Summary
Hier wordt een procedure gepresenteerd voor reproduceerbare en statistisch geldige bepalingen van zetmeelgranulaatgrootteverdelingen en voor het specificeren van de bepaalde korrellognormale grootteverdelingen met behulp van een multiplicatieve vorm met twee parameters. Het is van toepassing op alle granulaatgrootteanalyses van zetmeelmonsters op gramschaal voor plant- en voedselwetenschappelijk onderzoek.
Abstract
Zetmeel uit alle plantaardige bronnen bestaat uit korrels in verschillende maten en vormen met verschillende frequenties, d.w.z. met een grootte en eenvormverdeling. Gegevens over de grootte van zetmeelkorrels die zijn bepaald met behulp van verschillende soorten deeltjesgroottetechnieken zijn vaak problematisch vanwege een slechte reproduceerbaarheid of gebrek aan statistische significantie als gevolg van enkele onoverkomelijke systematische fouten, waaronder gevoeligheid voor korrelvormen en limieten van korrelmonstergroottes. We hebben een procedure beschreven voor reproduceerbare en statistisch geldige bepalingen van zetmeelgranulaatgrootteverdelingen met behulp van de techniek van de elektrische detectiezone, en voor het specificeren van de bepaalde korrellognormale grootteverdelingen met behulp van een aangenomen multiplicatieve vorm met twee parameters met verbeterde nauwkeurigheid en vergelijkbaarheid. Het is van toepassing op alle granulaatgrootteanalyses van zetmeelmonsters op gramschaal en zou daarom studies kunnen vergemakkelijken over de manier waarop zetmeelkorrelgroottes worden gevormd door het zetmeelbiosyntheseapparaat en -mechanismen; en hoe ze eigenschappen en functionaliteit van zetmeel voor voedsel en industrieel gebruik beïnvloeden. Representatieve resultaten worden gepresenteerd uit repliceringsanalyses van granulaatgrootteverdelingen van sweetpotato-zetmeelmonsters volgens de geschetste procedure. We bespraken verder verschillende belangrijke technische aspecten van de procedure, met name de multiplicatieve specificatie van korrellognormale grootteverdelingen en enkele technische middelen om frequente diafragmablokkades door korrelaggregaten te overwinnen.
Introduction
Zetmeelkorrels zijn de fysische structuur waarin twee hoofdreserve homoglucan polymeren in plantenfotosynthese- en opslagweefsels, de lineaire of dun vertakte amylose en de sterk vertakte amylopectine, ordelijk zijn verpakt samen met enkele kleine componenten, waaronder lipiden en eiwitten. Zetmeelkorrels van verschillende plantensoorten vertonen veel driedimensionale (3D) vormen (herzien in ref.1,2), waaronder bollen, ellipsoïden, veelvlak, bloedplaatjes, kubussen, cuboids en onregelmatige tubuli. Zelfs die van hetzelfde weefsel of verschillende weefsels van dezelfde plantensoort kunnen een reeks vormen hebben met verschillende frequenties. Met andere woorden, zetmeelkorrels van een plantensoort kunnen een karakteristieke statistische vormverdeling hebben, in plaats van een specifieke vorm. De niet-uniforme en niet-bolvormige korrelvormen maken het moeilijk om zetmeelkorrelgroottes goed te meten en te definiëren. Bovendien zijn zetmeelkorrels uit dezelfde weefsels van een plantensoort van een reeks maten met verschillende verhoudingen, d.w.z. met een karakteristieke grootteverdeling. Deze grootteverdeling bemoeilijkt de analyse en beschrijving van zetmeelkorrelgroottes verder.
Zetmeelkorrelgroottes zijn geanalyseerd met behulp van verschillende categorieën deeltjesgroottetechnieken (herzien in ref.3),waaronder microscopie, sedimentatie/sterische veldstroomfractie (Sd/StFFF), laserdiffractie en elektrische detectiezone (ESZ). Deze technieken zijn echter niet even geschikt voor de bepaling van zetmeelkorrelgroottes in aanwezigheid van een korrelvorm en een grootteverdeling. Microscopie, inclusief lichte, confocale en scanning elektronenmicroscopie, is uitstekend geschikt voor de studies van morfologie4,5,6,7, structuur8,9 en ontwikkeling10,11 van zetmeelkorrels, maar nauwelijks geschikt voor het definiëren van hun grootteverdelingen vanwege enkele inherente tekortkomingen. directe metingen van microscopische korrelbeelden of softwareondersteunde beeldanalyse van optische microscopiegegevens (IAOM), die zijn gebruikt voor de bepaling van korrelgroottes zetmeel van verschillende soorten; met inbegrip van maïs12, tarwe13,14, aardappel15 en gerst16, kan alleen 1D (meestal maximale lengte) of 2D (oppervlakte) maten van zeer beperkte aantallen (tienduizenden) zetmeelkorrel afbeeldingen meten. De kleine korrelbemonsteringsgrootten die inherent door de technieken worden beperkt, kunnen zelden statistisch representatief zijn, gezien de enorme korrelgetallen per gewicht per eenheid zetmeel (~120 x 106 per gram, uitgaande van alle bollen van 10 μm bij een dichtheid van 1,5 g/cm³), en kunnen daarom leiden tot een slechte reproduceerbaarheid van de resultaten. De Sd/StFFF-techniek kan hoge snelheid en resolutie hebben, en smalle fracties van zetmeelkorrels17, maar is zelden gebruikt waarschijnlijk omdat de nauwkeurigheid ervan ernstig kan worden beïnvloed door beschadigingen, verschillende vormen en dichtheid van zetmeelkorrels. De laserdiffractietechniek is de meest gebruikte en is toegepast voor zetmeelgranulaatgrootteanalyses voor alle belangrijke gewassoorten3,14,16. Hoewel de techniek veel voordelen heeft, is het eigenlijk niet geschikt voor het bepalen van zetmeelkorrelgroottes in aanwezigheid van een korrelvormverdeling. De meeste gelijktijdige laserdiffractie-instrumenten vertrouwen op de Mie-lichtverstrooiingstheorie18 voor uniforme bolvormige deeltjes en de gemodificeerde Mie-theorie18 voor sommige andere vormen van uniformiteit. De techniek is daarom inherent zeer gevoelig voor deeltjesvormen en niet helemaal geschikt, zelfs niet voor bepaalde vormen van uniformiteit19, laat staan voor zetmeelkorrels met een reeks vormen van verschillende verhoudingen. De ESZ-techniek meet de elektrische veldstoring in verhouding tot het volume van het deeltje dat door een opening gaat. Het biedt korrelvolumegrootten, evenals de informatie over aantal- en volumeverdeling, enz., bij hoge resoluties. Aangezien de ESZ-techniek onafhankelijk is van optische eigenschappen van deeltjes, waaronder kleur, vorm, samenstelling of brekingsindex, en de resultaten zeer reproduceerbaar zijn, is het bijzonder geschikt voor het bepalen van grootteverdelingen van zetmeelkorrels met een reeks vormen.
