molekylære mekanismer for koronar angiogenese på en høy gjennomstrømning og tilgjengelig måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruk av alle dyrene i denne protokollen fulgte Ball State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) retningslinjer.
1. Etablere mus oppdrettere og oppdage vaginal plugger for tidsbestemt graviditeter
- Sett opp et museavlbur med villtype hann- og hunnmus. Sørg for at alderen på avlsmusene er mellom 6-8 uker. Sett opp enten et par (1 mann og 1 kvinne) eller som en trio (1 mann og 2 kvinne) for avl.
- Se etter en vaginal plugg neste morgen. Bruk en vinklet metallsonde til å oppdage en dyp plugg ved å sette den inn i vaginalåpningen. Angi morgenen av en positiv vaginal plugg for å være embryonisk dag 0,5 (e0.5).
MERK: En vaginal plugg kan være enten overfladisk (som er lett synlig, se figur 1) eller dyp (som ikke er lett synlig). Tilstedeværelse av en dyp plugg vil blokkere full innsetting av sonden, mens fraværet av en plugg vil tillate full innsetting uten motstand. - Oppretthold tidsriktig graviditet til embryoene når e11.5 hvor de vil bli høstet. For å bekrefte graviditet før høsting av embryoer, registrer vekten av kvinnelige mus mellom e7.5 og e11.5.
MERK: Daglig økning i morens vekt vil indikere en vellykket graviditet, mens ingen endring i vekt vil indikere en mislykket graviditet.
2. Høsting av embryoer fra gravide mus
MERK: Før du begynner, sørg for å ha følgende utstyr og reagenser: et CO2 eutanasikammer, 70% etanol, papirhåndklær, vanlige tang, fine tang, saks, 1x sterilfosfatbufret saltvann (PBS), 10 cm sterile Petri-retter, beholder med is, perforert skje, disseksjonstereomikroskop.
- Plasser en e11.5 gravid mus i et rent CO2 eutanasikammer for å ofre det. Lukk lokket på kammeret for å hindre at musen rømmer.
- Etter at musen er sikret i eutanasikammeret, slå på CO2. Sørg for å regulere strømningshastigheten til CO2 per IACUC-anbefalinger (dvs. 10-30 % forskyvning per minutt). Etter at musen er helt euthanized, utføre cervical dislokasjon for å sikre døden.
- Spray musen med 70% etanol. Løft huden over magen ved hjelp av tang, gjør et lite snitt ved hjelp av en saks og utvide snittet sidelengs. Forstørre snittet fremioralt opp til membranen og utsett livmorhornet som inneholder embryoene (figur 2).
- Trekk ut strengen av embryoer (livmor horn + embryoer) ved å gripe livmoren og kutte den fri. Plasser strengen av embryoer i iskald steril 1x PBS.
- Dissekere ut de enkelte embryoene fra livmorhornet ved å peeling av livmormuskelen, eggeplommesekken og amnion en etter en (Figur 3A-F) under et stereomikroskop. Overfør de rengjorte embryoene ved hjelp av en perforert skje til en petriskål som inneholder steril 1x PBS på is. Sørg for å holde embryoene kalde.
3. Isolere hjerter fra e11.5 Embryoer
MERK: Før du begynner, må du sørge for å ha følgende utstyr og reagenser: vanlige tang, fine tang, 1x sterile PBS, 10 cm steril petriskål, 6 cm steril petriskål, beholder med is, perforert skje, disseksjonstereomikroskop.
- Sett opp en ny petriskål med iskald steril 1x PBS under et stereomikroskop. Overfør et embryo fra trinn 2.5 til Petri-fatet for å dissekere ut hjertet.
- Fjern embryoets hode ved hjelp av tang. Klem først hodet mellom tangmed den ene hånden og fjern deretter hodet ved å skrape det bort med den andre hånden ved hjelp av lukkede tang (Figur 4A-C).
- Etter å ha fjernet hodet, orienter embryoet med sin ventrale side opp ved å holde embryoet med tang i magen med en hånd (Figur 4D).
- Med den andre hånden, åpne brystveggen av embryoet ved først å lage et lite snitt i brystet litt over membranen ved hjelp av fine tang. Deretter forstørresnittet veldig nøye ved å sette inn lukkede tang og rive brystveggen ved å åpne tang. Pass på å ikke skyve for dypt, noe som kan skade hjertet. Ved hjelp av pinsett, hold brystveggen åpen for å utsette hjertet og lungene i thoraxhulen (Figur 4E).
