Summary
Presenteras här är ett förfarande för reproducerbara och statistiskt giltiga bestämningar av stärkelse granulat storlek fördelningar, och för att specificera de bestämda granulat lognormal storlek fördelningar med hjälp av en två-parameter multiplikativ form. Det är tillämpligt på alla granulat storleksanalyser av gram-skala stärkelseprover för växt- och livsmedelsvetenskaplig forskning.
Abstract
Stärkelse från alla växtkällor består av granulat i en rad olika storlekar och former med olika förekomstfrekvenser,dvs. Stärkelsegranulatstorleksdata som bestäms med hjälp av flera typer av partikelstorlekstekniker är ofta problematiska på grund av dålig reproducerbarhet eller brist på statistisk signifikans till följd av vissa oöverstigliga systematiska fel, inklusive känslighet för granulatformer och gränser för granulatprovstorlekar. Vi skisserade ett förfarande för reproducerbara och statistiskt giltiga bestämningar av stärkelse granulat storlek distributioner med hjälp av elektrisk avkänning zon teknik, och för att specificera de bestämda granulat lognormal storlek fördelningar med hjälp av en antagen två-parameter multiplikativ form med förbättrad noggrannhet och jämförbarhet. Det är tillämpligt på alla granulatstorleksanalyser av gramskalsstärkelseprover och kan därför underlätta studier av hur stärkelsegranulatstorlekar formas av stärkelsebiosyntesapparaten och mekanismerna. och hur de påverkar egenskaper och funktionalitet hos stärkelse för mat och industriell användning. Representativa resultat presenteras från replikatanalyser av granulat storlek distributioner av sweetpotato stärkelse prover med hjälp av det skisserade förfarandet. Vi diskuterade vidare flera viktiga tekniska aspekter av förfarandet, särskilt multiplikativ specifikation av granulat lognormal storlek distributioner och vissa tekniska medel för att övervinna täta bländare blockering av granulat aggregat.
Introduction
Stärkelsegranulat är den fysiska struktur där två huvudreservhomoglukanpolymerer i växtfotosyntes och lagringsvävnader, den linjära eller glest förgrenade amylosen och det mycket förgrenade amylopectinet, packas ordnat tillsammans med några mindre komponenter, inklusive lipider och proteiner. Stärkelsegranulat från olika växtarter uppvisar många tredimensionella (3D) former (granskade i ref.1,2), inklusive sfärer, ellipsoider, polyhedroner, trombocyter, kuber, kuber och oregelbundna tubuler. Även de från samma vävnad eller olika vävnader av samma växtart kan ha en uppsättning former med varierande förekomstfrekvenser. Med andra ord kan stärkelsegranulat från en växtart ha en karakteristisk statistisk formfördelning snarare än en specifik form. De icke-enhetliga och icke-sfäriska granulatformerna gör det svårt att korrekt mäta och definiera stärkelsegranulatstorlekar. Dessutom är stärkelsegranulat från samma vävnader av en växtart av en rad storlekar med olika proportioner, dvs. Denna storleksfördelning komplicerar ytterligare analysen och beskrivningen av stärkelsegranulatstorlekar.
Stärkelsegranulatstorlekar har analyserats med hjälp av flera kategorier av partikelstorlekstekniker (granskade i ref.3), inklusive mikroskopi, sedimentering/sterisk fältflödesfraktion (Sd/StFFF), laserdiffraktion och elektrisk avkänningszon (ESZ). Dessa tekniker är dock inte lika lämpade för bestämning av stärkelsegranulatstorlekar i närvaro av en granulatform och en storleksfördelning. Mikroskopi, inklusive ljus, konfokal och scanning elektronmikroskopi, är utmärkt för studier av morfologi4,5,6,7,struktur8,9 och utveckling10,11 av stärkelsegranulat, men knappast lämpad för att definiera deras storleksfördelningar på grund av några inneboende brister. Direkta mätningar av mikroskopiska granulatbilder eller programvaruassisterad bildanalys av optiska mikroskopidata (IAOM), som har använts för bestämning av granulatstorlekar av stärkelse från flera arter. inklusive majs12,vete 13,14,potatis 15 och korn16, kan mäta endast 1D (vanligtvis maximal längd) eller 2D (yta) storlekar av mycket begränsat antal (tiotusentals till några tusen) stärkelse granulat bilder. De små granulatprovtagningsstorlekarna som i sig begränsas av teknikerna kan sällan vara statistiskt representativa, med tanke på de enorma granulattalen per enhetsvikt av stärkelse (~ 120 x 106 per gram, förutsatt att alla 10 μm sfärer vid 1,5 g / cm³ densitet), och därför kan leda till den dåliga reproducerbarheten av resultaten. Sd/StFFF-tekniken kan ha hög hastighet och upplösning, och smala storleksfraktioner av stärkelsegranulat17, men har sällan använts förmodligen för att dess noggrannhet kan påverkas allvarligt av skador, olika former och densitet av stärkelsegranulat. Laserdiffraktionstekniken är den mest använda, och har tillämpats för stärkelsegranulatstorleksanalyser för alla större växtarter3,14,16. Även om tekniken har många fördelar, är den faktiskt inte lämplig för bestämningar av stärkelsegranulatstorlekar i närvaro av en granulatformfördelning. De flesta av de samtidiga laserdiffraktionsinstrumenten förlitar sig på Mie ljusspridningsteori18 för enhetliga sfäriska partiklar och den modifierade Mie-teorin18 för några andra former av enhetlighet. Tekniken är därför i sig mycket känslig för partikelformer, och inte helt lämpad även för vissa former av enhetlighet19, än mindre för stärkelsegranulat med en uppsättning former av varierande proportioner. ESZ-tekniken mäter den elektriska fältstörningen proportionell mot volymen av partikeln som passerar genom en bländare. Den ger granulatvolymstorlekar, liksom nummer- och volymfördelningsinformation etc., med hög upplösning. Eftersom ESZ-tekniken är oberoende av eventuella optiska egenskaper hos partiklar inklusive färg, form, komposition eller brytningsindex, och resultaten är mycket reproducerbara, är den särskilt lämplig för att bestämma storleksfördelningar av stärkelsegranulat med en uppsättning former.
