Summary
心脏自主神经系统的病理生理变化，特别是其交感分支的病理生理变化，有助于心室心律失常的发病和维持。在本协议中，我们展示了如何描述粘膜结节，以增进对基础分子和细胞过程的理解。
Abstract
自主神经系统是心脏电生理学的一大驱动力。特别是其同情分支的作用是心室心律失常（VA）病理生理学中正在进行的研究。交感链的双子星形结构（SG） 中的神经元 是交感基础设施的重要组成部分。SG 是治疗难治 VA 患者通过心脏交感衰减而公认的治疗目标。虽然在SG的神经元重塑和胶质激活已经描述了VA患者，潜在的潜在的细胞和分子过程，潜在的心律失常开始之前，只是不够了解，应该阐明，以改善自主调节。小鼠模型允许我们研究交感神经元改造，但对缺乏经验的研究者来说，识别穆林SG是具有挑战性的。因此，许多常见的心脏病缺乏对穆林SG的深入细胞和分子生物学研究。在这里，我们描述了解剖和研究成年小鼠SG的基本剧目，用于RNA水平分析（基因表达分析的RNA分离，原位杂交）、蛋白质水平（免疫荧光全安装染色）和细胞水平（基本形态、细胞大小测量）。我们提出潜在的解决方案，以克服制备技术中的挑战，以及如何通过淬火自流来改善染色。这允许通过既定标记对神经元和胶质细胞进行可视化，以确定细胞组成和重塑过程。这里介绍的方法允许SG的特征获得关于容易发生VA的小鼠自主功能障碍的进一步信息，并可以辅之以额外的技术来研究心脏自主神经系统的神经元和胶质成分。
Introduction
心脏自主神经系统是一种受严格控制的交感、寄生和感官成分的平衡，使心脏能够适应环境变化，并具有适当的生理反应1，2。这种平衡的干扰，例如，同情活动的增加，已被确定为发病和维持心室心律失常（VA）3，4的关键驱动因素。因此，自主调制，通过药理学减少与β阻滞剂的交感活性，一直是治疗VA患者几十年的基石5，6。但是，尽管药理学和导管为基础的干预，相关数量的患者仍然患有复发性VA7。
对心脏的交感输入主要通过交感链的双星形结构——神经元细胞体进行中介，这种结构通过无数的胸内神经从脑干传递信息到心脏8、9、10。受伤后从SG发芽的神经与VA和心脏骤死11，12有关，强调SG作为自主调制的目标13，14。通过局部麻醉剂的皮下注射或通过视频辅助胸腔镜检查15、16部分切除SG，可以暂时减少对心脏的交感输入。心脏交感衰竭为治疗难治VA的患者提供了一个选择，结果有希望的结果14，16，17。我们从这些患者的外植SG中了解到，神经元和神经化学改造、神经炎症和胶质活化是同情性重塑的标志，可能有助于或加重自主功能障碍18，19。尽管如此，这些神经元中潜在的细胞和分子过程至今仍然模糊不清，例如，神经元分化成胆碱表型20，21的作用。实验研究提出了治疗VA的新方法，例如，通过光遗传学22减少交感神经活动，但SG的深度表征仍然缺乏许多心脏病理与VA齐头并进。模仿这些病理学的小鼠模型可以研究神经元重塑，这可能先于心律失常12，23的发生。这些可以通过进一步的形态和功能分析来完成，以实现心脏和神经系统的自主特征。在本协议中，我们提供了一系列基本的方法，允许解剖和描述 Murine SG，以增进对 VA 的理解。
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Protocol
所有涉及动物的程序都得到汉堡州动物护理和使用委员会（ORG870，959）和北莱茵-威斯特法伦州自然、环境和消费者保护局（LANUV，07/11）的批准，并符合国家卫生研究院的实验室动物护理和使用指南（2011年）。研究使用男性和女性（10-24周）C57BL/6小鼠（库存号000664，杰克逊实验室）和小鼠同源性（db/db）或异质性（db/het：控制）为糖尿病自发突变（Leprdb：Bks.Cg-Dock7m+/+ 勒普db/J，股票号000642，杰克逊实验室）。作者已经使用手头的协议，对60周以上的小鼠没有变化。
1. 木质刺结的定位和解剖
注：尽管描述和图纸大多在较大的物种中可用，但一些出版物以前曾分别使用解剖方法和荧光记者线描述SG在24 只大鼠和25 只小鼠中的位置。
- 准备50mL的冰冷（3-4°C）肝素化（20单位/mL，见 材料表）磷酸盐缓冲盐水（PBS）。在室温下对 SG 进行解剖 （RT）。
- 根据机构和地方指南，通过吸入3%-5%异黄素对鼠标进行深度麻醉。通过失去踏板戒断反射来验证足够的麻醉。斩首小鼠或进行颈椎错位。
注：不正确的颈椎错位可能导致脊椎破裂和胸血管损伤，导致出血，从而阻碍交感链的准备或切除，使SG处于不正确的位置。因此，让有经验的人员在深度消沉中进行颈椎错位或斩首动物是至关重要的。 - 用乙醇喷洒皮肤，用梅奥剪刀和窄图案钳子沿着前轴线打开胸腔。切开隔膜，取出肋骨的前部。
