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Neuroscience

न्यूरोडिजेनरेशन के सहयोग से वयस्क ड्रोसोफिला में सिनैप्टिक डिजनरेशन की कल्पना करना

Published: May 13, 2020 doi: 10.3791/61363
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Lehigh University

Summary

इस प्रक्रिया का लक्ष्य ड्रोसोफिला मेलानोगेस्टरका उपयोग करके न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग मॉडल में डीएलएम न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों (एनएमजेएस) की संरचनात्मक अखंडता का आकलन करने के लिए पृष्ठीय देशांतर मांसपेशी (डीएलएम) ऊतक को विच्छेदन करना है।

Abstract

ड्रोसोफिला न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों से जुड़े सिनैप्टिक संरचना और कार्य का आकलन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल के रूप में कार्य करता है। जबकि बहुत काम ड्रोसोफिला लार्वा में न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों (एनएमजेएस) पर केंद्रित है, वयस्क ड्रोसोफिला में सिनैप्टिक अखंडता का आकलन करने पर बहुत कम ध्यान दिया गया है। यहां हम पृष्ठीय देशांतर मांसपेशियों (डीएलएमएस) के विच्छेदन के लिए एक सीधी विधि प्रदान करते हैं, जो उड़ान की क्षमता के लिए आवश्यक हैं। एक व्यवहार readout के रूप में उड़ान के अलावा, यह विच्छेदन दोनों डीएलएम सिनेप्स और मांसपेशियों के ऊतकों के लिए सिनैप्टिक मार्कर या ब्याज के प्रोटीन के लिए फ्लोरोसेंटी लेबल एंटीबॉडी का उपयोग करके संरचनात्मक विश्लेषण के लिए उत्तरदायी होने की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल अधिकांश न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की प्रगतिशील, आयु-निर्भर प्रकृति को मॉडल करने के लिए उम्र बढ़ने के दौरान वयस्क ड्रोसोफिला में सिनेप्स की संरचनात्मक अखंडता के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है।

Introduction

सिनैप्टिक रोग सबसे प्रमुख न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की प्राचीनतम पहचानों में से एक है1,2,3,,4,5,,6. हालांकि, बहुत कम कैसे इन संरचनात्मक और कार्यात्मक हानि रोग प्रगति के बाद के चरणों से संबंधित के बारे में जाना जाता है । ड्रोसोफिला लार्वा एनएमजेएस 7 ,8,,9का उपयोग करके सिनैप्स विकास और विकास को समझने के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रणाली साबितहुईहै। हालांकि, तीसरा लार्वा इंस्टार चरण केवल कुछ दिनों तक रहता है, जो प्रगतिशील, उम्र पर निर्भर न्यूरोडिजेनरेशन का अध्ययन करने में उनकी उपयोगिता को सीमित करता है। लार्वा एनएमजे का आकलन करने का एक विकल्प वयस्क ड्रोसोफिलामें सिनैप्टिक संरचनाओं की जांच करना है, जैसे कि पृष्ठीय देशांतर मांसपेशियों (डीएलएमएस) पर गठित सिनैप्सिस जो उड़ान10 , 11,12,13,14,15, 15,1613,केलिए आवश्यक हैं।, ये त्रिपक्षीय सिनैप्स संरचनात्मक रूप से स्तनधारी सिनैप्स17के समान तरीके से आयोजित किए जाते हैं, जो न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के मॉडल का आकलन करने के लिए एक अनूठा लाभ प्रदान करते हैं।

यहां हम न्यूरोडिजेनरेशन के ड्रोसोफिला मॉडल में वयस्क एनएमजेएस की संरचनात्मक अखंडता का विश्लेषण करने के लिए एक सीधी विधि का वर्णन करते हैं। पिछले डीएलएम विच्छेदन विधियों और अध्ययनों ने 18 ,19 , 20, 22 ,22,,,,,23के विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए मांसपेशियों के ऊतकोंकोसंरक्षित करनेकेमहत्व पर बल दिया है ।23 हमारा प्रोटोकॉल न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की जांच करने के लिए न्यूरोनल और मांसपेशियों के ऊतकों दोनों को संरक्षित करने के लिए एक व्यापक विधि प्रदान करता है। इन बीमारियों का अध्ययन करने का एक और प्रमुख घटक उम्र पर निर्भर तरीके से न्यूरोनल लॉस को समझने की क्षमता है। पिछला कार्य इस बात की एक महत्वपूर्ण और गहन समझ प्रदान करता है कि कायापलट के दौरान डीएलएम एनएमजेस का गठन प्रारंभिक वयस्कता11, 12,14,15,,16,24में कैसेहोताहै । हमारा प्रोटोकॉल उम्र बढ़ने और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में उम्र पर निर्भर तरीके से डीएलएम एनएमजेएस की जांच करने के लिए इस काम पर निर्माण करने के लिए एक विधि स्थापित करता है।

