Nanoakışkan Teknoloji Kullanarak Tek ve Toplu C. elegans Örneklerinde Yüksek Verimli Nicel RT-PCR

Summary

Bu makalede, tek veya toplu C. elegans örneklerinde gen ekspresyon seviyelerinin hızlı ve güvenilir bir şekilde belirlenmesi için yüksek aktarım hızı protokolü açıklanmıştır. Bu protokol RNA yalıtımı gerektirmez ve doğrudan örneklerden cDNA üretir. Yüksek verimli çok katlı nanoakışkan gerçek zamanlı qPCR platformları ile birlikte kullanılabilir.

Abstract

Bu makale, caenorhabditis elegans için hızlı, sağlam ve son derece hassas olan yüksek verimli ters transkripsiyon nicel PCR (RT-qPCR) testini sürmektedir. Bu protokol, tek solucanlardan veya toplu örneklerden gen ekspresyonunun hassas ölçümlerini elde eder. Burada sunulan protokol, nanoakışkan rt-qPCR platformuna bağlı olarak tamamlayıcı DNA (cDNA) hazırlama için mevcut yöntemlerin yeni bir uyarlamasını sağlar. 'Worm-to-CT' adı verilen bu protokolün ilk bölümü, önceden mRNA izolasyonu gerek kalmadan doğrudan nematodlardan cDNA üretimine izin verir. 3,5 saat içinde 96 solucandan cDNA hazırlanmasına izin vererek deneysel verimi arttırır. Protokolün ikinci bölümü, cDNA'da yüksek verimli RT-qPCR çalıştırmak için mevcut nanoakışkan teknolojiyi kullanır. Bu makale iki farklı nanoakışkan çipi değerlendirir: ilki 96 örnek ve 96 hedef çalıştırır ve yaklaşık 1,5 günlük tezgah çalışmasında 9.216 reaksiyonla sonuçlanır. İkinci yonga türü altı 12 x 12 diziden oluşur ve 864 reaksiyonla sonuçlanır. Burada, Worm-to-CT yöntemi, tek solucanlardan ve toplu örneklerden ısı şok proteinlerini kodlayan genlerin mRNA seviyelerinin ölçülmesi ile gösterilmiştir. Sağlanan, C. elegans genomunda kodlanan genlerin çoğu için işlenmiş RNA'yı güçlendirmek için tasarlanmış astarların geniş bir listesidir.

Introduction

Tek hücreli RNA diziliminin ve qPCR'nin optimizasyonu, transkripsiyonel darbelerin veya patlamaların hücre başına RNA moleküllerinin sayısında büyük farklılıklara yol açabileceğini ortaya koydu¹. Ayrıca, bu teknolojiler daha önce standart toplu transkriptomik ölçümler tarafından kaçırılan önemli hücresel heterojenliği ortaya çıkardı. Bağlama bağlı olarak, bazı tek hücreli transkripsiyonal değişkenlik dokuların karışık hücresel bileşimden kaynaklanır. Bununla birlikte, aynı ortamda yetişen izojenik hücre popülasyonlarında bile yaygın transkripsiyonal heterojenlik^{vardır 2,3}. Bu 'biyolojik değişkenlik', bakterilerden insana kadar hücresel ağların her yerde bulunan bir özelliği olarak giderek daha fazla tanımlanmaktadır. Bazı durumlarda, gelişim, kanser ilerlemesi, HIV gecikmesi ve kemoterapiye yanıtta fenotipik sonuçlar doğurabilir^4,5.

Nematod Caenorhabditis elegans, bireyler arasındaki biyolojik değişkenliğin nedenlerini ve sonuçlarını incelemek için ideal özelliklere sahip benzersiz bir model organizmadır. Bu nematodlar 959 hücreden oluşan basit bir model organizmadır ve şeffaf lütikülleri onları in vivo görüntüleme çalışmaları için uygun hale getirir⁶. C. elegans, ağırlıklı olarak kendi kendini dölleme yoluyla üreyen hermafroditik bir türdür; bu izojenik laboratuvar suşları ile sonuçlandı. İzojenikliğe ve kontrollü kültür koşullarına rağmen, birçok fenotip ve transkript bireyler arasında değişkendir, bu da stokastik veya mikroçevronmental farklılıkların bireyler arasında heterojenliğe katkıda bulunduğunu göstermektedir^7,8. Gen ekspresyonunda bu tür değişkenlik, mutasyonların penetrancesinde değişkenlik, sağkalım, gelişimsel zamanlama ve doğurganlık 7^,8 ,⁹dahil olmak üzere birden fazla fitness sonucuna sahiptir. Bu özellikler nedeniyle, tek solucan çalışmaları tüm bir organizmada biyolojik değişkenliği incelemek için eşi görülmemiş bir fırsat sağlar.

Transkriptlerin tek solucan düzeyinde doğru tespiti için teknolojilerin geliştirilmesi ve optimize edilmesi için sahada temel bir ihtiyaç vardır. Tek solucanlı RNA dizilimi^10,izole dokulardan RNA dizilimi¹¹ve tek hücreli sıralama¹² gibi yeni teknolojiler artık C. elegansiçin kullanılabilir. Bununla birlikte, ana bir zorluk devam etmektedir: interindividuality izlerken, zayıf ifade edilen genler genellikle tespit edilebilir seviyelerin altına düşer¹³. Bu, özellikle küçük miktarlardaki başlangıç malzemesinden izole edilmiş nadir transkriptler için geçerlidir, çünkü ortalama ifade ve teknik varyans arasında köklü, ters bir ilişki vardır ve genellikle nadir transkriptlerin istatistiksel kesintilerin altına düşmesine neden olur¹³. Yüksek verimli çok katlı qPCR teknolojilerinin optimizasyonu, özellikle nadir transkriptlerin ekspresyonunu incelerken memeli tek hücreli çalışmalar için yararlı olduğu kanıtlanmıştır^14,15. Bu teknoloji, diğer tek solucan teknolojilerinin kıyaslama ve doğrulama amaçları için de kullanılabilir.