- 使用伦敦钳子将主动脉和静脉卡瓦抓住隔膜上方，并用斯特拉比斯谟剪刀切割靠近下脊柱的所有血管和结缔组织，从而去除心肺包。
- 使用塑料一次性移液器用肝素化 PBS 彻底冲洗胸腔，直到去除所有血液痕迹。
- 将躯干置于立体显微镜制备双筒望远镜下，确保胸腔内具有外部光源的良好照明。
- 找到第一根肋骨和朗格斯科利肌肉。
注：SG位于双边位置，平行于脊柱在第一根肋骨和脊柱之间的分支，在一个凹槽横向到隆格斯科利肌肉24。SG 的平侧位于朗格斯科利肌肉附近。根据准备情况，交感链的某些部分可能已经可见为与脊柱平行的白色斜纤维。这些可追溯到 SG。 - 轻轻地使用杜蒙#5/45钳子的尖端，将结缔组织横向暴露在长腹肌上。
- 将钳子转动 180°，然后使用平侧抓住 SG，并以最小的压力将其拉出。
- 重复第二个 SG。
- 将两个 SG 放在装满冷 PBS 的盘子（直径 6 厘米）中，并以适当的放大倍数进行检查。如有必要，去除多余的血管、脂肪组织和较大的神经。
注：自主结肠被一个结缔组织胶囊包围，由胶原纤维和成纤维细胞26，27组成。这些胶囊的渗透性似乎因物种而异，不同种类的黑帮26岁和28岁。使用 Dumont #5/45 钳子以及如有必要，使用弹簧剪刀去除尽可能多的结缔组织。 - 根据实验目标，继续执行本协议的第 2、3 或 5 节。
2. 全安装免疫造血化学协议
注：此协议是根据心脏整个安装染色4，29改编而成的。在 96 井板的一口井中为每个 SG 执行孵化步骤，并将 100 μL（用于含抗体解决方案）到 200 μL（用于所有其他解决方案）的解决方案进行孵化，以确保完全覆盖。定期用双筒望远镜检查 SG 的覆盖范围并正确浸入。手动取出液体时，配有 200 μL 移液器，在 200 μL 尖端上再加一个 10 μL 尖端。这将防止移液器尖端中 SG 的吸入。使用新制备的溶液和无菌液体来防止细菌生长。
- 修复 Sg 的组织学 2 小时在 Rt 在 4% 无甲醇副甲醛 （Pfa） / Pbs 。
- 尽快处理 SG，但此时 PBS 中的钠酸钠含量为 0.02%（w/v），可在 PBS 的 4-6 °C 下存储 2-4 周。
- 准备苏丹黑股解决方案（1%苏丹黑色w/v在100%乙醇），以减少自动荧光和改善信号到背景比30。在 RT 的磁搅拌器上溶解 2-3 小时。
注：使用库存溶液最多 6-8 周，在出现沉降时提前丢弃。 - 准备苏丹黑色工作解决方案，通过离心的库存溶液30分钟全速（13，000 x g）去除碎片和稀释库存70%乙醇到最终浓度0.25%苏丹黑色。
- 用登特的漂白剂治疗SG，以改善抗体渗透31。通过混合甲醇 （MeOH）、过氧化氢溶液 30% （w/w） 在 H2O 中和二甲基硫氧化物 （DMSO） 的比例为 4：1：1，新鲜准备登特的漂白剂。每 SG 添加 200 μL，并将板放置在轨道摇床上 1 小时 RT。
- 在轨道摇床上孵育 10 分钟，进行降压 MeOH 系列以进行补液：100% MeOH、75% MeOH/PBS、50% MeOH/PBS、25% MeOH/PBS。
- 在 RT 的 PBS/1% Triton-X-100 中，通过两次孵育 SG 进行 60 分钟，从而执行渗透。
- 从 SG 中删除渗透解决方案，并添加苏丹黑色工作解决方案。在轨道摇床的 RT 上孵育 2 小时。
- 同时，通过在 PBS 中加入 5% 受体级牛血清白蛋白 （BSA） 和 0.1% Triton-X-100（15 mL 容器），并让它在滚筒摇床上溶解约 5-10 分钟，从而准备阻塞溶液。通过预褶皱纸过滤器去除碎屑。
- 通过倾斜板和小心地从直立侧管道去除苏丹黑色非常小心。
注：不可能看到苏丹的SG是黑色的。使用强光源并缓慢工作。从这一步开始，SG 被染黑，提高了可见度。如果此时在 SG 周围看到任何其他结缔组织，请使用 Dumont #5/45 钳子和弹簧剪刀将其取出。 - 加入 200 μL 的 PBS/0.1% 特里顿-X-100 （PBS-T），在轨道摇床的 RT 上洗 5 分钟。
- 用移液器吸气，然后重复 2 次，以去除 PBS-T。
- 删除 PBS;加入 200 μL 的阻塞溶液，并在轨道摇床上在 4 °C 的夜间孵育。
- 第二天，通过在阻塞溶液中添加主要抗体来准备解决方案。从既定协议中调整抗体浓度。
注：包括一个SG作为抗体控制没有原发性抗体（孵化与抗原预吸收抗体或IgG，如果可用，或阻塞缓冲）。 - 在轨道摇床上执行 36-48 h 的初级抗体孵化，在 4 °C 下进行。对于细胞大小测量和交感神经元的染色，请使用抗酪氨酸羟基酶的抗体（请参阅抗体建议 材料表 ）。