Zetmeelkorrelgroottes zijn ook gedefinieerd met behulp van veel parameters. Ze werden vaak simplistisch beschreven door gemiddelde diameters, die in sommige gevallen de rekenkundige middelen waren van de microscopisch gemeten maximale lengtes van 2D-afbeeldingen12,20, of gemiddelden van equivalente boldiameters3. In andere gevallen werden de korrelgrootteverdelingen gespecificeerd aan de hand van groottebereiken21,22, het distributiegemiddelde volume of de gemiddelde diameter (bolequivalent, gewogen naar aantal, volume of oppervlakte) uitgaande van een normale verdeling14,23,24,25,26. Deze descriptoren van zetmeelkorrelgroottes uit verschillende analyses zijn van een heel andere aard en niet strikt vergelijkbaar. Het kan zeer misleidend zijn als deze "maten" zetmeelkorrels van verschillende soorten of zelfs dezelfde weefsels van dezelfde soort rechtstreeks worden vergeleken. Bovendien is de spreidingsparameter (of vorm) van de veronderstelde normale verdelingen, d.w.z. de standaardafwijking σ (of grafische standaardafwijking σg)die de breedte van de verdeling meet (d.w.z. de spreiding van de afmetingen), in de meeste studies genegeerd.
Om de bovengenoemde kritieke problemen op te lossen waarmee zetmeelkorrelgrootteanalyses worden geconfronteerd, hebben we een procedure beschreven voor reproduceerbare en statistisch geldige bepaling van korrelgrootteverdelingen van zetmeelmonsters met behulp van de ESZ-techniek, en voor het correct specificeren van de vastgestelde korrellognormale grootteverdelingen met behulp van een aangenomen multiplicatieve vorm met twee parameters27 met verbeterde nauwkeurigheid en vergelijkbaarheid. Voor validatie en demonstratie hebben we replicerende granulaatmaatanalyses van sweetpotato zetmeelmonsters uitgevoerd met behulp van de procedure en de lognormale differentiële volume-percentage volume-equivalente-boldiameterverdelingen gespecificeerd met behulp van hun grafische geometrische middelen 
en multiplicatieve standaardafwijkingen s* in een x/ (vermenigvuldigen en delen) s* vorm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van zetmeelmonsters
- Bereid volgens de vastgestelde procedures twee (of drie) gramschaal replicerende zetmeelmonsters van zetmeelaccumulerende weefsels van verschillende plantensoorten (bv. aardappelen15, sweetpotatoes28, tarwekorrels13,29en maïspitten30,enz.).
- Was zetmeelmonsters grondig met aceton of tolueen 3-4x om granulaataggregaten te minimaliseren en volledig te drogen.
OPMERKING: Gebruik extractieprocedures die meer dan 1 g zetmeel per preparaat opleveren. Een of twee aliquots van 0,5 g uit elk van de drie of twee replicerende extracten worden bemonsterd voor granulaatsizinganalyse van één zetmeelextract.
2. Elektrolytenpreparaat
- Bereid 500 ml lithiumchloride van 50 g/L in methanol voor vier maatruns voor replicatiezetmeelmonsters (100 ml per run plus 100 ml extra). Maak het elektrolyt bij voorkeur in batches met een groot volume, bijvoorbeeld 4 tot 8 L per keer, om de concentratievariatie te minimaliseren.
- Koel de container op ijs of in een kast van 4 °C om de ontbinding van het lithiumchloride te versnellen.
3. De analysator instellen
- Kies een diafragmabuis met een deeltjesdiameterbereik dat het bekende (in de literatuur of door middel van proefritten) korrelgroottebereik van te analyseren zetmeelmonsters bestrijkt, bijvoorbeeld een diafragma van 100 μm voor sweetpotatozetmeel. Voor zetmeelmonsters met een onbekend korrelgroottebereik selecteert u een geschikt diafragma tijdens proefritten met behulp van verschillende diafragmabuizen met overlappende deeltjesdiameterbereiken.
OPMERKING: Het deeltjesdiameterbereik van een diafragmabuis is het nauwkeurige groottebereik tussen 2 en 60% van en met een uitgebreid maatbereik tot 80% van de openingdiameter. Tabel 1 geeft een overzicht van de eigenschappen van drie nuttigste diafragmabuizen voor het dimensioneren van korrels van grote gewaszetmeel. Als het korrelgroottebereik van een zetmeelmonster breder is dan het groottebereik van een buis met één diafragma, voert u een overlappingsanalyse met meerdere buisjes uit waarbij maximaal vijf deeltjesgrootteverdelingen worden gecombineerd, gemeten met openingen van verschillende grootte. Elk diafragma is te herkennen aan de diameter en het onderdeelnummer dat op de buis is gelabeld. De diameter en het serienummer in een streepjescode op de buis kunnen worden gescand in de analysesoftware met behulp van de Streepjescodelezer in het Configuratiescherm van de analysator. - Kies een analytisch bekerglas van 100 of 200 ml (boven cuvetten) voor de bepaling van zetmeelkorrelgroottes en stel automatisch roeren (hieronder) in om een goede korrelsususpensie tijdens de meting te behouden.
- Maak een standaardwerkmethode (SOM) om uitvoeringsinstellingen en een voorkeurenbestand op te geven voor het analyseren, weergeven en afdrukken van de resultaten. Combineer som en voorkeuren bestand in een standaard operationele procedure (SOP) indien nodig.
OPMERKING: Voor niet-standaardiseerbare analyses gebruikt u SOM om de analyses uit te voeren en past u de SOM-instellingen aan tussen uitvoeringen door het venster Som bewerken (zie hieronder) indien nodig. Nadat u de uitvoering hebt voltooid, analyseert, bekijkt en afdrukt u de uitvoeringsresultaten door de voorkeuren naar wens te wijzigen. Gebruik voor standaardiseerbare granulaatmaatschapsanalyses een SOP om de analyses uit te voeren.- Start de analysesoftware. Klik op de main manu op SOP | Maak som wizard of bewerk de SOM, of klik in het statuspaneel op SOM bewerken. Gebruik de wizard of het venster Som bewerken om instellingen voor een SOM te selecteren. Instellingen die doorgaans worden gebruikt voor het dimensioneren van korrels van sweetpotato zetmeelmonsters zijn samengevat in tabel 2.
- Sla de gemaakte SOM op in een bestand in het venster SOM Wizard-Summary of Settings of in het venster Som bewerken.
- Klik op de hoofdmanu op SOP | Wizard Voorkeuren maken of Voorkeuren bewerken. Gebruik de wizard of tabbladen in het bewerkingsvenster Voorkeuren om voorkeursinstellingen te selecteren zoals die in tabel 3 of andere naar wens.
- Sla de geselecteerde voorkeuren op in een bestand in het venster Voorkeuren maken-overzicht van instellingen of in het venster Voorkeuren bewerken.
- Klik in het hoofdmenu op SOP-| Wizard SOP maken. Voer in de stapsgewijze handleiding van de wizard een beschrijving in, selecteer het bestand SOM en Voorkeuren om een SOP te maken en op teslaan.
4. Granulaat dimensioneringsanalyses van de zetmeelmonsters
- De analyzer voorbereiden
- Schakel de analyzer in, open de software op de computer en controleer de status Gereed boven aan het statuspaneel na de automatische verbinding met de analyzer.