Stärkelsegranulatstorlekar har också definierats med hjälp av många parametrar. De beskrevs ofta förenklat av genomsnittliga diametrar, som i vissa fall var de aritmetiska sätten för de mikroskopiskt uppmätta maximala längderna på 2D-bilder12,20, eller medelvärden av motsvarande sfärdiametrar3. I andra fall specificerades granulatstorleksfördelningarna med storleksintervallen21,22, fördelningens medelvolym eller medeldiameter (sfärekvivalenter, viktade efter antal, volym eller yta) förutsatt en normal fördelning14,23,24,25,26. Dessa deskriptorer av stärkelsegranulatstorlekar från olika analyser är av en helt annan natur och inte strikt jämförbara. Det kan vara mycket vilseledande om dessa "storlekar" av stärkelsegranulat från olika arter eller till och med samma vävnader av samma art jämfördes direkt. Dessutom har parametern spread (eller form) för de förmodade normala fördelningar, dvs. standardavvikelsen σ (eller den grafiska standardavvikelsen σg)som mäter fördelningens bredd (dvs. storleksspridningen), ignorerats i de flesta studier.
För att lösa de ovannämnda kritiska problem som stärkelse granulat storlek analyser, skisserade vi ett förfarande för reproducerbara och statistiskt giltiga bestämningar av granulat storlek distributioner av stärkelse prover med hjälp av ESZ tekniken, och för korrekt specificera den bestämda granulat lognormal storlek distributioner med hjälp av en antagen två-parameter multiplikativ form27 med förbättrad noggrannhet och jämförbarhet. För validering och demonstration utförde vi replikerade granulatstorleksanalyser av sweetpotato stärkelseprover med hjälp av proceduren, och specificerade lognormala differentialvolym-procent volym-ekvivalenter-sfärdiameterfördelningar med hjälp av deras grafiska geometriska 
medel och multiplikativa standardavvikelser s* i en x/ (multiplicera och dela) s* form.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av stärkelseprover
- Bered två (eller tre) gram-skala replikera stärkelseprover från stärkelseackumulerande vävnader av olika växtarter enligt de fastställdaförfarandena (t.ex. potatis 15, sweetpotatoes28,vetekorn 13,29och majskärnor30,etc.).
- Tvätta stärkelseprover noggrant med aceton eller toluen 3-4x för att minimera granulataggregat och torka dem helt.
OBS: Använd extraktionsförfaranden som ger mer än 1 g stärkelse per beredning. En eller två 0,5-g alikvoter från var och en av de tre eller två replikatextrakten provtas för granulatstorleksanalys av ett stärkelseextrakt.
2. Elektrolytberedning
- Förbered 500 ml litiumklorid 50 g/L i metanol för fyra storlekskörningar för replikeringsstärkelseprover (100 ml per körning plus ytterligare 100 ml). Gör helst elektrolyten i stora partier, t.ex. 4 till 8 L åt gången, för att minimera koncentrationsvariationen.
- Kyl behållaren på is eller i ett 4 °C skåp för att påskynda upplösningen av litiumkloriden.
3. Ställa in analysatorn
- Välj ett bländarrör med ett partikeldiameterområde som täcker det kända (i litteraturen eller genom försökskörningar) granulatstorleksintervall för stärkelseprover som ska analyseras, t.ex. För stärkelseprover av okänd granulatstorlek väljer du en lämplig bländare genom försökskörningar med hjälp av flera bländarrör med överlappande partikeldiameterintervall.
OBS: Partikeldiameterområdet för ett bländarrör är dess exakta storleksområde mellan 2 och 60% av, och med ett utökat storleksområde till 80% av dess öppning diameter. Tabell 1 listar egenskaper hos tre mest användbara bländarrör för att storleksdimensionera granulat av större gröda stärkelse. Om ett stärkelseprovs granulatstorleksområde är bredare än storleksintervallet för ett enda bländarrör, utför du en flerrörs överlappningsanalys som kombinerar upp till fem partikelstorleksfördelningar mätta med bländare av olika storlekar. Varje bländare kan identifieras med sin diameter och sitt artikelnummer märkt på röret. Dess diameter och serienummer i en streckkod på röret kan skannas in i analysatorns programvara med hjälp av streckkodsläsaren på analysatorns kontrollpanel. - Välj en 100 eller 200 ml analytisk bägare (över cuvettes) för bestämning av stärkelsegranulatstorlekar och ställ in automatisk omrörning (nedan) för att bibehålla en bra granulatupphängning under mätningen.
- Skapa en standardoperativmetod (SOM) för att ange körinställningar och en inställningsfil för analys, visning och utskrift av resultaten. Kombinera SOM- och inställningsfilen till en standardoperativprocedur (SOP) efter behov.
OBS: För icke-standardiserbara analyser, använd SOM för att köra analyserna och justera SOM-inställningarna mellan körningar genom fönstret Redigera SOM (se nedan) efter behov. När körningen är klar analyserar, visar och skriver du ut körningsresultaten genom att ändra inställningarna efter behov. För standardiserbara granulatstorleksanalyser använder du en SOP för att köra analyserna.- Starta analysprogrammet. Klicka på SOP-| på Huvudmanu. Skapa SOM-guiden eller Redigera SOM, eller klicka på Redigera SOM på statuspanelen. Använd guiden eller fönstret Redigera SOM för att välja inställningar för en SOM. Inställningar som vanligtvis används för att ändra granulat av sweetpotato stärkelseprover sammanfattas i tabell 2.
- Spara den skapade SOM i en fil i fönstret SOM-guidesammanfattning av inställningar eller i fönstret Redigera SOM.
- Klicka på SOP-| på huvudmanu Guiden Skapa inställningar eller Redigera inställningar. Använd guiden eller flikarna i redigeringsfönstret Inställningar för att välja inställningsinställningar som de i tabell 3 eller andra efter önskemål.
- Spara de markerade inställningarna i en fil i fönstret Skapa inställningar-Sammanfattning av inställningar eller i fönstret Redigeringsinställningar.
- Klicka på SOP-| på huvudmenyn Skapa SOP-guiden. Efter guidens steg-för-steg-guide anger du en beskrivning, väljer filen SOM och Inställningar för att skapa och spara en SOP.
4. Granulat storleksanalyser av stärkelseproverna
- Förbered analysatorn
- Slå på analysatorn, öppna programvaran i datorn och verifiera ready-statusen högst upp på statuspanelen efter dess automatiska anslutning till analysatorn.
- Fyll elektrolytburken med elektrolyt, töm avfallsburken om det behövs.
- Installera och säkra det valda bländarröret på rätt sätt enligt bruksanvisningen. För ett okalibrerat nytt bländarrör kalibrerar du det enligt steg-för-steg-guiden under Kalibrerings-| Kalibrera bländaren på huvudmenyn. För ett kalibrerat bländarrör, kontrollera kalibreringen enligt steg-för-steg-guiden i guiden Byt bländare under run- eller kalibreringsguiden | Kontrollera bländarkalibreringen på huvudmenyn.