- Bruk fine tang, flytt forsiktig hjertet fremre (90°) og utsett dorsal aorta/venen forsiktig. Trekk ut hjerte/lunger kraftig ved å fange den dorsal aorta/venen ved foten av hjertet (Figur 4F-H).
MERK: Vær forsiktig mens du trekker ut hjertet/lungene for å unngå å rive SV, som ligger på dorsalsiden av hjertet. - Skyll hjertet/lungene med kald 1x PBS for å fjerne blodceller.
- Gjenta trinn 3.1-3.6 for å fjerne hjertet/lungene fra de gjenværende embryoene. Sørg for å holde det isolerte hjertet/lungene på isen.
4. Isolere SVs og ventrikler fra E11.5 Embryonale Mus Hearts
- Plasser petriskålen med hjerte/lunger fra trinn 3.7 under et stereomikroskop for å isolere SVs og hele ventrikler. Skrell av lungenes vedlagte fliker en etter en fra roten ved hjelp av fine tang.
- Orienter hjertet på sin dorsal side og fjerne atria og tilstøtende vev som omgir SV anteriorly uten å rive SV. Fjern venstre og høyre atria fra hjertet ved å holde på basen og skrape den av ved hjelp av fine tang (Figur 5B). Fjern det tilstøtende vevet rundt SV ved hjelp av en lignende teknikk (figur 5C).
MERK: Husk at høyre atrium er festet til SV, så vær forsiktig så du bare fjerner atriumet. - For å isolere SV, først orientere hjertet med sin dorsal side vendt opp (fordi SV er på dorsal side) og holde hjertet fortsatt i denne posisjonen ved forsiktig å holde hjertet på sine ventrikler med tang.
MERK: SV er et tilsigsorgan av et embryonisk hjerte som ligger mellom atria på dorsalsiden av hjertet. - Fjern SV ved å forsiktig flasse den av hjertet der den er festet eller ved å holde SV ved foten av tilbehøret med fine tang og skrape den av med lukkede tang (figur 5D,E).
- Overfør den isolerte SV til en ny 6 cm Petriskål med iskald steril 1x PBS på is ved hjelp av en steril overføringspipette og merk petriskålen som SV.
- For å isolere hele ventriklene, fjern utstrømningskanalen (aorta og lungestamme) fra hjertet etter at SV er fjernet (Figur 5F,G).
- Overfør hele ventriklene til en ny 6 cm Petriskål som inneholder steril 1x PBS på is ved hjelp av en steril overføringspipette og merk Petri-fatet som ventrikler. Hold den isolerte SV og ventriklene på is.
- Gjenta trinn 4.1-4.7 for å isolere SVs og ventrikler fra de gjenværende hjertene.
5. Sette opp vevkulturplater med innsatser og ekstracellulær matrisebelegg
MERK: Før du begynner, må du sørge for å ha følgende utstyr og reagenser: kommersiell ekstracellulær matriseløsning (ECM, f.eks. Matrigel), 8,0 μM polyetylenterofthaatkultur innsatser, 24 brønnplater, 37 °C, 5 % CO2 inkubator.
- La ECM-løsningen tine på is. Oppbevar ECM-løsningen på is for å unngå størkning.
- Plasser PET membran kultur innsatser (pore størrelse = 8,0 μm, filtrering seddel = 0,3 cm2, filter diameter = 6,5 mm) i brønnene av ikke-vevskultur behandlet 24 brønnplater. Merk platene som SV eller ventrikler for sv eller endokardial angiogenese analyser, henholdsvis.
MERK: Sett opp innsatsene i separate plater for SV og ventriklene når du utfører begge kulturene samtidig. Sørg for å sette opp nok brønner for alle eksperimentelle prøver og kontroller. - Etter at ECM-løsningen er tint, fortynnstraks ECM 1:2 umiddelbart i forhåndskjølt basalmedium (dvs. EBM-2 basalmedium, se Materialtabellen) til et tilstrekkelig volum (100 μL/innsats x antall innsatser).
MERK: Hvis det for eksempel er seks innsatser, vil det totale volumet være 100 μL x 6 = 600 μL. Tilsett 200 μL ECM i 400 μL basalmedium. - Coat innsatsene med 100 μL nyfortynnet ECM ved å legge den direkte på toppen av membranen. Inkuber platen ved 37 °C i minst 30 minutter for at ECM kan stivne.
MERK: Dette må utføres under en laminær strømningvevskulturhette for å unngå kontaminering.