- Vul de elektrolytenpot met elektrolyt, leeg indien nodig de afvalpot.
- Installeer en beveilig de gekozen diafragmabuis correct volgens de handleiding in de gebruikershandleiding. Voor een ongekalibreerde nieuwe diafragmabuis kalibreer deze volgens de stapsgewijze handleiding onder Kalibratie-| Kalibreer Aperture in het hoofdmenu. Controleer voor een gekalibreerde diafragmabuis de kalibratie volgens de stapsgewijze handleiding van de wizard Diafragmabuis wijzigen onder de | Controleer diafragmakalibratie in het hoofdmenu.
- Ontgrendel het testplatform door op de vergrendelingsclip te drukken (aan de middelste voorkant van de linkerwand van het monstercompartiment) en laat het platform handmatig naar beneden zakken. Plaats een analytische beker met 100 ml elektrolyt op het platform, verplaats de roerder naar de roerstand en til het platform handmatig op naar de zelfsluitende bovenste positie om de diafragmabuis en roerder in het elektrolyt onder te dompelen.
- Klik op Vullen op het onderste instrument Werkbalk om de analyzer automatisch het systeem te laten vullen met het elektrolyt en klik op Flush om de analyzer het systeem automatisch te laten spoelen.
- Laad de SOM door op SOP te klikken | Een SOM in hethoofdmenu te laden en de SOM te gebruiken om een analyse uit te voeren zonder een voorkeurenbestand. U ook een SOP laden door op SOP | te klikken Laad een SOP in het hoofdmenu of laad SOP in het statuspaneel en gebruik de SOP om een analyse uit te voeren.
- Als u een SOP gebruikt, klikt u op SOP | SOM-informatie of voorkeursinformatie in het hoofdmenu om de SOM- en voorkeursinstellingen te controleren. Klik op Voorbeeld | Voer Voorbeeldgegevens in het hoofdmenu of Info bewerken in het statuspaneel in om de voorbeeldgegevens voor de uitvoering in te voeren.
- Bereid zetmeel-methanolmonster en maatsuspensies voor
- Weeg uit elk van de twee of drie repliceerzetmeelextracten respectievelijk twee of één monster van 0,5 g.
- Voeg elk van de 0,5 g zetmeel aliquots toe aan 5 ml methanol in een conische centrifugebuis van 50 ml en verspreid zetmeelkorrels volledig met behulp van verschillende pulsen ultrageluid met lage intensiteit (12-24 W/cm2)van een ultrasone processor.
- Breng met behulp van een wegwerptransferpipet een kleine druppel van de zetmeelmethanolsuspensie (~ 0,2 ml) aan op de 100 ml van 50 g/L LiCl methanolelektrolyt onder constant roeren in het bekerglas. Sluit de deur van het monstercompartiment.
- Een maatvoering uitvoeren
- Klik op Voorbeeld in de onderste werkbalk instrument om een voorbeeld uitvoering te starten. Controleer in het statuspaneel of de dynamisch weergegeven concentratiebalk groen is en een nominaal concentratiebereik van 5 tot 8% voor de suspensie weergeeft.
- Klik op Stoppen op de onderste werkbalk om de preview-uitvoering te stoppen. Verdun indien nodig de zetmeel-elektrolytensuspensie door een aliquot van de suspensie te vervangen door het elektrolyt en herhaal vervolgens een Preview-run.
OPMERKING: Het nominale concentratiebereik van 5% tot 8% van de ophanging is van cruciaal belang voor het voltooien van een run zonder onderbreking als gevolg van diafragmablokkade door geaggregeerde korrels. Pas indien nodig de grootte van het druppelmonster en/of de concentratie van de zetmeel-methanolsuspensie aan om een nieuwe zetmeel-elektrolytensuspensie te maken met de nominale concentratie in het optimale bereik. - Klik na de verificatie op Start op de onderste werkbalk om de uitvoering te starten. De analyzer voltooit de uitvoering automatisch zodra het totale aantal korrels van formaat, dat samen met de uitvoeringstijd in het statuspaneel in een uitvoering wordt weergegeven, het ingestelde totale aantal (125.000 of 250.000) bereikt door de besturingsmodus van de SOM. Afhankelijk van de suspensieconcentratie (binnen 5-8% bereik of lager) duurt een enkele run 2 tot 5 minuten of meer.
OPMERKING: Wanneer de analysator automatisch een diafragmablokkade detecteert per verstoppingsdetectie-instellingen van de SOM, wordt de run afgebroken, wordt het diafragma verwijderd en wordt een nieuwe run gestart. Deze blokkeringsactie is ingesteld op maximaal vier keer herhalen voordat de analyzer de uitvoeringsbewerking annuleert. Dit probleem met het afbreken van de blokkade kan worden opgelost met behulp van twee technische methoden zoals vermeld in tabel 2 en gedetailleerd in de discussie. - Voer indien nodig een technische herhalingsrun uit (zie tabel 2 en gedetailleerd in Discussie) met dezelfde zetmeel-elektrolytenophanging door simpelweg op Start of Herhalen op de onderste werkbalk te klikken.
- Nadat een run of herhaling is voltooid, leegt u het bekerglas, spoelt u het af met methanol en vult u het bij met 100 ml verse elektrolytoplossing voor de volgende run.
- Als tijdens een uitvoering een meldingsdialoogvenster Voor groter bereik wordt weergegeven wanneer het aantal korrels groter dan 60 μm groter is dan 0,1% van het totale aantal (volgens de SOM-instelling), klikt u op Uitvoeren van 60% tot 80% voor het uitvoeren van een uitgebreid dynamisch groottebereik tot 80% van de diafragmadiameter.
OPMERKING: De instelling Extended Size Range regelt de acties voor korrels groter dan 60% van de diafragmadiameter (100 μm, in dit geval). De instelling in de SOM specificeert de opname van zetmeelkorrels groter dan 60 μm wanneer hun tellingen meer dan 0,1% van het totale aantal bereiken. De voltooiing van de uitvoering wordt nog steeds gecontroleerd door het totale aantal en kan iets minder tijd innemen dan anders zonder opname van de grotere korrels van minder dan 0,1% (vermoedelijk statisch onbeduidende hoeveelheid) van het totale aantal.
- De uitvoeringsresultaten analyseren
- Als een SOM is gebruikt om de uitvoeringen te beheren, selecteert u voorkeureninstellingen zoals gewenst voor het bekijken, afdrukken en statistische analyses van de resultaten met behulp van de wizard Voorkeuren maken of de voorkeuren bewerken onder de SOP in het hoofdmenu.
- Overlay is het resultaat van meerdere uitvoeringen op één grafiek ter vergelijking.
- Klik op Overlay op de hoofdwerkbalk of | Overlay in het hoofdmenu om toegang te krijgen tot het Overlay-venster. Navigeer naar en selecteer meerdere gewenste resultaatbestanden in het vak Bestanden, klik op Toevoegen om ze naar het vak Geselecteerde bestanden te verplaatsen en klik op OK om de geselecteerde resultaten in één grafiek te bedekken.
