Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

الموقع، تشريح، وتحليل عصابة مورين ستيلاتي

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/62026
Automatic Translation
1,2,3, 2,4, 2, 2,4,5, 3, 1,2,3
1Division of Cardiology, EVK Düsseldorf, cNEP, cardiac Neuro- and Electrophysiology Research Consortium, 2DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 3Institute of Neural and Sensory Physiology, Medical Faculty, Heinrich Heine University Düsseldorf, 4Clinic for Cardiology, University Heart & Vascular Centre, University Hospital Hamburg-Eppendorf, 5Department of Cardiology, Leiden University Medical Center

Summary

تساهم التغيرات المرضية الفسيولوجية في الجهاز العصبي اللاإرادي القلبي ، خاصة في فرعه المتعاطف ، في ظهور وصيانة عدم انتظام ضربات القلب البطيني. في هذا البروتوكول، نعرض كيفية توصيف العصابات النجمية مورين لتحسين فهم العمليات الجزيئية والخلوية الكامنة.

Abstract

الجهاز العصبي اللاإرادي هو محرك كبير للفيزيولوجيا الكهربية القلبية. خاصة دور فرعها المتعاطف هو مسألة مستمرة للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية لرواية البطين (VA). الخلايا العصبية في العقدة النجمية (SG)   – الهياكل الثنائية على شكل نجمة من سلسلة متعاطفة –   هي عنصر مهم في البنية التحتية المتعاطفة. وSG هي هدف معترف به للعلاج عن طريق denervation متعاطفة مع القلب في المرضى الذين يعانون من العلاج الحراري VA. في حين تم وصف إعادة عرض الخلايا العصبية والتنشيط الدبقية في SG في المرضى الذين يعانون من VA ، فإن العمليات الخلوية والجزيئية الأساسية التي يحتمل أن تسبق ظهور عدم انتظام ضربات القلب غير مفهومة بشكل كاف فقط وينبغي توضيحها لتحسين التشكيل اللاإرادي. نماذج الماوس تسمح لنا لدراسة إعادة عرض الخلايا العصبية متعاطفة، ولكن تحديد SG مورين يشكل تحديا للمحقق عديم الخبرة. وبالتالي، تفتقر الدراسات البيولوجية الخلوية والجزيئية المتعمقة للمورين SG للعديد من أمراض القلب الشائعة. هنا، ونحن نصف ذخيرة أساسية لتشريح ودراسة SG في الفئران الكبار للتحليلات على مستوى الحمض النووي الريبي (عزل الحمض النووي الريبي لتحليل التعبير الجيني، في التهجين الموقعي)، ومستوى البروتين (immunofluorescent تلطيخ جبل كامل)، والمستوى الخلوي (مورفولوجيا الأساسية، وقياس حجم الخلية). نحن نقدم الحلول المحتملة للتغلب على التحديات في تقنية التحضير، وكيفية تحسين تلطيخ عن طريق إخماد autofluorescence. وهذا يسمح لتصور الخلايا العصبية وكذلك الخلايا الدبقية عن طريق علامات المنشأة من أجل تحديد تكوين الخلية وإعادة عرض العمليات. الأساليب المعروضة هنا تسمح لتميز SG للحصول على مزيد من المعلومات حول الخلل اللاإرادي في الفئران المعرضة لVA ويمكن أن تستكمل بتقنيات إضافية التحقيق في المكونات العصبية والجلبقية من الجهاز العصبي اللاإرادي في القلب.

Introduction

الجهاز العصبي اللاإرادي القلبي هو توازن منظم بإحكام من المكونات المتعاطفة وشبه المتعاطفة والحسية التي تسمح للقلب بالتكيف مع التغيرات البيئية مع الاستجابة الفسيولوجية المناسبة1،2. الاضطرابات في هذا التوازن، على سبيل المثال، زيادة النشاط المتعاطف، وقد ثبت كمحرك رئيسي لبداية وكذلك الحفاظ على عدم انتظام ضربات القلب البطيني (VA)3،4. لذلك ، كان التشكيل اللاإرادي ، الذي تحقق عن طريق الحد الدوائي للنشاط المتعاطف مع حاصرات بيتا ، حجر الزاوية في علاج المرضى الذين يعانون من VA لعقود5،6. ولكن على الرغم من التدخلات الدوائية والقائمة على القسطرة ، لا يزال عدد كبير من المرضى يعانون من VA7المتكررة.

يتم التوسط في الغالب مدخلات متعاطفة إلى القلب عن طريق أجسام الخلايا العصبية في العقدة النجمية (SG) ، والهياكل الثنائية على شكل نجمة من السلسلة المتعاطفة ، والتي تنقل المعلومات عبر العديد من الأعصاب داخل الصدر من جذع الدماغ إلى القلب8و9و10. العصب تنبت من SG بعد الإصابة ويرتبط VA والموت القلبي المفاجئ11,12, مؤكدا على SG كهدف لتعديل اللاإرادي13,14. ويمكن تحقيق انخفاض في المدخلات المتعاطفة للقلب مؤقتا عن طريق الحقن عن طريق الجلد من التخدير الموضعي أو بشكل دائم عن طريق إزالة جزئية من SG عن طريق تنظير الصدر بمساعدة الفيديو15,16. القلب متعاطفة denervation يقدم خيارا للمرضى الذين يعانون من العلاج الحراري VA مع نتائج واعدة14,16,17. لقد تعلمنا من SG explanted من هؤلاء المرضى أن إعادة عرض الخلايا العصبية والأعصاب الكيميائية، والتهاب الأعصاب والتنشيط الدبقية هي السمات المميزة لإعادة عرض متعاطفة التي قد تسهم أو تفاقم الخلل اللاإرادي18،19. ومع ذلك، فإن العمليات الخلوية والجزيئية الكامنة في هذه الخلايا العصبية لا تزال غامضة حتى الآن، على سبيل المثال، دور التمايز العصبي في النمط الظاهري الكوليني20،21. تقدم الدراسات التجريبية مقاربات جديدة لعلاج VA ، على سبيل المثال ، الحد من النشاط العصبي المتعاطف عن طريق optogenetics22، ولكن التوصيف المتعمق ل SG لا يزال مفقودا في العديد من أمراض القلب التي تسير جنبا إلى جنب مع VA. نماذج الماوس تحاكي هذه الأمراض تسمح لدراسة إعادة عرض الخلايا العصبية التي يحتمل أن تسبق ظهور عدم انتظام ضربات القلب12،23. ويمكن استكمال هذه من خلال مزيد من التحليلات المورفولوجية والوظيفية لتوصيف اللاإرادي للقلب والجهاز العصبي. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم ذخيرة أساسية من الأساليب التي تسمح لتشريح وتوصيف SG مورين لتحسين فهم VA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافقت لجنة رعاية الحيوان واستخدامه في ولاية هامبورغ (ORG870, 959) والوكالة الحكومية للطبيعة والبيئة وحماية المستهلك في شمال الراين وستفاليا على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات (LANUV, 07/11) وتتوافق مع دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر (2011). أجريت دراسات باستخدام الذكور والإناث (الذين تتراوح أعمارهم بين 10-24 أسبوعا) C57BL/6 الفئران (عدد المخزون 000664, مختبرات جاكسون) والفئران homozygous (db/db) أو heterozygous (db/het; السيطرة) للطفرة العفوية مرض السكري (Leprdb; بي كيه. CG-Dock7م +/+ Leprdb /J، رقم السهم 000642، مختبرات جاكسون). وقد استخدم المؤلفون البروتوكولات في متناول اليد دون اختلافات للفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 60 أسبوعا.

1. موقع وتشريح العصابات الزبرجية الزبرجية مورين

ملاحظة: على الرغم من أن الأوصاف والرسومات متوفرة في الغالب في أنواع أكبر، فقد وصفت بعض المنشورات في وقت سابق موقع SG في الفئران24 والفئران25 باستخدام الطرق التشريحية وخطوط المراسلات الفلورية، على التوالي.

