Summary
ここでは、麻酔薬の使用を必要としない、早期出生後マウス用に最適化された非侵襲的心電図(ECG)プロトコルを提示する。
Abstract
心電図(ECG)は、長い間、疾患の人間と動物の両方のモデルで心血管(および心肺)機能を評価する効果的かつ信頼性の高い方法として頼られています。個々の心拍数、リズム、および規則性は、ECGから収集された定量的パラメータと組み合わせて、心臓伝導系の完全性ならびに心周期の統合された生理学を評価するのに役立つ。 本稿では、麻酔薬を使用することなく、出生後の最初の日の早い時期に周産期および新生児マウスの子犬に非侵襲的な心電図を実行するために使用される方法と技術の包括的な説明を提供する。このプロトコルは、新生児マウスでECGを得るための標準化された反復可能な方法の必要性に直接対処するように設計された。トランスジェニックマウスラインを用いて発生する先天性心肺欠損の特徴付け、特に出生後の最初の日に致死性を引き起こす欠陥の解析に対して、このプロトコルは完全に有効であることが証明されています。このプロトコルはまた、初期の出生後心伝導系の成熟に関連する規範的なデータを特徴付け、提供するために、科学文献のギャップに直接対処することを目的としています。この方法は、特定の出生後の時点に限定されるものではなく、出生から出生後10日目(P10)までの新生児マウスのECGデータ収集を可能にする。
Introduction
心臓機能は、心臓を通して電流の伝導を分析する心電図(ECG)の使用、ならびにその全体的な心周期および機能1を含む、さまざまな方法で測定することができる。心電図は、疾患1,2のヒトおよび動物モデルの心臓異常を同定し、特徴付けるための有用な診断ツールであり続けている。心電図の読み取りの不規則性は、異常な心臓の発達(すなわち、先天性心疾患(CHD))に見られ、心拍数の変化として現れる不整脈(例えば、徐脈)、およびリズム(例えば、「心臓ブロック」)、基底心心筋の完全性および/または機能の欠陥を示唆する。このような変化は、患者が生命を脅かす心機能障害(例えば、うっ血性心不全および/または心停止)にかかり、死亡率が3、4に増加する可能性がある。重度および未治療のCHDによる死亡率が高いことを考えると、この出生後初期の間に心電図を収集するための標準化された反復可能な方法を開発することが重要である。
我々はこの問題に対処する最初のものではありませんが、マウスの子犬にECGを収集する以前の方法は、伝統的に侵襲的な手順(皮下針またはワイヤー電極)および/または麻酔薬5、6、7の使用を含んでいた。非侵襲的なECG分析を行う利点は、痛みを最小限に抑え、動物のストレスを取り消すことを含む。実験者はまだ子犬のストレスを引き起こすことについて慎重でなければならないが、デバイスは正確なデータを生成するために一般的なストレーターを避けるように設計されている。心機能を評価する文脈では、心肺異常を有する可能性のある動物に麻酔を導入すると、潜在的にマスクまたは基礎的な状態を悪化させる可能性があります。麻酔薬は、細胞の脱分極および/または再分極化を変化させることによって電気伝導に影響を与える可能性があります。最後に、麻酔の使用は、新生児の子犬を低体温症のリスクを高めることができ、固有の病理をさらに混乱させる可能性があります。以下のプロトコルは、麻酔薬、侵襲的な手順、または子犬に顕著な不快感を導入しません。機器のセットアップが完了すると、デバイスのセットアップと動物を含むデータ収集を効率的に完了することができ、その後、子犬は母親に返すことができます。また、このシステムは、繰り返しおよび/またはシリアル分析を実行することができ、これは時間の経過とともに分析を必要とする実験、薬理療法の導入などに最適です。
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Protocol
以下の議定書は、ニューイングランド大学の制度的動物のケアと使用委員会の基準に従います。プロトコルの綿密な観察は、すべての検査された新生児(n > 70)で満足のいくECG読み取りを提供する必要があります。
1. デバイスの準備
- デバイスをコンピュータのUSBポートに接続し、ダウンロードしたECGソフトウェアを使用します。測定装置は自動的に(37 °C/98.6 °F)まで加熱を開始します。内部加熱ユニットは測定ユニット内に含まれ、プラスチック表面のみを加熱します。銀線電極は加熱されません。