- Lås upp analysplattformen genom att trycka på låsfrisättningsklämman (på mitten av den vänstra provrumsväggen) och manuellt sänka plattformen till botten. Placera en analytisk bägare som innehåller 100 ml elektrolyt på plattformen, flytta omröraren till omrörningsläget och lyft manuellt plattformen till det självlåsande övre läget för att sänka bländarröret och omröraren i elektrolyten.
- Klicka på Fyll i det nedre instrumentverktygsfältet om du vill att analysatorn automatiskt ska fylla systemet med elektrolyten och klicka på Spola för att få analysatorn automatiskt att spola systemet.
- Läs in SOM genom att klicka på SOP | Ladda en SOM påhuvudmenyn och använd SOM för att köra en analys utan en inställningsfil. Du kan också läsa in en SOP genom att klicka på SOP | Läs in en SOP på huvudmenyn eller läs in SOP på statuspanelen och använd SOP för att köra en analys.
- Om du använder en SOP klickar du på SOP | SOM Info eller Inställningsinformation på huvudmenyn för att verifiera inställningarna FÖR SOM och Inställningar. Klicka på Exempel | Ange exempelinformation på huvudmenyn eller Redigera information på statuspanelen för att ange exempelinformationen för körningen.
- Bered stärkelse-metanolprov och storleksupphängningar
- Väg två eller ett prov på 0,5 g från vart och ett av de två respektive tre replikerade stärkelseextrakten.
- Tillsätt var och en av de 0,5 g stärkelse alikvoterna till 5 ml metanol i ett 50 ml koniskt centrifugeringsrör och sprid helt stärkelsegranulat med hjälp av flera pulser av lågintensiv ultraljud (12–24 W/cm2)från en ultraljudsprocessor.
- Använd en engångsöverföringspipett och applicera en liten droppe av stärkelse-metanolupphängningen (~ 0,2 ml) på 100 ml 50 g/L LiCl metanolelektrolyt under konstant omrörning i bägaren. Stäng provluckan.
- Utföra en storleksändringskörning
- Klicka på Förhandsgranska i det nedre instrumentverktygsfältet om du vill starta en förhandsgranskningskörning. På statuspanelen kontrollerar du att den dynamiskt visade koncentrationsstången är grön och visar ett nominellt koncentrationsområde på 5 till 8 % för suspensionen.
- Klicka på Stoppa i det nedre verktygsfältet för att stoppa förhandsgranskningskörningen. Späd vid behov stärkelse-elektrolytupphängningen genom att ersätta en alikvot av suspensionen med elektrolyten och upprepa sedan en förhandsgranskningskörning.
OBS: Suspensionens nominella koncentrationsområde på 5% till 8% är avgörande för att slutföra en körning utan stopp på grund av bländarblockering av aggregerade granulat. Vid behov justera droppprovets storlek och/eller koncentrationen av stärkelse-metanolupphängningen för att göra en ny stärkelseelektrolytfjädring med den nominella koncentrationen i det optimala intervallet. - Efter verifieringen klickar du på Starta i det nedre verktygsfältet för att starta körningen. Analysatorn slutför automatiskt körningen när det totala antalet storleksgranulat, som visas tillsammans med körningstiden på statuspanelen i en körning, når det inställda totala antalet (125 000 eller 250 000) av SOM:s kontrollläge. Beroende på suspensionskoncentrationen (inom 5-8% intervall eller lägre) tar en enda körning 2 till 5 min eller mer.
OBS: När analysatorn automatiskt upptäcker en bländarblockering per blockeringsdetekteringsinställningar för SOM, avbryter den körningen, spolar för att avblockera bländaren och startar en ny körning. Den här blockeringsåtgärden är inställd på att upprepas maximalt fyra gånger innan analysatorn avbryter körnings åtgärden. Det här problem med att köra blockering kan lösas med hjälp av två tekniska metoder som anges i tabell 2 och beskrivs i diskussionen. - Vid behov utför du en teknisk upprepningskörning (se tabell 2 och detaljerad i Diskussion) med samma stärkelseelektrolytupphängning genom att helt enkelt klicka på Start eller Upprepa i det nedre verktygsfältet.
- Efter avslutad körning eller upprepning, töm bägaren, skölj den med metanol och fyll på den med 100 ml färsk elektrolytlösning för nästa körning.
- Om en meddelandedialogruta för utökat storleksintervall visas under en körning när antalet granulat som är större än 60 μm överstiger 0,1 % av det totala antalet (enligt SOM-inställningen) klickar du på Kör 60 % till 80 % för att köra ett utökat dynamiskt storleksområde till 80 % av bländardiametern.
OBS: Inställningen för utökat storleksområde styr åtgärder för granulat som är större än 60 % av bländardiametern (100 μm, i detta fall). Inställningen i SOM anger införandet av stärkelsegranulat större än 60 μm när deras antal når över 0,1% av det totala antalet. Slutförandet av körningen styrs fortfarande av det totala antalet och kan ta något mindre tid än annars utan att inkludera de större granulerna som uppgår till mindre än 0,1% (förmodat statiskt obetydlig mängd) av det totala antalet.
- Analysera körningsresultaten
- Om en SOM användes för att styra körningarna väljer du Inställningar som önskat för visning, utskrift och statistiska analyser av resultaten med guiden Skapa inställningar eller Redigeringsinställningar under SOP på huvudmenyn.
- Överläggsresultat från flera körningar i ett enda diagram för jämförelse.
- Klicka på Överlägg i huvudverktygsfältet eller | Överlägg på huvudmenyn för att komma åt fönstret Överlägg. Navigera till och markera flera önskade resultatfiler i rutan Filer, klicka på Lägg till för att flytta dem till rutan Markerade filer och klicka på OK för att överlagra de markerade resultaten i ett enda diagram.
- Om du vill lägga till en fil i ett öppet överlägg klickar du på RunFile | Öppna för överlägg på menyn Kör för att komma åt fönstret Överlägg, navigera till önskad fil och klicka för att lägga till.
- Genomsnittliga resultat från replikerade analyser (2 extrakt x 2 stärkelseprovtagning eller 3 extrakt x 1 stärkelseprovtagning) och visa eller skriva ut den genomsnittliga granulatstorleksfördelningen och statistiken i en lista eller ett diagram.
- Klicka på File | FileTool på huvudmenyn | Medelvärde för att öppna fönstret Medelvärde. Navigera till och markera flera önskade resultatfiler i rutan Filer, klicka på Lägg till för att flytta dem till rutan Markerade filer och klicka på OK för att medelmåtta de markerade resultaten och visa medelvärdet i ett enda diagram.