  1. إعداد 50 مل من الجليد البارد (3-4 درجة مئوية) heparinized (20 وحدة / مل، انظر جدول المواد) المالحة العازلة بالفوسفات (PBS). إجراء تشريح ل SG في درجة حرارة الغرفة (RT).
  2. تخدير عميق الماوس عن طريق استنشاق isoflurane 3٪ -5٪ وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والمحلية. تحقق من التخدير الكافي عن طريق فقدان دواسة الانسحاب منعكس. قطع رأس الفئران أو إجراء خلع عنق الرحم.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي خلع عنق الرحم غير الصحيح إلى كسر العمود الفقري وتلف الأوعية الصدرية مما يؤدي إلى نزيف يعوق إعداد أو قطع السلسلة المتعاطفة ، بحيث لا تكون SG في وضعها الصحيح. لذلك ، من الأهمية بمكان أن يقوم الموظفون ذوي الخبرة بإجراء خلع عنق الرحم أو قطع رؤوس الحيوانات في التخدير العميق.
  3. رش الجلد بالإيثانول وافتح الصدر بشقين على طول الخطوط الإبطية الأمامية باستخدام مقص Mayo (مايو) وملقط النمط الضيق. قطع الحجاب الحاجز وإزالة الجزء الأمامي من القفص الصدري.
  4. إزالة حزمة القلب والرئة عن طريق تجتاح الشريان الأورطي وفينا كافا الحق فوق الحجاب الحاجز باستخدام ملقط لندن وقطع جميع الأوعية والأنسجة الضامة على مقربة من العمود الفقري أدناه مع مقص الحول.
  5. تدفق الصدر بدقة مع برنامج تلفزيوني heparinized باستخدام ماصة بلاستيكية المتاح حتى تتم إزالة جميع آثار الدم.
  6. ضع الجذع تحت مناظير إعداد المنظار المجسم وتأكد من إضاءة جيدة في الصدر مع مصادر الضوء الخارجية.
  7. حدد موقع الضلع الأول وعضلات الولي الطويلة.
    ملاحظة: وتقع SG ثنائيا، بالتوازي مع العمود الفقري في الفرع بين الضلع الأول والعمود الفقري، في أخدود الجانبية لعضلات كولي longus24. يقع الجانب المسطح من SG المجاورة لعضلات الولي longus. اعتمادا على التحضير، قد تكون أجزاء من السلسلة المتعاطفة مرئية بالفعل كألياف بيضاء مائلة موازية للعمود الفقري. ويمكن تتبع هذه على طول إلى SG.
  8. بلطف استخدام غيض من ملقط دومون #5/45 لفضح النسيج الضام الجانبية إلى العضلات كولي longus.
  9. بدوره ملقط حولها بنسبة 180 درجة واستخدام الجانب المسطح لقبضة SG وسحبه مع الحد الأدنى من الضغط.
  10. كرر مع SG الثاني.
  11. وضع كل من SG في طبق (قطرها 6 سم) مليئة برنامج تلفزيوني الباردة وتفقد مع التكبير المناسبة. إذا لزم الأمر، قم بإزالة الأوعية الزائدة والأنسجة الدهنية والأعصاب الأكبر.
    ملاحظة: ويحيط ganglia اللاإرادي من قبل كبسولة النسيج الضام تتكون من ألياف الكولاجين والخلايا الليفية26،27. نفاذية هذه الكبسولات ويبدو أن تختلف بين الأنواع، ونوع مختلف من ganglia26 و28سن . إزالة أكبر قدر ممكن من النسيج الضام باستخدام دومون #5/45 ملقط، وإذا لزم الأمر، مقص الربيع.
  12. اعتمادا على الهدف من التجربة، انتقل إلى القسم 2 أو 3 أو 5 من هذا البروتوكول.

2. تركيب كامل بروتوكول الكيمياء المناعية

ملاحظة: يتم تكييف هذا البروتوكول من تلطيخ جبل القلب كله4،29. تنفيذ خطوات حضانة لكل SG واحد في بئر واحد من لوحة 96 جيدا واستخدام 100 ميكرولتر (للحلول التي تحتوي على الأجسام المضادة) إلى 200 ميكرولتر (لجميع الحلول الأخرى) من الحل لضمان التغطية الكاملة. تحقق بانتظام من التغطية والغمر الصحيح ل SG باستخدام المناظير. قم بإزالة السوائل يدويا باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر مع طرف إضافي 10 ميكرولتر فوق طرف 200 ميكرولتر. وهذا من شأنه أن يمنع طموح من SG في تلميح ماصة. استخدم الحلول الطازجة والسوائل المعقمة لمنع نمو البكتيريا.