6. SVs og hele ventrikler kulturer
MERK: Før du begynner, må du sørge for å ha følgende utstyr og reagenser: 70 % etanol, overføring av pipette, stereomikroskop, tang, lamitarflytvevskulturhette, mikrovaskulær endotelcelletilskuddssett (Materialbord), basalmedium, 1x sterilt PBS). Figur 6 viser arbeidsflyten til SV og ventrikkelkultur.
- Tin innholdet i tilleggssettet på isen. Forbered hele mediet ved å legge til alt innholdet i supplementsettet i 500 ml basalmedium under en sertifisert lamiar flyt vev kultur hette. Bland mediet godt og fordel til 50 ml aliquots.
- Steriliser bunnen av stereomikroskopet og det omkringliggende arbeidsområdet med 70% etanol.
- Få vevkulturplatene fra trinn 5.4. Ved hjelp av en overføringspipette, overfør forsiktig eksplantene fra trinn 4.7 på toppen av innsatsmembranen. Under et stereomikroskop og ved hjelp av rene tang, plasser plantene i midten av innsatsene for å sikre at de ikke sitter fast i hjørnet av innsatsene eller festet til sideveggene.
- Etter at eksplantene er plassert og sentrert på innsatsene, fjern forsiktig eventuelle ekstra PBS fra innsatsene og lukk lokkene på platene.
- Under en lamiar flyt vev kultur hette, tilsett 100 μL av det forvarmede komplette medium på toppen av innsatsene og 200 μL inn i brønnene for å dyrke plantene på luft-væske grensesnitt slik at basal overflaten av innsatsen er i kontakt med mediet , men den øverste overflaten er utsatt for luften.
MERK: Sørg for å justere volumet for å få et luftflytende grensesnitt hvis du bruker forskjellige størrelser setter inn /brønnplater. - Tilsett 300 μL PBS i de ubrukte brønnene på de 24 brønnplatene og dekk med lokket. Inkuber platen i en 37 °C, 5% CO2 inkubator, og vokse kulturene i 5 dager.
- I de følgende dagene, rutinemessig observere kulturer under et omvendt lys mikroskop for å vurdere status for explant kulturer. Sørg for at eksplantene viser kontraktile juling og at alle eksplantene er festet til bunnen av membranen innebygd med ECM. Legg merke til eventuelle flytende eksplanter.
MERK: Den periodiske sammentrekningen av eksplantene indikerer at de er i live. Flytende eksplanter bør utelates fra analysen. - Etter å ha vurdert kulturstatusen, sett kulturplaten tilbake i inkubatoren og fortsett å vokse kulturen i opptil 5 dager.
7. Behandling av kulturer med VEGF-A (positiv kontroll)
MERK: Før du begynner, må du sørge for å ha følgende utstyr og reagenser: lamiklasvevsvevskulturhette, 1x PBS, basalmedium + 1% føtal storfeserum (FBS), basalmedium + VEGF-A, pipetter og pipettespisser.
- Forbered basalmediet + 1% FBS og basalmedium + VEGF-A.
- For å forberede basalmedium + 1% FBS, først bestemme antall kontrollbrønner som trengs. For eksempel, hvis det er tre kontrollbrønner, er 300 μL / brønn x 3 = 900 μL det totale volumet som trengs. Tilsett 9 μL FBS i 891 μL basalmedium for å gjøre basalmedium + 1% FBS.
- For å forberede basalmedium + VEGF-A, først bestemme det totale antall brønner som trenger VEGF-A medium. Hvis det er tre brønner, er 300 μL/brønn x 3 = 900 μL det totale volumet og 50 ng/well x 3 = 150 ng VEGF-A. Tilsett 150 ng av VEGF-A i 900 μL basalmedium for å gjøre basalmedium + VEGF-A.
MERK: Sett sammen denne løsningen med et større volum enn beregnet for å sikre et tilstrekkelig antall mindre aliquots for hvert eksperiment.
- På dag 2, fjern media fra begge kamrene (innsatsene og brønnene). Vask kulturer med 300 μL 1x PBS ved å legge 100 μL til innsatsene og 200 μL i brønnene. Virvle platene et par ganger og fjern PBS.
- Tilsett 300 μL basalmedium + 1% FBS (100 μL i innsatsen og 200 μL i brønnene) for å sulte kulturene i 24 timer.
- På dag 3, etter sult, tilsett 300 μL basalmedium + 1% FBS (100 μL i innsatsen og 200 μL i brønnene) i kontrollbrønnene og basalmedium + VEGF-A (50 ng / brønn) i behandlingsbrønnene, henholdsvis.