Protocol

1. ट्रांसजेनिक मक्खियों का उत्पादन

  1. इस प्रयोग के लिए ट्रांसजेनिक मक्खियों को उत्पन्न करने के लिए, OK371-Gal425 कुंवारी महिला मक्खियों और यूएएस-टीडीपी-43एम337वी 26 (चित्रा 1A)के पुरुषों को सॉर्ट करने के लिए पैड पर सीओ2 के साथ एनेस्थेटाइजिंग मक्खियों द्वारा इकट्ठा करें।
  2. क्रॉस के लिए मानक ड्रोसोफिला मीडिया के साथ शीशियों में एनेस्थेटाइज्ड मक्खियों को सॉर्ट करें। अगली पीढ़ी के उभरने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर लेबल शीशियों रखें।
    नोट: उचित जीनोटाइप सुनिश्चित करने के लिए संतान उभरने से पहले शीशियों से वयस्कों को साफ़ करें।
  3. एक बार संतान उभरने के बाद, ट्रांसजेनिक मक्खियों को शीशियों में इकट्ठा करें और प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए उम्र बढ़ने शुरू करने के लिए सेक्स द्वारा सॉर्ट करें।
  4. एक बार मक्खियों को एकत्र करने के बाद, मक्खियों को हर 2 दिनों में ताजा भोजन में स्थानांतरित करें जब तक कि मक्खियों 21 दिन पुराने न हों।

2. विच्छेदन तैयारी

  1. विच्छेदन के लिए तैयार करने के लिए, कमरे के तापमान फॉस्फेट बफर खारा (1x पीबीएस), एक सिलिकॉन इलास्टोमर के साथ लेपित 10 सेमी विच्छेदन पकवान प्राप्त करें, सीधे किनारे विच्छेदन कैंची, कुंद विच्छेदन संदंश का एक सेट, एक P200 पिपेट और पिपेट टिप्स, 2.0 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब, मानक कार्यालय कैंची, 70% इथेनॉल, एक 6 सेमी पेट्री डिश, और 32% फॉर्मलडिहाइड 1x पीबीएस के साथ 4% तक पतला।
  2. प्रत्येक जीनोटाइप या स्थिति के लिए लेबल ट्यूब और प्रत्येक ट्यूब में 1x पीबीएस (कमरे के अस्थायी) के 900 माइक्रोन और 32% फॉर्मलडिहाइड के 150 माइक्रोन जोड़ें। 4% फॉर्मलडिहाइड फिक्सेटिव तैयार करते समय दस्ताने और सुरक्षा चश्मा पहनें।
  3. एनेस्थेटाइज 6\u201210 प्रति समूह सीधे सीओ2 के साथ शीशी से उड़ता है और जलमग्न मक्खियों को 70% इथेनॉल के साथ 6 सेमी पेट्री डिश में जाता है। प्रेस एक पेंट ब्रश का उपयोग कर इथेनॉल में नीचे मक्खियों को सुनिश्चित करने के लिए कि नमूने पूरी तरह से जलमग्न हैं । इससे बाहरी क्यूटिकल पर तेल की परत निकल जाएगी।

3. छाती अलगाव और निर्धारण

  1. प्रत्येक नमूने को विच्छेदन करने से पहले, सिलिकॉन इलास्टोमर के साथ लेपित विच्छेदन पकवान में 1x पीबीएस के लगभग 7\u201210 एमएल जोड़ें। इस मात्रा में यह सुनिश्चित करना चाहिए कि ऊतक के नमूने पूरी तरह से जलमग्न हैं।
  2. कुंद संदंश का उपयोग कर 70% इथेनॉल से विच्छेदन पकवान के लिए एक फ्लाई स्थानांतरण और या तो पंख या पैर लोभी।
  3. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत विच्छेदन पकवान में नमूने पर ध्यान केंद्रित करें। अगला 1x पीबीएस में नमूना जलमग्न करें, और कुंद ड्यूमोंट का उपयोग करके पंखों को ध्यान से हटा दें #5 ठीक संदंश।
  4. वन्नास स्ट्रेट एज स्प्रिंग विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, क्यूटिकल के वेंट्रल साइड में एक छोटा सा चीरा बनाकर पैरों को हटा दें। चरण 3.8 में, यह चीरा फॉर्मलडिहाइड को ऊतक में प्रवेश करने की अनुमति देगा।
  5. एक हाथ में कैंची लें और फ्लाई वेंट्रल साइड को ऊपर रखने के लिए दूसरे में संदंश पकड़ें। कुंद संदंश के साथ जगह में नमूना पकड़ते समय, विच्छेदन कैंची के साथ सिर और पेट को हटा दें।
  6. संशोधित पिपेट टिप का उपयोग करके अलग छाती को चरण 3.2 से लेबल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: फिक्सेटिव में अतिरिक्त 1x पीबीएस जोड़ने से बचने के लिए पिपेट को 40 माइक्रोन में सेट करें।
  7. प्रत्येक नमूने के लिए ऊपर चरण 3.2\u20123.6 दोहराएं।
  8. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए नमूने ठीक करें।
  9. एक पाश्चुर पिपेट का उपयोग करके फिक्स निकालें और इसे धुएं हुड के नीचे उचित अपशिष्ट कंटेनर में त्याग दें। एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक 1x पीबीएस के 1.5 एमएल के साथ तीन बार नमूने कुल्ला। केवल 750 माइक्रोन का उपयोग करके एक चौथा कुल्ला पूरा करें और 1x पीबीएस में ऊतकों को छोड़ दें।
    नोट: इस बिंदु पर, ऊतक के नमूने अगले चरणों में आगे बढ़ने से पहले 3 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रह सकते हैं।