- Als u een bestand wilt toevoegen aan een geopende overlay, klikt u op RunFile | Open voor Overlay in het menu Uitvoeren om toegang te krijgen tot het overlayvenster, navigeer naar het gewenste bestand en klik om toe te voegen.
- Gemiddelde resultaten van replicerende analyses (2 extracten x 2 zetmeelbemonstering of 3 extracten x 1 zetmeelbemonstering) en het weergeven of afdrukken van de gemiddelde korrelgrootteverdeling en statistieken in een lijst of grafiek.
- Klik in het hoofdmenu op Bestand | FileTool | Gemiddeld om het venster Gemiddeld te openen. Navigeer naar en selecteer meerdere gewenste resultaatbestanden in het vak Bestanden, klik op Toevoegen om ze naar het vak Geselecteerde bestanden te verplaatsen en klik op OK om de geselecteerde resultaten te gemiddelden en het gemiddelde in één grafiek weer te geven.
- Als u een extra resultaatbestand wilt opnemen in een gemiddelde verdeling, klikt u in het menu Uitvoeren op RunFile | Openen en Toevoegen aan gemiddelde om het venster Toevoegen aan gemiddelde te openen, naar het bestand te navigeren en toe te voegen. Het nieuwe gemiddelde wordt weergegeven in de grafiek in het venster Uitvoeren (resultaat) of de aanbieding.
5. Specificeren van de gemiddelde verdeling
- Klik in het venster Run-Menu met de gemiddelde verdeling op | berekenen Gemiddelde statistieken in het menu Uitvoeren om het overzichtsvenster statistieken te openen, waarin de gemiddelde statistieken in rijen worden weergegeven, en de grafiekstatistieken voor de gemiddelde verdeling in de kolommen.
- Gebruik het grafische geometrische gemiddelde (
) en S.D. (s*) in de kolom grafiekstatistieken om de gemiddelde verdeling in het x / s * formulier op te geven. Bereken de CV-metingsvariaties tussen de gemiddelde repliceringsverdelingen door het gemiddelde (μ, hetzelfde als het gemiddelde van de gemiddelde verdeling) van de geometrische middelen van de gemiddelde verdelingen te delen met de gemiddelde S.D. (σ) die in de rij met gemiddelde statistieken worden vermeld.
OPMERKING: De gemiddelde S.D. (voor μ) die variaties tussen de middelen van de repliceerverdelingen beoordeelt, verschilt van de grafische geometrische S.D. (voor ) die de spreiding van de gemiddelde verdeling meet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de procedure te valideren en de reproduceerbaarheid van de bepaalde korrelgrootteverdeling aan te tonen, hebben we repliceringsanalyses van sweetpotato zetmeelmonsters uitgevoerd. We bereidden replicerende (S1 en S2) zetmeelmonsters van in het veld gekweekte sweetpotatoes van een foklijn SC1149-19 op een vergelijkbare ontwikkelingsleeftijd met behulp van een eerder beschreven procedure28. Van elk zetmeelextract werden twee aliquots van 0,5 g (a en b) bemonsterd, opgehangen in 5 ml methanol en gesoniceerd met verschillende pulsen van low-energy echografie om aggregaten op te breken. Elk van de twee paar zetmeel-methanol suspensies werd druppel-bemonsterd om een zetmeel-elektrolyten suspensie te maken, die vervolgens tweemaal werd gedimensioneerd (technische herhalingsruns) met behulp van de hierboven geschetste SOM voor een totaal aantal van 125.000 korrels elk. Voor elke afzonderlijke maatvoering, zodra het totale aantal meer dan ~ 65.000 en ~ 125.000 bereikt, veranderen de grafische geometrische S.D. (s*) en geometrische gemiddelde ( ) van de weergegeven differentiële volumegrootteverdeling niet langer significant, respectievelijk. Elk paar van de herhalingsruns met behulp van één zetmeel-methanolsuspensie werd samengevoegd na voltooiing voor een totale groottetelling van 250.000.
Figuur 1 toont differentiële volume-percentage volume-equivalente boldiameterverdelingen (S1a, S1b, S2a en S2b) voor de vier replicerende maatanalyses van de sweetpotato zetmeelmonsters, en hun gemiddelde verdeling. Het CV voor het gemiddelde van de geometrische middelen van de vier replicerende distributies bedroeg 3,75 %, wat een uitstekende reproduceerbaarheid van de maatresultaten aantoont. Elk van de vier replicerende distributies werd bepaald aan de hand van een zeer grote bemonsteringsgrootte van 250.000 korrels, veel meer dan de minimale tellingen (~ 65.000 en ~ 125.000) waarboven de grafische geometrische S.D. (s*) en geometrisch gemiddelde ( ) van de weergegeven differentiële volumegrootteverdeling in één maatvoering niet langer significant veranderen. Daarom waren de vastgestelde volumeverdelingen voor repliceren allemaal statistisch geldig. Voor een betere nauwkeurigheid en vergelijkbaarheid (hieronder besproken) van de specificatie van bepaalde lognormale korrelgrootteverdelingen, werden al deze verdelingen gespecificeerd met behulp van hun grafische geometrische middelen ( ) en S.D. (s*) in een x/ (vermenigvuldigen en delen) s* vorm zoals vermeld in de grafiek. Houd er rekening mee dat de korrelgrootteverdeling van het sweetpotato-zetmeel rigoureus is aangebracht om lognormaal te zijn zoals eerder beschreven28.
Figuur 1: Lognormale differentiële volume-percentage volume-equivalente bolgrootteverdelingen uit replicerende maatanalyses van sweetpotato zetmeelmonsters. Het bemonsteringsschema voor de vier replicerende maatanalyses werd in het resultaat gedetailleerd beschreven. De vier verdelingen (S1a, S1b, S2a en S2b) uit repliceeranalyses en hun gemiddelde werden bedekt en gespecificeerd met behulp van de x/ (vermenigvuldigen en delen) s* vorm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 toont de gemiddelde (of gemiddelde) cumulatieve (<) getal- en volumepercentagegrootteverdelingen van de vier replicerende maatanalyses, die transformatieweergaven waren van de gemiddelde differentiële volumepercentagegrootteverdeling. Uit de vergelijking tussen het cumulatieve aantal en het volumepercentage van zetmeelkorrels bleek dat korrels met kleinere volume-equivalente boldiameters veel grotere percentages van het totale aantal vertegenwoordigden dan het totale volume. Het aantal korrels met volume-equivalent-boldiameters kleiner of gelijk aan 9,976 μm was bijvoorbeeld goed voor 48,53% van het totale aantal, maar slechts 5,854% van het totale volume.