- Etter behandling, fortsett å vokse kulturene i inkubatoren.
8. Fiksering og immunfarging
MERK: Før du begynner, må du sørge for å ha følgende utstyr og reagenser: 4 % paraformaldehyd (PFA), 1x PBS, primære og sekundære antistoffer, en shaker, 0,5 % nonionisk overflateaktivt middel i PBS (PBT).
- På den sjette dagen av kuling, fjern mellomrommet og vask kulturer med 1x PBS ved romtemperatur (RT).
- Fest kulturene ved å tilsette 200 μL av 4% PFA-løsning i brønnene og 100 μL i innsatsene. Fest kulturer i 4 °C i 20 min mens du gynger.
- Etter 20 min fiksering, fjern PFA fra kulturene i en røykhette og vask kulturene med 1x PBS ved å legge til 200 μL i brønnene og 100 μL i innsatsene.
- Gjenta vasker 3x, 10 min hver, mens gynge. Fortsett deretter å utføre immunfarging.
MERK: Alle vasketrinnene utføres på en benkeplate på RT.
- Fortynn primære antistoffer (anti-VE-kadherin, anti-ERG 1/2/3) i blokkeringsløsning (5% eselserum, 0,5% PBT). Tilsett 300 μL primær antistoffløsning (200 μL i de nederste brønnene og 100 μL i innsatsene). Inkuber kulturer i primære antistoffer over natten ved 4 °C mens du gynger.
MERK: Anti-VE-Kadherin brukes til å merke endotelcellemembranen og anti-ERG 1/2/3 brukes til å merke endothelial cellekjernen for å visualisere de angigene spirene til endotelceller. - Neste dag, vask og rock kulturplatene 10x i 0,5% PBT, skiftende PBT hver 10 min.
- Fortynn de sekundære antistoffene (esel antirotte Alexa Fluor 488 og esel antikanin Alexa Fluor 555) i blokkeringsløsning. Tilsett 300 μL av det sekundære antistoffet som i trinn 8.2 og inkuber kulturene over natten ved 4 °C mens du gynger. Neste dag, vask de sekundære antistoffene 10x i PBT, endre PBT hver 10.
MERK: Vask minst 10x, men flere vasker er bedre. Etter at vaskene er fullført, kan kulturene lagres med 1x PBS til de er montert på lysbilder.
9. Monteringskulturer på lysbilder, bildebehandling og analyse
MERK: Før du begynner, sørg for å ha følgende utstyr og reagenser: fine tang, lysbilder, monteringsmedium med 4',6-diamidino-2-fenylindzol (DAPI), coverslips og konfokalmikroskop. Etter sekundær antistofffarging monterer du kulturene på lysbilder for avbildning ved hjelp av følgende trinn.
- Skrell av membranen forsiktig fra innsatsen ved hjelp av fine tang og overfør den til lysbildene ved å sette membranen side ned og plassere explant kulturer oppover. Plasser replikereksemplene i de samme lysbildene, og merk lysbildene som kontroll eller VEGF-A. Tilsett noen dråper monteringsmedium med DAPI direkte på membranen og dekk lysbildene med dekksedler.
MERK: Pass på at du unngår luftbobler mens du plasserer dekksedlene. - Forsegle kantene på lysbildene med klar neglelakk og la tørke.
MERK: Lysbilder kan lagres i -20 °C for langtidslagring. - Bildelysbilder ved hjelp av et konfokalmikroskop.
- Utfør analyse for å måle lengden på angiogen utvekst. Kvantifiser angiogene utvekstlengde ved å måle avstanden til endotelcellene (Ve-Cadherin+/ERG 1/2/3+) utvidet fra innsiden av ERG 1/2/3+-cellene i ventrikkelkulturene og fra sentrum av SV-eksplantene i SV-kulturene.
- For å utføre kvantifisering ved hjelp av FIJI/ImageJ, må du først laste ned FIJI-programvare.
- Åpne bildefiler i FIJI: gå til Fil | Åpent | Mappe | Filnavn | Åpne.
- Gå til Analyser | Angi målinger | Velg Perimeter.
- Velg rette linjeverktøyet fra hovedvinduet.
- Tegn en linje over lengden på en spire som foreslått i trinn 9.4.
- Gå til Analyser | Mål.