4. फ्लैश फ्रीजिंग और छाती बिस्खंड

  1. बाइसेक्शन शुरू करने से पहले, उचित क्रायो-सुरक्षात्मक दस्ताने और सुरक्षा चश्मा पहने तरल नाइट्रोजन के साथ एक देवर फ्लास्क भरें। एक ब्लेड ब्रेकर, पंख ब्लेड, ठीक संदंश, बर्फ, बर्फ ठंडा 1x PBS, और क्रायोजेनिक चिमटी की एक जोड़ी प्राप्त करें।
  2. 1x पीबीएस आइस-कोल्ड रखने के लिए एक आइस बकेट तैयार करें।
  3. एक कोण पर पंख ब्लेड हड़पने के लिए ब्लेड ब्रेकर का प्रयोग करें, और एक छोटे से टुकड़े को तोड़ने के क्रम में ब्लेड मोड़। ब्लेड ब्रेकर तो एक छोटे स्केलपेल के रूप में उपयोग के लिए स्थिति में ब्लेड बंद कर सकते हैं ।
    नोट: एक ब्लेड सभी समूहों के लिए पिछले चाहिए । ब्लेड टूट जाता है या सुस्त हो जाता है तो स्विच करें।
  4. P200 में एक साफ पिपेट टिप जोड़ें और नमूनों के परिवहन के लिए टिप के1/5 वें को हटा दें।
  5. प्रत्येक समूह के लिए एक नया माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब तैयार करें और प्रत्येक ट्यूब में 1x पीबीएस के 200 माइक्रोल जोड़ें। इस दूसरी ट्यूब का उपयोग अंतिम डीएलएम प्रेप एकत्र करने के लिए किया जाएगा।
  6. पाश्चर पिपेट का उपयोग करके ट्यूबों से सभी 1x पीबीएस निकालें।
  7. उचित सुरक्षा उपकरण पहने हुए, क्रायोजेनिक चिमटी के साथ 10 एस के लिए तरल नाइट्रोजन फ्लास्क में ट्यूब जलमग्न करें।
    नोट: ट्यूब को विस्फोट से रखने के लिए ट्यूबों को कसकर बंद किया जाना चाहिए।
  8. तरल नाइट्रोजन से ट्यूब निकालें और एक पाश्चर पिपेट के साथ नमूनों के लिए बर्फ ठंडा 1x PBS के लगभग 300 माइक्रोन जोड़ें। नमूनों को बर्फ पर रखें।
  9. सिलिकॉन इलास्टोमर के साथ लेपित 10 सेमी विच्छेदन डिश में बर्फ-ठंड 1x पीबीएस जोड़ें और संशोधित 200 माइक्रोल पिपेट के साथ पहला छाती वितरित करें।
  10. छाती वेंट्रल साइड को ऊपर रखें। एक हाथ में छाती की स्थिति के लिए संदंश की एक सुस्त जोड़ी का उपयोग करें और दूसरे में छाती के मिडलाइन को बेनकाब करने के लिए छाती गैंगलियन के कुछ को हटाने के लिए संदंश की एक अच्छी जोड़ी का उपयोग करें।
  11. ब्लेड के साथ छाती के 1/3के माध्यम से एक उथले कट बनाने के लिए एक गाइड के रूप में छाती के मिडलाइन का उपयोग करें।
  12. छाती से ब्लेड निकालें और कुंद संदंश के साथ एक 45 डिग्री कोण पर छाती की स्थिति। ब्लेड को फिर से स्थापित करें और छाती के मिडलाइन को सीधे काट लें। इसके परिणामस्वरूप दो हेमीथोरेस होंगे।
  13. एक समय में एक हेमिटोराक्स लें और डीएलएम मांसपेशी फाइबर एफ(चित्रा 1B),सबसे वेंट्रल फाइबर के तहत अतिरिक्त ऊतक को हटा दें। डीएलएमएस को नुकसान पहुंचाए बिना अतिरिक्त ऊतक को हटाने के लिए सावधानी से एक या दो कटौती करने के लिए ब्लेड का उपयोग करें।
  14. एक बार अलग होने के बाद, हेमिटोराक्स को 1x पीबीएस के साथ सही ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  15. जब तक प्रति समूह 10 विच्छेदित हेमिटोरासेस नहीं किए जाते तब तक चरण 4.6\u20124.14 दोहराएं।