注意：将 96 井板放在湿室（例如，内衬 ddH2O 湿纸巾的塑料盒），以防止此时蒸发。 - 小心地去除抗体溶液，并添加 200 μL 的 PBS-T。将板放在轨道摇床上30分钟。
- 移除 PBS-T 并重复洗涤步骤 5 次。
- 使用前全速（13，000 x g）离心荧光亚历克萨标签的二级抗体，准备二次抗体工作解决方案1分钟。根据阻塞溶液中的主要抗体 1：500 稀释适当的二级抗体，如果需要核染色，则添加到 SG. 添加 1 μg/mL 的双苯酰胺 H33342 三氯化氢（霍奇斯特染色）。在轨道摇床的 4 °C 下孵育 12-24 小时。
- 小心地取下抗体溶液，并添加 200 μL 的 PBS-T。将板放在轨道摇床上30分钟。
- 移除 PBS-T 并重复洗涤步骤 5 次。对于最后一步，使用没有特里顿的 PBS。
- 要嵌入，请将 50-100 μL 的荧光安装介质（参见 材料表）涂抹在玻璃滑梯上，并放置在准备的双筒望远镜下。使用 Dumont #5/45 钳子从 96 井板中取出 SG，并通过将一端浸入滤纸（例如 Whatman 干燥垫）中去除多余的液体，并将其放在掉落处。
- 使用杜蒙#5/45 钳以适当的放大镜校正定位。
- 轻轻地将玻璃盖片（20 毫米 x 20 毫米）放在 SG 旁边，然后慢慢下降。
注意：使用过多的安装介质会导致 SG 运动或神经缠绕。如果发生这种情况，请快速取下盖唇并重复步骤 2.9-2.21。 - 让滑梯在 RT 的黑暗中干燥过夜。在 4 °C 下，至少可以储存 4-6 周。
3. 全安装就地杂交
注：SG的全安装原位混合体由corti32 器官和商业RNA荧光原位协议（见 材料表）改编而成。从供应商那里获得感兴趣的基因、缓冲和解决方案的探针。所有孵化步骤均在 RT 执行，如果不提及，则不进行。使用无菌 PBS。如果有兴趣在一口井中染色多个 SG，请使用至少 150 μL 的缓冲器和解决方案。
- 执行步骤 1.1-1.13 中描述的 SG 解剖。
- 固定 SG 1 h 在 200 μL 的 4% 无 MEOH PFA/PBS 在一口井的 96 井板放置在轨道摇床。
- 在轨道摇床上以 0.1% Tween-20/PBS 为 30 分钟清洗 SG 三次。
- 脱水 SG 在 MeOH/PBS 系列中，通过随后在 50% MeOH/PBS、70% MeOH/PBS 和 100% MeOH 中孵育，每个在轨道摇床上 10 分钟。
- 将 SG 存储在 -20 °C 的 100% MeOH 过夜。
- 第二天，将孵化器预热至40°C。 使用温度计检查温度。
- 在反向 MeOH/PBS 系列（100% MeOH、70% MeOH/PBS、50% MeOH/PBS）中补充水合 SG，每次 10 分钟。
- 在 PBS 中，每次清洗 SG 三次，每次 5 分钟。
- 同时，在 40 °C 的潜伏期 10 分钟开始预热探测器，然后冷却 10 分钟。
- 在 200 μL 的蛋白酶 III 中孵育 SG 15 分钟。
- 可选：如果计划进行后续免疫荧光染色，则根据本协议第 2.3、2.4 和 2.8 节执行苏丹黑色处理以淬火自动荧光。
- 在轨道摇床上以 0.1% Tween-20/PBS 3x 的 200 μL 清洗 SG，每次 5 分钟。
- 可选：如果需要与多个探头共染污，则稀释通道-2 （50 倍） 和第 3 频道探头 （50 倍） 在第 1 频道探头 （1x）中。
- 用100微升的探针覆盖SG，寻找感兴趣的基因，并在40°C下在夜间孵育，并轻微激动。将 96 井板放置在 40 °C 的湿室中，用于所有孵化步骤。
注：包括一个SG作为负控制，使用对细菌基因（如二氢二聚二甲酸酯还原酶 ，Dapb）的探针，以检查在以后的步骤中放大试剂的非特异性结合。 - 在提供洗涤缓冲器中清洗 SG，每次在轨道摇床上清洗 15 分钟。
- 预热 Amp1-3、HRP-C1 和 HRP 拦截器到 RT。如果需要与通道-2和/或通道-2探头共同染色，则需要预热 HRP-C2 和 HRP-C3。
- 在轨道摇床上以 4% PFA/PBS 在 RT 中重新修复 SG 10 分钟。
- 在 Rt 的轨道摇床上以 200 μL 的供应洗涤缓冲器 3 倍清洗 Sg， 每次 5 分钟。
- 为了放大，在轨道摇床上用 100 μL 的 Amp1 孵育 SG，在 40 °C 下进行 35 分钟。
- 小心地取出任何液体，在轨道摇床的 RT 上用 200 μL 的供应洗涤缓冲器 3x 清洗 SG，每次 5 分钟。