MERK: Lengdemålinger vises i det nye vinduet. - Utfør kvantifisering i bilder som representerer minst tre tilfeldig valgte synsfelt. Gjennomsnittlig spire lengde målinger og rapportere dem som gjennomsnitt ± standardavvik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En av de mest slående funksjonene i SV angiogenese in vivo er at den følger en bestemt vei og innebærer cellededifferensiering og redifferensiering hendelser som oppstår på stereotypiske tider og posisjoner1. Som innledende SV-celler vokser på hjertet ventrikkel, de slutter å produsere venøse markører som COUP-TFII (Figur 7). Deretter tar koronarspirer to migrasjonsstier, enten over hjertets overflate eller dypt inne i myokardiet. Overflatefartøy blir til slutt årer mens invaderende fartøy blir arterier og kapillærer1,6,7. Dette skillet er bevart som hjertet vokser og koronar vaskulatur utvider.
For å lette oppdagelsen av molekylær evidens av koronarutvikling, har vi utviklet en in vitro-modell av SV-spiresom kan brukes til funksjonstap og funksjonsgevinsteksperimenter. SV vev fra embryonale musehjerter dissekeres, plasseres på toppen av fortynnet ECM (som er kommersielt tilgjengelig, se Materialtabellen),og vedlikeholdes ved luft-væske grensesnittet i endotelcellevekst medium. SV myocardium fortsetter å slå gjennom hele kulturperioden. Etter 2 dager i kulturen forlater epikardiale celler som linje vevet eksplanten og migrerer ut på matrisen. Etter 5 dager spirer SV-endotelceller ut og migrerer til epikardialvev (Figur 8A, svarte pilspisser). Samlet oppsummerer denne prosessen angigene aspekter ved koronarutvikling.
Kultiverte SV spirer gjennomgår også venøs dedifferensiering. Som i det embryonale hjertet reduseres OB-TFII-uttrykket når fartøyene migrerer bort fra SV (figur 8B,sammenlignet med figur 7). Kontrollfartøy som navlestreng eller eggeplomme sac arterier og årer kan produsere spirende fartøy. Imidlertid er de færre i antall og kortere i lengde og endrer ikke sin arterielle eller venøse identitet (ikke vist). Dermed er venøs omprogrammering spesifikk for SV spirende og ikke en generell funksjon av angiogenese eller et svar på ECM komponenter. Disse dataene indikerer også at celletypene i Selve SV er nødvendige og tilstrekkelige til å indusere dedifferensiering.
Det er velkjent at vaskulær endotelvekstfaktor A (VEGF-A) er en potent induktor av angiogenese7,13,14,15,16,17,18. Tidligere studier har vist at myokard VEGF-A stimulerer endokardial angiogenese til å vokse koronarfartøy7. I tillegg har koronar endotelceller vist seg å uttrykke VEGF-A reseptor, og SV-avledet koronarfartøy i myokardiet kan vokse som svar på VEGF-A in vivo2. For å vise at vår in vitro modell av koronar angiogenese trofast reagerer på VEGF-A, stimulerte vi SV og Endo kulturer med VEGF-A. Som forventet viste resultatene våre at både SV og Endo er svært lydhøre overfor VEGF-A. Kulturer stimulert med VEGF-A viser økt vekst av angiogene spirer både i tetthet og lengde (Figur 9A, C). SV kulturer stimulert av VEGF-A viser en nesten 3 ganger økning i spire lengde sammenlignet med kontrollen (Figur 9B). Disse resultatene tyder på at endotelspirer fra SV og Endo reagerer på lignende signaler som er kjent in vivo.
Samlet sett tyder våre data på at disse in vitro explant kulturer dele lignende cellulære og molekylære hendelser som oppstår under in vivo koronar utvikling, inkludert venøs dedifferensiering og robust vekst som svar på VEGF-A stimulering. Derfor tyder våre data på at disse plantekulturmodellene er nyttige for å studere koronar angiogenese in vitro.