5. संरचनात्मक धुंधला

  1. छाती के नमूनों को विभाजित करने के बाद, ऊतक को अवरुद्ध करने में ऊतक रखें (0.1% सामान्य बकरी सीरम के साथ 1x पीबीएस, और पीएच 7.4 पर 0.2% ट्राइटन एक्स-100) ऊतक को पार करने और गैर-विशिष्ट धुंधला को रोकने के लिए। अतिरिक्त 1x पीबीएस को हटाने के लिए एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें और प्रत्येक ट्यूब में बफर को अवरुद्ध करने के 1.5 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए ऊतकों को ब्लॉक करें।
  2. 1:200 और फल्लोइडिन-647 के कमजोर पड़ने पर क्रमशः 1:200 और फालियाइडिन-647 के कमजोर पड़ने पर फ्लोरोसेंटली संयुग्मित एंटीबॉडी, सहिजन पेरोक्सिडेस 488 (एंटी-एचआरपी-488) का उपयोग करके संरचनात्मक धुंधला के लिए नमूने तैयार करें। ट्यूब प्रति 150 μL है करने के लिए पर्याप्त दाग बनाओ। दाग को पन्नी में या एक अंधेरे बॉक्स में ढके 4 डिग्री सेल्सियस पर धुंधला करने के लिए तैयार होने तक स्टोर करें।
  3. ब्लॉक करने के बाद, एक ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ अतिरिक्त अवरुद्ध बफर को हटा दें।
  4. संरचनात्मक दाग को वितरित करने से पहले, दाग को भंवर। प्रत्येक ट्यूब में दाग के 150 माइक्रोन जोड़ें। नमूनों को 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर रोटेटर पर एक अंधेरे बॉक्स में रखें।
  5. दाग निकालें और एक अंधेरे बॉक्स में रोटेटर पर 5 मिनट के लिए 0.3% ट्राइटन एक्स-100 के साथ कमरे अस्थायी 1x पीबीएस के 1.5 एमएल में चार बार ऊतकों को धोएं। नमूने अब एक स्लाइड करने के लिए माउंट करने के लिए तैयार हैं ।

6. बढ़ते ऊतक

  1. पीबीएएसटी में नमूने धोने के बाद, धुंधला करने के लिए ऊतक माउंट करने के लिए एक माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करें। स्लाइड को कवर करने के लिए ग्लास कवर स्लिप, एक पी 200 पिपेट, 200 माइक्रोल पिपेट टिप्स, कैंची, स्पष्ट सुदृढीकरण, सीधे किनारे के संदंश, एंटी-फीका फ्लोरोसेंट बढ़ते मीडिया, नेल पॉलिश और एक डार्क बॉक्स सहित अतिरिक्त आपूर्ति तैयार करें।
  2. नमूनों की पहचान करने के लिए स्लाइड लेबल और kimwipes के साथ स्लाइड साफ करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहां कोई धब्बा हैं ।
  3. यह सुनिश्चित करने के लिए कि हेमिटोराक्स नमूने कवर स्लिप से क्षतिग्रस्त नहीं हैं, सुदृढीकरण लेबल का उपयोग करके "पुल" बनाएं। एक सुदृढीकरण लेबल लें, इसे आधे में काट लें, और प्रत्येक आधे लगभग 15 मिमी के अलावा रखें। यह दूरी कवर स्लिप की चौड़ाई से छोटी होनी चाहिए। एक "पुल" को पूरा करने के लिए इस चरण को चार बार दोहराएं जो 5 लेबल उच्च है।
  4. P200 पिपेट लें और नमूनों को स्लाइड में स्थानांतरित करने के लिए1/5 टिप काटकर एक टिप को संशोधित करें। नमूनों को पुल के केंद्र में स्लाइड पर स्थानांतरित किया जाना चाहिए ।
  5. एक लैब पोंछ के किनारे ले लो और किसी भी अतिरिक्त PBST हटा दें। संदंश का उपयोग करके, डीएलएमएस की व्यवस्था करें ताकि सभी नमूने मांसपेशियों की ओर ऊपर और क्यूटिकल साइड डाउन का सामना कर रहे हों।
  6. एक मानक P200 पिपेट टिप का उपयोग करना, स्लाइड करने के लिए बढ़ते मीडिया के 70 μL लागू होते हैं, हवा के बुलबुले से परहेज. केंद्र में बाहर से शुरू सुदृढीकरण के अंदर एक परिपत्र पैटर्न में मीडिया बांटना ।
  7. सुदृढीकरण के ऊपर एक कवर स्लिप रखें।
  8. कवरस्लिप की परिधि के चारों ओर बाहर के किनारों को कोट करने के लिए नेल पॉलिश का उपयोग करें। ऊतक की पूरी मुहर बनाने के लिए उदारता से लागू करें।
  9. स्लाइड को अंधेरे में एक सपाट सतह पर रखें, जिससे कम से कम 10 मिनट सूख जाएं और फोटो-ब्लीचिंग या फ्लोरेसेंस के नुकसान को रोका जा सके। स्लाइड्स अब तुरंत इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या अन्यथा बाद में देखने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर एक स्लाइड फ़ोल्डर में संग्रहीत किया जा सकता है।