Figuur 2: Gemiddelde cumulatieve (<) aantal- en volumepercentagegrootteverdelingen van zetmeelkorrels uit de vier replicerende maatanalyses van sweetpotato zetmeelmonsters. De twee verdelingen zijn transformatieweergaven van de gemiddelde grootteverdeling in figuur 1. De grafiek vergelijkt het cumulatieve getal (<) (linker Y-as) met volumepercentages (rechter Y-as) van zetmeelkorrels met volume-equivalente bolgrootten lager of gelijk aan bepaalde groottebakken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Diafragmadiameter (μm) | Deeltjesdiameterbereik (μm) | Deeltjesvolumebereik (μm3) |
| 50 | 1.0 - 40 | 0,524 - 33,5 x 103 |
| 70 | 1.4 - 56 | 1.44 - 92.0 x 103 |
| 100 | 2.0 - 80 | 4.19 - 268 x 103 |
Tabel 1: Drie nuttigste diafragmabuizen voor het dimensioneren van korrels zetmeel van gewassoorten.
| SOM-instellingen | Selectie | |
| Beschrijving | SOM beschrijving | Dimensionering Zetmeelkorrels |
| SOM auteur | - | |
| Voorbeeldbeschrijving | Sweetpotato zetmeel monsters | |
| Elektrolyt | 50 g L-1 Lithiumchloride | |
| Dispergeermiddel | Nee | |
| Diafragma | 100 μm | |
| Besturingsmodus | Besturingsmodus | Totaal aantal [250.000] of [125.000]a |
| Afvaltank | Wanneer 80% vol | |
| Instellingen uitvoeren | Voorbeeldgegevens invoeren | Ja |
| Aantal uitvoeringen | 1 (of 2, voor herhalingsruns) | |
| Spoel diafragmabuis vóór het lopen | Ja | |
| Spoel diafragmabuis na run | Ja | |
| Bestand opslaan | Ja, inclusief pulsgegevens | |
| Gegevens exporteren | Ja | |
| Rapport afdrukken | Ja | |
| Vergelijk met voorbeeldspecificaties | Nee | |
| Bekijken | Grootte | |
| Stirrer-instellingen | Monsterbeker | 100 ml Multisizer 4 ST |
| Roerder gebruiken | Ja | |
| Snelheid | [15], CW (qua klok) | |
| Roerstand | Automatisch | |
| Drempel, stroom en versterking | Groottedrempel | 2 μm |
| Diafragmastroom | 1600 mA | |
| Voorversterkerwinst | 2 | |
| Uitgebreid bereik b | Bij telling [> 0,1%] van het totale aantal | |
| Instellingen voor pulse-to-size | Grootte bakken | 400 |
| Groottebereik | 2 tot 60 μm | |
| Opslaglocatieafstand | De diameter van het logboek | |
| Toevalscorrectie | Ja | |
| Puls bewerken | Nee | |
| Concentratie | Steekproefbedrag | 0,2 ml |
| Dichtheid | - | |
| Gebruik preverdunningsfactor | - | |
| Analytisch volume | - | |
| Elektrolytvolume | 100 ml | |
| Verdunningsfactor gebruiken | Nee | |
| Blokkade | Detectie van verstopping | Automatisch (Vanaf het begin van de run) |
| Standaardblokkadedetectie: bij tellingspercentage <20%, Diafragmasnelheid >40% of concentratiepiek >40%. | ||
| Blokkadeactie | Annuleren, deblokkeren en opnieuw opstarten, tot [4] keer | |
| Pictogram Weergeven | Ja | |
| Blokkademonitor | Aantal | |
| a: Als herhaalde deblokkering en herstart de uitvoering met een groter aantal niet konden voltooien, voert u twee herhalingsruns uit met een lager totaal aantal van elk 125.000 van dezelfde zetmeel-elektrolytenophanging en voegt u de resultaten van deherhalingsrunssamen met behulp van [ MergeRuns ] onder [FileTools] van [Bestand] in het hoofdmenu. U ook de zetmeel-elektrolytensuspensie vervangen door een nieuwe met een lagere nominale concentratie (2-5%). Bij het bereiden van een nieuwe druppelmonster zetmeel-elektrolytensuspensie, pulseer-soniceer de zetmeel-methanol suspensie opnieuw om meer aggregaten te breken. | ||
| b: Het uitgebreide groottebereik regelt acties voor korrels groter dan 60% van de diafragmadiameter (100 μm in deze SOM). De instelling specificeert de opname van zetmeelkorrels groter dan 60 μm wanneer hun tellingen groter zijn dan 0,1% van het totale aantal. | ||
Tabel 2: Typische SOM-instellingen voor het regelen van de dimensioneringsruns voor sweetpotato-zetmeelmonsters.
| Voorkeursinstellingen | Selectie | |
| Afgedrukte rapporten | Voorbeeldinformatie | Voorbeeld, uitvoeringsnummer, grootteopslaglocaties, totaal aantal |
| Grootte grafieken | Differentieel volume %, Log X-as, vloeiend per groep van zeven | |
| Groottestatistieken | Volume, Volume % | |
| Gemiddelde statistieken | Totaal bedrag, gemiddelde, S.D. | |
| Overlay statistieken | Totaal bedrag, gemiddelde, S.D. | |
| Aanbieding | Kolommen: Bin Number, Bin Diameter (midden), Diff. Number, Diff. Number %, Diff. Volume %. | |
| Bin Grouping: Bin Group Size 7, All Bins, Sum Bins in Group. | ||
| Statistieken | Type | Geometrischa |
| Bereik | Alle | |
| Resultaten om af te drukken | Bereik, totaal bedrag, gemiddelde, S.D., 95% betrouwbaarheidslimieten | |
| Resultaten op grafiek | Bereik: Alles, Totaal bedrag, Gemiddelde, S.D. | |
| Middeling en Trend | Gemiddelde wegingb | Volume % |
| Distributiec | Differentiële | |
| Grenzen | 2 S.D. | |
| Pulsmiddeling | Pulsen converteren naar groottebereik gebruiken | |
| Exporteren | Gegevensitems | Voorbeeldinformatie, statistieken, gemiddelde statistieken, groottelijst |
| Exportextensie | .xls | |
| Getalnotatie | 123456.78 | |
| Gegevensformaat | Tabblad Afgebakend | |
| Map exporteren | Huidige map | |
| Pagina-instelling | Aangepaste titel opnemen, grafieken afdrukken met schermkleur Inclusief datum | |
| Grafiekgrootte: | Halve pagina | |
| Grafiek, optie | Weergeven: | Scherm en kleurenprinter |
| Lijnkleur | (Standaard) | |
| Lijnstijl | (Standaard) | |
| Legende | Rechtsboven | |
| Grootte | (Standaard) | |
| Grafiekstijl | Stap | |
| Stijl beperken | Curve | |
| Lettertypen en kleuren | Standaardlettertypen en standaardkleuren of naar wens. | |
| Opties weergeven | Standaardweergave | Grootte, Grafiek |
| Grootte X-as | Diameter | |
| Meten | Deeltjes | |
| Het Symbool van de liter | L (ml, μL, fL) | |
| Multisizer pulsgegevens | Grafiek hoogsten 5010 impulsen, Lijst hoogsten 5010 impulsen | |
| Volume-eenheden | μm3 | |
| Cijfers | 123456.78 | |
| a: De hier gespecificeerde geometrische gemiddelde- en S.D.-statistieken zijn grafische statistieken die de schaal en vorm van de bepaalde differentiële volume-percentage equivalente bolgrootteverdeling definiëren. Ze worden gebruikt om de lognormale verdeling op te geven in het formulier x ̅* x/s*. | ||
| b: De gemiddelde weging verwijst naar hoe de resultaten van meerdere runs worden gemiddeld door verschillende wegingsopties. Wijzig deze instellingen in het menu Uitvoeren voor verschillende middelings- en weergaveopties. | ||