Figur 1: Identifikasjon av vaginalplugg. (A) En vaginal plugg (hvit flekk). (B) Forstørret visning av boxed region inkludert vaginal plugg (angitt ved pilen). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tilgang til embryostrengen i livmoren til en gravid mus. En euthanized gravid mus er plassert med sin ventrale overflate opp og sprayet med 70% etanol til våt hud for disseksjon. Huden trekkes opp i bekkenområdet ved hjelp av tang og et lite snitt er laget. Snittet forlenges sidelengs. Et ekstra snitt er gjort fremre opp til membranen. I livmoren er en streng av embryoer synlig (indikert av pilspisser). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Disseksjon og fjerning av embryoer fra livmoren. (A) Bilde som viser livmoren som inneholder en rekke embryoer. Membranen på dorsalsiden av embryoet (motsatt av siden der morkaken ligger) er skrelles av. (B) Embryoet i eggeplommesekken blir synlig etter peeling av livmormembranen. - Jeghar ikke noeå si. Embryo festet til morkaken med navlestrengen er synlig etter peeling av eggeplommesekken. Amnion er skrelles av hvis den fortsatt er til stede. (E) Bilde som viser et embryo festet til morkaken av navlestrengen. (F) Bilde som viser løsingen av embryoet fra morkaken ved å trekke på navlestrengen (Umb. Ledning) ved hjelp av tang. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Fjerning av hjertet/lungene plukker fra embryoer. - Jeg har ikkenoe å si. Hodet fjernes fra embryoet ved å fange i nakken og skrape det av. (C) Bilde som viser fjerning av hodet fra kroppen. (D) Riktig posisjonering av embryoet for hjertedisseksjon. Embryoet er plassert med ventralsiden opp for å ha lett tilgang til thoraxhulen for fjerning av hjertet. Når embryoet er plassert som vist i D, åpnes brysthulen med tang. (E) Bilde som viser det åpne brysthulen med hjertet eksponert på ventralsiden. (F) For å fjerne hjertet uten å skade SV, blir hjertet vendt anteriorly, og den dorsal aorta blir synlig. (G) Bilde som viser posisjonen ved foten av hjertet / lungene der dorsal aorta / venen er fanget med tang og hjerte / lunger plukker trekkes ut fremre. (H) Bildet viser e11.5 hjerte/lunger plukker fjernet fra embryoet. V. hjerte = ventral hjerte; d. hjerte = dorsal hjerte; d. aorta = dorsal aorta; LA = venstre atrium; RA = høyre atrium; LV = venstre ventrikkel; RV = høyre ventrikkel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Isolere SV og ventrikler fra embryonale hjerter. (A) Bilde som viser dorsal visning av det isolerte hjertet / lungene plukke fra e11.5 embryo. Plasseringen av SV i hjertet er indikert. (B) Bilde av hjertet etter at lungeknoppene er fjernet. (C) Atria og tilstøtende vev rundt SV fjernes, avslører aorta. Plasseringen av SV er merket. (D) Bilde som viser fjerning av SV. Ved hjelp av tang er SV grepet ved basen og skrapes av fra hjertet. (E) SV fjernet fra hjertet er vist sammen med det gjenværende vevet i hjertet. Aorta- og lungestammen (PT), kollektivt kalt utstrømningskanalen (OFT), blir synlig i hjertet etter at SV er fjernet. SV vil bli brukt til in vitro kultur, som beskrevet i figur 6 (venstre panel). (F) Plasseringen av OFT som skal dissekeres er merket med en stiplet hvit linje. (G) Aorta/PT (utstrømningskanal) fjernes fra ventriklene ved disseksjon i posisjonen som vises i panel F. De resterende ventriklene uten OFT brukes til ventrikkelkulturer som vist i figur 6 (høyre panel). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Skjematisk som viser arbeidsflyten til SV og ventrikkelkultur. Venstre: Prosedyre for SV kultur. Først fjernes SV fra e11.5 hjerter og plasseres på en kulturinnsats. Innsatsen inneholder porøs membran nederst (8 μm pore) og er belagt med vekstfaktor redusert ECM. Innsatser er plassert i brønnene på en 24 brønnplate. Medium legges både i bunn- og toppkammeret uten å dekke eksplanten. Kulturen dyrkes i 5 dager. Etter 5 dager fjernes membranen fra innsatsen og monteres på lysbildene for bildebehandling og analyse. Høyre: Prosedyre for ventrikkel kultur. Ventriklene uten SV, atria og OFT fjernes fra e11.5 hjerter og er kultivert som beskrevet ovenfor for SV. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: COUP-TFII-uttrykket går tapt i SV-spirene in vivo. (A) Dorsal syn på e11.5 hjerter. Konfokal bilde av endotelmarkør (rød) som merker sinus venosus (SV), koronar spirer (cs, stiplet linje), og endokardiet (endo) fôr hjertet lumen. (B) Den venøse produsenten COUP-TFII (grønn), en venetranskripsjonsfaktor (trx), uttrykt i SV er gradvis tapt som spirer forlate SV og vokse på ventrikkelen. Høyre: Høyere forstørrelse av koronarspiren som vises i den boksede delen av panel A. Skalabar = 100 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 8: In vitro modeller av venøs identitet og omprogrammering. (A) Brightfield bilde av kultivert SV vev. Vaskulære spirer (pilspisser) vokser ut fra den opprinnelige eksplanten (svart stiplet linje) over ECM-substratet. (B) Immunfluorescens av SV-kulturer merket med antistoffer som markerer endotelcelleoverflaten (VE-Kadherin), endotelcellekjerner (ERG 1/2/3), og vener og epikardiale kjerner (COUP-TFII). Kjerner er positive for både ERG 1/2/3 og COUP-TFII ved SV, men ERG 1/2/3 bare i spirer som migrerer over ECM. Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 9: SV og endokardemium reagerer på VEGF-A in vitro. (A) Konfokal bilde av 5-dagers-gammel kontroll og VEGF-A behandlet SV explant kultur. Endotelceller er immunisert med VE-kadherin (grønn), endotelcellekjerner farget med ERG 1/2/3 (røde) antistoffer og cellekjerner med DAPI (blå). (B) Angiogen utvekst av endotelceller kvantifiseres ved å måle lengden på spireforlengelsen (avstanden migrert av ERG 1/2/3+ endotelceller fra utplanten, indikert med hvite faste linjer i bunnpanelene på (A). (C) Konfokale bilde av en 5-dagers gammel kultur av en kontroll og VEGF-A behandlet ventrikler. Endotelceller er immunisert med VE-kadherin (grønn) og endotelcellekjerner er farget med ERG 1/2/3 (blå) antistoffer. Prikker er individuelle målinger og feilfelt er gjennomsnittlig ± SD. Skalabar = 200 μm (A, C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Noen av de mest kritiske trinnene for vellykket voksende koronarfartøy fra SV og Endo stamcellevev er: 1) Korrekt identifisering og isolere SV-vevet for SV-kultur; 2) ved hjelp av ventrikler fra embryoer mellom e11-11,5 år for nøyaktig Endo kultur; 3) opprettholde sterile forhold gjennom disseksjonsperioden og holde vevet kaldt til enhver tid; og 4) holde explants festet til ECM belagt membran for å unngå vev flyter i mediet.
For det første kan isolasjon av SV-vev være utfordrende. Det er viktig å innse at SV ligger på dorsal siden av hjertet mellom venstre og høyre atria skjult i lungelobules. Derfor er det vanskelig å skille og isolere. I stedet må hele hjertet / lungene plukke ekstraheres først. SV blir deretter isolert fra plukken ved å forsiktig fjerne lungelobules og rydde opp i tilstøtende vev ved hjelp av fine tang. Videre må man være veldig forsiktig mens man rydder opp i tilstøtende vev for å ikke miste SV.
For det andre, for nøyaktig endokardial angiogenese, er det viktig å kulturventrikler fra embryoer som ikke er eldre enn e11.5. I e12.5 og eldre embryoer vokser koronar fra SV til en betydelig andel av ventriklene. Derfor kan koronarfartøyene som vokser fra eldre ventrikler bestå av både SV- og Endo-avledede koronarfartøy1,2,10,19,20. Av denne grunn, for å nøyaktig analysere koronarfartøyveksten fra Endo, er det avgjørende for kulturventrikler (minus SV og utstrømningsveis) fra e11.5 embryoer20. I tillegg er SV relativt større og er lettere å isolere på e11.5.
For det tredje, fordi protokollen innebærer en betydelig mengde arbeid utenfor vevskulturhetten, er det avgjørende å opprettholde et sterilt arbeidsmiljø. Det er viktig å sterilisere disseksjonsverktøyene (tang, saks, etc.) og vevskulturplatene og unngå kontakt med usterile områder til enhver tid. Det er viktig å sprøyte arbeidsområdet og disseksjonsomfanget med 70% etanol. For å unngå forurensning er det viktig å utføre disseksjonsprosedyren raskt og minimere arbeidet utenfor vevskulturhetten.
For det fjerde, for å oppnå sunne plantekulturer, er det viktig at eksplantene forblir festet til membranens base til enhver tid. Flytende eksplanter i mediet må unngås for å lykkes med å vokse eksplantkulturene. For å unngå flytende, er det avgjørende å opprettholde et luftflytende grensesnitt der basaloverflaten på innsatsen er i kontakt med mediet, men den øverste overflaten er utsatt for luften. Et slikt grensesnitt oppnås når eksplanten er tilstrekkelig dekket av mediet, men er ikke helt nedsenket. Det er viktig å overvåke volumet av mediet daglig, da volumet kan gå tapt til fordampning. For å forhindre dette kan kulturplaten fuktes ved å legge PBS inn i de ubrukte brønnene i kulturplatene.