7. वैकल्पिक: प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ धुंधला

नोट: यह अनुभाग वैकल्पिक है और यदि वांछित हो तो सीधे सेक्शन 4 और 5 के बीच उपयोग किया जाना चाहिए।

  1. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊतक दाग करने के लिए, कम से कम 1 घंटे के लिए बफर अवरुद्ध में ऊतक जलमग्न।
  2. बफर को अवरुद्ध करने में उचित कमजोर पड़ने के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें। कम से कम, प्रति समूह 150 माइक्रोल रखने के लिए पर्याप्त एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें। ध्यान रहे कि अभी भी नमूने रखे गए हैं। उपयोग के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. एक पाश्चुर पिपेट के साथ अतिरिक्त अवरुद्ध बफर निकालें। प्राथमिक एंटीबॉडी को संक्षेप में भंवर में डालें और प्रत्येक समूह में एंटीबॉडी मिश्रण के 150 माइक्रोन जोड़ें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने रखें।
  4. अगले दिन, प्राथमिक एंटीबॉडी को हटा दें और एक रोटेटर पर 5 मिनट के लिए पीबीटीएसटी के साथ ऊतक को 4 बार धोएं।
  5. बफर को अवरुद्ध करने में माध्यमिक दाग तैयार करें। नमूने में माध्यमिक दाग जोड़ें और फिर इसे रोटेटर पर एक अंधेरे बॉक्स में 2 घंटे के लिए एक कमरे का तापमान रखें।
    नोट: माध्यमिक धुंधला भी एचआरपी और फॉलोइडिन शामिल कर सकते हैं ।
  6. 2 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, PBST के साथ 5 मिनट के लिए माध्यमिक दाग धोने के ऊतकों को 4 बार हटाने के लिए और बढ़ते करने के लिए आगे बढ़ें।

Representative Results

ट्रांसजेनिक मक्खियों की पीढ़ी 43 केडीए उत्परिवर्ती (टीडीपी-43एम 337वी)के मानव टार-बाइंडिंग प्रोटीन को व्यक्त करती है, जो योजनाबद्ध(चित्रा 1 ए)द्वारा दर्शाई जाती है। यह ड्रोसोफिला27में बाइनरी Gal4/UAS प्रणाली के आवेदन को दर्शाता है । उदाहरण में छह मांसपेशी फाइबर के साथ एक हेमिटहोरेक्स को दर्शाया गया है, A\u2012F सबसे पृष्ठीय फाइबर ए से सबसे वेंट्रल एफ(चित्रा 1B) 11,,12तक जा रहा है।11 सिनैप्टिक अखंडता का आकलन करने के लिए, एनएमजेएस को एचआरपी और फालोइडिन(चित्रा 1सी\u2012E) सेदाग दिया गया था। टीडीपी-43एम337वी म्यूटेंट(चित्रा 1F)में मोटर न्यूरॉन्स के पास 21 दिन तक कोई एचआरपी धुंधला नहीं है, जबकि डब्ल्यूटी (ओरेगन-आर) बरकरार है(चित्रा 1C)। मांसपेशियों के धुंधला होने में कोई अंतर नहीं दिख रहाहै (चित्रा 1डी, जी)। टीडीपी-43एम337वी म्यूटेंट में देखे गए सकल आकृति विज्ञान में परिवर्तन यह दर्शाता है कि वयस्क डीएलएम मॉडल का उपयोग करके एमियोट्रोफिक पार्श्व स्क्लेरोसिस (एएलएस) के न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग मॉडल में सिनैप्टिक अखंडता को कैसे फंसाया जा सकता है। संरचनात्मक धुंधला होने के अलावा, डीएलएम एनएमजेएस को धुंधला करने से प्रेसिनैप्टिक(चित्रा 2ए\u2012R)और पोस्ट सिनैप्टिक(चित्रा 2एस\u2012X)मार्कर के साथ सिनैप्टिक अखंडता का आकलन भी प्रदान किया जा सकता है। साथ में, ये परिणाम स्पष्ट करते हैं कि न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों में डीएलएम ऊतक का अध्ययन करने के लिए इस विच्छेदन प्रोटोकॉल को कैसे लागू किया जा सकता है।