- 表面が温度に達するまで約15分を待ちます。この時間を使って動物を集め、セットアップしてください。
注: この時点でプロトコルが一時停止され、プラットフォームが接続されたままで、長時間加熱することができます。自己発熱電極プラットフォームがない場合、動物の安全な加熱パッドは、母親と子犬が低体温にならないようにするためにも使用できます。
2. 動物の準備
- 母親と子犬を収集し、収集する準備ができるまで、住宅ケージ内に保管してください。
- 測定ユニットが温度に加熱されたら、ケージからマウスの子犬を取り出し、70%エタノールを拭いて胸郭を拭きます。プラスチックの熱い表面に子犬を置きます。
- マウスを暗闇の中で約2〜5分間表面に順応させます。
3. マウスと電極プラットフォームのセットアップ(電極アプリケーション)
- 金属ヘラ、プローブ、または木製のダボを使用して、接着剤、電気伝導ゲル(げっ歯類電極の配置に一般的に使用される速乾性高伝導性電極ゲル)の小さな液滴を収集します。
注:電気信号の品質を妨げる可能性のある電極に合成繊維または類似の材料を残さない限り、非繊維状の固体物体を使用して導電ゲルを塗布することができます。 - スパチュラ/ダボを使用して、4つの平らな電極表面の上部を軽く押し下げ、導電ゲルを電極構築体の中心から斜めの角度で引っ張ります。個々の電極がゲルで完全に覆われていることを確認します。
注意:このステップは、導電性、電極ゲルが単一の電極以上に付着しないことを保証するために非常に重要です。電極間に形成される接着剤ストランドは、電荷を伝導し、望ましい電気信号を妨害または短絡させる可能性があります。ゲルが固まり、付着し始めるので、この時点でプロトコルを一時停止しないでください。導電ゲル(または等価導電性電極ゲル置換)を適用してから5〜10分以内にプラットフォームにマウスを設置してください。 - 残りのゲルを横に入れた金属スパチュラまたは木製のダボを置きます。
- 新生児マウスの子犬の胸骨を下に置き、プラットフォームの発信USBエッジに面した子犬の頭を持ちやすくなります。子犬の胸の一部が4つの電極のそれぞれを覆っていることを確認してください。子犬の前腕を横にそっと押さえながら、約1分間押し続け、導電ゲルをセットします。
- 子犬の左右にゴム製シリコーンバンパーを置きます。バンパーは、それぞれの側に子犬を固定し、マウスの過度の動きを防ぐために安定性を提供する必要がありますが、マウスのすべての動きを防ぐべきではありません。取り付けたら、マウスをしばらく見て、必要に応じてバンパーの配置を調整します。
注意:呼吸の仕組みや呼吸数を妨げる可能性がありますので、マウスをあまりしっかりと圧縮しないでください。 - 残りの導電ゲルを接地テール電極に適用し、子犬のランプに置くために確保されたダボを使用してください。穏やかな圧力を加え、子犬を放出する前にゲルをセットできるようにします。
- 最終的なシリコンバンパーをマウスのランプの上に置き、接地電極を所定の位置に保持します。
注意:最終的なバンパーを配置している間は、子犬に不快感を与えたり、接地電極を置き換えたりする可能性がありますので、過度の力を加えないでください。 - プラットフォーム全体を手に入れ、ファラデーケージの中にそっと置きます。
注意:ファラデーケージが設置されると、注意して上部のシリコーンバンパーが変位しないようにしてください。 - 記録する前に、マウスの子犬が過度に動いないことを確認し、マウスの本体と頭部が安全に見えることを確認してください。
注意:マウスの子犬の頭がバンパー内でいくらか自由に動くことができ、プラットフォームに完全に抜け出していないことを確認してください。上げられたプラットホームはマウスの胸郭をわずかに高め、窒息を防ぐように設計されているが、これは注意深く監視されるべきである。
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Representative Results
理想的なECGは、すべての波をいくつかの異なる時間枠で分析することを可能にする明確で顕著な信号を有するであろう(図1)。研究室は当初、不十分な品質のECGを生成するために、電図装置のカスタムアプリケーションを採用しました。これは、早期出生後マウスの子犬の分析のために特別に新しいプロトタイプ心電図装置を開発する会社との仕事にインスピレーションを与えました。