  1. إصلاح SG لعلم الأنسجة لمدة 2 ساعة في RT في 4٪ بارافورمالديهايد خالية من الميثانول (PFA)/PBS.
  2. معالجة SG في أسرع وقت ممكن، ولكن يمكن تخزينها لمدة 2-4 أسابيع في 4-6 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني مع 0.02٪ (ث / الخامس) أزايد الصوديوم في هذه المرحلة.
  3. إعداد السودان الأسود الأسهم الحل (1٪ السودان الأسود ث / الخامس في الإيثانول 100٪) للحد من autofluorescence وتحسين إشارة إلىخلفية نسبة 30. تذوب لمدة 2-3 ساعة على ستيرر المغناطيسي في RT.
    ملاحظة: استخدم محلول المخزون لمدة أقصاها 6-8 أسابيع، وتجاهل في وقت سابق عند ظهور الترسيب.
  4. إعداد السودان حل العمل الأسود عن طريق الطرد المركزي حل المخزون لمدة 30 دقيقة بأقصى سرعة (13000 × ز)لإزالة الحطام وتمييع المخزون في الإيثانول 70٪ إلى تركيز نهائي من 0.25٪ أسود السودان.
  5. علاج SG مع التبييض دنت لتحسين permeabilization الأجسام المضادة31. إعداد التبييض دنت الطازجة عن طريق خلط الميثانول (MeOH)، محلول بيروكسيد الهيدروجين 30٪ (ث / ث) في H2O وأولف أكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) في نسبة 4:1:1. إضافة 200 ميكرولتر لكل SG ووضع لوحة على شاكر المدارية لمدة 1 ساعة في RT.
  6. تنفيذ سلسلة MeOH تنازلي للإماهة عن طريق احتضان لمدة 10 دقيقة لكل منهما على شاكر المداري: 100٪ MeOH، 75٪ MeOH/PBS، 50٪ MeOH/PBS، 25٪ MeOH/PBS.
  7. أداء permeabilization عن طريق احتضان SG مرتين لمدة 60 دقيقة لكل منهما في برنامج تلفزيوني / 1 ٪ تريتون العاشر - 100 في RT.
  8. إزالة حل permeabilization من SG وإضافة السودان حل العمل الأسود. احتضان لمدة 2 ساعة في RT على شاكر المداري.
  9. في غضون ذلك، وإعداد حل حجب بإضافة 5٪ مستقبلات الصف المصل البقري الألبومين (BSA) و 0.1٪ تريتون-X-100 في برنامج تلفزيوني وعاء 15 مل والسماح لها تذوب على شاكر الأسطوانة لمدة 5-10 دقيقة تقريبا. Decant من خلال مرشح ورقة مطوية مسبقا لإزالة الحطام.
  10. إزالة السودان الأسود بعناية فائقة عن طريق إمالة لوحة وpipetting بعناية من الجانب تستقيم.
    ملاحظة: لا يمكن رؤية SG في السودان أسود. استخدام مصدر ضوء قوي والعمل ببطء. من هذه الخطوة فصاعدا، SG ملطخة باللون الأسود، وتعزيز الرؤية. إذا كان ينظر إلى أي نسيج الضام إضافية المحيطة سان سانج في هذه المرحلة، إزالته باستخدام دومون #5/45 ملقط ومقص الربيع.
  11. إضافة 200 ميكرولتر من PBS/0.1٪ تريتون-X-100 (PBS-T) وغسل لمدة 5 دقائق في RT على شاكر المداري.
  12. إزالة برنامج تلفزيوني-T عن طريق أسبيراتينغ مع ماصة وتكرار 2 مرات.
  13. إزالة برنامج تلفزيوني; إضافة 200 ميكرولتر من حل حجب واحتضان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها على شاكر المدارية.
  14. في اليوم التالي، قم بإعداد الحلول بإضافة أجسام مضادة أساسية في حل الحجب. تكييف تركيزات الأجسام المضادة من البروتوكولات المعمول بها.
    ملاحظة: تضمين SG واحد كتحكم في الأجسام المضادة بدون الأجسام المضادة الأولية (المحتضنة بأجسام مضادة مستضد أو IgG، إذا كانت متوفرة، أو حظر العازلة).
  15. إجراء حضانة الأجسام المضادة الأولية لمدة 36-48 ساعة عند 4 درجات مئوية على شاكر مداري. لقياس حجم الخلية وتلطيخ الخلايا العصبية المتعاطفة، استخدم الأجسام المضادة ضد هيدروكسيلولاز التيروزين (انظر جدول المواد للحصول على توصيات الأجسام المضادة).
    ملاحظة: ضع لوحة 96 جيدا في غرفة رطبة (على سبيل المثال، مربع من البلاستيك اصطف مع ddH2O-مبللة المناشف الورقية) لمنع التبخر في هذه المرحلة.
  16. إزالة حل الأجسام المضادة بعناية وإضافة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-T. ضع اللوحة على شاكر مداري لمدة 30 دقيقة.
  17. إزالة برنامج تلفزيوني-T وتكرار خطوة الغسيل 5 مرات إضافية.
  18. إعداد حل عمل الأجسام المضادة الثانوية عن طريق الطرد المركزي الفلورسنت اليكسا المسمى الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 دقيقة بأقصى سرعة (13000 × غرام)قبل الاستخدام. تمييع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة وفقا للأجسام المضادة الأولية 1:500 في حل الحجب وإضافة إلى SG. إضافة 1 ميكروغرام / مل من bisbenzimide H33342 ثلاثي هيدروكلوريد (هويشست تلطيخ) إذا كان من المرغوب تلطيخ النووية. حضانة لمدة 12-24 ساعة في 4 درجة مئوية على شاكر المداري.
  19. إزالة حل الأجسام المضادة بعناية وإضافة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-T. ضع اللوحة على شاكر مداري لمدة 30 دقيقة.
  20. إزالة برنامج تلفزيوني-T وتكرار خطوة الغسيل 5 مرات إضافية. للخطوة الأخيرة، استخدم برنامج تلفزيوني بدون تريتون.
  21. لتضمين، انتشار 50-100 ميكرولتر من الفلورسنت تصاعد المتوسطة (انظر جدول المواد)على شريحة زجاجية ومكان تحت إعداد المناظير. استخدم Dumont #5/45 ملقط لالتقاط SG من لوحة 96 جيدا وإزالة السائل الزائد عن طريق غمس طرف واحد على ورقة تصفية (على سبيل المثال ، لوحة تجفيف Whatman) ووضعها على القطرة.
  22. استخدم dumont #5/45 ملقط لتصحيح تحديد المواقع مع التكبير المناسب.
  23. ضع بلطف غطاء زجاجي (20 مم × 20 مم) بجوار SG ونزل ببطء.
    ملاحظة: استخدام الكثير من المتوسطة المتصاعدة سيؤدي إلى حركة SG أو متشابكة من الأعصاب. إذا حدث ذلك، قم بإزالة غطاء الغطاء بسرعة وكرر الخطوات 2.9-2.21.
  24. دع الشرائح تجف في الظلام بين عشية وضحاها في RT. تخزين العينة الملطخة ممكن لمدة 4-6 أسابيع على الأقل عند 4 درجة مئوية.

3. جبل كله في التهجين الموقع

ملاحظة: يتم تكييف كامل جبل في الموقع التهجين من SG من الجهاز من كورتي32 وفلورسينس الجيش الملكي النيبالي التجارية في بروتوكول الموقع (انظر جدول المواد). الحصول على تحقيقات لجينات الفائدة والمخازن المؤقتة والحلول من المورد. يتم تنفيذ جميع خطوات الحضانة في RT ، إذا لم يذكر خلاف ذلك. استخدام برنامج تلفزيوني عقيم. إذا كنت مهتما في تلطيخ العديد من SG في بئر واحد، استخدم ما لا يقل عن 150 ميكرولتر من المخازن المؤقتة والحلول.

  1. إجراء تشريح من SG كما هو موضح في الخطوات 1.1-1.13.
  2. تثبيت SG لمدة 1 ساعة في 200 ميكرولتر من 4٪ PFA خالية من MeOH / PBS في بئر واحد من لوحة 96 جيدا وضعت على شاكر المدارية.
  3. غسل SG ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل منهما في 0.1٪ توين-20/PBS على شاكر المدارية.
  4. الجفاف SG في سلسلة MeOH / PBS من قبل الحضانة اللاحقة في 50٪ MeOH / PBS، 70٪ MeOH / PBS، و 100٪ MeOH لمدة 10 دقائق لكل منهما على شاكر المداري.
  5. تخزين SG في -20 درجة مئوية في 100٪ MeOH بين عشية وضحاها.
  6. في اليوم التالي، قبل الحارة الحاضنة إلى 40 درجة مئوية. تحقق من درجة الحرارة باستخدام ميزان الحرارة.
  7. Rehydrate SG في عكس MeOH / PBS سلسلة (100 ٪ MeOH ، 70 ٪ MeOH / PBS ، 50 ٪ MeOH / PBS) لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
  8. غسل SG ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما في برنامج تلفزيوني.
  9. في غضون ذلك، ابدأ قبل الاحترار المسابير عن طريق الحضانة في 40 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، تليها التبريد لمدة 10 دقائق.
  10. احتضان SG في 200 ميكرولتر من بروتياز الثالث لمدة 15 دقيقة.
  11. اختياري: إجراء علاج أسود سوداني لإرواء الفلورة الذاتية وفقا للأقسام 2.3 و2.4 و2.8 من هذا البروتوكول إذا تم التخطيط لتلوين المناعة اللاحق.
  12. غسل SG في 200 ميكرولتر من 0.1٪ توين-20/PBS 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما على شاكر المدارية.
  13. اختياري: إذا كان من المرغوب فيه تلطيخ مشترك مع العديد من المسابير، تمييع القناة-2 (50x) وقناة-3 التحقيق (50x) في القناة-1 التحقيق (1x).
  14. تغطية SG مع 100 ميكرولتر من التحقيق لجين الفائدة واحتضان بين عشية وضحاها في 40 درجة مئوية مع هياج طفيف. ضع لوحة 96 بئرا في غرفة رطبة عند 40 درجة مئوية لجميع خطوات الحضانة.
    ملاحظة: تضمين SG واحد كتحكم سلبي، باستخدام مسبار ضد جين بكتيري (على سبيل المثال، اختزال ديهيدرو ديبيكولينات، داب)للتحقق من وجود ربط غير محدد لكواشف التضخيم في خطوات لاحقة.
  15. غسل SG في العازلة الغسيل الموردة 3x لمدة 15 دقيقة لكل منهما على شاكر المدارية.
  16. ما قبل الدافئة Amp1-3، HRP-C1، و HRP-مانع لRT. إذا كان من المرغوب فيه المشاركة في تلطيخ مع القناة-2 و /أو القناة-2 التحقيق، قبل الحارة HRP-C2 و HRP-C3.
  17. إعادة إصلاح SG لمدة 10 دقيقة في RT في 4٪ PFA / PBS على شاكر المدارية.
  18. غسل SG في 200 ميكرولتر من العازلة الغسيل الموردة 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما على شاكر المدارية في RT.
  19. للتضخيم، احتضان SG مع 100 ميكرولتر من Amp1 لمدة 35 دقيقة في 40 درجة مئوية على شاكر المداري.
  20. إزالة بعناية أي سائل وغسل SG في 200 ميكرولتر من العازلة الغسيل الموردة 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما في RT على شاكر المداري.
  21. احتضان SG مع 100 ميكرولتر من Amp2 لمدة 35 دقيقة في 40 درجة مئوية على شاكر المداري.
  22. كرر الخطوة 3.18.
  23. احتضان SG مع 100 ميكرولتر من Amp3 لمدة 20 دقيقة في 40 درجة مئوية على شاكر المداري.
  24. كرر الخطوة 3.18.
  25. احتضان SG مع 100 ميكرولتر من زودت Multix FL v2 HRP-C1 لمدة 20 دقيقة في 40 درجة مئوية على شاكر المداري.
  26. كرر الخطوة 3.18.
  27. إعداد الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع أوبال 1:1000 في 200 ميكرولتر من العازلة TSA الموردة واحتضان SG لمدة 35 دقيقة في 40 درجة مئوية على شاكر المداري. حماية من الضوء أثناء الحضانة ومن هذه الخطوة على.
  28. كرر الخطوة 3.18.
  29. احتضان SG في 100 ميكرولتر من زودت Multix FL v2 HRP-مانع لمدة 15 دقيقة في 40 درجة مئوية على شاكر المداري.
  30. كرر الخطوة 3.18.
  31. اختياري: للتلطيخ المشترك مع مسبار القناة-2، كرر الخطوات 3.25-3.30 مع Multix FL v2 HRP-C2 المزود.
  32. اختياري: للتلطيخ المشترك مع مسبار القناة-3، كرر الخطوات 3.25-3.30 مع Multix FL v2 HRP-C3 المزود.
  33. في حالة تلطيخ immunofluorescent اللاحقة، تنفيذ الخطوات 2.13-2.25 من هذا البروتوكول.
  34. احتضان في 1٪ BSA / PBS لمدة 30 دقيقة على شاكر المدارية.
  35. احتضان SG لمدة 30 دقيقة في 1 ميكروغرام / مل من bisbenzimide H33342 ثلاثي هيدروكلوريد (تلطيخ Hoechst) في 1٪ BSA / PBS إذا كان من المرغوب تلطيخ النووية و / أو إضافة اليكسا مقرونة جرثومة القمح agglutinin (WGA، 1:500) على شاكر المدارية.
  36. كرر الخطوة 3.18.
  37. تضمين كما هو موضح في الخطوات 2.19-2.22.