इस विच्छेदन का एक प्रमुख पहलू बिस्सेक्शन को आसान बनाने के लिए ऊतक को फ्रीज करने के लिए तरल नाइट्रोजन का अनुप्रयोग है। तरल नाइट्रोजन की उपयोगिता तरल नाइट्रोजन के साथ डब्ल्यूटी मक्खियों में प्रदर्शित की जाती है जहां मांसपेशियों के ऊतकों को कोई नुकसान या निचोड़ित फाइबर(चित्रा 3ए\u2012C) नहीं होता है। तरल नाइट्रोजन के बिना, ऊतक विच्छेदन करने के लिए और अधिक कठिन हो सकता है। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल का पालन करना और तरल नाइट्रोजन फ्लैश फ्रीजिंग स्टेप को छोड़ना ऊतक को विच्छेदन उपकरणों जैसे क्षतिग्रस्त न्यूरॉन्स (चित्रा 3डी)या क्षतिग्रस्त मांसपेशी फाइबर(चित्रा 3E)से नुकसान के लिए अतिसंवेदनशील होने की अनुमतिदेता है। तरल नाइट्रोजन का अनुप्रयोग ऊतक क्षति को रोकने में मदद करता है जो नमूने के जीनोटाइप(चित्र 3सी और3F)की परवाह किए बिना डीएलएम ऊतक के साथ काम करते समय हो सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: एएलएस के ड्रोसोफिला मॉडल में डीएलएम सिनेप्स का प्रगतिशील डिनेरवेशन। (क)एएलएस ट्रांसजेनिक मक्खियों की पीढ़ी 43 केडीए (टीडीपी-43) के टार-बाइंडिंग प्रोटीन के मानव उत्परिवर्ती रूप को व्यक्त करने वाली योजनाबद्ध में दिखाई जाती है। (ख) इस दृष्टांत में वयस्क ड्रोसोफिलामें मितभोरेक्स के आकार और अभिविन्यास को दर्शाया गया है . प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम एचआरपी (ग्रीन) और मांसपेशियों के ऊतकों के साथ मोटर न्यूरॉन्स के संरचनात्मक धुंधला के माध्यम से डीएलएम एनएमजे सिनेप्स की सिनैप्टिक अखंडता के प्रगतिशील नुकसान का निरीक्षण कर सकते हैं। हमारे मॉडल वयस्क मक्खियों की पीढ़ी के माध्यम से एएलएस के एक वयस्क मॉडल में सिनैप्टिक अखंडता के नुकसान को दर्शाया गया है मोटर न्यूरॉन्स में मानव TDP-43M337V (चित्रा 1F\u2012H)की तुलना में एक उत्परिवर्ती व्यक्त करने के लिए WT(चित्रा 1C \u2012E)मांसपेशी फाइबर सी में मक्खियों । तीर एक डब्ल्यूटीई सिनेप्स(चित्रा 1 सी)के उदाहरणों और सिनैप्टिक अखंडता के नुकसान का एक उदाहरण उजागर करते हैं। स्केल बार = 63x आवर्धन पर 20 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: वयस्क एनएमजेएस में प्रेसिनैप्टिक मार्कर का उपयोग करके सिनैप्टिक अखंडता का आकलन करना। सिनैप्टिक अखंडता का मूल्यांकन डब्ल्यूटी मक्खियों में प्रेसिनैप्टिक और पोस्टसिनैप्टिक मार्कर का उपयोग करके भी किया जा सकता है जो मांसपेशियों के फाइबर सी में 14 दिन पुराने हैं। प्रेसिनैप्टिक मार्कर सिनेप्सिन(बी),सिंटैक्सिन(एच),और ब्रुचपायलट (बीआरपी)(एन)एचआरपी(ए, जी, एम)के साथ सह-दाग हैं। धुंधला इन मार्कर के स्थानीयकरण को प्रेसिनैप्टिक टर्मिनलों(सी, आई,ओ) में दर्शाया गया है। उच्च आवर्धन पर, छवियां सिनैपसिन(ई),सिनटैक्सिन(कश्मीर)और बीआरपी(क्यू)के स्थानीयकरण को एचआरपी(डी, जेऔर पी)के साथ अधिक विस्तार सेदर्शाती हैं (चित्र एफ, एलऔर आर)। हम एक पोस्टसिनैप्टिक मार्कर ग्लूटामेट रिसेप्टर III (ग्लूआरआईआईआई)(टी)एचआरपी(एस)के साथ सह-दाग भी दिखाते हैं। सह धुंधला इन मार्कर(यू)की उपयोगिता को दर्शाता है । उच्च आवर्धन पर प्रतिनिधि छवियां क्रमशः पोस्टसिनैप्टिक मांसपेशी ऊतक और प्रेसिनैप्टिक टर्मिनलों के लिए ग्लूरआईआई(डब्ल्यू)और एचआरपी(वी)के स्थानीयकरण(एक्स)का उदाहरण देती हैं। पैनलों के लिए स्केल बार A\u2012C, जी-I, M\u2012O, S\u2012U 63x आवर्धन पर 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। पैनलों के लिए स्केल बार D\u2012F, 2J-2L, 2P-2R, और 2V-2X 63x आवर्धन पर 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: डीएलएम विच्छेदन के लिए तरल नाइट्रोजन की उपयोगिता। डीएलएम विच्छेदन के लिए तरल नाइट्रोजन की उपयोगिता प्रदर्शित करने के लिए, हम मांसपेशियों के फाइबर सी से तरल नाइट्रोजन के साथ और बिना 21 डब्ल्यूटी मक्खियों के दिन की तुलना दिखाते हैं। तरल नाइट्रोजन के साथ, फालोडिन(बी)बरकरार रहता है और एचआरपी स्टेनिंग(ए, सी)से समझौता नहीं करता है। तरल नाइट्रोजन के बिना, मांसपेशियों के ऊतकों को स्ट्रीक और मुश्किल हो जाता है(ई)और एचआरपी धुंधला(डी, एफ)तकनीकी त्रुटि के कारण समझौता हो जाता है। सफेद तीर तरल नाइट्रोजन(बी)और क्षतिग्रस्त मांसपेशियों के ऊतकों(ई)के साथ कोई मांसपेशी क्षति का एक क्षेत्र दिखाते हैं । स्केल बार = 63x आवर्धन पर 20 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल में वर्णित तरीकों का उपयोग करके, हम डीएलएम ऊतक के विच्छेदन के लिए एक सीधा दृष्टिकोण प्रदान करते हैं और प्रदर्शित करते हैं कि वयस्क ड्रोसोफिला में संरचनात्मक धुंधला और सिनैप्टिक मार्कर के माध्यम से सिनैप्टिक अखंडता का आकलन करने के लिए इसे कैसे लागू किया जा सकता है। प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है कि डीएलएम ऊतक को काटना आसान बनाता है तरल नाइट्रोजन के साथ फ्लैश फ्रीजिंग है । इस कदम के बिना, ऊतक कम फर्म है और अधिक मुश्किल के रूप में ठीक से कटौती के रूप में चित्रा 3में मनाया । यह प्रोटोकॉल मोटर न्यूरॉन्स और मांसपेशियों के ऊतकों 18 , 19 , 20 ,22, 22,22,,,23दोनों के संरक्षण की अनुमति देने19के,लिए पिछले विच्छेदन विधियों परबनाताहै । इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि जब बाइसेक्शन के लिए मिडलाइन को काट दिया जाता है, तो प्रति छाती दो साफ प्रेप प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है। एक तरह से प्रति फ्लाई कम से कम एक षिकोराक्स सुनिश्चित करने के लिए, आप जानबूझकर एक साफ तैयारी प्राप्त करने के लिए छाती के एक तरफ काट सकते हैं। इस संशोधन के साथ, ब्लेड ब्रेकर के साथ नमूने को साफ करने के लिए कटौती से अतिरिक्त अतिरिक्त ऊतक को हटाने की भी आवश्यकता हो सकती है। इस तकनीक के लिए नए लोगों के लिए, निरंतर अभ्यास के साथ, बाइसेक्शन की सटीकता में वृद्धि होगी।