低品質の読み取り値は、識別可能なビートを持たない、明確な干渉を示し、読み取り全体に波や矛盾を持っています (図 2)。最高品質のECGを達成するために、慎重に指示に従ってください。導電ゲルの適用には注意が必要であり、適度に粘着性があり、マウスがデバイスに収容できるように追加の時間が必要な場合があります。これにより、マウスが動くリスクが下がり、電極がショートし、デバイスを正しく使用することができます。マウスは、デバイスを USB ポートに接続するコードに対して、かつ発生しやすい位置に向くように、デバイスに配置する必要があります (図 3)。マウスは、側面に2つと上に1つを持つ、所定の位置にしっかりと保持するために、ゴムバンパーによって固定する必要があります(図3)。これらのバンパーはマウスを固定する必要がありますが、マウスの頭部の移動を阻害すべきではありません。リードは静止しているので、マウスのレイアウトは読み取りのために重要です。リードは、前面2つの電極がリードI(図3)になるように設定されています。後方の2つの電極はリードIIとIIIで、グランド電極は子犬のランプ上にある(図3)。この方法でマウスを設定すると、より良い結果が得られます。
使用されるプログラムはプログラムのECGの分析を可能にする。これにより、心拍数、R-R間隔、QRS複合インターバル、QT間隔、PR間隔などの主要な側面の分析が行われます。この能力を考えると、周産期マウスの標準値のデータセットを確立することが可能であった(表1)。これらの規範的な結果は、生後1日以内に分析されたマウスに基づいていた。平均ハートビートは毎分357.2拍(bpm)であることがわかった。R-R、QRS、QT、およびPR間隔の平均はそれぞれ169.1、16.9、45.4、および36.3ミリ秒(ms)であった(表1)。重要なことに、セットアップは先天性心不全に罹患した新生児マウスからの心電図パターンを分析するために使用することができる(図S2)。
| 子犬の年齢 | アベニュー/ストデフ | 心拍数(bpm) | R-R 間隔 (ミリ秒) | PR 期間 (ミリ秒) | QRS 期間 (ミリ秒) | QT 期間 (ミリ秒) | ST 期間 (ミリ秒) | T 期間 (ミリ秒) | P 期間 (ミリ秒) |
| P1 | 平均 | 357.2 | 169.1 | 36.3 | 16.9 | 45.4 | 16.4 | 18 | 12.8 |
| 標準偏差 | 36.3 | 20 | 10.9 | 5.8 | 16 | 7.4 | 7.2 | 3.1 | |
| P3 | 平均 | 412.4 | 149.2 | 46.4 | 14.5 | 53 | 22.3 | 16.2 | 14.8 |
| 標準偏差 | 55.4 | 21.4 | 6.8 | 11 | 12.2 | 6.9 | 4.6 | 3.1 | |
| P5 | 平均 | 505.5 | 119.2 | 46.7 | 11.7 | 51.3 | 20.8 | 18.8 | 14.2 |
| 標準偏差 | 19.2 | 4.6 | 13.3 | 5.8 | 8.1 | 11.4 | 4.6 | 2.3 | |
| P7 | 平均 | 555.3 | 108.7 | 40 | 9.5 | 43.6 | 20.3 | 13.7 | 14 |
| 標準偏差 | 34.2 | 7 | 2.5 | 0.6 | 6 | 7.1 | 3.2 | 2.7 |
表1:平均周産期マウスp1、P3、P5、およびP7に対するECG測定の代表的な結果。
図1:第1(A,P1.0)、第3(B,P3.0)および7番目(C,P7.0)の新生児マウスからの代表的な心電図読み取り。
(A-C)画像は、読み取りの1.5 sフレームでキャプチャされた2リード、非侵襲的なデバイスを使用して、良好な品質のECGトレースの例を表しています。良好なECG読み取りの顕著な特徴は、一貫したP波の存在とそれに続くQRS複合体とその後のT波の存在によってまとめて説明されるように、明確で識別可能なビートを含み、各出生後のタイムポイントの両方のリードI-IIで見える。例としては、低信号対雑音比(最小限のアーティファクト)と識別可能な等電線も含まれます。トップECGストリップ(赤):リードI;下部心電図ストリップ(緑):リードII. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:合併症を伴う代表的なECGの読み取り。