- 在轨道摇床上用 100 μL 的 Amp2 孵化 SG，在 40 °C 下进行 35 分钟。
- 重复步骤 3.18。
- 在轨道摇床上用 100 μL 的 Amp3 孵化 SG 20 分钟，在 40 °C 下。
- 重复步骤 3.18。
- 在轨道摇床上以 100 μL 的多路复用 FL v2 HRP-C1 孵育 SG 20 分钟，在 40 °C 处使用。
- 重复步骤 3.18。
- 准备蛋白石结合的二级抗体 1：1，000 在 200 μL 提供的 TSA 缓冲和孵育 SG 35 分钟在 40 °C 的轨道摇床。在孵化过程中和从这一步开始时，要防止光线照射。
- 重复步骤 3.18。
- 在轨道摇床上以 100 μL 的多路复用 FL v2 HRP 阻滞器在 40 °C 处孵育 SG 15 分钟。
- 重复步骤 3.18。
- 可选：用于与通道-2探头共同染色，重复步骤 3.25-3.30 与提供的多路复用 FL v2 HRP-C2。
- 可选：用于与通道-3探头共同染色，重复步骤 3.25-3.30 与提供的多路复用 FL v2 HRP-C3。
- 如果随后发生免疫荧光染色，执行本协议的第 2.13-2.25 步。
- 在轨道摇床上以 1% BSA/PBS 孵育 30 分钟。
- 如果需要核染色，在 1 μg/mL 的双苯甲酰胺 H33342 三氯化氢 （霍奇斯特染色） 中孵育 SG 30 分钟，如果需要核染色，并/或在轨道摇床上添加亚历克萨耦合小麦胚芽凝胶素 （WGA， 1：500）。
- 重复步骤 3.18。
- 按步骤 2.19-2.22 中描述的嵌入。
4. 木质结肠的成像和分析
- 在本地成像设备中对嵌入式 SG 进行共聚焦显微镜检查。
- 如果需要细胞大小测量，图像SG染色酪氨酸羟基酶（见 材料表）在200倍放大，并采取4-6随机图像从每个SG。
- 使用 ImageJ33 软件分析图像以估计单元格大小（例如，使用笔表，参见 材料表）。使用 免费手选择，圈每个单元格，然后单击 分析|测量 获取细胞区域。小心只包括位于 SG 内的完整、完全可见的细胞。
- 使用此方法，执行每 SG 约 100 个细胞的测量。
- 如果你想比较来自不同老鼠的 SG，请让失明的调查员执行步骤 4.2-4.3。使用统计软件中的频率分布来可视化第 34组之间的大小差异。
5. 穆林·斯特拉特结帮的分子分析
注意：根据您的实验设计，包括控制。这可能是具有不同基因型和疾病背景和/或其他自主结节的SG，如交感优越的宫颈结节（位于颈部区域，见齐格勒等人的详细描述）或寄生性结节（如颅内结节，见君根等人）。
- 准备一个2mL管与500微升的酚/瓜尼丁硫氰酸酯溶液（例如，Qiazol）每只动物，并有液氮准备防震霜或考虑商业解决方案，以保护RNA（可选，见材料表）36。快速进行RNA隔离。
- 执行步骤 1.1-1.13 中描述的 SG 解剖。
- 立即将两个 SG 直接浸入一个管中，用酚/瓜尼丁硫氰酸酯溶液和冲击霜管浸入液氮中。
- 在 -80 °C 下存放，直到进一步处理。
- 对于组织裂解，让带有 SG 解冻的管子解冻，直到苯酚/瓜尼丁硫氰酸酯溶液液液化，并添加两个 7 mm 不锈钢珠。在 4 °C 的干冰和离心机上冷却组织同质化器（球或搅拌机，例如组织 Lyser II）的金属部件。
- 离心管在 500 x g 1 分钟在 4 °C，使 SG 在管的底部。
- 将管子放入组织莱瑟的金属部件中，在 20 Hz 处将 1 分钟置于莱塞和莱塞中 1 分钟。
- 重复步骤 5.6 和 5.7 最多 5 次，直到无法检测到完整的组织。
- 将液体转移到新鲜的 1.5 mL 管中。
- 根据制造商的说明，使用基于柱的RNA隔离套件（例如 miRNeasy 迷你套件）执行 RNA 隔离。
- Elute RNA 在 20 μL 的无 RNase 水中，使用光谱光度计测量浓度。
注：为了排除纯RNA与基因组DNA的污染，我们建议用基因组引物和1微升RNA作为模板进行聚合酶链式反应，而不是减去反向转录酶控制。这将节省大量的RNA。如果RNA被污染，请使用外在内子边界引物或内侧引物进行后续定量实时聚合酶链反应。 - 使用 250 ng SG RNA 执行 cDNA 合成并使用已建立的协议。在这里，根据制造商的说明使用大容量 cDNA 反向转录套件。
- 稀释到 cDNA 的 2.5 ng/μL 的最终浓度，并根据既定协议与适当的探头进行定量实时聚合酶链式反应。在这里，塔克曼检测（见 材料表）使用10 ng cDNA每反应进行。