| c: Selecteer [Berekenen] om [ Gemiddelde statistieken] te openen in het [Menu Uitvoeren] om de gemiddelde statistieken in rijen te zien, de grafiekstatistieken voor de gemiddelde verdeling in de kolom "Gemiddeld". | ||
Tabel 3: Typische voorkeursinstellingen voor weergave, analyses en afdrukken van resultaten van maatvoeringen voor sweetpotato zetmeelmonsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De geschetste procedure heeft een aantal kritieke problemen opgelost in verschillende bestaande methoden voor zetmeelgranulaatgrootteanalyses, waaronder ongepaste 1D- of 2D-dimensionering van 3D-korrels, vervorming van maatmetingen als gevolg van niet-uniforme korrelvormen, slechte reproduceerbaarheid en dubieuze statistische validiteit als gevolg van beperkte korrelmonstergroottes, onnauwkeurige of onjuiste specificatie (met name het gebruik van de gemiddelde grootte) van korrelgroottes in aanwezigheid van zowel korrelvorm als niet-normale grootteverdelingen. Het maakt gebruik van de ESZ-techniek die 3D-maten (volume) zetmeelkorrels meet en reageert niet op korrelvormen. Het ontwerp om de gemiddelde korrelgrootteverdeling af te leiden uit replicerende analyses met een zeer grote korrelmonstergrootte (4 x 250.000) maakt het resultaat niet alleen statistisch geldig en reproduceerbaarder, maar vermindert ook technisch meetvervormingen door geaggregeerde en beschadigde korrels om de maatnauwkeurigheid te verbeteren (hieronder uitgelegd). Zoals aangetoond in de representatieve resultaten, is het CV voor het gemiddelde van geometrische repliceermiddelen die volgens de procedure worden bepaald, meestal kleiner dan 5%, wat wijst op een bevredigende reproduceerbaarheid van de resultaten. Bovendien geeft de multiplicatieve specificatie van zowel de schaal ( ) als de vorm (s*) van de lognormale korrel volume-equivalente bolgrootteverdeling nauwkeuriger de ware aard weer van gedistribueerde korrelgroottes in een zetmeelmonster, en is eenvoudig te gebruiken en universeel vergelijkbaar onder granulaatgrootteanalyses van zetmeel uit dezelfde of verschillende bronnen. Daarom maakt de procedure een nauwkeurigere, reproduceerbare en statistisch geldige bepaling van zetmeelkorrelgroottes en een juiste specificatie van bepaalde korrellognormale grootteverdelingen mogelijk. Het is van toepassing op alle granulaatgrootteanalyses van zetmeelmonsters op gramschaal en zou een essentieel hulpmiddel kunnen worden voor studies over hoe zetmeelkorrelafmetingen worden gevormd door het zetmeelbiosyntheseapparaat en -mechanismen in plantenzetmeelaccumulerende weefsels, en hoe ze eigenschappen en functionaliteiten van zetmeel voor voedsel en industrieel gebruik beïnvloeden.
Zetmeelkorrels zijn stereodeeltjes met meestal niet-bolvormige vormen, zodat hun maten in 3D-termen moeten worden gedefinieerd en gemeten. Zo bepalen de volumes zetmeelkorrels het best hun maten, en de volume-equivalent-boldiameter is de enige enkele 1D-grootteparameter die kan worden gebruikt om de 3D-grootte van de korrel goed te beschrijven, omdat geen stereoobjecten anders dan bol kunnen worden gedefinieerd met één parameter voor 1D-grootte. Bovendien bezitten zetmeelkorrels van alle plantensoorten een reeks vormen met verschillende frequenties. In aanwezigheid van een dergelijke vormverdeling zijn deeltjesgroottetechnieken die reageren op deeltjesvormen, bijvoorbeeld de laserdiffractietechniek, niet geschikt voor reproduceerbare en statistisch geldige bepaling van de grootteverdeling van zetmeelkorrels, omdat de systeemfout die inherent is aan deze technieken niet gemakkelijk kan worden gecorrigeerd met een vormfactor. In feite kan het foutenpercentage (CV) bij replicerende analyses van korrelgroottes uit hetzelfde sweetpotato-zetmeelmonster met behulp van de laserdiffractietechniek oplopen tot 15-20%28, wat wijst op zeer slecht reproduceerbare maatresultaten. Helaas is de impact van korrelvormen op het dimensioneren van zetmeelkorrels meestal over het hoofd gezien, wat resulteerde in een groot aantal dubieuze gegevens over de grootte van zetmeelkorrels die zijn verkregen met behulp van vormgevoelige deeltjesgroottetechnieken in de literatuur.
De multiplicatieve specificatie met twee parameters definieert zowel de schaal ( ) als de vorm (s*) van lognormale verdelingen, en is tot nu toe veel nauwkeuriger en zinvoller dan een enkele descriptor van gemiddelde grootte of een groottebereik26. De multiplicatieve x/ s*, x/ (s*)2, en x/ (s*)3 intervallen, overeenkomend met 
± s, ± 2s, en ± 3s intervallen van een normale verdeling, beslaat ongeveer 68,3%, 95,5% en 99,7% betrouwbaarheidsintervallen van een lognormale verdeling, respectievelijk27. Het geometrische gemiddelde ( ) en S.D. ( s* ) van een lognormale korrelgrootteverdeling komen overeen met het grafische geometrische gemiddelde en de S.D. van de grootteverdelingscurve, die worden berekend door de analyzersoftware en kunnen worden geselecteerd om weer te geven op de grafiek op schermgrootte tijdens een dimensioneringsrun of analyses van resultaten. Het is daarom nogal handig en eenvoudig om de multiplicatieve specificatie te gebruiken. Bovendien is aangetoond dat de and s* verschillende fysiologische implicaties hebben die verband houden met het zetmeelbiosyntheseapparaat28. De volumegrote verdelingen van zetmeel van verschillende plantensoorten kunnen allemaal lognormaal zijn, omdat de vorming van zetmeelkorrels in plantzetmeelaccumulerende weefsels valt in een ongeremd evoluerend complex systeem31 of een intracellulair katalytisch reactienetwerk32 dat kenmerkend is voor een lognormale distributie. De bimodale korrelgrootteverdelingen van zetmeel van sommige plantensoorten, zoals die van tarwe13,14, kunnen worden beschouwd als twee lognormale distributies. Daarom kan de multiplicatieve specificatie van korrellognormale volume-equivalente bolgrootteverdelingen ook een statistisch geldige universele vergelijking mogelijk maken van korrelgroottes die worden bepaald aan de hand van zetmeel van verschillende plantaardige bronnen en door verschillende metingen, aangezien deze in de vorm van volume-equivalent-boldiameter en s* demensieloos is.