- Om du vill inkludera ytterligare en resultatfil i en genomsnittlig distribution klickar du på RunFile | Öppna och Lägg till i genomsnitt på Kör-menyn för att öppna fönstret Lägg till i genomsnitt, navigera till och lägga till filen. Det nya medelvärdet visas i diagrammet i fönstret Kör (resultat) eller listan.
5. Ange den genomsnittliga fördelningen
- I fönstret Körmeny som visar den genomsnittliga fördelningen klickar du på Beräkna | Genomsnittlig statistik på menyn Kör för att öppna statistiksammanfattningsfönstret, som visar genomsnittlig statistik i rader, och diagramstatistiken för den genomsnittliga fördelningen i kolumnerna.
- Använd det grafiska geometriska medelvärdet (
) och S.D. (s*) i diagramstatistikkolumnen för att ange den genomsnittliga fördelningen i x/ s* -formuläret. Beräkna CV-mätvariationerna mellan de genomsnittliga replikationsfördelningarna genom att dividera medelvärdet (μ, samma som den genomsnittliga fördelningen) för de geometriska metoderna för de genomsnittliga fördelningar med den genomsnittliga S.D. (σ) som anges på den genomsnittliga statistikraden.
OBS: Den genomsnittliga S.D. (för μ) som bedömer variationer mellan medel för replikationsfördelningarna skiljer sig från den grafiska geometriska S.D. (för) som mäter spridningen av den genomsnittliga fördelningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att validera proceduren och visa reproducerbarhet av den bestämda granulat storleksfördelningen utförde vi replikat storleksanalyser av sweetpotato stärkelse prover. Vi beredde replikat (S1 och S2) stärkelseprover från fältodlade sweetpotatoes av en avelslinje SC1149-19 vid en liknande utvecklingsålder med hjälp av ett tidigare beskrivetförfarande 28. Från varje stärkelse extrakt, två 0,5 g aliquots (a och b) provtogs, suspenderas i 5 mL metanol och ultraljud med flera pulser av lågenergi ultraljud att bryta upp aggregat. Var och en av de två paren av stärkelse-metanol suspensioner var drop-sampled för att göra en stärkelse-elektrolyt suspension, som sedan storleksanpassades två gånger (tekniska repetitionskörningar) med hjälp av ovanstående skisserade SOM för totalt antal 125 000 granulat vardera. För varje enskild storleks körning, när det totala antalet når över ~65,000 och ~125,000, den grafiska geometriska S.D. (s*) och geometriska medelvärdet ( ) av den visade differential volym storlek fördelningen inte längre ändras avsevärt, respektive. Varje par av de upprepade körningarna med en stärkelse-metanol suspension slogs samman efter slutförandet för en total storleksräkning på 250,000.
Figur 1 visar fördelningar av differentiell volymprocent volymekvivalenter och sfärdiameter (S1a, S1b, S2a och S2b) för de fyra replikatiseringsanalyserna av sweetpotato-stärkelseproverna och deras genomsnittliga fördelning. CV för genomsnittet av geometriska medel för de fyra replikatfördelningarna var 3,75 %, vilket visar en utmärkt reproducerbarhet av storleksresultaten. Var och en av de fyra replikeringsfördelningarna bestämdes från en mycket stor samplingsstorlek på 250 000 granulat, långt över de minimala räkningarna (~ 65 000 och ~ 125 000) över vilka den grafiska geometriska S.D. (s* ) och geometriska medelvärdet ( ) av den visade differentialvolymstorleksfördelningen i en enda storlekskörning inte längre förändras nämnvärt. Därför var de fastställda volymfördelningarna för replikatstorlekar alla statistiskt giltiga. För bättre noggrannhet och jämförbarhet (diskuteras nedan) av specifikationen av bestämda lognormala granulat storleksfördelningar, alla dessa fördelningar specificerades med hjälp av deras grafiska geometriska medel ( ) och S.D. (s*) i en x/ (multiplicera och dela) s* form som anges i diagrammet. Observera att granulatstorleksfördelningen av sweetpotatostärkelsen har monterats rigoröst för att vara lognormal enligt tidigare beskrivit28.
Figur 1: Lognormala volymprocent volymekvivalenter-sfärstorleksfördelningar från replikerade storleksanalyser av sweetpotato-stärkelseprover. Provtagningsschemat för de fyra replikerade storleksanalyserna beskrevs i resultatet. De fyra fördelningar (S1a, S1b, S2a och S2b) från replikerade analyser och deras genomsnitt överlagrad och specificerades med hjälp av x/ (multiplicera och dela) s* form. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2 visar de genomsnittliga (eller genomsnittliga) kumulativa (<) storleksfördelningarna för tal- och volymprocent för de fyra replikeringsstorleksanalyserna, som var omvandlingsvyer av den genomsnittliga differentialvolymprocentstorleksfördelningen. Jämförelsen mellan det ackumulerade antalet och volymprocenten stärkelsegranulat visade att granulat med mindre volymekvivalenter-sfärdiametrar stod för mycket större procentandelar av det totala antalet än den totala volymen. Till exempel stod antalet granulat med volymekvivalenta sfärdiametrar mindre eller lika med 9,976 μm för 48,53% av det totala antalet, men bara 5,854% av den totala volymen.
Figur 2: Genomsnittlig kumulativ (<) tal- och volymprocentstorleksfördelning av stärkelsegranulat från de fyra replikerade storleksanalyserna av sweetpotato-stärkelseprover. De två distributionerna är omvandlingsvyer över den genomsnittliga storleksfördelningen i figur 1. Diagrammet jämför det kumulativa (<) talet (vänster Y-axel) med volymprocenten (höger Y-axel) av stärkelsegranulat med volymekvivalenta sfärstorlekar som är lägre eller lika med vissa storlekslagerplatser. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Bländardiameter (μm) | Partikeldiameterområde (μm) | Partikelvolymområde (μm3) |
| 50 | 1.0 - 40 | 0,524 - 33,5 x 103 |
| 70 | 1.4 - 56 | 1,44 - 92,0 x 103 |
| 100 | 2.0 - 80 | 4.19 - 268 x 103 |
Tabell 1: Tre mest användbara bländarrör för storleksdimensionering av granulat av stärkelse från växtarter.
| SOM-inställningar | Urval | |
| Beskrivning | BESKRIVNING AV SOM | Storlek stärkelse granulat |
| SOM författare | - | |
| Exempel beskrivning | Sweetpotato stärkelseprover | |
| Elektrolyt | 50 g L-1 litiumklorid | |
| Dispergeringsmedel | Nej | |
| Bländare | 100 μm | |
| Kontrollläge | Kontrollläge | Totalt antal [250 000] eller [125 000]a |
| Avfallstank | När 80% full | |
| Kör inställningar | Ange exempelinformation | Ja |
| Antal körningar | 1 (eller 2, för upprepade körningar) | |
| Spola bländarröret före körning | Ja | |
| Spola bländarröret efter körning | Ja | |
| Spara fil | Ja, inklusive pulsdata | |
| Exportera data | Ja | |
| Skriv ut rapport | Ja | |
| Jämför med exempelspecifikationer | Nej | |
| Visa | Storlek | |
| Inställningar för omrörare | Prov bägare | 100 ml Multisizer 4 ST |
| Använd omrörare | Ja | |
| Hastighet | [15], CW (klocka klokt) | |
| Omrörarposition | Automatisk | |
| Tröskelvärde, aktuell och vinst | Storlekströskel | 2 μm |
| Bländarström | 1600 mA | |
| Preamp vinst | 2 | |
| Utökat storleksområde b | Vid antal [> 0,1%] av det totala antalet | |
| Inställningar för puls till storlek | Storlek på lagerplatser | 400 |
| Storleksområde | 2 till 60 μm | |
| Lagerplatsavstånd | Stockdiameter | |
| Korrigering av sammanträffande | Ja | |
| Pulsredigering | Nej | |
| Koncentration | Provbelopp | 0,2 ml |
| Densitet | - | |
| Använd faktorn före utspädning | - | |
| Analytisk volym | - | |
| Elektrolytvolym | 100 ml | |
| Använd utspädningsfaktor | Nej | |
| Blockering | Identifiering av blockering | Automatisk (från början av körningen) |
| Standardblockeringsidentifiering: vid räkningshastighet <20%, bländarhastighet >40% eller koncentrationsspik >40%. | ||
| Blockera åtgärd | Avbryt, avblockera och starta om,Upp till [4] gånger | |
| Visa ikon | Ja | |
| Blockeringsövervakare | Räkna ränta | |
| s: Om upprepad avblockering och omstart inte kunde slutföras med det större antalet körningar, gör två upprepade körningar av storleksändringen ett lägre totalt antal på 125 000 vardera från samma stärkelseelektrolytupphängning och sammanfogar resultaten av upprepningskörningarna med hjälp av [MergeRuns] under [FileTools] av [File] i huvudmenyn. Alternativt, byt ut stärkelse-elektrolyt suspensionen med en ny med en lägre nominell koncentration (2-5%). När du förbereder en ny droppprovsstärkelse-elektrolytupphängning, pulse-sonicate stärkelse-metanol suspension igen för att bryta upp fler aggregat. | ||
| b: Det utökade storleksområdet styr åtgärder för granulat större än 60 % av bländardiametern (100 μm i denna SOM). Inställningen anger införande av stärkelsegranulat större än 60 μm när deras antal är större än 0,1% av det totala antalet. | ||
Tabell 2: Typiska SOM-inställningar för styrning av storlekskörningar för sweetpotato-stärkelseprover.
| Inställningar | Urval | |
| Utskrivna rapporter | Exempel på information | Exempel, Kör nummer, Storlekslagerplatser, Totalt antal |
| Storleksdiagram | Differentialvolym %, Log X-axel, utjämnad efter grupper om sju | |
| Storleksstatistik | Volym, Volym % | |
| Genomsnittlig statistik | Totalt belopp, medelvärde, S.D. | |
| Statistik över överlägg | Totalt belopp, medelvärde, S.D. | |
| Lista | Kolumner: Lagerplatsnummer, Lagerplatsdiameter (mitten), Diff. Tal, Diff. Tal %, Diff. Volym %. | |
| Lagerplatsgrupp: Lagerplatsgruppsstorlek 7, alla lagerplatser, summalagerplatser i grupp. | ||
| Statistik | Typ | Geometriska |
| Utbud | Alla | |
| Resultat att skriva ut | Intervall, totalt belopp, medelvärde, S.D., 95% konfidensgränser | |
| Resultat i diagrammet | Intervall: Alla, Totalt belopp, Medelvärde, S.D. | |
| Genomsnitt och trend | Genomsnittlig viktningb | Volym % |
| Distributionc | Differentiell | |
| Gränser | 2 S.D. | |
| Puls i genomsnitt | Använd Konvertera pulser till storleksområde | |
| Exportera | Dataobjekt | Exempelinformation, statistik, genomsnittlig statistik, storlekslista |
| Exportera tillägg | .xls | |
| Talformat | 123456.78 | |
| Dataformat | Avgränsad flik | |
| Exportera mapp | Aktuell mapp | |
| Inställningar för sida | Inkludera anpassad rubrik, skriva ut diagram med hjälp av datum för skärmfärgsintervall | |
| Diagramstorlek: | Halv sida | |
| Alternativ för diagram | Visa: | Skärm- och färgskrivare |
| Linjefärg | (Standard) | |
| Linjeformat | (Standard) | |
| Legend | Uppe till höger | |
| Storlek | (Standard) | |
| Diagramformat | Steg | |
| Begränsa format | Kurva | |
| Teckensnitt och färger | Standardteckensnitt och standardfärger eller efter önskemål. | |
| Visa alternativ | Standardvy | Storlek, diagram |
| Storlek X-axel | Diameter | |
| Mäta | Partiklar | |
| Liter Symbol | L (ml, μL, fL) | |
| Pulsdata för multisizer | Graf som mest 5010 pulser, Lista som mest 5010 pulser | |
| Volymenheter | μm3 | |
| Tal | 123456.78 | |
| a: Den geometriska medelvärdet och S.D.-statistiken som anges här är grafiska som definierar skalan och formen för den bestämda differentialvolymprocenten ekvivalentsfärstorleksfördelning. De används för att ange den lognormala fördelningen i formuläret x ̅* x/ s* . | ||
| b: Den genomsnittliga viktningen avser hur resultat från flera körningar är genomsnittliga av olika viktningsalternativ. Ändra dessa inställningar i menyn Kör för olika genomsnitts- och visningsalternativ. | ||
| c: Välj [Beräkna] för att öppna [ Genomsnittlig statistik] i [Kör-menyn] för att se den genomsnittliga statistiken i rader, diagramstatistiken för den genomsnittliga fördelningen i kolumnen "Medelvärde". | ||