注：对每个基因执行无模板控制，以排除误报结果。 - 使你感兴趣的基因在家养基因上的基因表达正常化（例如 ，Cdkn1b），以比较不同组的SG之间的相对基因表达。
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Representative Results
图 1可视化如何识别和解剖 SG.图 1A显示了位置的示意图图，而图 1B在切除心肺包后将视图呈现到胸腔中。左和右长部的科利肌肉从 SG 和肋骨笼是方向的重要地标。解剖是沿着肌肉和第一根肋骨之间的虚线进行的。SG 和交感链变得可见为白色结构（图 1C）。图 1D显示了左长腹肌和第一根肋骨之间的区域放大，左侧 SG 位于此位置。SG 的形态因人而异。它通常包括低劣的宫颈的融合和第一到第三胸结24。实验者可以期待在木质SG的一些品种被描绘在图1E，F，其中左右SG的5个雄性C57Bl6野生型小鼠被拍摄。
通过蛋白质和RNA水平的整个安装技术，可以评估总解剖概览，以及细胞和细胞子细胞分析，分析心脏内侧的SG细胞。图2中介绍了SG的概况。心肌交感纤维来自SG中的细胞体。这些通过涂上抗酪氨酸羟基酶（TH）的抗体来可视化。TH表达神经元索玛塔被神经纤维包围，对胆碱乙酰转移酶（ChAT）呈阳性。这些最有可能是早熟纤维37，38。图2A中介绍了TH和ChAT共同标签的模范放大倍率。神经元细胞体周围的胶质细胞可以通过S100B的染色来可视化。图2B中结合神经标记 PGP9.5 描绘了这一点。图2C-F显示了在子细胞水平上研究SG的示范性分析，使用整个坐骑原位杂交和免疫荧光共染。Tubb3（图2D，白色）的蛋白质TH（图2C，红色）和mRNA分子在大型神经元细胞体中表达，而S100b（图2E，绿色）的mRNA在周围的胶质细胞中也可检测到。在合并（图2F），它可见，一些神经元是阴性的TH，但表达Tubb3，而S100b mRNA也可以检测到周围的细胞，如图2G的放大图所示。
图3为研究受TH染色SG（图3A）的粘胶SG图像提供了潜在的定量分析和陷阱，可用于细胞大小测量，作为糖尿病小鼠模型的典范。神经元索玛塔从控制 （db/het） SG 是 388.8 ± 123.8 μm2与. 在糖尿病 SG （db/db） 407.33 ± 139.6 μm2 （图 3B， n = 2 SG， 每个 SG 每个基因型 100 细胞， P = 0.348， 数据使用曼 - 惠特尼测试进行比较）.图3C显示来自SG（n = 6-7）不同细胞类型的基因的表达。将两种SG从一种动物中汇集出来，可以测量大约24个测定（12个重复基因）的基因表达测量。如果有必要考虑其他细胞类型和解剖的神经元纯度，我们通常会对Cdkn1b的样本（检测值为 25.4 ± 0.97）以及神经元标记Neun/Rbfox3（32.5 ± 0.7）进行正常化。我们发现用于描述SG分子过程的基因包括交感基因Th（22.4±1.6），Chat，它可以表示胆碱变异（在Ct表达） 值 30.8 ± 1.3） 和Gap43，神经元发芽的标记 （可检测到 Ct 值 22.4 ± 1.4） 。 非神经元细胞类型表达的基因包括S100b（用于胶质细胞，27.3±1.2）、Ki-67（用于增殖细胞，33.0±1.6）和Cd45（用于免疫细胞，30.2±1.1）。
SG被一个结缔组织26胶囊包围，通过血氧林和eosin染色在图3D，E可视化。有时，我们观察到抗体染色不一致，如图3F所示，很可能是由于胶囊的不完全去除。虽然 ChAT 和 TH 染色仅在 SG 的某些部分可检测到，但始终可以检测到带有 DAPI 的核计数器。合并图像中的虚线将成功的染色（线的右侧）与不成功的染色（线的左侧）区分开来。
数据被表示为平均±标准偏差。统计意义被定义为P值为<0.05：统计分析是使用商业软件进行的。
图1：木质结节的位置、解剖和形态。 （A） 存根结节位置的示意图图（SG）。（B） 切除心肺包后查看胸腔。请务必注意，SG 在大部分时间内不会立即可见。长丝科利肌肉位于脊柱的横向位置。SG 位于与第一根肋骨交界处的肌肉的横向位置。仔细解剖横向肌肉（以虚线标记的区域），以发现黑帮。解剖后，结节（左和右，LSG和RSG，分别）和交感链可以制成白色，长的结构。（C） 一个示范性的解剖，显示黑帮和解剖地标。（D） LSG 的放大。（E） LSG和（F）RSG从野生类型，雄性C57Bl6小鼠（16周）被解剖和拍照，以显示形态和大小的变化。秤杆代表 1，000 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：通过全坐骑免疫造血术和原位杂交，可视化木质结石结石中不同细胞类型的可视化。 （A） 为同情标记酪氨酸羟基酶 （TH） 和胆碱乙酰转移酶 （ChAT） 染色的穆林石榴石 （SG） 的粗总概述。放大图显示了TH阳性细胞体和周围神经元躯体周围具有 CHAT 阳性（最有可能是先天性）神经纤维。（B） 通过染色S100B，这里结合神经元标记PGP9.5，可以可视化包裹神经元细胞体的胶质细胞。（C， D， E ，F）来自一个 SG 的微观图像通过 TH（红色）免疫造血术和Tubb3 （D、白色） 和S100b （E、绿色） 的原位杂交组合染色整个坐骑。核与 DAPI（蓝色）进行反制。（F） 合并表明并非所有神经元（Tubb3阳性）细胞都是TH阳性。S100b mRNA 可以在神经元 somata 中检测到，也可以在周围细胞中检测到，如放大镜中的箭头（G）。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：潜在的定量分析和陷阱。（A） 来自酪氨酸-羟基酶 （TH） 染色 SG 的图像可用于使用 ImageJ 进行细胞大小测量。（B） 这是在糖尿病小鼠模型中执行的（每SG100个细胞，每个基因型2个SG，数据使用曼-惠特尼测试进行比较）。（C） 在SG中表达的示范基因，可能有助于分子过程的特征。Cdkn1b以及神经元标记Neun/Rbfox3（用于解释其他细胞类型的存在）可用于正常化。酪氨酸羟基酶（Th） 作为交感标记， 胆碱乙酰转移酶 （聊天） 用于胆碱转分， Gap43用于神经元发芽。非神经元细胞类型表达的基因包括S100b（胶质细胞）、Ki-67（增殖细胞）和Cd45（免疫细胞）。（D） 甲氧西林和蛋白染色剂的正式固定SG可视化结缔组织和细胞在SG（E）的顶部放大从盒装区域。（F） 在某些场合，我们观察到抗体染色失败，很可能是由于胶囊的不完全去除。虽然 ChAT（红色）和 TH（绿色）染色仅在 SG 的某些部分可检测到，但始终可以检测到带有 DAPI（深蓝色）的核计数器。合并图像中的虚线将成功的染色（线的右侧）与不成功的染色（线的左侧）区分开来。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
对VA发病前交感神经系统神经元和胶质细胞的细胞和分子过程的理解是高度关注的，因为心脏骤停仍然是全世界最常见的死因。因此，在当前的手稿中，我们提供了一系列基本的方法来识别该网络中的穆林 SG - 喃喃元素 ， 并随后对 RNA、蛋白质和细胞水平进行分析。
Murine SG的一个挑战是它的大小和有限的细胞数量39。因此，不同的动物模型，如老鼠40，狗22，猪41用于研究SG。尽管如此，在小鼠中仍有各种成熟的心脏表型疾病模型，其中一些已经在心脏内化和心律失常的不同方面具有特征，如糖尿病23、心肌梗塞42或心肌炎43。因此，有必要进一步研究穆林SG，以进一步描述自主功能障碍的VA。这些可以通过其他方法来研究穆林心脏的内侧，如功能实验4，23，44，包括体内刺激SG23。
由于其体积小，位置在胸腔24，操纵在体内的穆林SG是具有挑战性的，虽然它已经成功地进行了23。因此，一些研究集中在优越的颈椎结节，这是位于更方便的颈部，上游的SG在同情链背后的胡萝卜分叉成内外胡萝卜动脉24，35。心脏衰竭通过去除优越的颈椎结节已被证明可以减轻心肌炎症，肥大和心肌功能障碍后心肌梗塞35。然而，重要的是要注意，优越的颈椎结节内侧心脏的不同区域，最突出的是前侧45。此外，最近一项深入的文献综述得出结论，宫颈结节对心脏内侧的同情作用在人类中仍不清楚。这突出了SG在心脏交感内侧研究中描述其特征的重要性。
需要注意的是，心脏不是 SG 的唯一目标。其中，肺47 和汗腺在前48 也内脏纤维起源于SG，后者是同情生理学的例外，因为他们表达胆碱乙酰转移酶37。研究SG的暂时封锁，以治疗急性肺损伤49 的炎症过程或治疗潮热和睡眠功能障碍50：因此，手头的协议可能会为这些领域的机械问题提供一个剧目。在关注心脏病模型时，应牢记对心脏神经元不能与非心脏神经元51的形态或电生理特性区分的结果的解释。这可以通过逆行追踪来实现，因此向心脏投射的神经元的位置被证明位于SG52的颅介质部分。
此外，重要的是要注意，除了不同类型的神经元，交感结石是由包裹的胶质，所谓的卫星胶质细胞或卫星细胞标记的胶质标记S100B53的表达。虽然对这些细胞在心血管病理学中的作用知之甚少，但从18岁心律失常患者中，SG中描述了胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的胶质活化和表达。