4. تصوير وتحليلات من العصابات الزبرجية مورين

  1. إجراء المجهر confocal من SG جزءا لا يتجزأ في منشأة التصوير المحلية.
  2. إذا كانت هناك حاجة إلى قياسات حجم الخلية، صورة SG ملطخة هيدروكسيلولاز التيروزين (انظر جدول المواد) في التكبير 200x واتخاذ 4-6 صور عشوائية من كل SG.
  3. تحليل الصور باستخدام برنامج ImageJ33 لتقدير حجم الخلية (على سبيل المثال، مع جدول القلم، راجع جدول المواد). استخدام اختيار اليد الحرة، ودائرة كل خلية وانقر على تحليل | قياس للحصول على منطقة الخلية. كن حذرا لتضمين الخلايا سليمة فقط، مرئية تماما التي تقع بشكل جيد داخل SG.
  4. باستخدام هذه الطريقة، قم بإجراء قياس لحوالي 100 خلية لكل SG.
  5. يكون المحقق أعمى تنفيذ الخطوات 4.2-4.3 إذا كنت ترغب في مقارنة SG من الفئران المختلفة. استخدام توزيع تردد في البرامج الإحصائية لتصور الاختلافات في الحجم بين المجموعات34.

5. التحليلات الجزيئية للغانجليا الزبرجية الزبرجية مورين

ملاحظة: تضمين عناصر التحكم اعتمادا على التصميم التجريبي الخاص بك. هذا يمكن أن يكون SG مع الأنماط الجينية المختلفة وخلفية المرض و / أو غيرها من العقد اللاإرادية، مثل العقدة عنق الرحم متفوقة متعاطفة (تقع في منطقة الرقبة، انظر وصفا مفصلا فيزيغلر وآخرون. 35)أو العقدة شبه متعاطفة (مثل العقدة داخل القلب، انظر Jungen وآخرون.4).

  1. إعداد أنبوب 2 مل مع 500 ميكرولتر من محلول الفينول / جوانيدين ثيوسيانات (على سبيل المثال، Qiazol) لكل ويكون النيتروجين السائل جاهزة لصدمة صقيع أو النظر في حلول تجارية لحماية الحمض النووي الريبي (اختياري، انظر جدول المواد)36. العمل بسرعة لعزل الجيش الملكي النيبالي.
  2. إجراء تشريح من SG كما هو موضح في الخطوات 1.1-1.13.
  3. تزج فورا كل من SG مباشرة في أنبوب واحد مع محلول الفينول / جوانيدين ثيوسياناتي وأنبوب الصدمة الصقيع في النيتروجين السائل.
  4. يخزن عند -80 درجة مئوية حتى يتم إجراء المزيد من المعالجة.
  5. لتحلل الأنسجة، والسماح أنابيب مع ذوبان SG حتى يتم تجليد محلول الفينول / guanidine thiocyanate وإضافة اثنين من حبات الفولاذ المقاوم للصدأ 7 ملم. قم بتهدئة الأجزاء المعدنية من متجانس الأنسجة (طاحونة الكرة أو الخلاط، على سبيل المثال، Tissue Lyser II) على الجليد الجاف والطرد المركزي عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  6. أنابيب الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجة مئوية بحيث SG هي في الجزء السفلي من الأنبوب.
  7. وضع أنابيب في الأجزاء المعدنية من الأنسجة Lyser والليس لمدة 1 دقيقة في 20 هرتز.
  8. كرر الخطوتين 5.6 و5.7 حتى 5 مرات حتى لا يمكن اكتشاف أي نسيج سليم.
  9. نقل السائل إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
  10. قم بإجراء عزل الحمض النووي الريبي مع مجموعة عزل الحمض النووي الريبي المستندة إلى العمود (على سبيل المثال، طقم miRNeasy المصغر) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  11. إلوت الجيش الملكي النيبالي في 20 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase وقياس التركيز باستخدام مطياف.
    ملاحظة: لاستبعاد تلوث الحمض النووي الريبي المنقى بالحمض النووي الجينومي، نقترح إجراء تفاعل متسلسل بوليمرازي مع التمهيديات الجينومية و1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي كقالب، بدلا من ذلك ناقص التحكم في النسخ العكسي. وهذا سيوفر كمية كبيرة من الحمض النووي الريبي. إذا كان الحمض النووي الريبي ملوثا، فاستخدم التمهيديات الحدودية exon-intron أو اللتمهيدات المحيطة بالانترون للتفاعل المتسلسل البوليميراز الكمي في الوقت الحقيقي اللاحق.
  12. استخدام 250 نانوغرام SG الجيش الملكي النيبالي لأداء توليف cDNA واستخدام البروتوكولات المنشأة. هنا، تم استخدام مجموعة النسخ العكسي cDNA عالية السعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  13. تمييع إلى تركيز نهائي من 2.5 نانوغرام / ميكرولتر من cDNA وأداء تفاعل سلسلة البوليميراز في الوقت الحقيقي الكمية مع المسابير المناسبة وفقا للبروتوكولات المعمول بها. هنا، TaqMan Assay (انظر جدول المواد)تم تنفيذها باستخدام 10 نانوغرام cDNA لكل رد فعل.
    ملاحظة: تنفيذ عنصر تحكم بلا قالب لكل جين لاستبعاد نتائج إيجابية خاطئة.
  14. تطبيع التعبير الجيني لجينك من الاهتمام على منزل حفظ الجينات (على سبيل المثال، Cdkn1b)لمقارنة التعبير الجيني النسبي بين مجموعات مختلفة من SG.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الشكل 1 تصور كيفية تحديد وتشريح SG. الشكل 1A يظهر رسم تخطيطي للموقع، في حين أن الشكل 1B يقدم وجهة نظر في الصدر بعد إزالة حزمة القلب والرئة. عضلات لونغوس كولي اليسار واليمين وسيطة من SG القفص الصدري هي معالم هامة للتوجيه. يتم إجراء تشريح على طول خطوط منقط بين العضلات والضلع الأول. تصبح مرئية SG وسلسلة متعاطفة كما هياكل بيضاء (الشكل 1C). الشكل 1D يظهر تكبير المنطقة بين العضلة اليسرى لونغوس كولي والضلع الأول، حيث يقع SG اليسار. يختلف مورفولوجيا SG بين الأفراد. وغالبا ما يتكون من الانصهار من عنق الرحم أدنى وأول إلى العقد الصدرية الثالثة24. بعض التنوع الذي يمكن أن نتوقع المجرب في مورين SG يصور في الشكل 1E, F, حيث يتم تصويرها اليسار واليمين SG من خمسة ذكور C57Bl6 الفئران نوع البرية.