Tabell 3: Typiska inställningsinställningar för vy, analyser och utskrift av resultat från storlekskörningar för sweetpotato-stärkelseprover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det skisserade förfarandet har löst några kritiska problem i flera befintliga metoder för stärkelse granulat storlek analyser, inklusive olämplig 1D eller 2D storlek av 3D granulat, förvrängning av storlek mätningar på grund av att ingen enhetlig granulat former, dålig reproducerbarhet och tvivelaktiga statistiska giltighet på grund av begränsade granulat-prov storlekar, felaktig eller felaktig specifikation (särskilt användningen av den genomsnittliga storleken) av granulat storlekar i närvaro av både granulat form och ingen-normala storlekar. Den använder ESZ-tekniken som mäter 3D-storlekar (volym) av stärkelsegranulat och svarar inte på granulatformer. Designen för att härleda den genomsnittliga granulatstorleksfördelningen från replikerade analyser med en mycket stor granulatprovstorlek (4 x 250 000) gör inte bara resultatet statistiskt giltigt och mer reproducerbart, utan mildrar också tekniskt mätförvrängningar genom aggregerade och skadade granulat för att förbättra storleksnoggrannheten (förklaras nedan). Såsom framgår av de representativa resultaten är cv:t för genomsnittet av geometriska medel för replikatfördelningar som bestäms med hjälp av förfarandet vanligtvis mindre än 5 %, vilket tyder på en tillfredsställande reproducerbarhet av resultaten. Dessutom visar den multiplikativa specifikationen av både skalan ( ) och formen (s*) för den lognormala granulatvolymekvivalent-sfärstorleksfördelningen mer exakt den sanna karaktären hos distribuerade granulatstorlekar i ett stärkelseprov och är okomplicerad att använda och universellt jämförbar bland granulatstorleksanalyser av stärkelse från samma eller olika källor. Därför möjliggör förfarandet en mer exakt, reproducerbar och statistiskt giltig bestämning av stärkelsegranulatstorlekar och korrekt specifikation av bestämda granulat lognormal storleksfördelningar. Det är tillämpligt på alla granulatdimensioneringsanalyser av gramskalsstärkelseprover och kan bli ett viktigt verktyg för studier av hur stärkelsegranulatdimensioner formas av stärkelsebiosyntesapparaten och mekanismerna i växtstärkelseackumulerande vävnader och hur de påverkar stärkelse och funktioner hos stärkelse för livsmedel och industriellt bruk.
Stärkelsegranulat är stereopartiklar med mestadels icke-sfäriska former så att deras storlekar måste definieras och mätas i 3D-termer. Således definierar volymerna av stärkelsegranulat bäst sina storlekar, och volymekvivalenten-sphere diametern är den enda enskilda 1D-storleksparametern som kan användas för att korrekt beskriva granulat 3D-storlekarna eftersom inga andra stereoobjekt än sfär kan definieras med en enda 1D-storleksparameter. Dessutom har stärkelsegranulat från alla växtarter en uppsättning former med olika förekomstfrekvenser. I närvaro av en sådan formfördelning är alla partikelstorlekstekniker som reagerar på partikelformer, t.ex. laserdiffraktionstekniken, inte lämpade för reproducerbara och statistiskt giltiga bestämningar av storleksfördelningar av stärkelsegranulat, eftersom systemfelet som är inneboende i dessa tekniker inte lätt kan korrigeras med en formfaktor. Faktum är att felfrekvensen (CV) bland replikerade analyser av granulatstorlekar från samma sweetpotato stärkelseprov med laserdiffraktionstekniken kan nå så högt som 15-20%28, vilket indikerar mycket dåligt reproducerbara storleksresultat. Tyvärr har granulatformens inverkan på storleksstärkelsegranulat mestadels förbisetts, vilket resulterade i en stor mängd tvivelaktiga stärkelsegranulatstorleksdata som förvärvats med hjälp av formresponsiva partikelstorlekstekniker i litteraturen.
Den multiplikativa specifikationen med två parametrar definierar både skalan ( ) och formen (s*) för lognormala fördelningar, och är hittills mer exakt och meningsfull än en enda deskriptor av medelstorlek eller ett storleksområde26. De multiplikativa x/ s* , x/ (s* )2, och x/ (s* )3 intervall, 
motsvarande ± s, ± 2soch ± 3 s intervaller av en normal fördelning, täcker cirka 68,3%, 95,5% respektive 99,7% konfidensintervall för en lognormal fördelning,respektive 27. Det geometriska medelvärdet ( ) och S.D. ( s* ) för en lognormal granulatstorleksfördelning motsvarar det grafiska geometriska medelvärdet och S.D. för storleksfördelningskurvan, som beräknas av analysatorns programvara och kan väljas för att visas på diagrammet för storlek på skärmen under en storlekskörning eller analyser av resultat. Det är därför ganska bekvämt och enkelt att använda den multiplikativa specifikationen. Dessutom har and s* visat sig ha olika fysiologiska konsekvenser i samband med stärkelsebiosyntesapparaturen28. Granulatvolymfördelningen av stärkelse från olika växtarter kan mycket väl vara lognormal eftersom bildandet av stärkelsegranulat i växtstärkelseackumulerande vävnader faller i ett obehindrat utvecklande komplext system31 eller ett intracellulärt katalytiskt reaktionsnätverk32 som är karakteristiskt för en lognormal fördelning. De bimodala granulatstorleksfördelningarna av stärkelse från vissa växtarter, såsom defrån vete 13,14, kan betraktas som två lognormala fördelningar. Därför kan den multiplikativa specifikationen av granulat lognormal volymekvivalenter-sfärstorleksfördelningar också möjliggöra en statistiskt giltig universell jämförelse av granulatstorlekar som bestäms av stärkelse av olika växtkällor och genom olika mätningar, eftersom är i form av volymekvivalenter-sfärdiameter och s* är demensionless.