Lignende explant kulturer av SV og Endo er beskrevet andre steder20. I disse metodene ble eksplantene dyrket direkte inn i brønnene til vevskulturplater, noe som begrenser høyoppløselig konfokal avbildning. Bildene som er tatt i denne innstillingen er relativt dårlige i kvalitet sammenlignet med metoden som foreslås her, og begrenser detaljerte mikroskopiske analyser. For å omgå dette, brukte vi kulturinnsatser som membranene som inneholder kulturen kan skrelles av og monteres på glasslysbildene for avbildning. Dette gjør det mulig for høyoppløselig konfokal avbildning der cellulære detaljer som uttrykksmønstre og morfologi kan vises. I tillegg krever dyrking direkte på plater en egen fargingsprotokoll for DAPI eller annen pan-nukleær markørfarging. Denne protokollen krever ikke separate flekker trinn fordi lysbildene kan monteres med monteringsmedium som inneholder DAPI. Videre gir montering på lysbilder for langsiktig lagring uten fluorescerende falming, mens kulturer som er lagret i brønner med flytende medium, vil resultere i rask falming og er ikke egnet for langsiktig lagring og bildebehandling.
In vitro kulturmodeller beskrevet her er ideelle for avhør cellulær og molekylære mekanismer for koronar angiogenese på en høy gjennomstrømning og tilgjengelig måte. Dette in vitro-systemet kan brukes til å screene for potensielle legemidler eller molekylære mål for å vurdere deres effekt på koronar angiogenese. I tillegg kan dette systemet også brukes til å studere funksjonsgevinst og funksjonstap av ulike gener for deres autonome funksjon i koronarangiogenese. Vi observerte at koronarspirer fra SV fulgte epikaridmigrasjonen i våre in vitro-kulturer, noe som tyder på en viktig interaksjon mellom koronar endotelceller og epikaridceller. Det er velkjent at epicardium er en rik kilde til vekstfaktorer for koronar angiogenese fra SV. For eksempel har epikardial-avledede vekstfaktorer som VEGF-C og ELABELA tidligere vist seg å regulere SV-avledet koronarangiogenese2,19. Vi kan bruke dette SV kultursystem for å undersøke samspillet mellom epicardium og koronar endotelceller og identifisere nye epikardial-avledede molekylære veier av koronar angiogenese. I tillegg tyder våre in vivo-data på at myokardhypoksi kan være involvert i endokardial angiogenese19. Vårt in vitro kultursystem tilbyr en utmerket modell for å studere hypoksiens rolle i endokardial angiogenese ved å inkubere kulturene i hypoksiske eller normoksiske forhold. Dette er vanskelige eksperimenter å gjennomføre in vivo fordi det krever en gravid mus som skal plasseres i et kontrollert hypoksisk kammer. Fra vår egen erfaring er det svært utfordrende å oppnå konsistente og pålitelige resultater fra in vivo-eksperimenter. Oppsummert gir vår in vitro-modell av koronar angiogenese et pålitelig system for å avhøre et bredt spekter av spørsmål knyttet til cellulær og molekylærbiologi av koronar angiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne takker medlemmene av Sharma-laboratoriet for å gi et støttende forskningsmiljø. Vi liker å utvide spesiell takk til Diane (Dee) R. Hoffman som opprettholder og bryr seg om vår musekoloni. Vi vil også takke Drs. Philip J. Smaldino og Carolyn Vann for grundig korrekturlesing av manuskriptet og gi nyttige kommentarer. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Ball State University Provost Office og Department of Biology til B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant midler til B, og NIH (RO1-HL128503) og The New York Stem Cell Foundation midler til K.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
- Red-Horse, K., et al. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).
- Volz, K. S., et al. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. Elife. 4, (2015).
- Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).
- Chang, A. H., et al. DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis. Genes and Development. , (2017).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).
- Das, S., Red-Horse, K. Cellular plasticity in cardiovascular development and disease. Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).
- Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways. Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).
- Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).
- Ruhrberg, C., et al. Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis. Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).
- Kikuchi, R., et al. An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease. Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).
- Folkman, J., et al. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).
- Ferrara, N. The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis. Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).
- Ferrara, N., Bunting, S. Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).
- Sharma, B., et al. Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts. Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).
- Rhee, S., et al. Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease. Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).