この画像は、出生後の最初の日(P1.0)に2鉛、非侵襲的な装置を用いた低品質のECG読み取り値の代表である。上記の画像は、1.5の読み取りフレームでキャプチャされました。低品質の心電図のトレースは、顕著なアーティファクト(高信号:ノイズ比)と共に識別可能な拍動(および特定の心周期波形)の欠如と、与えられたマウスの子犬からのリードIとIIの間の顕著な矛盾によって特徴付けられる。このECGを改善するためには、子犬を固定するデバイスとシリコーンバンパーの両方がファラデーケージ内の再配置を必要とする。電磁干渉を最小限に抑えるために、装置の近くにあるすべての移動装置の取り外しが必要です。最終的なトラブルシューティングの手段は、デバイス電極上のマウスの子犬の位置を変更することを含み、より多くの導電性ゲルを(再)適用する必要があります。トップECGストリップ(赤):リードI;下部心電図ストリップ(緑):リードII. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:早期出生後心電図の採取のためのマウスの子犬および四肢リード電極の配置。
(A)左:ファラデーケージ内の電極プラットフォーム上のマウス配置の前視投影(黒)。右:上げられた電極/プラットホームの上に適切なマウスの配置を示す側面の眺め;支持的なシリコーンバンパー(写真ではない)はファラデーケージ内のマウスの子犬の上部に、両側に配置されます。(B)新生児マウス上のバイポーラ四肢リードおよび電極配置。図は、マウスの子犬の腹側胸部表面上の各隆起電極の接触点を示している。(B,C)電極配置、胸部鉛の方向性、および(C)対応する、P1.0(鉛I(赤)で新生児マウスの子犬から代表的なECGトレース。リードII(緑)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:複数の出生後の時点における新生児マウスの代表的なECGトレーシング。
代表心電図は、新生児マウスの子犬(A、P1.0)、第3(B、P3.0)、7番目(C、P7.0)の出生後の日の新生児マウスの子犬から読み取り(上2つの痕跡)と図示された心臓周期(下段)各画像は、読み取りの1.5秒フレーム(A-C、リードI(上/赤)でキャプチャされた2リード、非侵襲的なデバイスを使用して模範的なECGトレースを表します。リードII(下/緑)。個々の波形は年齢の増加に伴って形態学的変化を起こしているように見えるが、顕著で一貫した特性は、一貫したP波の存在とQRS複合体とその後のT波の存在によって一括して記述されるように、明確で識別可能なビートを含み、出生後の各時点の両方のリードI-IIで見える。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図S1:出生後心電図の非侵襲的収集のための伝統的な四肢リード電極の図示。 (A, 左)ファラデーケージ内のマウスと電極配置の側面図(ボックス)。(B)従来のセルフスティックスキン電極は、子犬の後ろ面に配置されます。(A, 右)心電図様のような信号は、従来の筋電図変換器を用いて、リードII(C、底部)でのみ識別可能な最小限のECGトレースを生成する場合に解釈することができる。(B-C)P1.0(リードII;パープル)での新生児マウスの子犬から、電極配置、胸部鉛の方向性、および対応する、代表的なECGトレース。 こちらをダウンロードしてください。
図S2:出生後1日目の先天性心疾患を伴うリターメイトコントロールの子犬および突然変異体の子犬からの比較心電図の読み取り(P1.0)。(A,B)画像は、P1.0でCHD(B,CHD MUT)で生まれた子犬と比較して、健康な新生児の子犬(A、CONTROL)からの良質のECGトレースの例を表しています。2リード、非侵襲的なデバイスは、10.0(A、B、上)および1.5秒間隔(A、B、底部)でECGトレースをキャプチャするために使用されました。心拍数の顕著な違いは、CHDMUT(B)において、与えられた時間枠で見える心周期(複合体)の減少によって視覚化されるように明らかである。比較はまた、制御(A)と比較した場合、CHDMUT(B)における心周期の一般的な形態、周波数、および全体的な規則性の不規則性を明らかにする。リードI(赤);リードII(緑)。こちらをダウンロードしてください。
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Discussion