一些陷阱应该记住所呈现的方法：我们观察到在某些场合基于抗体的染色不一致，并假设不完全去除连接组织胶囊包裹SG可能有故障，因为它们被描述为不同类型的结石26的渗透性不同。在《大鼠颈椎》中，使用细钳机械切除胶囊，直至产后第1028天，在文献中提到成年大鼠SG 54、55和小鼠56。去除SG胶囊可能因年龄差异而异，因大小差异而异。根据我们的经验，新鲜解剖、使用精细钳子尽可能多地切除结缔组织以及如本协议中所述的彻底渗透，是成功染色的重要因素。关于定量实时 PCR，快速工作和高效裂解至关重要。将两个 SG 从一种动物中集中可靠地用于分析多达 12 种不同的基因（当执行重复时）。
尽管SG的功能和总解剖学已经研究了几十年，并且每一个心肌细胞都由交感纤维46内在化，但许多悬而未决的问题依然存在。例如，目前还不清楚，为什么SG的交感神经元在缺血性21和非缺血性心力衰竭中，在动物模型和患者20中短暂地异化到胆碱表型。最近，我们小组描述了S100B阳性胶质细胞的作用，这些胶质细胞也存在于穆林SG中，在心脏神经系统29的神经发芽中。这些细胞是否与与VA11，12相关的损伤后交感神经发芽有关，需要在未来的研究中阐明。重要的是，创新的方法，如光遗传学52和转录仪分析36可以补充既定的方法，如神经元追踪，以加深对交感神经系统及其在心脏电生理学中的作用的理解。
总之，本剧目允许缺乏经验的调查员在心脏病理学的模糊模型中对SG进行基本描述。我们希望这将刺激新方法的使用、组合和创造。这可能有助于增加对交感神经元中潜在的细胞和分子过程的理解，这些神经元可能负责VA的启动和维护。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢哈特维格·维博尔德的出色技术援助，以及汉堡-埃彭多夫大学医学中心的UKE显微镜成像设施（Umif）提供显微镜和支持。这项研究由DZHK（德国心血管研究中心）[FKZ 81Z4710141]资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | TPP | 92097 | RNAscope |
| Adhesion Slides SuperFrost plus 25 x 75 x 1 mm | R. Langenbrinck | 03-0060 | Microscopy |
| Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. | Serva | 11924.03 | Whole mount staining |
| bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Donkey anti chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Donkey anti goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Drying block 37-100 mm | Whatman (Sigma Aldrich) | WHA10310992 | Whole mount staining |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | Whole mount staining |
| Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) | Th.Geyer | 2212.5000 | Whole mount staining |
| Eukitt mounting medium | AppliChem | 253681.0008 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G + DAPI | Southern Biotech | 0100-20 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| H2O2 30% (w/w) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml | Rotexmedica | PZN: 3862340 | Preparation SG |
| High-capacity cDNA reverse transctiption kit | Life technologies | 4368813 | RNA isolation |