تقييم نظرة عامة التشريحية الإجمالية، فضلا عن التحليلات الخلوية ودون الخلوية للخلايا في داخل SG القلب يمكن أن يؤديها تقنيات جبل كله على مستوى البروتين والجيش الملكي النيبالي. ويرد لمحة عامة عن مجموعة SG في الشكل 2. الألياف المتعاطفة عضلة القلب تنشأ من أجسام الخلايا في SG. يتم تصور هذه عن طريق تلطيخ مع الأجسام المضادة ضد هيدروكسيلوكس التيروزين (TH). ويحيط سوماتا العصبية التعبير عن TH من الألياف العصبية تلطيخ إيجابية لأسيتيل ترانسفيراز الكولين (ChAT). هذه هي على الأرجح ألياف presynaptic37،38. يتم تقديم التكبير المثالي من TH و ChAT المشاركة في وضع العلامات في الشكل 2A. يمكن تصور الخلايا الدبقية المحيطة بأجسام الخلايا العصبية عن طريق تلطيخ S100B. ويصور هذا في الشكل 2B في تركيبة مع علامة العصبي PGP9.5. الشكل 2C-F يظهر تحليلات مثالية لدراسة SG على مستوى دون الخلوية، وذلك باستخدام جبل كامل في التهجين الموقعي والمناعة التلطيخ المشترك. البروتين TH (الشكل 2C, أحمر) والجزيئات مرنا من Tubb3 (الشكل 2D, أبيض) وأعرب في أجسام الخلايا العصبية الكبيرة, في حين أن مرنا من S100b (الشكل 2E, الأخضر) هو أيضا الكشف عنها في الخلايا غليا المحيطة بها. في دمج (الشكل 2F), فمن الواضح أن بعض الخلايا العصبية سلبية لTH ولكن التعبير Tubb3, في حين يمكن أيضا الكشف عن S100b mRNAs في الخلايا المحيطة, كما هو مبين في التكبير في الشكل 2G.

الشكل 3 يقدم التحليلات الكمية المحتملة والمزالق لدراسة murine SG. صور من TH الملطخة SG(الشكل 3A)يمكن استخدامها لقياس حجم الخلية كما تم تنفيذ مثالي لنموذج الماوس من مرض السكري. وكانت سوماتا العصبية من السيطرة (db/het) SG 388.8 ± 123.8 ميكرومتر2 مقابل. في السكري SG (db/db) 407.33 ± 139.6 ميكرومتر2 (الشكل 3B، ن = 2 SG ، 100 خلية لكل SG لكل النمط الجيني ، P = 0.348 ، تمت مقارنة البيانات باستخدام اختبار مان ويتني). ويبين الشكل 3C التعبير عن الجينات من أنواع مختلفة من خلايا SG (ن = 6-7). تجميع كل من SG من واحد يسمح قياسات التعبير الجيني من ما يقرب من 24 المقايسات (12 الجينات في التكرارات). نحن عادة تطبيع عينات لCdkn1b (الكشف عن قيم Ct من 25.4 ± 0.97) ، فضلا عن علامة العصبية نيون / Rbfox3 (32.5 ± 0.7) إذا كان من الضروري لحساب أنواع الخلايا الأخرى ونقاء الخلايا العصبية للتشريح. الجينات التي وجدناها مفيدة لتميز العمليات الجزيئية في SG تشمل الجين المتعاطف Th (22.4 ± 1.6) ، دردشة، والتي يمكن أن تشير إلى التمايز الكوليني (أعرب في Ct قيم 30.8 ± 1.3) و Gap43، علامة على تنبت الخلايا العصبية (يمكن اكتشافها في قيم Ct من 22.4 ± 1.4). الجينات المعبر عنها في نوع الخلية غير العصبية تشمل S100b (للخلايا الدبقية، 27.3 ± 1.2)، كي-67 (للخلايا المنتشرة، 33.0 ± 1.6) وCD45 (للخلايا المناعية، 30.2 ± 1.1).

ويحيط SG من قبل كبسولة من النسيج الضام26, تصور عن طريق hematoxylin وتلطيخ ايوسين في الشكل 3D, E. في بعض الأحيان، لاحظنا وجود تناقضات في تلطيخ الأجسام المضادة كما هو موضح في الشكل 3F، على الأرجح بسبب إزالة غير مكتملة للكبسولة. في حين أن تلطيخ ChAT وTH يمكن اكتشافه فقط في بعض أجزاء من SG ، فإن مكافحة النواة الملطخة ب DAPI يمكن اكتشافها طوال الوقت. يفصل الخط المنقط في الصورة المدمجة التلطيخ الناجح (يمين الخط) عن التلطيخ غير الناجح (يسار الخط).

يتم تقديم البيانات على أنها متوسط الانحراف المعياري ±. وقد عرفت الأهمية الإحصائية بأنها قيمة P قدرها 0.05 <؛ وقيمة P تبلغ 0.05؛ وقيمة P 0.05؛ وقيمة P 0.05؛ وقيمة P تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام البرمجيات التجارية.