周産期1日目のマウスの子犬で収集されたデータポイントは、成体マウスの平均予想値(毎分500〜700拍)をわずかに下回っています。8マウスの年齢が高齢化するにつれて心拍数が増加し、期待値に対してより多くの値が下がります(表1)。しかし、新生児の値がこの範囲の下端にあったことを強調することが重要であり、規範的価値は年齢固有の方法で文書化されるべきであるという考えを支持する。この方法は、マウスに物理的な外傷が存在しない点で、他の心電プロトコルとは異なる。プロトコルは完全に非侵襲的であり、麻酔の使用を必要とせず、出生直後のマウスに最適です。他の心電図装置は、この若者がこの方法で分析される子犬を許可しません9,10,11.このプロトコルは、新生児マウス集団に特有の標準データを生成する信頼できる参照法を確立することを目的としているが、ヒト小児集団に適用可能である。
このような小動物に対して心電図を行う場合、すべてのステップに注意することが重要である。ただし、結果の品質を変更できる重要な手順がいくつかあります。1つ目は、導電性ゲルを塗布する。ゲルが多すぎると、電極が接続して短くなる可能性が高くなります。ゲルが十分でない場合は、安全な接続が行われないです。ゲルを塗布する最良の方法は、電極を外側のコーナーから近づき、ゲルを電極の上部にロールすることです。電気的活動の存在および/または品質を妨げる電極間に糸がないことを保証するために細心の注意を払うことが非常に重要です。薄い工具(例えば鉗子)を取り、電極の間で実行して、明らかに見えない迷子の糸を集めるのに役立つかもしれません。プロトコルの一部として正式に必要とされるわけではありませんが、この追加のステップは、最適な伝導と最小限のノイズを確保するための追加の予防措置として役立つ可能性があります。
静電気のノイズが存在すると、ECGが読み取れなくなる場合(図2)、直ちに(テーブルトップ)近傍からすべての電子機器を取り外すと便利です。この動きは、ECG記録装置12によって拾うことができるので、近くに存在する電子機器のいずれかが動いている場合、これは特に有用である。また、データ収集中に外部の動きを導入しないことも重要です。ECGの品質を妨げる可能性のある外部の動きには、同じ近くの表面にオブジェクトを下げる設定が含まれる可能性があり、読み取りが完了するまで避ける必要があります。外部デバイスに加えて、非常にアクティブなマウスの子犬はまた、過度の身体の動きに関連する電気的干渉を引き起こす可能性があります。このタイプの筋骨格系干渉の可能性は、子犬が成熟するにつれて増加し、データ収集のために年齢を選択する際に考慮する必要があります。子犬がECG読み取りの質を著しく損なう方法で電極からシフトする場合、子犬の位置変更を考慮する必要があります。電極ゲルを再塗布する前にマウスを再配置することで、ほとんどの場合に改善された結果を提供し、追加の時間と試薬を節約できます。子犬の位置を変更する前に、ソフトウェアの一時停止ボタンを選択します。実行を一時停止すると、ECGのアクティブな記録が停止しますが、時間を追跡し続けます。なお、録音が再開されると、ECGは一時停止した時点より後で表示されます。ファラデー時代からデバイスプラットフォームを引き出し、マウスをバンパーの間に置きます。マウスを取り囲むバンパーを取り外し、電極からそっと子犬を持ち上げます。ゲルが付着するために1分間マウスを緩やかに保持するのと同じプロトコルに従って電極上の子犬を再配置する(ステップ3.4-3.5)。電極が上肢の胸郭に表示されるようにマウスの位置を変更します(図3)。新生児マウスでECGを収集するための理想的で非侵襲的な方法として設計されているが、このプロトコルに関連する1つの制限は、マウスが読み取りの質に影響を与えるデバイス上で移動およびシフトする可能性があるため、麻酔なしマウス上のデータ収集に関連する移動度の増加である。動きはシリコーンのバンパーの位置によって制限されるかもしれないが、これは沈下または麻酔の使用なしでは防ぐことができない。
ECG記録に重い干渉が伴う状況では(図2)すべての電気干渉を最小限に抑えたにもかかわらず、次に取るべきステップは、記録プラットフォームをFaradayケージに接続する外部配線を再配置することです。データ収集中に、外部配線が記録プラットフォームに正しく接続されたままになっていることは非常に重要です。外部配線が再配置される場合は、より鮮明な記録が得られるまで、この配線を両端に注意深く取り付け直してください。装置と提供されるファラデーケージの使用が適していない場合、装置は他のファラデーケージで使用することができる。