यहां वर्णित विधि शोधकर्ताओं को आसानी से अपने जीवन भर में किसी भी समय वयस्क DLM एनएमजेएस की संरचनात्मक अखंडता का आकलन करने की अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल का एक प्रमुख लाभ सिनैप्टिक मार्कर का उपयोग करके न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग मॉडल में सिनैप्टिक अखंडता तक पहुंचने की क्षमता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि यह एप्लिकेशन संरचनात्मक धुंधला(चित्रा 1C\u2012H)के साथ सकल आकृति विज्ञान में परिवर्तन की कल्पना करने में मदद कर सकता है। इसके अतिरिक्त, सिनैप्टिक अखंडता का आकलन प्रेसिनैप्टिक मार्कर के धुंधला होने के साथ किया जा सकता है, जिसमें सिनेपसिन28 (चित्रा2\u2012F), सिंटैक्सिन29 (चित्रा 2जी \u2012L)और बीआरपी30 (चित्रा 2M\u2012R)तक सीमित नहीं है।A‒F इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता का प्रदर्शन करते हुए ग्लूटामेट रिसेप्टर III सबयूनिट एंटीबॉडी31 (चित्रा 2एस\u2012X)का उपयोग करके पोस्टसिनैप्टिक मांसपेशी ऊतक का भी आकलन किया जा सकता है।