Solucandan BT'ye, hücre biyolojisi çalışmalarında kullanılan bir kitten, tek solucanlı cDNA hazırlama için uyarlanmış hızlı ve sağlam bir yöntemdir. Bu yöntemle elde edilen cDNA, çok katlı nanoakışkan qPCR teknolojisi ile birleştiğinde, daha yüksek deneysel aktarım hızı, daha geniş bir dinamik algılama aralığı sağladığı ve tek hücreli amaçlar için doğrulandığı için seçilmiştir^14,15. Açıklanan cDNA hazırlığı standart PCR teknolojileriyle kullanım için de geçerlidir. Verim iki şekilde artırılır: İlk olarak, cDNA hazırlığı geleneksel guanidium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyondan daha hızlı ve daha güvenilirdir, çünkü solucanlar doğrudan lizis tamponuna eklenir ve kolayca bozulabilir RNA'nın doğrudan izolasyonunu atlar. İkincisi, nanoakışkan teknolojilerin kullanılması, aynı anda çalıştırılabilen numune ve hedef sayısını önemli ölçüde artırır. Bu makalede, iki yonga karşılaştırılmıştır: tek dizili bir çip ve çok dizili bir çip. Tek dizili bir çip, 96 tek solucan ve 96 astar seti çalıştırabilir ve bu da deney başına 9.216 reaksiyona neden olur. Standart qPCR teknolojilerini kullanarak benzer bir aktarım hızı elde etmek için 96 kuyu plakası kullanarak 96 ayrı qPCR denemesi gerekir. Daha küçük ve daha esnek çok dizili yonga, 864 reaksiyonla sonuçlanan altı 12 x 12 diziden oluşur. Yöntemin üstün güvenilirliği ve duyarlılığı nanoakışkan teknoloji ve bir önamplifikasyon adımının devreye girmesiyle artırılmıştır. Bu makalede sunulan yöntem, biyolojik varyansı çıkarmak için son teknoloji istatistiksel algoritma ile birlikte kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Bu makalede, hem tek solucan hem de toplu solucan örnekleri için hızlı cDNA hazırlama ve yüksek verimli qPCR protokolü sunulmaktadır; algoritma başka bir yerde yayınlanacaktır. Bu protokol için, her çipin organizasyonu deneyden önce hazırlanmalıdır. Tablo 1 ve Tablo 2, sırasıyla çok dizili ve tek dizili yonga için bu planların örneklerini gösterir. Şekil 1'de ayrıntılı olarak açıklanan ve Şekil 2'deçok dizili ve tek dizili yongaları çalıştıran Solucandan CT'ye protokolüne genel bakışlar da vardır.

Protocol

NOT: Bu protokol boyunca Caenorhabditis elegans "solucan" veya "solucanlar" olarak adlandırılır. Çeşitli C. elegans suşları çevrimiçi veritabanları aracılığıyla veya model organizmayı kullanan laboratuvarlara doğrudan başvurarak sipariş edilebilir. Bu protokolün I. bölümü (bölüm 1−3), Worm-to-CT protokolü aracılığıyla cDNA hazırlığını açıklar. Bu protokolün BÖLÜM II'si (bölüm 4−13), Fluidigm¹⁶tarafından geliştirilen bir protokolden uyarlanan nanoakışkanlar kullanılarak yüksek verimli RT-qPCR çalıştırmayı açıklar. Bu protokol, daha önce tanımlanan iki tür nanoakışkan yonganın, 96 numuneye (toplam 9.216 RT-qPCR reaksiyon) 96 hedefi izleyebilen tek dizili yonganın veya 12 hedef x 12 örneğin alt birimi olarak işlev gören çok dizili yonganın kullanımı için geçerlidir. Her çok dizili yonga, birlikte veya ayrı ayrı çalıştırılabilen altı bağımsız dizi içerir. Örneğin, çok dizili bir yonganın tamamı kullanılarak 72 hedef x 12 örnek (veya tam tersi) veya 36 hedef x 24 örnek (veya tam tersi) izlenebilir. Bu protokolde kullanılan materyallerden herhangi biri hakkında daha fazla bilgi için Malzeme Tablosunabakın.

1. RT-qPCR astar doğrulaması

NOT: Gerçek zamanlı astarlar, başlangıçta MIQUE yönergeleri¹⁷tarafından yayınlanan önerilen özelliklere göre tasarlanmıştır. İşlenmiş RNA'ya özgü astarlar yapmak için, ürünler en az bir splice kavşağının her iki tarafına bağlı iki astar olacak şekilde tasarlanmıştır. Uygun astarlar için gereksinimler arasında %20−%80 guanin ve sitozin içeriği, 58−60 °C erime sıcaklığı, ≤0,5 °C astar çiftleri arasındaki erime sıcaklığı farkı ve 70-120 bp ürün uzunluğu yer aldı. Oluşturulan astarların sırası Ek Tablo 1'de bulunabilir. Astarları oluşturmak için kullanılan komut dosyaları için açık kaynak kodu https://github.com/s-andrews/wormrtpcr bulunabilir. Splice sitelerine sahip transkriptler için primer çiftleri, bir intron'u kuşayan iki eksonda yatacak şekilde tasarlanmıştır, ancak NCBI Primer Blast yazılımı¹⁸kullanılarak splice varyantı özgü olacak şekilde tasarlanmamıştır. Bu çalışma için astar setleri, hedef dışı herhangi bir tamamlayıcılığı test etmek için C. elegans genomuna karşı patlatıldı.

1. RT-qPCR primer veritabanından astarları alın (Ek Tablo 1). Alternatif olarak, NCBI Primer Blast 18 gibi çevrimiçi araçları kullanarak qPCR astar çiftleri^tasarlayin.
2. Standart dökme qPCR teknikleri¹⁹ kullanarak ve MIQUE yönergelerini takip^17,20kullanarak her astar çifti için özgüllüğü ve PCR verimliliğini izlemek için bir qPCR standart eğrisi gerçekleştirin.
   NOT: Sadece R² > 0.98 ve PCR verimliliği %85 ile %115 arasında olan astar çiftleri kullanılmalıdır. Bu çalışmada kullanılan astarlar için sıra, PCR verimliliği ve R² Tablo 3'teayrıntılı olarak yer uzamıştır.