| Isoflurane (Forene) | Abbott Laboratories | 2594.00.00 | Preparation SG |
| Mayer's hemalum solution | Merck | 1.09249.0500 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller | Marienfeld | 0101040 | Whole mount staining |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA isolation |
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | RNA isolation |
| Opal 570 Reagent Pack | Akoya Bioscience | FP1488001KT | RNAscope |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 43368 | Whole mount staining |
| Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm | Th.Geyer | 7691202 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco | 18912-014 | Whole mount staining |
| Pinzette Dumont SS Forceps | FineScienceTools | 11203-25 | Preparation SG |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | RNA isolation |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| RNAlater | Merck | R0901-100ML | RNA isolation (optional) |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | biotechne (ACD) | 323100 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 | biotechne (ACD) | 431738-C2 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-Tubb3 | biotechne (ACD) | 423391 | RNAscope |
| Stainless steel beads 7 mm | Qiagen | 69990 | RNA isolation |
| Sudan black B | Roth | 0292.2 | Whole mount staining |
| TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan mastermix | Applied biosystems | 4370074 | Gene Expression analysis |
| Tissue Lyser II | Qiagen | 85300 | RNA isolation |
| Triton X-100 10% solution | Sigma-Aldrich | 93443-100ml | Whole mount staining |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ML | RNAscope |
| Wacom bamboo pen | Wacom | CTL-460/K | Cell size measurements |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 | Sigma-Aldrich | WHA10311647 | Whole mount staining |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | RNAscope |
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