Figure 1
الشكل 1: الموقع ، تشريح ، ومورفولوجيا من العقدة الزبرجد مورين. (أ) الرسم التخطيطي لموقع ganglia ستيلاتي (SG). (ب) عرض في الصدر بعد إزالة حزمة القلب والرئة. ومن المهم ملاحظة أن الفريق لا يظهر على الفور معظم الوقت. وتقع عضلات الولي longus الجانبية من العمود الفقري. وتقع SG الجانبية من العضلات عند تقاطع مع الضلع الأول. تشريح الجانبي بعناية إلى العضلات (المنطقة التي تميزت خط منقط) للكشف عن ganglia. بعد تشريح، يمكن إجراء ganglia (اليسار واليمين، LSG و RSG، على التوالي) وسلسلة متعاطفة من أصل أبيض، هياكل طويلة. (ج) تشريح مثالي يظهر العصابات والمعالم التشريحية. (د)تكبير LSG. (E) LSG و (F) RSG من نوع البرية، تم تشريح الفئران C57Bl6 الذكور (16 أسبوعا) وتصويرها لإظهار الاختلافات في مورفولوجيا وحجم. يمثل شريط المقياس 1000 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تصور أنواع الخلايا المختلفة في العقدة ستيلاتين عبر الكيمياء المناعية جبل كامل والتهجين في الموقع. (A) نظرة عامة إجمالية من العقدة ستيلاتي مورين (SG) ملطخة لعلامة متعاطفة التيروزين هيدروكسيلولاز (TH) والكولين أسيتيل ترانسفيراز (ChAT). التكبير يظهر الهيئات الخلية TH إيجابية ووجود ChAT إيجابية، على الأرجح presynaptic، والألياف العصبية المحيطة سوماتا العصبية. (ب) يمكن تصور الخلايا الدبقية ensheathing الخلايا العصبية الهيئات عن طريق تلطيخ لS100B, هنا بالاشتراك مع علامة الخلايا العصبية PGP9.5. (C, D, E ,F) صور مجهرية من جبل واحد SG ملطخة كله عن طريق مزيج من الكيمياء المناعية لTH (الأحمر) والتهجين في الموقع لتوب3 (D، أبيض) وS100b (E، الأخضر). النوى ملطخة بال DAPI (أزرق). (F)يظهر دمج أن ليس كل الخلايا العصبية(Tubb3-إيجابية) هي TH إيجابية. يمكن الكشف عن S100b mRNAs داخل سوماتا الخلايا العصبية، ولكن أيضا الخلايا المحيطة بها، كما تميزت بسهم في التكبير في (G). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التحليلات الكمية المحتملة والمزالق. (أ)يمكن استخدام الصور من التيروزين هيدروكسي راز (TH) الملطخة SG لقياس حجم الخلية باستخدام ImageJ. (ب)تم تنفيذ هذا في نموذج الماوس من مرض السكري (100 خلية لكل SG، ن = 2 SG لكل النمط الجيني، تمت مقارنة البيانات باستخدام اختبار مان ويتني). (ج)الجينات المثالية التي أعرب عنها في SG التي قد تكون مفيدة لتميز العمليات الجزيئية. Cdkn1b وكذلك علامة العصبية نيون / Rbfox3 (لحساب وجود أنواع الخلايا الأخرى) يمكن استخدامها لتطبيع. التيروزين هيدروكسي راز(Th)بمثابة علامة متعاطفة, أستيل الكولين (دردشة) لحساسية التمايز, Gap43 لنبت الخلايا العصبية. الجينات التي أعرب عنها في أنواع الخلايا غير العصبية تشمل S100b (الخلايا الدبقية), كي-67 (الخلايا المنتشرة) وCD45 (الخلايا المناعية). (د) Hematoxylin و تلطيخ ايوسين من SG الفورماتين الثابتة تصور النسيج الضام والخلايا على رأس SG. (ه) التكبير من منطقة محاصر. (F)في بعض المناسبات، لاحظنا الفشل في تلطيخ الأجسام المضادة القائمة، على الأرجح بسبب إزالة غير مكتملة من الكبسولة. في حين ChAT (الأحمر) وTH (الأخضر) تلطيخ يمكن الكشف عنها فقط في بعض أجزاء من SG، نواة مضادة ملطخة DAPI (الأزرق الداكن) يمكن الكشف عنها في جميع أنحاء. يفصل الخط المنقط في الصورة المدمجة التلطيخ الناجح (يمين الخط) عن التلطيخ غير الناجح (يسار الخط). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

فهم العمليات الخلوية والجزيئية في الخلايا العصبية والخلايا الدبقية من الجهاز العصبي المتعاطف الذي يسبق ظهور VA هو من أهمية عالية، والسكتة القلبية المفاجئة لا يزال السبب الأكثر شيوعا للوفاة في جميع أنحاء العالم5. لذلك، في المخطوطة الحالية، نقدم مجموعة أساسية من الأساليب لتحديد مورين SG - عنصر مورين داخل هذه الشبكة - وإجراء تحليلات لاحقة على الحمض النووي الريبي والبروتين والمستوى الخلوي.

تحدي واحد من SG مورين هو حجمها وعدد محدود من الخلايا39. ونتيجة لذلك، وتستخدم نماذج مختلفة من الحيوانات، مثلالفئران 40،ال22،والخنازير41 للدراسات على SG. ومع ذلك ، هناك مجموعة متنوعة من نماذج الأمراض الراسخة للأنماط الظاهرية القلبية المتاحة في الفئران وبعضها قد تم توصيفه بالفعل في جوانب مختلفة من الداخلي القلب وعدم انتظام ضربات القلب ، مثل نماذج لمرض السكري23، احتشاء عضلة القلب42، أو التهاب عضلة القلب43. لذلك ، هناك ما يبرر إجراء مزيد من الدراسات على murine SG لزيادة توصيف الخلل اللاإرادي في ضوء VA. ويمكن استكمال هذه النهج الأخرى لدراسة داخليا لقلب مورين مثل التجارب الوظيفية4,23,44 بما في ذلك التحفيز في الجسم الحي من SG23.

نظرا لصغر حجمها وموقعها داخل تجويف الصدر24، فإن التلاعب ب murine SG في الجسم الحي أمر صعب ، على الرغم من أنه تم تنفيذه بنجاح23. لهذا السبب، تركز بعض الدراسات لذلك على العقدة عنق الرحم متفوقة، والتي تقع أكثر سهولة في الرقبة، المنبع من SG في سلسلة متعاطفة وراء التشعب السباتي في الشرايين السباتية الداخلية والخارجية24،35. وقد ثبت denervation القلب عن طريق إزالة العقدة عنق الرحم متفوقة لتخفيف التهاب عضلة القلب, تضخم, وضعف القلب بعد احتشاء عضلة القلب35. ومع ذلك ، من المهم أن نلاحظ أن العنق العنقي المتفوق ganglia innervate مناطق مختلفة من القلب ، وأبرزها الجانب الأمامي45. وبالإضافة إلى ذلك، جاء استعراض الأدب المتعمق مؤخرا إلى استنتاج مفاده أن دور العقدة عنق الرحم على التعصيب متعاطفة من القلب لا يزال غير واضح في البشر46. وهذا يسلط الضوء على أهمية توصيف SG لدراسات ال الداخلي متعاطفة القلب.

من المهم أن نلاحظ أن القلب ليس الهدف الوحيد من SG. من بين أمور أخرى, الرئتين47 والغدد العرقية في forepaw48 هي أيضا innervated من الألياف التي تنشأ في SG, هذا الأخير هي استثناء لعلم وظائف الأعضاء متعاطفة لأنها تعبر عن أستيل الكولين37. تتم دراسة الحصار المؤقت على SG فيما يتعلق بالعمليات الالتهابية في إصابة الرئةالحادة 49 أو لعلاج الهبات الساخنة وخلل النوم50؛ لذلك، قد توفر البروتوكولات الموجودة في متناول اليد مرجعا للأسئلة الميكانيكية في هذه المجالات. عند التركيز على نماذج أمراض القلب، ينبغي أن يوضع في الاعتبار لتفسير النتائج التي لا يمكن تمييز الخلايا العصبية القلبية من قبل مورفولوجيا أو خصائص الفيزيولوجيا الكهربائية من الخلايا العصبية غير القلبية51. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق تتبع الرجعية، وبالتالي تبين أن موقع الخلايا العصبية إسقاط إلى القلب لتكون موجودة في أجزاء كرانيو-وساطة من SG52.

بالإضافة إلى ذلك، من المهم أن نلاحظ أنه إلى جانب أنواع مختلفة من الخلايا العصبية، تتكون العقدة متعاطفة تتكون من غليا ensheathing، ما يسمى الخلايا الدبقية الأقمار الصناعية أو خلايا الأقمار الصناعية التي تميزت التعبير عن علامة الدبقية S100B53. في حين لا يعرف الكثير عن دور هذه الخلايا في أمراض القلب والأوعية الدموية ، تم وصف تنشيط الرجفان الدبقية والتعبير عن البروتين الحمضي الرجفانى (GFAP) في SG من المرضى الذين يعانون من عدم انتظام ضربات القلب18.