Een passend totaal aantal korrelgroottes voor de analyse van een zetmeelmonster (in methanol), dat de grootte van het korrelmonster vertegenwoordigt, is het meest van cruciaal belang voor een succesvolle bepaling van de korrelgrootteverdeling van statistische significantie voor het zetmeelmonster. In het geval van sweetpotato-zetmeelmonsters verandert het grafische geometrische S.D. ( s*) en geometrische gemiddelde ( ) van de weergegeven differentiële volumegrootteverdelingscurve niet langer significant, wat wijst op minimale tellingen voor de s* en van statistische significantie. De bemonsteringsredundantie bij het dimensioneren van 250.000 korrels voor een zetmeelmethanolmonster in de procedure is bedoeld om de geaggregeerde en beschadigde korrels in de korrelpool van het formaat te verdisconteren. Zelfs ervan uitgaande dat de geaggregeerde en beschadigde of gebroken korrels 50% van het totale aantal van 250.000 korrels in een voltooide uitvoering of twee samengevoegde herhalingsruns voor hun rekening nemen, zouden de grafische geometrische S.D. en het gemiddelde van de vastgestelde verdeling niet significant zijn beïnvloed, omdat ze zouden zijn verankerd door de intacte korrels van de helft van het totale aantal. Bovendien, hoe meer volumegrootte reductie van de beschadigde of gebroken korrels, hoe minder impact ze hebben op de distributie. Dit komt omdat kleinere korrels een groter getalpercentage hebben, maar kleinere volumepercentages van de totale groottekorrels. Zoals blijkt uit de vergelijking tussen de cumulatieve verdelingen van het aantal en het volume voor dezelfde gemiddelde verdeling in figuur 2,waren zetmeelkorrels met een diameter van een gelijkwaardige bol kleiner dan of gelijk aan 9,967 μm goed voor ongeveer 48,53% van het totale aantal, maar slechts 5,854% van het totale volume. Zo zouden beschadigde of afgebroken korrels van minder dan 10 μm een zeer kleine invloed hebben op de verdeling van het differentiële volumepercentage. Voor zetmeelmonsters van andere plantenbronnen kan een passend totaalaantal voor hun maatanalyses degene zijn die het minimale aantal verdubbelt waarover het grafische geometrische gemiddelde ( ) van de weergegeven grootteverdeling in een proefrun niet langer significant verandert.
Technisch gezien is de meest kritieke stap voor een dimensioneringsrun het laten vallen van een juiste hoeveelheid van de zetmeel-methanol suspensie naar het elektrolyt voor een optimaal bereik van 5 tot 8% nominale concentratie voor de zetmeel-elektrolytensuspensie. Om het doel te bereiken, moeten de druppelgrootte en de concentratie van de zetmeel-methanolsuspensie mogelijk worden aangepast door middel van proefritten. Concentraties van de zetmeel-elektrolyten suspensies hoger dan het optimale bereik verhogen de risico's van verminderde maatprecisie en frequente diafragmablokkades die leiden tot abortussen, wat het erg moeilijk kan maken om een run te voltooien. Maar een te lage concentratie (bijv. <2%) van de zetmeel-elektrolytensuspensie kan een run te veel verlengen en de frequenties van korrels in verschillende groottebakken verstoren als gevolg van niet-willekeurige bemonstering van korrels, wat kan leiden tot een onaanvaardbaar foutenpercentage (het gemiddelde CV > 5%) voor een repliceeranalyse. Het totale aantal voor een dimensioneringsrun heeft ook een grote invloed op de optimale concentratie van een zetmeel-elektrolytensuspensie, vandaar op de hoeveelheid en concentratie van de toegevoegde zetmeelmethanol. Hoe groter het totale aantal voor een run, hoe langer de tijd voor de voltooiing van de run, en dus hoe meer risico's voor diafragmablokkades die leiden tot abortussen. Het probleem van diafragmablokkade door aggregaten verergert wanneer diafragmabuizen met kleinere diameters worden gebruikt voor zetmeelkorrels van kleinere grootte, waardoor het erg moeilijk is om kleine zetmeelkorrels (< 2 μm) te analyseren. Dit is inderdaad het grootste nadeel of beperking van de procedure. Het probleem van de diafragmablokkade zou tot op zekere hoogte met behulp van enkele technische middelen kunnen worden verlicht. Men kan meer sonicatie gebruiken om aggregaten (onvermijdelijk ook meer beschadigde korrels) te breken in een zetmeel-methanolsuspensie en/of een verdunde zetmeel-elektrolytensuspensie bij 2-5% nominale concentraties. Als alternatief kan men technische herhalingsruns gebruiken om het minimale totale aantal voor stabiele s* en van de grootteverdelingen voor een zetmeeltype (bijv. ongeveer 125.0000 tellingen voor sweetpotato-zetmeel) uit dezelfde zetmeel-elektrolytensuspensie te dimensioneren en de resultaten van de herhalingsruns samen te voegen. Elk van de vier replicerende distributies (S1a, S1b, S2a en S2b) in figuur 1 was afkomstig van twee samengevoegde technische herhalingsruns van elk 125.000 korrels van dezelfde zetmeel-elektrolytenophanging. Beide methoden moeten goed worden getest, omdat ze het replicatiefoutpercentage tot een onaanvaardbaar niveau kunnen verhogen (d.w.z. het gemiddelde CV > 5%).
Technische en biologische repliceringsanalyses van zetmeelmonsters uit plantaardige bronnen onder vergelijkbare fysiologische omstandigheden verbeteren de reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid van de vastgestelde gemiddelde korrelgrootteverdeling. Praktisch gezien kunnen drie of vier biologische duplo's van zetmeelmonsters onder een specifieke aandoening onafhankelijk uit hetzelfde weefsel worden geëxtraheerd. Maar we ontdekten eerder dat er geen significant verschil was in foutenpercentages (CV- en standaardfouten voor het gemiddelde), en s* tussen de gemiddelde korrelgrootteverdeling afgeleid van distributies van vier biologische repliceren (d.w.z. één maat x één suspensie x 4 extracten) en die van twee technische bemonstering elk uit twee biologische repliceringen (d.w.z. één maat x 2 zetmeel-methanolsuspenspensies x 2 extracten)28. Zo kunnen biologische repliceermonsters worden teruggebracht tot twee, althans voor het sweetpotato-zetmeel. Andere stappen en technische parameters die konden worden gewijzigd of aangepast, werden specifiek genoteerd onder elk van de stappen of de specifieke parameter in de procedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
Dit werk wordt deels ondersteund door het Cooperative Agriculture Research Center en Integrated Food Security Research Center van het College of Agriculture and Human Sciences, Prairie View A&M University. We danken Hua Tian voor zijn technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytical beaker | Beckman Coulter Life Sciences | A35595 | Smart-Technology (ST) beaker |
| Aperture tube, 100 µm | Beckman Coulter Life Sciences | A36394 | For the MS4E |
| Disposable transfer pipettor, | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 13-711-9AM | Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used. |
| Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 05-539-13 | Any other similar types of tubes can be used. |
| Glass beakers, 150 to 250 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 02-540K | These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirrer between runs. |
| LiCl | Fisher Chemical | L121-100 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A412-500 | Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol. |
| Mettler Toledo ML-T Precision Balances | Mettler Toledo | 30243412 | Any other precision balance with a readability 0.01 g to 1 mg will work. |
| Multisizer 4e Coulter Counter | Beckman Coulter Life Sciences | B23005 | The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company. |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | Other laboratory sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension. |
References
- Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Starch:Chemistry and Technology Food Science and Technology. BeMiller, J., Whistler, R. , Academic Press. Ch. 3 23-82 (2009).