Ett lämpligt totalt antal granulatstorlekar för analys av ett stärkelseprov (i metanolprov), som representerar granulatprovets storlek, är mest avgörande för en framgångsrik bestämning av granulatstorleksfördelningen av statistisk signifikans för stärkelseprovet. När det gäller sweetpotato stärkelseprover, när det totala antalet i en enda körning når över ~ 65,000 och ~ 125,000, den grafiska geometriska S.D. ( s* ) och geometriska medelvärdet ( ) av den visade differential volymstorleksfördelningskurvan inte längre väsentligt ändras, vilket indikerar minimala antal för s* och statistisk signifikans. Provtagningsredundansen vid storleksändring av 250 000 granulat för ett prov av stärkelsemetanol i förfarandet är avsett att rabattera för aggregerade och skadade granulat i den stora granulatpoolen. Även om man antar att de aggregerade och skadade eller trasiga granulaten stod för 50% av det totala antalet 250 000 granulat i en slutförd körning eller två sammanslagna repetitionskörningar, skulle det grafiska geometriska S.D. och medelvärdet av den bestämda fördelningen inte ha påverkats nämnvärt eftersom de skulle ha förankrats av de intakta granulaten av hälften av det totala antalet. Dessutom, den mer volymstora minskningen av de skadade eller trasiga granulaten, desto mindre inverkan har de på fördelningen. Detta beror på att mindre granulat tar ett större antal procent, men mindre volymprocent av de totala granulerna. Som framgår av jämförelsen mellan kumulativa fördelningar av tal och volym för samma genomsnittliga fördelning i figur 2,stod stärkelsegranulat med en motsvarande sfärdiameter mindre än eller lika med 9,967 μm för cirka 48,53 % av det totala antalet, men endast 5,854 % av den totala volymen. Således skulle alla skadade eller nedbrutna granulat som är mindre än 10 μm ha en mycket liten inverkan på fördelningen av differentierade volymprocentstorlekar. För stärkelseprover från andra växtkällor kan ett lämpligt totalt antal för deras storleksanalyser vara det som fördubblar det minimala antalet över vilket det grafiska geometriska medelvärdet ( ) för den visade storleksfördelningen i en försökskörning inte längre förändras nämnvärt.
Tekniskt sett är det mest kritiska steget för en storlekskörning att släppa en lämplig mängd stärkelse-metanolupphängning till elektrolyten för ett optimalt intervall på 5 till 8% nominell koncentration för stärkelse-elektrolytupphängningen. För att nå målet kan droppstorleken och koncentrationen av stärkelse-metanolupphängningen behöva justeras genom provkörningar. Koncentrationer av stärkelse-elektrolyt suspensioner högre än det optimala intervallet ökar risken för minskad storleksprecision, och frekventa bländare blockeringar leder till kör aborter, vilket kan göra det mycket svårt att slutföra en körning. Men för låg koncentration (t.ex. <2%) av stärkelseelektrolytupphängningen kan förlänga en körning för mycket och förvränga frekvenserna av granulat i olika storleksbehållare på grund av icke-slumpmässig provtagning av granulat, vilket kan leda till en oacceptabel felfrekvens (det genomsnittliga CV > 5%) för en replikerad analys. Det totala antalet för en storlekskörning har också en stor inverkan på den optimala koncentrationen av en stärkelseelektrolytupphängning, därav på mängden och koncentrationen av den tillsatta stärkelse-metanolen. Ju större totalantalet för en körning, desto längre tid för slutförandet av körningen, och därmed desto fler risker för bländarblockeringar som leder till aborter. Problemet med bländarblockering av aggregat förvärras när bländarrör med mindre diametrar används för stärkelsegranulat av mindre storlekar, vilket gör det mycket svårt att analysera små stärkelsegranulat (< 2 μm). Detta är verkligen den största nackdelen eller begränsningen av förfarandet. Problemet med bländarblockering skulle i viss utsträckning kunna lindras med hjälp av vissa tekniska medel. Man kan använda mer ultraljudsbehandling för att bryta upp aggregat (oundvikligen mer skadade granulat också) i en stärkelse-metanol suspension, och/eller en utspädd stärkelse-elektrolyt suspension vid 2-5% nominella koncentrationer. Alternativt kan man använda tekniska repetitionskörningar av storlek det minimala totala antalet för stabila s* och av storleksfördelningarna för en stärkelsetyp (t.ex. cirka 125 000 räkningar för sweetpotato stärkelse) från samma stärkelse-elektrolytupphängning och slå samman resultaten av de upprepade körningarna. Var och en av de fyra replikationsfördelningarna (S1a, S1b, S2a och S2b) som visas i figur 1 var från två sammanslagna tekniska repetitionskörningar av storlek 125 000 granulat vardera från samma stärkelse-elektrolytupphängning. Båda metoderna måste testas väl, eftersom de kan öka replikeringsfelfrekvensen till en oacceptabel nivå (dvs. det genomsnittliga CV > 5%).
Tekniska och biologiska replikatstorleksanalyser av stärkelseprover från växtkällor under liknande fysiologiska förhållanden förbättrar reproducerbarheten och noggrannheten hos den fastställda genomsnittliga granulatstorleksfördelningen. Praktiskt taget kan tre eller fyra biologiska replikat av stärkelseprover självständigt extraheras från samma vävnad under ett visst tillstånd. Men vi fann tidigare att det inte fanns någon signifikant skillnad i felfrekvenser (CV och standardfel för genomsnittet), och s* mellan den genomsnittliga granulatstorleksfördelningen som härrör från fördelningar av fyra biologiska replikat (dvs. en storlek x en suspension x 4 extrakt) och den från två tekniska provtagningar vardera från två biologiska replikat (dvs. en storlek x 2 stärkelse-metanol suspensioner x 2 extrakt)28. Således kan biologiska replikatprover reduceras till två, åtminstone för sweetpotato-stärkelsen. Andra steg och tekniska parametrar som kunde ändras eller justeras noterades särskilt under vart och ett av stegen eller den särskilda parametern i förfarandet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja
Acknowledgments
Detta arbete stöds delvis av Cooperative Agriculture Research Center och Integrated Food Security Research Center vid College of Agriculture and Human Sciences, Prairie View A&M University. Vi tackar Hua Tian för hans tekniska support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytical beaker | Beckman Coulter Life Sciences | A35595 | Smart-Technology (ST) beaker |
| Aperture tube, 100 µm | Beckman Coulter Life Sciences | A36394 | For the MS4E |
| Disposable transfer pipettor, | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 13-711-9AM | Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used. |
| Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 05-539-13 | Any other similar types of tubes can be used. |
| Glass beakers, 150 to 250 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 02-540K | These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirrer between runs. |
| LiCl | Fisher Chemical | L121-100 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A412-500 | Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol. |
| Mettler Toledo ML-T Precision Balances | Mettler Toledo | 30243412 | Any other precision balance with a readability 0.01 g to 1 mg will work. |
| Multisizer 4e Coulter Counter | Beckman Coulter Life Sciences | B23005 | The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company. |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | Other laboratory sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension. |
References
- Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Starch:Chemistry and Technology Food Science and Technology. BeMiller, J., Whistler, R. , Academic Press. Ch. 3 23-82 (2009).