2. Solucandan CT'ye solucan lizisi

1. Solucanları bakteri çimlerinden taze, kamışsız bir NGM plakasına alın ve solucanların hareket yoluyla bakterilerin çoğunu solucandan uzaklaştırmak için 5 dakika boyunca plakanın etrafında hareket etmesine izin verin.
   NOT: Bakteriyel çimler ve büyüme koşulları deneysel tasarıma bağlı olarak farklılık gösterecektir. Burada sunulan deneyler, 20 °C inkübatörde L4.9 aşamasına yetiştirilen ilgi solucanları ile OP50 Escherichia coli ile tohumlanmış 6 cm NGM plakaları gerektirir.
2. RNase içermeyen bir başlıkta, numune başına 12,5 μL 2x RT tampon, 1,25 μL 20x RT enzim tamponu ve 0,25 μL çekirdeksiz sudan oluşan bir ana karışım hazırlayın. Adım 2.8'den her numunenin 11 μL'sine 14 μL ana karışım ekleyin.
3. Bir PCR şeridinin kapağını kesme kapsamının platformuna baş aşağı yerleştirin ve kubbeli PCR tüp kapaklarına bileşik bir mikroskop altında 10 μL lizis karışımı ekleyin.
   NOT: Sadece bir veya iki örnekle, en az dört tüp içeren bir PCR şeridi kullanmak daha iyidir, çünkü bu, sonraki donma-çözülme adımlarında kapakların patlama riskini azaltır. Alternatif olarak, kapakları yerinde tutmak için lastik bantlar kullanılabilir. Bu durumda, tüpler her aktarıldığı zaman kapakların düzgün bir şekilde kapatıldığından emin olun.
4. Bakteriyel kirlenmeyi önlemek için solucanları plakadan liziz karışımını içeren kapağın her yuvasına "kepçeleyerek" (yani, altındaki solucanları kazmayla yakalayarak) alın. Tüpleri kapatın ve sıvı nitrojenle dolu bir Dewar şişesine yerleştirmeden önce bir masa üstü mikrosantrifüj (Malzeme Masası)kullanarak 5 sn aşağı çevirin.
   NOT: Toplu deneyler için 15 ila 30 solucan, tek solucan ölçümleri için 1 solucan kullanılmalıdır.
   DİkKAT: Sıvı nitrojen kullanımı yaparken Cryo-Gloves ve koruyucu gözlük giyin ve standart giysi yönetmeliklerine uyun, çünkü cilt veya gözlerle temas ciddi donma hasarına neden olabilir.
5. PCR tüplerini sıvı nitrojen ve ~40 °C su banyosu arasında aktararak 10x dondurun. Numunelerin tamamen dondurulduğundan emin olmak için tüpleri sıvı nitrojende en az 5 sn bekletin. Numuneler eriyene kadar tüpleri su banyosunda bırakın. RNA bozulmasına yol açtığı için daha uzun süre bırakmayın.
   NOT: Numuneler yaklaşık -200 °C'ye kadar dondurulduğu için tüpler uzun süre sıvı nitrojende bırakılabilir ve RNA bozulmasını azaltır. Bununla birlikte, bu bir protokol durdurma noktası olmamalıdır, çünkü sıvı azot hızla buharlaşır.
6. Numuneleri ~ 1.800 rpm'de dönen 20−30 dakika boyunca 4 °C'de ayarlanmış bir termal karıştırıcıda(Malzeme Masası)karıştırın.
7. Numuneler karıştırılırken, buz üzerindeki durdurma çözeltisini çözün.
8. Numuneleri bir masa üstü mikrosantrifüj (Malzeme Masası)kullanarak aşağı çevirin ve her tüpe 1 μL durdurma çözeltisi ekleyin.
   NOT: Numuneler RNA'yı ters çevirmeden önce 1 haftaya kadar -80 °C'de bırakılabilir (bölüm 3).

3. Ters transkripsiyon

NOT: Tek solucanların ters transkripsiyonu için, burada gösterilen sonuçlar nanoakışkan çiplerle sağlanan reaktifler kullanılarak oluşturulmuştır (Şekil 1'dekiseçenek 2). Şekil 1'in 2. seçeneğinde vurgulanan reaktifler, havuza alınan örneklerin ters transkripsiyonu için de kullanılmıştır. Her iki yöntem de farklı örnek türleri için birbirinin yerine çalışır.

1. Tek solucanların ters transkripsiyon
   1. RNase içermeyen bir davlumbazda, taze bir PCR tüpüne 1,25 μL ters transkripsiyon karışımı (Malzeme Masası)ekleyin.
      NOT: Çok sayıda örnek varsa 96 kuyu PCR plakası ve otomatik pipet kullanılabilir. Üreticinin protokolü, numune başına 1 μL kullanılabileceğini belirtir.
   2. Liziz çözeltisinin 5 μL'sini alın ve çözelti karışımını adım 2.8'den durdurun ve ters transkripsiyon karışımını içeren taze PCR tüpüne ekleyin.
      NOT: Üreticinin protokolü, reaksiyon başına 1 μL RNA (2,5 pg/μL–250 ng/μL) kullanılabileceğini belirtir. Ters transkripsiyon karışımını 5 μL lised numune ve 1,25 μL RNAse içermeyen su ile değiştirerek plaka başına negatif bir RT kontrolü eklenebilir.
   3. Numuneleri bir termosikler üzerinde aşağıdaki ters transkripsiyon programını kullanarak çalıştırın: 5 dakika için 25 °C, 30 dakika için 42 °C, 5 dakika için 85 °C ve ∞ için 4 °C.
      NOT: Üretilen cDNA, yüksek verimli qPCR kullanılarak amplifikasyona ve veri toplamaya geçmeden önce -20 °C'de saklanabilir.
2. Toplu numuneler için ters transkripsiyon (15−30 solucan)
   1. RNase içermeyen bir başlıkta, numune başına 12,5 μL 2x RT tampon, 1,25 μL 20x RT enzim tamponu ve 0,25 μL çekirdeksiz sudan oluşan bir ana karışım hazırlayın. 11 μL lizis çözeltisine 14 μL ana karışım ekleyin ve 2.8 adımından çözelti karışımını durdurun.
      NOT: Çok sayıda numune ile uğraşırken bu 96 kuyu plakasında gerçekleştirilebilir.
   2. Numuneleri aşağıdaki ters transkripsiyon programını kullanarak bir termosikler aracılığıyla çalıştırın: 60 dakika için 37 °C, 5 dakika için 95 °C ve ∞ için 4 °C.
   3. Üretilen cDNA 1:4'i nükleaz içermeyen suda seyreltin.
      NOT: Genellikle, ürünler 25 μL'lik son hacme gelir, bu durumda 75 μL eklenmelidir. Bununla birlikte, yoğuşma nedeniyle son hacim değişebilir. Bu nedenle, son çözümde 1:4 oranı yapmak için buna göre ayarlayın. Bu seyreltme adımı, tek solucanlarda qPCR gerçekleştiriyorsa geçerli değildir. Üretilen cDNA, yüksek verimli qPCR kullanılarak amplifikasyon ve veri toplama işlemine geçmeden önce -20 °C'de saklanabilir.

4. Multipleks astar karışımının hazırlanması

1. 50 μM son konsantrasyondaki her astar çifti için ileri/geri (F/R) astar stoğu hazırlayın. Her biri 100 μM'de aynı hacimde ileri ve ters astarları karıştırın.
2. Test edilecek her astar çifti için 1 μL 50 μM F/R astar stoğunu birleştirin. DNA süspansiyon tamponu toplam 100 μL hacme kadar ekleyin.
   NOT: Buradaki stok astar konsantrasyonları, üreticinin protokol^16'da açıklananlardan farklıdır, ancak aynı son konsantrasyon olan 500 nM'i korur.

5. Belirli bir önkopunlamayı hedefle

1. %10 genel fazla hacimle reaksiyon başına 1 μL önamplifikasyon mastermiksi (Malzeme Masası),0,5 μL havuzlanmış astar karışımı (adım 4,2) ve 2,25 μL çekirdeksiz su içeren bir ana karışım hazırlayın.
2. 96 kuyu plakasında, aliquot 3.75 μL ana karışımı, çalıştırılacak numune sayısı için gerektiği kadar kuyuya karışır.
3. Her kuyuya adım 3.1.3 veya 3.2.3'te üretilen 1.25 μL cDNA faiz çözümlerini ekleyin.
4. Plakayı 96 iyi sızdırmazlık bandı, kısa bir girdap ve santrifüj ile bir masa üstü plaka spinner ile örtün. Bir termostale aktarın ve aşağıdaki programı çalıştırın: 2 dakika için 95 °C, 15 s için 95 °C'de 15 denatürasyon döngüsü, 4 dakika boyunca 60 °C'de tavlama /uzatma ve ∞ için 4 °C.
   NOT: Üretici, önamplifikasyon reaksiyonu için 10−20 döngüden^{tavsiye eder 16}. Bu protokol, hedef genlerin ifade seviyelerine bağlı olarak 10 veya 15 döngü önerir.