記録が明確でないか、マウスが電極から移動した場合は、デバイスからマウスを取り外し、鉗子を取り出し、すべての導電性ゲルを取り除くことによって電極をきれいにします。導電ゲルは水溶性であるため、暖かい水を使用して、子犬の皮膚から余分なゲルを穏やかに除去することもできます。ゲルを再適用し、子犬を再配置します。
最良の結果を得るには、デバイスが各使用の前後に適切にクリーニングされていることを確認します。ゲルは乾燥し、デバイスからそれを引っ張るために鉗子を使用して除去することができますが、ゲルは水溶性であるため、湿った布を使用して記録プラットフォームの電極をきれいにすることができます。
古いマウスは記録プロセスでより活発になっているので、しばしば電極から移動し、デバイスプラットフォームから移動することさえできるため、それらを注意深く監視することが重要です。トラブルシューティングと再配置を行うなど、すぐには明確な読み取りが行われないかもしれませんが、このデバイスで使用できる録画を取得することに成功しています(図1)。活動性マウスは、母親に戻し、休憩後に再分析する必要があるかもしれません。彼らはまた、手のひらに保持され、子犬が落ち着くまで熱と暗闇を提供するために穏やかに覆うことができます。
この装置は、P10の生年からマウスの子犬に関するECGデータを収集するように設計されている(図4)。P10より古い子犬は、信号対ノイズ比を最大化するために不可欠なコンポーネントであるファラデーケージでデバイスに収まらない可能性があります。P10でも、より大きなボディサイズをデバイスに収容するために位置調整が必要になる可能性があります。デバイスをファラデーケージに出入りする場合は、細心の注意を払ってください。上部バンパーを取り外すと、周囲のファラデーケージを持つ電極プラットフォーム上にマウスを置くことが可能になります。この年齢のマウスがより活性であることを考えると、彼らはトップバンパーの安定化なしに電極から移動する傾向があります。トップバンパーは、子犬がデバイスから移動するのを阻止するために子犬の前に置くことができます。
この装置の新しさおよび対応するプロトコルには、出生直後の使用のための最適化、より広い年齢層(P1-P10)に対応するシステムの能力、および心血管生理学の分野におけるin vivo研究法の翻訳応用を拡大する必要性が含まれる。新生児マウスの心臓周期を定量化するために心エコーを利用した高度なデバイスは13が利用可能であるが、このプロトコルの1つの大きな利点は、現在のパロス科学的資金調達環境において非常に魅力的である基本的な電気生理学的パラメータに対処するための比較的簡単で手頃な価格の手段を可能にすることです。
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Disclosures
著者らは利益相反を報告していない。
Acknowledgments
著者らは、セービング・ディ・タイ・ハーツ・ソサエティ(KLT)、UNE COBREプログラム(NIGMS助成金番号P20GM103643)からの寛大な支援を認めている。LAF)、ニューイングランド大学(VLB)のSUREフェローシッププログラム、およびアシシュモア(iWorx、ドーバー、NH)からの患者技術サポート。図 3、図 4、図 S1 は、Biorender ソフトウェアを使用して作成されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LabScribe4 | iWorx | LabScribe4 | Software used to record ECG |
| Neonatal Mouse ECG & Respiration System | iWorx | RS-NMECG : Neonatal Mouse ECG | ECG device |
| Tensive Conductive Adhesive Gel | Parker Laboratories, Inc | 22-60 | Tac-gel used as conductive gel for ECG |
References
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