शोधकर्ता विभिन्न प्रकार की बीमारियों से जुड़े सिनेप्स की संरचनात्मक अखंडता की व्यापक जांच करने के लिए कार्यात्मक डेटा को पूरक करने के लिए इस विच्छेदन विधि का भी उपयोग कर सकते हैं। ये सिनेप्स इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग32 , 33,34,और उड़ान परख10के माध्यम से कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति देते हैं ।34 यह प्रोटोकॉल कई अनुप्रयोगों और परख के लिए ऊतक तक पहुंच में आसानी प्रदान कर सकता है। उदाहरण के लिए, भविष्य के अध्ययन इस प्रोटोकॉल का उपयोग घनत्व और15, 16,के सिनैप्स की संख्या के परिमाणीकरण के माध्यम से सिनैप्टिक परिवर्तनों की मात्रा निर्धारित करने के लिए करसकतेहैं। जबकि यहां वर्णित प्रोटोकॉल विशेष रूप से मोटर न्यूरॉन्स की सिनैप्टिक अखंडता की जांच करता है, मांसपेशियों की कोशिका हानि का आकलन करने के लिए पूरक प्रोटोकॉल भी ट्यूनल स्टेनिंग35का उपयोग करके इस विच्छेदन के साथ किया जा सकता है। न्यूरोनल हानि की जांच करने के लिए, वक्ष गैंगलियन36 के विच्छेदन का उपयोग ट्यूनल धुंधला के साथ भी किया जा सकता है। हम उम्मीद करते हैं कि यहां वर्णित विच्छेदन में उम्र से संबंधित विकृतियों के साथ-साथ न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों का आकलन करने वाले भविष्य के अध्ययनों के लिए अधिक अनुप्रयोग होंगे।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01 NS110727) द्वारा डी टी.B के लिए समर्थन दिया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
32% Formaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714 Tissue preservation
Alexa Fluor 568 goat anti mouse Fisher Scientific A11031 Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration.
Alexa Fluor 568 goat anti rabbit Fisher Scientific A11036 Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration.
anti- Bruchpilot (BRP) antibody Developmental Studies Hybridoma Bank NC82 Stains the active zones in presynaptic neurons. Used at 1:25 concentration.
anti-GluRIII antibody Gift from Aaron DiAntonio N/A Labels glutamate receptor subunits. Used at 1:1000 concentration.
anti-Synapsin antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 3C11 Labels the synaptic protein synapsin. Used at 1:50 concentration.
anti-Syntaxin antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 8C3 labels the synaptic protein syntaxin. Used at 1:10 concentration.
BenchRocker Genesee Scientific 31-302 Rotating samples during staining
Blade Breaker Fine Science Tools 10053-09 Used for holding feather blade
cover slips Fisher Scientific 12548A For mounting tissue
cryogenic gloves VWR 97008-198 protect hands from liquid nitrogen
cryogenic tweezers VWR 82027-432 Hold 2.0 mL tube in liquid nitrogen
dewar flask-1900 mL Thomas Scientific 5028M54 Hold liquid nitrogen
Feather Blades Electron Microscopy Sciences 72002-01 Scalpel Blades
Fine Forecps x 2 Fine Science Tools 11252-20 One fine pair for Clearing midline of thorax. The other pair can be dulled using a sharpening stone.
FITC-conjugated anti HRP Jackson Laboratories 123-545-021 Stains Motor Neurons. Used at 1:100 concentration
freezer box (Black) Fisher Scientific 14100F Protects samples from light
glass pasteur pipettes VWR 14637-010 Used to transfer samples
glass slides Fisher Scientific 12550143 For mounting tissue
mounting media (vectashield) anti-fade VWR 101098-042 Mounting media retains fluorescent signaling
nail polish Electron Microscopy Sciences 72180 Seals microscope slides
normal goat serum Fisher Scientific PCN5000 Prevents non-specific binding of antibodies
paint brush Genesee Scientific 59-204 Transferring flies
PBS Fisher Scientific 10-010-023 Saline solution for dissecting and staining
Phalloidin 647 Abcam AB176759 Stains F-Actin in muscle Tissue. Used at 1:1000 concentration
plastic petri dish (100 mm) VWR 25373-100 Dissection dish
reinforcement labels W.B. Mason AVE05722 Provides support for glass coverslip over the mounted tissue
sharpening block Grainger 1RDF5 Keeping fine forceps sharp and also dulling separate pair
slide folder VWR 10126-326 Sample storage
standard office scissors W.B. Mason ACM40618 Cutting reinforcement labels
Sylgard 184 Electron Microscopy Sciences 24236-10 Coating for dissection dish
Triton-X-100 Electron Microscopy Sciences 22140 Helps to permeabilize tissue
Vannas Disssection Sissors Fine Science Tools 1500-00 Ued for removing fly legs and making an incision on thorax

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References

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न्यूरोसाइंस अंक 159 पृष्ठीय देशांतर मांसपेशियां डीएलएमएस न्यूरोमस्कुलर जंक्शन एनएमजे न्यूरोडिजेनरेशन ड्रोसोफिला,इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री आईएचसी आयु
न्यूरोडिजेनरेशन के सहयोग से वयस्क <em>ड्रोसोफिला</em> में सिनैप्टिक डिजनरेशन की कल्पना करना
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Sidisky, J. M., Babcock, D. T.… More

Sidisky, J. M., Babcock, D. T. Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration. J. Vis. Exp. (159), e61363, doi:10.3791/61363 (2020).

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