- Singh, N., Singh, J., Kaur, L., Singh Sodhi, N., Singh Gill, B. Morphological, thermal and rheological properties of starches from different botanical sources. Food Chemistry. 81 (2), 219-231 (2003).
- Lindeboom, N., Chang, P. R., Tyler, R. T. Analytical, biochemical and physicochemical aspects of starch granule size, with emphasis on small granule starches: a review. Starch - Stärke. 56 (34), 89-99 (2004).
- Baldwin, P. M., Davies, M. C., Melia, C. D. Starch granule surface imaging using low-voltage scanning electron microscopy and atomic force microscopy. International Journal of Biological Macromolecules. 21 (1-2), 103-107 (1997).
- Jane, J. L., Kasemsuwan, T., Leas, S., Zobel, H., Robyt, J. F. Anthology of starch granule morphology by scanning electron microscopy. Starch-Stärke. 46 (4), 121-129 (1994).
- Matsushima, R. Starch: Metabolism and Structure. Nakamura, Y. , Ch. 13 425-441 (2015).
- Wang, S. -q, Wanf, L. -l, Fan, W. -h, Cao, H., Cao, B. -s Morphological analysis of common edible starch granules by scanning electron microscopy. Food Science. 32 (15), 74-79 (2011).
- Baldwin, P. M., Adler, J., Davies, M. C., Melia, C. D. Holes in starch granules: confocal, SEM and light microscopy studies of starch granule structure. Starch-Stärke. 46 (9), 341-346 (1994).
- Chakraborty, I., Pallen, S., Shetty, Y., Roy, N., Mazumder, N. Advanced microscopy techniques for revealing molecular structure of starch granules. Biophysical Reviews. 12 (1), 105-122 (2020).
- Bechtel, D. B., Wilson, J. D. Amyloplast formation and starch granule development in hard red winter wheat. Cereal Chemistry. 80 (2), 175-183 (2003).
- Evers, A. Scanning electron microscopy of wheat starch. III. Granule development in the endosperm. Starch-Stärke. 23 (5), 157-162 (1971).
- Wang, Y. J., White, P., Pollak, L., Jane, J. L. Characterization of starch structures of 17 maize endosperm mutant genotypes with Oh43 inbred line background. Cereal Chemistry. 70, 171-179 (1993).
- Peng, M., Gao, M., Abdel-Aal, E. S. M., Hucl, P., Chibbar, R. N. Separation and characterization of A-and B-type starch granules in wheat endosperm. Cereal Chemistry. 76, 375-379 (1999).
- Wilson, J. D., Bechtel, D. B., Todd, T. C., Seib, P. A. Measurement of wheat starch granule size distribution using image analysis and laser diffraction technology. Cereal Chemistry. 83 (3), 259-268 (2006).
- Liu, Q., Weber, E., Currie, V., Yada, R. Physicochemical properties of starches during potato growth. Carbohydrate Polymers. 51 (2), 213-221 (2003).
- Chmelik, J., et al. Comparison of size characterization of barley starch granules determined by electron and optical microscopy, low angle laser light scattering and gravitational field-flow fractionation. Journal of the Institute of Brewing. 107 (1), 11-17 (2001).
- Moon, M. H., Giddings, J. C. Rapid separation and measurement of particle size distribution of starch granules by sedimentation/steric field-flow fractionation. Journal of Food Science. 58 (5), 1166-1171 (1993).
- Wriedt, T. The Mie Theory: Basics and Applications. Wolfram, H., Wriedt, T. , Springer. Berlin Heidelberg. 53-71 (2012).
- Schuerman, D. W., Wang, R. T., Gustafson, B. ÅS., Schaefer, R. W. Systematic studies of light scattering. 1: Particle shape. Applied Optics. 20 (23), 4039-4050 (1981).
- Goering, K. J., Fritts, D. H., Eslick, R. F. A study of starch granule size and distribution in 29 barley varieties. Starch-Stärke. 25 (9), 297-302 (1973).
- Chen, Z., Schols, H. A., Voragen, A. G. J. Starch granule size strongly determines starch noodle processing and noodle quality. Journal of Food Sciences. 68 (5), 1584-1589 (2003).
- Dai, Z. M. Starch granule size distribution in grains at different positions on the spike of wheat (Triticum aestivum L.). Starch-Starke. 61 (10), 582-589 (2009).
- Edwards, M. A., Osborne, B. G., Henry, R. J. Effect of endosperm starch granule size distribution on milling yield in hard wheat. Journal of Cereal Science. 48 (1), 180-192 (2008).
- Karlsson, R., Olered, R., Eliasson, A. C. Changes in starch granule size distribution and starch gelatinization properties during development and maturation of wheat, barley and rye. Starch - Starke. 35 (10), 335-340 (1983).
- Li, W. -Y., et al. Comparison of starch granule size distribution between hard and soft wheat cultivars in Eastern China. Agricultural Sciences China. 7 (8), 907-914 (2008).
- Park, S. H., Wilson, J. D., Seabourn, B. W. Starch granule size distribution of hard red winter and hard red spring wheat: Its effects on mixing and breadmaking quality. Journal of Cereal Science. 49 (1), 98-105 (2009).
- Limpert, E., Stahel, W. A., Abbt, M. Log-normal distributions across the sciences: keys and clues. Bioscience. 51 (5), 341-352 (2001).
- Gao, M., et al. Self-preserving lognormal volume-size distributions of starch granules in developing sweetpotatoes and modulation of their scale parameters by a starch synthase II (SSII). Acta Physiologiae Plantarum. 38 (11), 259 (2016).
- Wattebled, F., et al. STA11, a Chlamydomonas reinhardtii locus required for normal starch granule biogenesis, encodes disproportionating enzyme. Further evidence for a function of alpha-1,4 glucanotransferases during starch granule biosynthesis in green algae. Plant Physiology. 132 (1), 137-145 (2003).
- Ji, Y., Seetharaman, K., White, P. J. Optimizing a Small-Scale Corn-Starch Extraction Method for Use in the Laboratory. Cereal Chemistry. 81 (1), 55-58 (2004).
- Halloy, S., Whigham, P. The lognormal as universal descriptor of unconstrained complex systems: a unifying theory for complexity. Proceedings of the 7th Asia-Pacific Complex Systems Conference. , QLD. Australia. 309-320 (2004).
- Furusawa, C., Suzuki, T., Kashiwagi, A., Yomo, T., Kaneko, K. Ubiquity of log-normal distributions in intra-cellular reaction dynamics. Biophysics (Nagoya-shi). 1, 25-31 (2005).