وينبغي أن تؤخذ في الاعتبار بعض المزالق مع الأساليب المعروضة: لاحظنا التناقضات في تلطيخ الأجسام المضادة القائمة في بعض المناسبات وافترضنا أن إزالة غير مكتملة من كبسولة النسيج الضام ensheathing SG قد يكون على خطأ، كما وصفت لتختلف في نفاذية بين أنواع مختلفة من ganglia26. وقد وصفت إزالة الميكانيكية للكبسولة باستخدام ملقط غرامة في العقدة عنق الرحم متفوقة من الفئران حتى يوم ما بعد الولادة 1028 وdesheathing مذكور في الأدب للفئران الكبار SG54،55 والفئران56. قد تختلف إزالة كبسولة SG بين سن28 و - بسبب اختلافات الحجم - الأنواع. في تجربتنا ، تشريح جديد ، وإزالة أكبر قدر ممكن من النسيج الضام باستخدام ملقط ناعم و permeabilization شامل كما هو موضح في البروتوكول في متناول اليد ، هي عوامل هامة لنجاح تلطيخ. وفيما يتعلق ب PCR الكمي في الوقت الحقيقي ، فإن العمل السريع والتحلل الفعال أمران أساسيان. تجميع كل من SGs من واحد يسمح بشكل موثوق لتحليل ما يصل إلى 12 جينات مختلفة (عند إجراء التكرارات).

على الرغم من أن وظيفة والتشريح الإجمالي من SG وقد درس لعقود الآن ويتم تنشيط كل عضلة القلب واحد من قبل ألياف متعاطفة46, لا تزال العديد من الأسئلة المفتوحة. على سبيل المثال، فإنه لا يزال من غير الواضح، لماذا الخلايا العصبية المتعاطفة من SG transdifferentiate عابرا إلى النمط الظاهري الكوليني في فشل القلب نقص التروية21 وغير الإقفارية، في النماذج الحيوانية وكذلك في المرضى20. في الآونة الأخيرة، وصفت مجموعتنا دور الخلايا الدبقية S100B إيجابية، والتي هي أيضا موجودة في SG مورين، على الأعصاب تنتشر في الجهاز العصبي القلبي29. ما إذا كانت هذه الخلايا ذات الصلة للأعصاب المتعاطفة تنتشر بعد الإصابة المرتبطة VA11,12, يحتاج إلى توضيح في الدراسات المستقبلية. الأهم من ذلك، يمكن أن تكمل النهج المبتكرة، مثل optogenetics52 وتحليلات النسخ36 الأساليب الراسخة مثل تتبع الخلايا العصبية من أجل تعميق فهم الجهاز العصبي المتعاطف ودوره في الفيزيولوجيا الكهربية القلبية.

في الختام ، تسمح هذه الذخيرة للمحقق عديم الخبرة بإجراء توصيف أساسي ل SG في نماذج مورين لأمراض القلب. ونأمل أن يحفز ذلك استخدام الأساليب الجديدة وتركيبها وخلقها. وهذا قد يساعد على زيادة فهم العمليات الخلوية والجزيئية الكامنة في الخلايا العصبية المتعاطفة التي قد تكون مسؤولة عن بداية وصيانة VA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