6. Exonuclease I tedavisi

NOT: Bu, şirketleşmemiş astarları preamplifikasyondan çıkarmaktır.

1. 0.2 μL exonuclease I reaksiyon tamponu (Malzeme Tablosu), 20 U /μL'de 0.4 μL exonuclease I (Malzeme Masası) ve numune başına 1.4 μL çekirdeksiz su içeren bir exonuclease I karışımı hazırlayın. Tüm reaktifleri buzda tut, özellikle de exonuclease I.
2. 96 kuyu plakasını (adım 5.4) termositten çıkarın, masa üstü plaka spinner ile santrifüjleyin ve contayı dikkatlice çıkarın. Her preamplifikasyon reaksiyonuna karıştırdığım exonuclease'den 2 μL ekleyin. 96 kuyu plakasını aşağıdaki programı kullanarak termositlere yeniden yerleştirin, santrifüj edin ve yerleştirin: 30 dakika için 37 °C, 15 dakika için 80 °C ve ∞ için 4 °C.
3. Numuneleri termositten alın ve 18 μL 1x Tris EDTA tamponu(Malzeme Masası)ekleyerek 1:5 seyreltin.
   NOT: CDNA örneklerini daha sonra kullanmak üzere -20 °C'de tutmak mümkündür. Üreticinin protokolü, bu aşamada 5x, 10x veya 20x potansiyel seyreltmeler önerir¹⁶, ilgi hedeflerinin ifade seviyesine bağlı olarak.

7. Tahlil karışımlarının hazırlanması

NOT: Tahlil karışımları 384 kuyu plakasında hazırlanabilir, çünkü kuyular nanoakışkan talaşlarla aynı boşluktan sahiptir ve yüklemeyi kolaylaştırır.

1. Çok dizili bir çip için test karışımları hazırlama
   1. Hazırlanan plana göre her kuyu için 2 μL 2x test yükleme reaktifi (Malzeme Masası) ve 1,6 μL DNA süspansiyon tamponu (Malzeme Masası) oluşan bir ana karışımhazırlayın. Aliquot 3.6 μL bu ana karışımın kuyu başına 384 kuyu plakasına.
   2. 4.1. adımda hazırlanan 50 μM F/R astar stoğunun 0.4 μL'lik kısmını hazırlanan plana göre uygun kuyulara ekleyin.
      NOT: Bu, kuyu başına toplam 4 μL test karışımı sağlar ve 1 μL fazlalık sağlar.
2. Tek dizili yonga için tahlil karışımları hazırlama
   1. Hazırlanan plana göre her kuyu için 3 μL 2x test yükleme reaktifi ve 2,4 μL DNA süspansiyon tamponundan oluşan bir ana karışım hazırlayın. Aliquot 5.4 μL bu ana karışımın kuyu başına işaretli 384 kuyu plakasına.
   2. Hazırlanan plana göre uygun kuyulara 50 μM F/R astar stoğunun 0,6 μL'lik kısmını ekleyin.
      NOT: Bu, kuyu başına toplam 6 μL test karışımı sağlar ve 1 μL fazlalık sağlar.

8. Numune karışımlarının hazırlanması

NOT: Numune karışımları 1 güne kadar önceden hazırlanabilir ve 4 °C'de saklanabilir.

1. Çok dizili yonga için numune hazırlama
   1. Numune başına düşük ROX ( Malzeme Tablosu ) ve 0,2 μL numune reaktifi(Malzeme Tablosu)ile 2 μL 2x floresan prob süpermix'inden oluşan bir numune ana karışımıhazırlayın. Bu karışımın 2,2 μL'lik kısmını işaretli 384 kuyu plakasına dağıtın.
      NOT: Üretici, örnek reaktif^16'nıngirdaplamamanızı önerir.
   2. Pipet 1.8 μL her preamplified, exonuclease ben hazırlanan plana göre uygun kuyulara adım 3.2.3 örnek tedavi.
      NOT: Bu, 1 μL fazlalık ile toplam 4 μL verir.
2. Tek dizili yonga için numune hazırlama
   1. Numune başına düşük ROX (Malzeme Masası) ve 0,3 μL 20x DNA bağlayıcı boya numune yükleme reaktifi(Malzeme Tablosu)ile 3 μL 2x floresan prob süpermix'inden oluşan bir numune ana karışımıhazırlayın. Bu karışımın 3,3 μL'lik kısmını işaretli 384 kuyu plakasına dağıtın.
   2. Pipet 2.7 μL her bir preamplified ve exonuclease ben hazırlanan plana göre uygun kuyular içine adım 6.3 örnek tedavi.
      NOT: Bu, 1 μL fazlalık ile toplam 6 μL verir. Numune olmadan çalıştırılacak kuyular varsa, bunlar numune ana karışımı ve cDNA yerine 2,7 μL su ile yüklenmelidir. Bu, her iki yonga türü için de önerilir. Makine, çipin ızgarasını tespit etmek için her girişte düşük ROX'a ihtiyaç duyar.

9. Nanoakışkan çipi astarlama

NOT: Çok dizili bir yonganın yalnızca ilk çalıştırmada astarlanması gerekir. Aynı yonganın sonraki çalıştırmaları varsa, bu aşama atlanabilir. Bu adımlar her iki yonga türü için de aynıdır.

1. Yavaşça ve dikkatlice, kontrol hattı sıvısının tam 150 μL'lik kısmını talaşın akümülatörlerine dahil edilen şırınnalardan enjekte edin. Çipi 45° açıyla tutarak ve dökülmeyi önlemek için şırınnanın ucunu uzak tutarak hiçbir kontrol sıvısının çipe temas etmemesini sağlayın.
2. Mavi koruyucu filmi çipin altından çıkarın.
3. Çipi nanoakışkan PCR astar makinesine(Malzeme Masası)barkodu dışa bakacak şekilde yerleştirin. ~ 15-20 dakika süren 'Prime (153x)' komut dosyasını çalıştırın.
   NOT: Bu aşamada nanoakışkan termosikleyiciyi(Malzeme Masası)açın, çünkü kameranın 0 °C'nin altına soğuması yaklaşık 10 dakika sürer.

10. Nanoakışkan çipin yüklenmesi

1. Yükleme gerçekleşirken bariyer fişlerini sırayla çıkarın. Bu, kuyuları yanlış yükleme olasılığını azaltır.
2. Çok dizili bir çip için 3 μL veya hazırlanan plana göre nanoakışkan çipin ilgili girişlerine her astar testinin tek dizili çipi için 5 μL aktarın. Aktarılan toplam hacmin istenenden daha küçük olmasına neden olabilecek kabarcıkları tanıtmamaya dikkat edin.
   NOT: Astarsız çalıştırılacak kuyular varsa, bunların ana karışımla yüklenmesi, astar hacminin suyla ikame edilmesi önemlidir. Bu her iki yonga türü için de geçerlidir. Bu aşamada, çipi karanlık bir yüzeye yerleştirmek daha kolay olabilir, bu da kuyuların daha kolay görülmesini sağlayacaktır.

11. Nanoakışkan çipi çalıştırma

NOT: Çok dizili bir yongayı ilk kez çalıştırdığında, Araçlar'ı seçerek izleme dosyasını ayarlayın | Flex Six Kullanım İzleme, Yeni'yi tıklatın, bir dosya adı girin ve Bitti'yi tıklatmadan önce bir konum seçin.

1. Veri toplama yazılımını açın. Yeni Çalıştırmayı Başlat 'ıtıklatın. Yüklenen çipi, barkodu dışa bakacak şekilde nanoakışkan termosikleyiciye yerleştirin.
2. Varsa proje ayarını seçin ve İleri | 'yi yükleyin. Çok dizili bir yonga yüklüyorsanız, çalıştırılacak bölümleri (dizileri) seçin.
3. Uygulama Başvuru Probları'nı seçin, sonra uygulama türünü Gen İfadesiolarak değiştirin ve pasif başvuruyu ROXolarak değiştirin. Tek Prob Tahlili 'niseçin, prob türünü Eva Greenolarak değiştirin ve İleri'yi tıklatın.
4. Çok dizili bir çip çalıştırmak için GE FLEX altı Hızlı PCR+Melt v1 termal bisiklet protokolünü veya tek dizili bir çip çalıştırmak için GE 96.96 Fast PCR+Melt v2 protokolünü seçin.
5. Otomatik Pozlama'nın seçili olduğunu onaylayın ve Çalıştırmayı Başlat'ı tıklatın.

12. Çip çalıştırma sonrası

NOT: Bu bölüm yalnızca çipin tamamını kullanmadığında çok dizili yongalar için gereklidir.

1. Çipi nanoakışkan termositten alın ve nanoakışkanlar PCR astar makinesine yükleyin ve 5 dakika süren Post Run (153x) komut dosyasını çalıştırın.
2. Kişisel başvuru için kullanılan fişleri etiketleyin.
   NOT: Çip artık oda sıcaklığında saklanabilir ve çipteki kalan diziler 2 ay içinde çalıştırılabilir.

13. Veri temizleme ve analiz

1. Verileri ' GerçekZamanlı PCR Analizi' yazılımında (Malzeme Tablosu) açın. Test edilen her astar çifti için eriyen tepe sıcaklığını kontrol edin. Belirli bir astar çifti için birden fazla erime sıcaklığı zirvesi sergileyen sonuçları ortadan kaldırın.
   NOT: Birden fazla tepe noktası yalnızca ara sıra, muhtemelen astar çiftleri solukluk oluşturduğunda veya hedef astarların havuza alınan astar karışımındaki diğer astarlarla etkileşimlerinden görünür.
2. Verileri bir 'ısı haritası' elektronik tablo dosyası olarak dışa aktarın ve başarısız örnekleri veya astarları ortadan kaldırın.
3. Standart Delta-Ct yöntemi²¹kullanarak verileri analiz edin. İstatistiksel değerlendirme için göreli ifade düzeylerinde tek yönlü ANOVA gerçekleştirin.

Representative Results

Worm-to-CT'nin cDNA hazırlama yöntemi olarak doğrulanması

Worm-to-CT protokolünün geçerli bir cDNA ekstraksiyon yöntemi olup olmadığını test etmek için standart guanidium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyon yöntemleri ile karşılaştırıldı. Sonuçlar, cDNA'nın standart guanidium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyon teknikleri²² kullanılarak ortalama ~1.000 solucandan ve Solucandan CT'ye yöntemi kullanılarak 30 solucandan hazırlandığı Şekil3'te gösterilmiştir. Numuneler aynı anda ısı şokuna uğradı (34 °C'de 30 dk). Küresel olarak, toplam RNA'nın 100 ng'si başına hsp-70 mRNA ifade düzeyleri her iki yöntem kullanılarak karşılaştırılabilirdi. Bununla birlikte, en yüksek hsp-70 ekspresyozunda (yani ısı şokunun ardından N2'de) Worm-to-CT yöntemi ile ekspresyon seviyeleri daha yüksekti ve bu da hassasiyetin arttığını gösteriyordu.

Hsf-1(sy441)^23'te hsp ifadesinde beklenen bir azalma olup olmadığını belirlemek için, moleküler refakatçilerin 23^,24'ün ana transkripsiyonel regülatöründeki bir mutasyon çoğaltılabilir, kısa bir ısı şokunu takiben transkripsiyonel refakatçi indüksiyonu karşılaştırıldı. Her iki yöntemde de hsf-1(sy441) hayvanlarında hsp-70 indüksiyonunda azalma tespit edildi. Bu bekleniyordu, çünkü mutant hsf-1 (sy441) hayvanları, HSF-1'in transaktivasyon etki alanındaki bir kesilme nedeniyle refakatçileri teşvik etme yeteneğinin azaldığını gösteriyor. Guanidium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu için hsp70, kontrollere göre %82,7, solucandan CT'ye ise vahşi tip hayvanlara göre %92,3 azaldı (Şekil 3). Sonuçlar her iki yöntem arasında karşılaştırılabilir ve önceki raporlarda karşılaştırılabilir²³. Bu sonuçlar Worm-to-CT yönteminin standart cDNA sentez tekniklerine geçerli bir alternatif olduğunu göstermektedir.

mRNA hedeflerini güçlendirmek için kullanılan nanoakışkan PCR platformunun doğrulanması

Transkript amplifikasyonu için nanoakışik qPCR kullanarak sonuçların tutarlılığını test etmek için, Worm-to-CT bulk yönteminden elde edilen PCR sonuçları hem standart bir qPCR sisteminde(Malzeme Tablosu)hem de çok dizili bir çip kullanan nanoakışkan bir qPCR sisteminde karşılaştırıldı. DBL-1 (dbl-1(nk3) ) 25'te boş bir alele taşıyan hayvanlarda, vahşi tip benzerlerine kıyasla sma-3 ( Şekil 4A ), sma-10 (Şekil 4B) ve dnj-26 olmak üzere üç farklıgeninifadesindeki kat değişimi izlendi. Dbl-1, Kemik Morfogenetik Protein (BMP) sinyal yolunun tek ligandını kodlar. sma-3 ve sma-10, BMP sinyal basamaklamanın temel bileşenleri olan SMAD ortologlarını kodlayan genlerdir. Dnj-26, BMP sinyalinin hedefi olan moleküler bir refakatçiyi kodlar. Bu sonuçlar, iki yöntemin sonuçlarını karşılaştıran kat değişiminde çok az fark gösterir ve sırasıyla sma-3 , sma-10 ve dnj-26 için 0.3113, 0.2635ve 0.3481'deönemli P değerlerine neden olmaz. Tamamen, bu sonuçlar toplu örneklere uygulanan Worm-to-CT yönteminin birkaç solucandan RNA çıkarmanın etkili ve hızlı bir yolu olduğunu ve standart PCR sistemleri veya yüksek verimli nanoakışkan tabanlı qPCR platformları ile birleştiğinde güvenilir veriler sağladığını göstermektedir.

Toplu numunelerle elde edilen ifade düzeyleri ile tek solucanlardan elde edilen ortalamalar arasında karşılaştırma

Göreli ifade düzeyleri, toplu örneklerden (25 solucan) veya ortalama 36 tek solucan örneğinden elde edilen cDNA kullanılarak hesaplanmıştır (Şekil 5). Her iki CDNA da Worm-to-CT yöntemi kullanılarak elde edildi ve nanoakışkanlar PCR teknolojisi kullanılarak güçlendirildi. Şekil 5A–C'de gözlemlendiği gibi, test edilen tüm refakatçiler için (örneğin, hsp16.1, F44E5.4, hsp-70),yöntemler karşılaştırılabilir ifade düzeylerini algıladı. Bu sonuçlar, tek solucanlardan elde edilen parametrelerin güvenilir olduğunu göstermektedir.

Tek solucan gen ekspresyon parametrelerini tahmin etmek için nanoakışkanlar teknolojisine bağlı Worm-to-CT uygulaması

Tek dizili çip, 96 ayrı örnekte 96'ya kadar hedef transkriptin izlenmesine izin verdiğinden, bu nedenle tek solucanlar arasındaki transkript ifadesinde bireysel değişkenliği izlemek için uygundur. Şekil 6A, kısa bir ısı şokunun ardından tek solucanlardan birden fazla hsp transkriptinin ortalama ifadesini gösteren temsili bir sonuç sunar. Şekilde gözlendiği gibi, transkriptlerin ifadesindeki değişkenlik farklı genler arasında önemli ölçüde farklılık gösterdi (Şekil 6A). Daha fazla içgörü elde etmek için, standart sapmanın ifade düzeylerinin ortalaması²⁶ (Şekil 6B)ile bölünmesiyle varyasyon katsayısı (CV) hesaplanmıştır. CV değerleri daha önce alternatif yöntemlerle tahmin edilen üç gen izlendi (yayınlanmamış veriler). İki kararlı transkript (ife-1 ve Y45F10D.4) ve bir değişken (nlp-29²⁷) beklenen değişkenliklerini gösterdi. Grafik ayrıca değişkenlik değerleri ile ifade düzeyleri²⁶ (Şekil 6B) arasındaki iyi bilinen ters ilişkiyi de açıkça göstermektedir.

Toplu numuneler kullanırken tekrarlanabilirliği sağlamak için teknik çoğaltmalar çok önemlidir. Ancak, bu mutlaka tek hücreli deneyler için durum değildir^14,15,28. Tek solucan örnekleri kullanılırken parametre tahmini için teknik çoğaltmaların kullanılmasının gerekli olup olmadığını belirlemek için, kısa bir ısı şokundan sonra 28 ayrı solucan hasat edildi ve teknik triplicates kullanılarak işlendi. Üç ayda bir elde edilen tek solucan verilerinden hesaplanan CV değerleri (Şekil 7'dekimavi noktalar , teknik CV) ile bireysel solucanlardan elde edilen her transkript için hesaplananlar (Şekil 7'dekikırmızı noktalar , biyolojik değişkenlik) karşılaştırıldı. Test edilen her transkript için, teknik CV'ler biyolojik CV'lerden daha düşüktü, bu da parametre tahmini için teknik triplikatların gerekli olmadığını gösteriyordu. Teknik çoğaltmaların gerekli olmaması, kaliteden ödün vermeden deneyin verimini artırır.

Şekil 1: Solucandan CT'ye İletişim Kuralına Genel Bakış.
Bu şekilde, solucanları Solucandan CT'ye iletişim kuralı aracılığıyla çalıştırmak için gereken farklı adımlara kısa bir genel bakış gösterilmiştir. Ters transkripsiyon adımı için iki isteğe bağlı yöntem gösterilir; bunlar her iki yonga türü için de değiştirilebilir yöntemlerdir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Nanoakışkan qPCR'nin hazırlanmasına ve çalıştırıcısına genel bakış.
Bu şekil, nanoakışkan qPCR sistemini çok dizili bir çip ve tek dizili bir çip kullanarak çalıştırma hazırlıklarını tasvir eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Toplu numunelerde solucandan CT'ye protokol güvenilir sonuçlar sağladı.
Worm-to-CT protokolünün, dökme numunelerde düzenli guanidium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu²² ile karşılaştırılması. Önceki bulgularla tutarlı olarak, hsf-1(sy441) mutantlarda²³, ısı şokuna yanıt olarak hsp transkriptlerinin seviyeleri azaldı. Yukarıdaki histogramlar, 34 °C'de 30 dakikalık kısa bir ısı şokunun yokluğunda (-) veya ardından (+) hsp-70'in indüksiyonunu tasvir eder. CDNA, 1.000 solucana (solda) uygulanan guanidium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu veya 30 havuzlu solucana uygulanan Worm-to-CT yöntemi kullanılarak elde edildi (sağda). Her yöntemle elde edilen toplam RNA'nın 100 ng'si başına hsp-70 ifade düzeyleri karşılaştırıldı. Beklendiği gibi, hsf-1'de (sy441) ısı şokuna yanıt olarak hsp-70'in transkripsiyonel indüksiyonu guanidiyum tiyosiyanat-fenol-kloroform kullanılarak % 82.7 ve Worm-to-CT yöntemi kullanılarak% 92.3 azaldı. Hedef genlerden elde edilen mRNA seviyeleri, cdc-42, pmp-3ve ire-1olmak üzere üç temizlik geninin ortalamasına göre normalleştirildi. Her nokta biyolojik bir kopyayı temsil eder. Veriler, parametrik analiz için gerekli kuralları karşılamadığı için istatistiksel analiz için günlüğe dönüştürüldü. İstatistiksel analiz, Sidak'ın çoklu karşılaştırma testi kullanılarak RM-One-way ANOVA kullanılarak yapıldı. Vahşi tür = N2, hsf-1 = hsf-1(sy441). Çubuklar ortalamanın standart hatasını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: İfade desenleri standart qPCR ve nanoakışkan qPCR sistemleri arasında tutarlıydı.
(A) Sma-3 (A), sma-10 (B) veya dnj-26 (C) mRNA'nın ekspresyon seviyesi, Worm-to CT aracılığıyla vahşi tip suşu (N2) ve dbl-1(nk3) nakavt suşu^25'tenoluşturulan üç biyolojik cDNA çoğaltmasından normal qPCR ve nanoakışik qPCR (çok dizili çip) ile belirlendi. Delta-Ct yöntemi²¹kullanılarak her suş için göreli mRNA ekspresyon düzeyleri belirlenmiştir. Kat değişimi daha sonra dbl-1(nk3) solucanlarında elde edilen ekspresyon seviyelerinin N2 suşundaki karşılık gelen mRNA seviyelerine bölünmesiyle belirlendi. Panel A'da gösterildiği gibi, desenler her bir biyolojik yinelemedeki her iki yöntem için de tutarlıydı. (B) ve (C) sırasıyla sma-10 ve dnj-26 mRNA düzeyleri için (A) ile aynıdır. Hedef mRNA seviyeleri cdc-42 ve pmp-3temizlik genlerine karşı normalleştirildi. Her gen için istatistiksel analiz, standart qPCR ile üretilen üç biyolojik kopyanın ve nanoakışkan qPCR ile üretilenlerin sonuçlarını karşılaştıran eşleştirilmiş bir t testi kullanılarak hesaplanmıştır. Bu karşılaştırmaların P değerleri sırasıyla sma-3 , sma-10 ve dnj-26 için 0.3113, 0.2635ve 0.3481'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Toplu numunelerde veya tek solucanlarda Worm-to-CT yönteminin kullanılması, solucan başına normalleştirildiğinde benzer ifade düzeyleri sağlamıştır.
(A) hsp-16.1/11, (B) F44E5.4 ve (C) hsp-70 (C12C8.1) ifade düzeyleri, ısı şoku yokluğunda genç yetişkin hayvanlarda ya 25 hayvanda Worm-to-CT yaparak veya 36 tek bireyde analiz edildi. Veriler solucan başına normalleştirildiğinde, her iki yöntem kullanılarak her transkript için solucan başına elde edilen düzeyler arasında önemli bir fark yoktu. Hedef genlerden elde edilen mRNA seviyeleri cdc-42, pmp-3ve ire-1olmak üzere üç temizlik geninin ortalamasına göre normalleştirildi. Çubuklar ortalamanın standart hatasını temsil eder. İstatistikler = eşleştirilmiş t testi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Worm-to-CT yöntemini kullanan tek solucanlarda yüksek verimli RT-qPCR, gen ekspresyonunda bireyler arası değişkenliği izleyebilir.
(A) Kısa bir ısı şokuna maruz kalınca elde edilen 53 transkript için ortalama ifade seviyeleri (34 °C'de 30 dk). Boxplots, ortalama mRNA ekspresyonunun tek tek solucanlardan dağılımını temsil eder (bireysel solucan başına ortalama üç teknik çoğaltma kullanılmıştır). Noktalar, 28 ayrı solucandaki ifade düzeylerini temsil eder. Hedef genlerden elde edilen mRNA seviyeleri cdc-42, pmp-3ve ire-1olmak üzere üç temizlik geninin ortalamasına göre normalleştirildi. (B) Kısa bir ısı şokuna maruz kaldıktan sonra 53 transkript için ortalama mRNA ekspresyonunun bir fonksiyonu olarak varyasyon²⁶ (CV) katsayısı 28 ayrı hayvandan hesaplanmıştır (Bpanelinde gösterilen ham veriler). Transkript kümesi, nlp-29 transkript²⁷ değişkenini ve iki kararlı transkripti(ife-1 ve Y45F10D.4; yayınlanmamış verileri) içerir. CV, standart sapmanın ortalamaya oranıdır. Bu CV, bireysel solucanlar arasındaki transkript ifadesindeki bireyler arası değişkenliği tahmin etmek için kullanılmıştır. Beklendiği gibi, bireyler arası değişkenlik, azalan ortalama ifade düzeyleriyle ölçeklendirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Nanoakışkan çip kullanılarak gen ifadesindeki bireyler arası değişkenlik analiz edildiğinde teknik çoğaltmalara gerek yoktu.
Bu grafikte sunulan veriler, kısa bir ısı şoku (34 °C'de 30 dk) sonrasında 28 ayrı solucanda elde edilmiştir. Her kırmızı nokta, 28 ayrı solucan (bio CV) arasında test edilen bir transkript için ortalama transkript ifade seviyelerinin değişim katsayısını (CV) temsil eder. Her mavi nokta, test edilen transkript başına (teknik CV) tek bir solucandan elde edilen üç teknik çoğaltma arasındaki ifade düzeylerinin CV'sini temsil eder. Bu grafik, teknik değişkenliğin (teknik yinelemeler arasında) biyolojik değişkenlikten çok daha düşük olduğunu göstermektedir (bireysel solucanlar arasında), tek hücreli çalışmalara benzer şekilde, tek solucanlarda gen ekspresyonlarını test ederken nanoakışkan gen ekspresyon dizisinde teknik çoğaltmaların yapılması gerektiğini düşündürmektedir^14,15,28. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Çok dizili bir yonga için plan düzeni. Yukarıdaki tabloda, çok dizili yonga çalıştırması planlarken kullanılabilecek basit bir düzen gösterilmiştir. Solda ilgi çekici astar hedefleri ile doldurulması gereken alanlar, sağda ise ilgi örnekleri ile doldurulması gereken boşluklar bulunmaktadır. Her test ve örnek dizi çip üzerinden sayı açısından eşleştirilir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: Tek dizili yonga için plan düzeni. Yukarıdaki tabloda, tek dizili yonga çalıştırması planlarken kullanılabilecek basit bir düzen gösterilmiştir. Solda ilgi çekici astar hedefleri ile doldurulması gereken boşluklar, sağda ise ilgi örnekleri ile doldurulması gereken boşluklar bulunmaktadır. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 3: Bu çalışmada kullanılan RT-qPCR primerlerinin listesi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 1: RT-qPCR primer veritabanından primerler. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Bu yazıda, Worm-to-CT protokolünün, RNA'yı tek solucanlardan veya küçük bir solucan havuzundan çıkarmak için hızlı ve verimli bir yöntem olduğu gösterilmiştir. Nanoakışkan sistemin sunduğu yüksek verim, onu bireyler arası değişkenlik ölçümlerinin ölçülmesi için ideal hale getirir. Ayrıca, bu yöntemin yüksek duyarlılığı, tek solucanlı RNA-seq teknolojileri⁹kullanırken algılamanın altına düşen düşük seviyelerde ifade edilen genlerin algılanmasını sağlar.

Tek solucanlardan cDNA hazırlamak için yöntem seçimini düşünürken. Ly ve ark.^29, kütikül sindirimi için proteinaz K'ye dayanan bir protokolü optimize etti. Manikül, moleküllerin solucanlardan izolesi için büyük bir engeldir ve proteinaz K onu kırmak için etkili bir yöntem sağlar. Bununla birlikte, proteinaz K'nin ters transkripsiyon için enzim kullanabilmesi için ısı inaktive edilmesi gerekir. Ly ve arkadaşları 96 °C'ye 10 dk maruz kalma kullanırken, RNA kolayca bozulabilir olduğu için bu protokolde bu adımdan kaçınılmıştır. Kütikülün kırılması için proteinaz K kullanmak yerine tekrarlanan donma-çözülme döngüleri kullanılmıştır. Donma-çözülme, kütikülleri kırmak için etkili bir yöntemdir, çünkü solucan başına daha fazla RNA izole edilebilir. Ly ve ark. solucan başına çıkarılan toplam RNA'nın proteinaz K kullanılarak 35 ng olduğunu bildirirken, bu protokol solucan başına 51,75 ng ± toplam RNA 6,74 SEM elde eder. Önamplifikasyon adımlarıyla birlikte ısıya maruz kalmanın önlenmesi, görünüşe göre Worm-to-CT'nin dinamik algılama aralığını standart protokollere kıyasla genişletiyor. Ly ve ark. ısı şoku sonrası hsp-70 için hsp-16.2 ve 22.8 ± 0.17 için 21.1 ± 0.15 mutlak Ct değerlerini bildirin. Aynı ısı şoku koşullarını (30 °C'de 1 saat) kullanan bu protokol, hsp-16.2 için 17.93 ± 0.57 ve hsp-70 için 21.13 ±0.33 mutlak Ct değerleri elde eder. Bu, dondurarak çözülme liziz yönteminin daha yüksek RNA verimi sağladığını ve düşük eksprese transkriptler için daha uygun olduğunu gösterir.

Nanoakışkan sistemler, belirli bir hedef transkript kümesini ve deneyin ölçeğine adaptasyona izin veren daha küçük (çok dizili çip) veya daha büyük (tek dizili çip) sayıda numunenin kullanımını araştırırken idealdir. Tek bir solucanda ifade edilen tüm transkriptlerin tarafsız bir resmini elde etmek için, bariz seçim RNA dizilimini kullanmaktır. Bununla birlikte, deneyin odak noktası daha küçük ama yine de nispeten büyük bir hedef gen kümesi ise, araştırmacının bir nanoakışkan PCR makinesine erişimi olması koşuluyla bu protokolü kullanmak daha uygun maliyetlidir. Nanoakışkan sistem reaktiflerinin ve tek dizili çipin maliyeti solucan başına yaklaşık 13 £ olarak tahmin edilirken, tek solucan dizilimi için reaktiflerin maliyetleri, sıralama maliyetleri dahil olmak üzere solucan başına yaklaşık 60 £ olacaktır.

Hangi PCR platformunun kullanılacağı düşünüldüğünde, nanoakışkan qPCR ile birleştirilen Worm-to-CT yöntemi zaman ve aktarım hızı açısından avantajlar sunar. Yaklaşık 2 günlük çalışmada 9.216 RT-qPCR sonucu elde etmek mümkündür, ancak standart bir qPCR platformu kullanarak aynı sayıda hedefin amplifikasyonu, günde dört plaka çalıştıran 96 kuyu plakası tahlilleri kullanılarak yaklaşık 5 çalışma haftası sürer. Ancak, test edilecek hedef sayısı daha küçükse, standart bir qPCR makinesiyle birlikte Worm-to-CT kullanmak daha uygun maliyetlidir. Tek dizili yongalar yeniden çalıştırılamaz, bu nedenle boş kuyuların çalıştırılması maliyet verimliliğini azaltır.

Yöntemin bir sınırlaması, çoklama adımı sırasında astar-primer dimerlerin potansiyel oluşumudur, ancak bu vakaların% 1'inden daha azında gerçekleşir. Solucandan CT'ye protokol verimli olmasına ve tek solucanlara uygulandığında güvenilir sonuçlar sağlamasına rağmen, yaklaşık% 5'lik bir arıza oranı vardır, bu da solucanın hasat adımı sırasında kapakta veya tüpün üstünde sıkışıp kaldığı durumlara karşılık gelir.

Birlikte, bu çok yönlü ve güvenilir yöntem, daha standart tekniklere kıyasla daha yüksek verim ve hassasiyet sunar. Bu yöntem, yüksek verimli ekranların doğrulanması için çok yararlı olabilir ve tek solucan gen ifade düzeylerini izlemek veya doğrulamak için mükemmel bir seçimdir. Bu yöntem, izole dokulardan gen ekspresyonunun niceliği gibi diğer zorlu tekniklere uygulanabilir. Örneğin, bağırsak, gonadlar veya CBC'ler tarafından izole edilen hücreler gibi tam dokuların izolasyonu, RNA dizileme deneyleri yapmak için yeterli malzeme sağlar. Bununla birlikte, sınırlı miktarda malzeme genellikle nadir transkriptlerin nicelliğini önleyen yinelenen okumalara yol açar. Bu senaryoda, nanoakışkan tabanlı teknolojinin kullanılması, araştırmacıların bu dokulardaki veya hücrelerdeki tüm transkriptlerin yalnızca bir alt kümesini izlemeleri gerekiyorsa, deneylere ek duyarlılık sağlamalı ve maliyet verimliliğini artırmalıdır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100µM stock primers for genes of interest.
20X DNA Binding Dye	Fluidigm	100-7609	for 96.96 chip (Single-Array Chip)
2X Assay Loading Reagent	Fluidigm	100-7611
384 well plates
8-strip PCR tubes
96 well ice block
96 well plates
96.96 Dynamic Array IFC	Fluidigm	BMK-M-96.96	Referenced throughout the manuscript as "Single-Array Chip"
96-well sealing tape
BioMark & EP1 Software	Fluidigm	101-6793	Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software
BioMark or BioMark HD system	Fluidigm	100-2451 K1	Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics thermocycler"
Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs	Fluidigm	89000021	Referenced throughout manuscript as "control line fluid"
DNA Suspension buffer	TEKnova	T0021
domed PCR caps
Exonuclease I	New England BioLabs	M0293L
Exonuclease I reaction buffer	New England BioLabs	B0293S
FLEXsix DELTAgene Sample Reagent	Fluidigm	100-7673	referenced throughout manuscript as "sample reagent"
FLEXsix Gene Expression IFC	Fluidigm	100-6308	referenced throughout manuscript as "Multi-Array Chip"
Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide	Fluidigm	68000088	This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript.
IFC Controller MX	Fluidigm	68000112 I1	Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics PCR priming machine"
IFC Controllers SOFTWEAR	Fluidigm	100-2297	Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX
liquid nitrogen in dewar
Microcentrifuge	StarLab	C1301B-230V	Used to spin down PCR tube strips in the protocol.
Nuclease Free Water
plate spinner	Labnet	K4050725	mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as "tabletop plate spinner"
Power SYBR Green Cells-to-Ct kit	invitrogen	4402955	This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20°C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR®Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions.
PreAmp Master Mix	Fluidigm	100-5580, 100-5581
Reverse Transcription Master Mix—480 reactions	Fluidigm	100-6299	One tube also available for 96 reactions (PN100-6298)
Rnase Free water
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX	Bio-Rad Laboratories	172-5211	referenced throughout the manuscript as "fluorescent probe supermix"
Standard 96 and 384-well Thermal Cycler
TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA	TEKnova	T0224	Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000031	Referenced throughout the text as "thermal mixer"
Trizol	Thermo-Fisher	15596026	Referenced through the protocol as "guanidium thiocyanate-phenol-chloroform"
Warm water bath