- Singh, N., Singh, J., Kaur, L., Singh Sodhi, N., Singh Gill, B. Morphological, thermal and rheological properties of starches from different botanical sources. Food Chemistry. 81 (2), 219-231 (2003).
- Lindeboom, N., Chang, P. R., Tyler, R. T. Analytical, biochemical and physicochemical aspects of starch granule size, with emphasis on small granule starches: a review. Starch - Stärke. 56 (34), 89-99 (2004).
- Baldwin, P. M., Davies, M. C., Melia, C. D. Starch granule surface imaging using low-voltage scanning electron microscopy and atomic force microscopy. International Journal of Biological Macromolecules. 21 (1-2), 103-107 (1997).
- Jane, J. L., Kasemsuwan, T., Leas, S., Zobel, H., Robyt, J. F. Anthology of starch granule morphology by scanning electron microscopy. Starch-Stärke. 46 (4), 121-129 (1994).
- Matsushima, R. Starch: Metabolism and Structure. Nakamura, Y. , Ch. 13 425-441 (2015).
- Wang, S. -q, Wanf, L. -l, Fan, W. -h, Cao, H., Cao, B. -s Morphological analysis of common edible starch granules by scanning electron microscopy. Food Science. 32 (15), 74-79 (2011).
- Baldwin, P. M., Adler, J., Davies, M. C., Melia, C. D. Holes in starch granules: confocal, SEM and light microscopy studies of starch granule structure. Starch-Stärke. 46 (9), 341-346 (1994).
- Chakraborty, I., Pallen, S., Shetty, Y., Roy, N., Mazumder, N. Advanced microscopy techniques for revealing molecular structure of starch granules. Biophysical Reviews. 12 (1), 105-122 (2020).
- Bechtel, D. B., Wilson, J. D. Amyloplast formation and starch granule development in hard red winter wheat. Cereal Chemistry. 80 (2), 175-183 (2003).
- Evers, A. Scanning electron microscopy of wheat starch. III. Granule development in the endosperm. Starch-Stärke. 23 (5), 157-162 (1971).
- Wang, Y. J., White, P., Pollak, L., Jane, J. L. Characterization of starch structures of 17 maize endosperm mutant genotypes with Oh43 inbred line background. Cereal Chemistry. 70, 171-179 (1993).
- Peng, M., Gao, M., Abdel-Aal, E. S. M., Hucl, P., Chibbar, R. N. Separation and characterization of A-and B-type starch granules in wheat endosperm. Cereal Chemistry. 76, 375-379 (1999).
- Wilson, J. D., Bechtel, D. B., Todd, T. C., Seib, P. A. Measurement of wheat starch granule size distribution using image analysis and laser diffraction technology. Cereal Chemistry. 83 (3), 259-268 (2006).
- Liu, Q., Weber, E., Currie, V., Yada, R. Physicochemical properties of starches during potato growth. Carbohydrate Polymers. 51 (2), 213-221 (2003).
- Chmelik, J., et al. Comparison of size characterization of barley starch granules determined by electron and optical microscopy, low angle laser light scattering and gravitational field-flow fractionation. Journal of the Institute of Brewing. 107 (1), 11-17 (2001).
- Moon, M. H., Giddings, J. C. Rapid separation and measurement of particle size distribution of starch granules by sedimentation/steric field-flow fractionation. Journal of Food Science. 58 (5), 1166-1171 (1993).
- Wriedt, T. The Mie Theory: Basics and Applications. Wolfram, H., Wriedt, T. , Springer. Berlin Heidelberg. 53-71 (2012).
- Schuerman, D. W., Wang, R. T., Gustafson, B. ÅS., Schaefer, R. W. Systematic studies of light scattering. 1: Particle shape. Applied Optics. 20 (23), 4039-4050 (1981).
- Goering, K. J., Fritts, D. H., Eslick, R. F. A study of starch granule size and distribution in 29 barley varieties. Starch-Stärke. 25 (9), 297-302 (1973).
- Chen, Z., Schols, H. A., Voragen, A. G. J. Starch granule size strongly determines starch noodle processing and noodle quality. Journal of Food Sciences. 68 (5), 1584-1589 (2003).
- Dai, Z. M. Starch granule size distribution in grains at different positions on the spike of wheat (Triticum aestivum L.). Starch-Starke. 61 (10), 582-589 (2009).
- Edwards, M. A., Osborne, B. G., Henry, R. J. Effect of endosperm starch granule size distribution on milling yield in hard wheat. Journal of Cereal Science. 48 (1), 180-192 (2008).
- Karlsson, R., Olered, R., Eliasson, A. C. Changes in starch granule size distribution and starch gelatinization properties during development and maturation of wheat, barley and rye. Starch - Starke. 35 (10), 335-340 (1983).
- Li, W. -Y., et al. Comparison of starch granule size distribution between hard and soft wheat cultivars in Eastern China. Agricultural Sciences China. 7 (8), 907-914 (2008).
- Park, S. H., Wilson, J. D., Seabourn, B. W. Starch granule size distribution of hard red winter and hard red spring wheat: Its effects on mixing and breadmaking quality. Journal of Cereal Science. 49 (1), 98-105 (2009).
- Limpert, E., Stahel, W. A., Abbt, M. Log-normal distributions across the sciences: keys and clues. Bioscience. 51 (5), 341-352 (2001).
- Gao, M., et al. Self-preserving lognormal volume-size distributions of starch granules in developing sweetpotatoes and modulation of their scale parameters by a starch synthase II (SSII). Acta Physiologiae Plantarum. 38 (11), 259 (2016).
- Wattebled, F., et al. STA11, a Chlamydomonas reinhardtii locus required for normal starch granule biogenesis, encodes disproportionating enzyme. Further evidence for a function of alpha-1,4 glucanotransferases during starch granule biosynthesis in green algae. Plant Physiology. 132 (1), 137-145 (2003).
- Ji, Y., Seetharaman, K., White, P. J. Optimizing a Small-Scale Corn-Starch Extraction Method for Use in the Laboratory. Cereal Chemistry. 81 (1), 55-58 (2004).
- Halloy, S., Whigham, P. The lognormal as universal descriptor of unconstrained complex systems: a unifying theory for complexity. Proceedings of the 7th Asia-Pacific Complex Systems Conference. , QLD. Australia. 309-320 (2004).
- Furusawa, C., Suzuki, T., Kashiwagi, A., Yomo, T., Kaneko, K. Ubiquity of log-normal distributions in intra-cellular reaction dynamics. Biophysics (Nagoya-shi). 1, 25-31 (2005).