ويود المؤلفون أن يشكروا هارتفيغ ويبولدت على مساعدته التقنية الممتازة، ومرفق التصوير المجهري في المملكة المتحدة (Umif) التابع للمركز الطبي الجامعي هامبورغ - إيبيندورف على توفير المجاهر والدعم. تم تمويل هذا البحث من قبل DZHK (المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية) [FKZ 81Z4710141].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate TPP 92097 RNAscope
Adhesion Slides SuperFrost plus  25 x 75 x 1 mm R. Langenbrinck 03-0060 Microscopy
Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. Serva 11924.03 Whole mount staining
bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA B2261 Whole mount staining
Chicken anti neurofilament EMD Millipore AB5539 Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck, KGA, Darmstadt, Germany D8418 Whole mount staining
Donkey anti chicken IgY Alexa 647  Merck, KGA, Darmstadt, Germany AP194SA6 Whole mount staining
Donkey anti goat IgG Alexa 568  Thermo Fisher Scientific A11057 Whole mount staining
Donkey anti rabbit IgG Alexa 488  Thermo Fisher Scientific A21206 Whole mount staining
Drying block 37-100 mm Whatman (Sigma Aldrich) WHA10310992  Whole mount staining
Eosin Y Sigma Aldrich E4009 Whole mount staining
Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) Th.Geyer 2212.5000 Whole mount staining
Eukitt mounting medium AppliChem 253681.0008 Whole mount staining
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 Whole mount staining
Fluoromount-G + DAPI Southern Biotech 0100-20 Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferase EMD Millipore AP144P Whole mount staining
H2O2 30% (w/w) Merck, KGA, Darmstadt, Germany H1009 Whole mount staining
Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml Rotexmedica PZN: 3862340 Preparation SG
High-capacity cDNA reverse transctiption kit Life technologies  4368813 RNA isolation
Isoflurane (Forene) Abbott Laboratories 2594.00.00 Preparation SG
Mayer's hemalum solution Merck 1.09249.0500 Whole mount staining
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Whole mount staining
Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller Marienfeld 0101040 Whole mount staining
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 RNA isolation
NanoDrop 2000c Thermo Fisher Scientific ND-2000C RNA isolation
Opal 570 Reagent Pack Akoya Bioscience FP1488001KT RNAscope
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free  Alfa Aesar 43368 Whole mount staining
Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm Th.Geyer 7691202 Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tablets Gibco 18912-014 Whole mount staining
Pinzette Dumont SS Forceps FineScienceTools 11203-25 Preparation SG
QIAzol Lysis Reagent Qiagen  79306 RNA isolation
Rabbit anti tyrosine hydroxylase EMD Millipore AB152 Whole mount staining
RNAlater Merck R0901-100ML RNA isolation (optional)
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 biotechne (ACD) 323100 RNAscope
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 biotechne (ACD) 431738-C2 RNAscope
RNAscope Probe-Mm-Tubb3 biotechne (ACD) 423391 RNAscope
Stainless steel beads 7 mm  Qiagen  69990 RNA isolation
Sudan black B Roth 0292.2 Whole mount staining
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan mastermix Applied biosystems 4370074 Gene Expression analysis 
Tissue Lyser II Qiagen 85300 RNA isolation
Triton X-100 10% solution Sigma-Aldrich 93443-100ml Whole mount staining
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-100ML RNAscope
Wacom bamboo pen Wacom CTL-460/K Cell size measurements
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 Sigma-Aldrich WHA10311647 Whole mount staining
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate Thermo Fisher Scientific W21404 RNAscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldberger, J. J., Arora, R., Buckley, U., Shivkumar, K. Autonomic nervous system dysfunction: JACC focus seminar. Journal of the American College of Cardiology. 73 (10), 1189-1206 (2019).
  2. Jänig, W. Neurocardiology: a neurobiologist's perspective. The Journal of Physiology. 594 (14), 3955-3962 (2016).
  3. Meng, L., Shivkumar, K., Ajijola, O. Autonomic Regulation and Ventricular Arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 20 (5), (2018).
  4. Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
  5. Al-Khatib, S. M., et al. AHA/ACC/HRS Guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), 272 (2018).
  6. Yusuf, S., Wittes, J., Friedman, L. Overview of results of randomized clinical trials in heart disease: I. treatments following myocardial infarction. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 260 (14), 2088-2093 (1988).
  7. Sapp, J. L., et al. Ventricular tachycardia ablation versus escalation of antiarrhythmic drugs. New England Journal of Medicine. 375 (2), 111-121 (2016).
  8. Yasunaga, K., Nosaka, S. Cardiac sympathetic nerves in rats: Anatomical and functional features. The Japanese Journal of Physiology. 29 (6), (1979).
  9. Pardini, B. J., Lund, D. D., Schmid, P. G. Organization of the sympathetic postganglionic innervation of the rat heart. Journal of the Autonomic Nervous System. 28 (3), 193-201 (1989).
  10. Meyer, C., Scherschel, K. Ventricular tachycardia in ischemic heart disease: The sympathetic heart and its scars. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 549-551 (2017).
  11. Cao, J. M., et al. Relationship between regional cardiac hyperinnervation and ventricular arrhythmia. Circulation. 101 (16), 1960-1969 (2000).
  12. Ren, C., et al. Nerve sprouting suppresses myocardial Ito and IK1 channels and increases severity to ventricular fibrillation in rat. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 144 (1-2), 22-29 (2008).
  13. Zipes, D. P., et al. Treatment of ventricular arrhythmia by permanent atrial pacemaker and cardiac sympathectomy. Annals of Internal Medicine. 68 (3), 591-597 (1968).
  14. Kusumoto, F. M., et al. Systematic review for the 2017 AHA/ACC/HRS guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), (2018).
  15. Cronin, E. M., et al. 2019 HRS/EHRA/APHRS/LAHRS Expert Consensus Statement on Catheter Ablation of Ventricular Arrhythmias: Executive Summary. Heart Rhythm. , (2019).
  16. Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation in patients with refractory ventricular arrhythmias or electrical storm: Intermediate and long-term follow-up. Heart Rhythm. 11 (3), 360-366 (2014).
  17. Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation for refractory ventricular arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 69 (25), 3070-3080 (2017).
  18. Ajijola, O. A., et al. Inflammation, oxidative stress, and glial cell activation characterize stellate ganglia from humans with electrical storm. JCI insight. 2 (18), 1-11 (2017).
  19. Rizzo, S., et al. T-cell-mediated inflammatory activity in the stellate ganglia of patients with ion-channel disease and severe ventricular arrhythmias. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 224-229 (2014).
  20. Kanazawa, H., et al. Heart failure causes cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130-signaling cytokines in rodents. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 408-421 (2010).
  21. Olivas, A., et al. Myocardial infarction causes transient cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130. Journal of Neuroscience. 36 (2), 479-488 (2016).
  22. Yu, L., et al. Optogenetic Modulation of Cardiac Sympathetic Nerve Activity to Prevent Ventricular Arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 70 (22), 2778-2790 (2017).
  23. Jungen, C., et al. Increased arrhythmia susceptibility in type 2 diabetic mice related to dysregulation of ventricular sympathetic innervation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 317 (6), 1328-1341 (2019).
  24. Hedger, J. H., Webber, R. H. Anatomical study of the cervical sympathetic trunk and ganglia in the albino rat (Mus norvegicus albinus). Acta Anatomica. 96 (2), 206-217 (1976).
  25. Furlan, A., et al. Visceral motor neuron diversity delineates a cellular basis for nipple- and pilo-erection muscle control. Nature Neuroscience. 19 (10), 1331-1340 (2016).
  26. Al Khafaji, F. A. H., Anderson, P. N., Mitchell, J., Mayor, D. The permeability of the capsule of autonomic ganglia to horseradish peroxidase. Journal of Anatomy. 137 (4), 675-682 (1983).
  27. Armour, J. A., Murphy, D. A., Yuan, B. X., Macdonald, S., Hopkins, D. A. Gross and microscopic anatomy of the human intrinsic cardiac nervous system. Anatomical Record. 247 (2), 289-298 (1997).
  28. Fedoroff, S., Richardson, A., Johnson, M. I. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. (11051), 71-94 (2003).
  29. Scherschel, K., et al. Cardiac glial cells release neurotrophic S100B upon catheter-based treatment of atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (493), 1-12 (2019).
  30. Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
  31. Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
  32. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Bassil, G., et al. Pulmonary vein ganglia are remodeled in the diabetic heart. Journal of the American Heart Association. 7 (23), (2018).
  35. Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2018).
  36. Bayles, R. G., et al. Transcriptomic and neurochemical analysis of the stellate ganglia in mice highlights sex differences. Scientific Reports. 8 (1), 8963 (2018).
  37. Morales, M. A., et al. Localization of choline acetyltransferase in rat peripheral sympathetic neurons and its coexistence with nitric oxide synthase and neuropeptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11819-11823 (1995).
  38. Jimnez, B., Mora-Valladares, E., Zetina, M. E., Morales, M. A. Occurrence, co-occurrence and topographic distribution of choline acetyl transferase, met-enkephalin and neurotensin in the stellate ganglion of the cat. Synapse. 43 (3), 163-174 (2002).
  39. Ruit, K. G., Osborne, P. A., Schmidt, R. E., Johnson, E. M., Snider, W. D. Nerve growth factor regulates sympathetic ganglion cell morphology and survival in the adult mouse. Journal of Neuroscience. 10 (7), 2412-2419 (1990).
  40. Guo, J., et al. Involvement of P2Y 12 receptor of stellate ganglion in diabetic cardiovascular autonomic neuropathy. Purinergic Signalling. 14 (4), 345-357 (2018).
  41. Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
  42. Hinrichs, S., et al. Precursor proadrenomedullin influences cardiomyocyte survival and local inflammation related to myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (37), 8727-8736 (2018).
  43. Westermann, D., et al. Reduced degradation of the chemokine MCP-3 by matrix metalloproteinase-2 exacerbates myocardial inflammation in experimental viral cardiomyopathy. Circulation. 124 (19), 2082-2093 (2011).
  44. Johnsen, D., Olivas, A., Lang, B., Silver, J., Habecker, B. Disrupting protein tyrosine phosphatase σ does not prevent sympathetic axonal dieback following myocardial infarction. Experimental Neurology. 276, 1-4 (2016).
  45. Manousiouthakis, E., Mendez, M., Garner, M. C., Exertier, P., Makita, T. Venous endothelin guides sympathetic innervation of the developing mouse heart. Nature Communications. 5, 3918 (2014).
  46. Wink, J., et al. Human adult cardiac autonomic innervation: Controversies in anatomical knowledge and relevance for cardiac neuromodulation. Autonomic Neuroscience. 227, 102674 (2020).
  47. Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
  48. Schäfer, M. K. H., Schütz, B., Weihe, E., Eiden, L. E. Target-independent cholinergic differentiation in the rat sympathetic nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4149-4154 (1997).
  49. Chen, Y., et al. Effect of a Stellate Ganglion block on acute lung injury in septic rats. Inflammation. 41 (5), 1601-1609 (2018).
  50. Lipov, E. G., et al. Effects of stellate-ganglion block on hot flushes and night awakenings in survivors of breast cancer: a pilot study. The Lancet Oncology. 9 (6), 523-532 (2008).
  51. Mo, N., Wallis, D. I., Watson, A. Properties of putative cardiac and non-cardiac neurones in the rat stellate ganglion. Journal of the Autonomic Nervous System. 47 (1-2), 7-22 (1994).
  52. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
  53. Hanani, M. Satellite glial cells in sympathetic and parasympathetic ganglia: In search of function. Brain Research Reviews. 64 (2), 304-327 (2010).
  54. Larsen, H. E., Lefkimmiatis, K., Paterson, D. J. Sympathetic neurons are a powerful driver of myocyte function in cardiovascular disease. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  55. Hasan, W., et al. Sympathetic hyperinnervation and inflammatory cell NGF synthesis following myocardial infarction in rats. Brain Research. 1124 (1), 142-154 (2006).
  56. Lorentz, C. U., et al. Heterogeneous ventricular sympathetic innervation, altered β-adrenergic receptor expression, and rhythm instability in mice lacking the p75 neurotrophin receptor. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (6), 1652-1660 (2010).

Tags

الطب، العدد 166، الجهاز العصبي المتعاطف، العقد النجمية، الجهاز العصبي اللاإرادي داخل القلب، عدم انتظام ضربات القلب البطيني، علم الأشكال العصبية، الفيزيولوجيا الكهربية
الموقع، تشريح، وتحليل عصابة مورين ستيلاتي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scherschel, K., Bräuninger, H., … More

Scherschel, K., Bräuninger, H., Glufke, K., Jungen, C., Klöcker, N., Meyer, C. Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion. J. Vis. Exp. (166), e62026, doi:10.3791/62026 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter