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Lage, Dissektion und Analyse des Murin-Stellat-Ganglions

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/62026
Automatic Translation
1,2,3, 2,4, 2, 2,4,5, 3, 1,2,3
1Division of Cardiology, EVK Düsseldorf, cNEP, cardiac Neuro- and Electrophysiology Research Consortium, 2DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 3Institute of Neural and Sensory Physiology, Medical Faculty, Heinrich Heine University Düsseldorf, 4Clinic for Cardiology, University Heart & Vascular Centre, University Hospital Hamburg-Eppendorf, 5Department of Cardiology, Leiden University Medical Center

Summary

Pathophysiologische Veränderungen im kardialen autonomen Nervensystem, insbesondere in seinem sympathischen Zweig, tragen zum Auftreten und zur Aufrechterhaltung ventrikulärer Arrhythmien bei. Im vorliegenden Protokoll zeigen wir, wie murine Stellatganglien charakterisiert werden können, um das Verständnis der zugrunde liegenden molekularen und zellulären Prozesse zu verbessern.

Abstract

Das vegetative Nervensystem ist ein wesentlicher Treiber der kardialen Elektrophysiologie. Insbesondere die Rolle seines sympathischen Zweiges ist eine laufende Untersuchungsfrage in der Pathophysiologie ventrikulärer Arrhythmien (VA). Neuronen in den Sternganglien (SG)   – bilaterale sternförmige Strukturen der sympathischen Kette –   sind ein wichtiger Bestandteil der sympathischen Infrastruktur. Die SG sind ein anerkanntes Ziel für die Behandlung über kardiale sympathische Denervierung bei Patienten mit therapierefraktärer VA. Während neuronaler Umbau und Gliaaktivierung im SG bei Patienten mit VA beschrieben wurden, sind die zugrunde liegenden zellulären und molekularen Prozesse, die möglicherweise dem Auftreten von Arrhythmien vorausgehen, nur unzureichend verstanden und sollten zur Verbesserung der autonomen Modulation aufgeklärt werden. Mausmodelle ermöglichen es uns, sympathische neuronale Umbauten zu untersuchen, aber die Identifizierung des murinen SG ist für den unerfahrenen Forscher eine Herausforderung. So fehlen für viele häufige Herzerkrankungen vertiefte zelluläre und molekularbiologische Untersuchungen des murinen SG. Hier beschreiben wir ein grundlegendes Repertoire zur Sezierung und Untersuchung des SG bei erwachsenen Mäusen für Analysen auf RNA-Ebene (RNA-Isolierung für Genexpressionsanalysen, In-situ-Hybridisierung), Proteinebene (immunfluoreszierende Ganzkomountfärbung) und zelluläre Ebene (Basismorphologie, Zellgrößenmessung). Wir stellen mögliche Lösungen vor, um Herausforderungen in der Präparationstechnik zu meistern und die Färbung durch Abschrecken der Autofluoreszenz zu verbessern. Dies ermöglicht die Visualisierung von Neuronen sowie Gliazellen über etablierte Marker, um die Zellzusammensetzung und Umbauprozesse zu bestimmen. Die hier vorgestellten Methoden ermöglichen die Charakterisierung des SG, um weitere Informationen über autonome Dysfunktion bei Mäusen zu gewinnen, die zu VA neigen, und können durch zusätzliche Techniken ergänzt werden, die neuronale und gliale Komponenten des autonomen Nervensystems im Herzen untersuchen.

Introduction

Das kardiale autonome Nervensystem ist ein streng reguliertes Gleichgewicht von sympathischen, parasympathischen und sensorischen Komponenten, das es dem Herzen ermöglicht, sich an Umweltveränderungen mit der entsprechenden physiologischen Reaktion anzupassen1,2. Störungen in diesem Gleichgewicht, zum Beispiel eine Zunahme der sympathischen Aktivität, wurden als Schlüsselfaktor für den Beginn sowie die Aufrechterhaltung von ventrikulären Arrhythmien (VA)3,4festgestellt. Daher ist die autonome Modulation, die durch pharmakologische Reduktion der sympathischen Aktivität mit Betablockern erreicht wird, seit Jahrzehnten ein Eckpfeiler in der Behandlung von Patienten mit VA5,6. Aber trotz pharmakologischer und katheterbasierter Interventionen leidet eine relevante Anzahl von Patienten immer noch an wiederkehrender VA7.

Der sympathische Input zum Herzen erfolgt meist über neuronale Zellkörper in den Sternganglien (SG), bilateralen sternförmigen Strukturen der sympathischen Kette, die Informationen über zahlreiche intrathorarakale Nerven vom Hirnstamm zum Herzen weiterleiten8,9,10. Nervenkeimen aus dem SG nach Verletzung ist mit VA und plötzlichem Herztod verbunden11,12, wobei das SG als Ziel für autonome Modulation13,14hervorgehoben wird. Eine Reduktion des sympathischen Inputs in das Herz kann vorübergehend durch perkutane Injektion von Lokalanästhetika oder dauerhaft durch teilweise Entfernung des SG mittels videogestützter Thorakoskopie erreicht werden15,16. Herzsympathische Denervierung stellt eine Option für Patienten mit therapierefraktärer VA mit vielversprechenden Ergebnissendar 14,16,17. Wir haben von explantierten SG dieser Patienten gelernt, dass neuronale und neurochemische Umbauten, Neuroentzündungen und Gliaaktivierung Kennzeichen des sympathischen Umbaus sind, der die autonome Dysfunktion beitragen oder verschlimmern kann18,19. Dennoch bleiben die zugrunde liegenden zellulären und molekularen Prozesse in diesen Neuronen bis heute unklar, zum Beispiel die Rolle der neuronalen Transdifferenzierung in einen cholinergen Phänotyp20,21. Experimentelle Studien präsentieren neue Ansätze zur Behandlung von VA, zum Beispiel die Verringerung der sympathischen Nervenaktivität über die Optogenetik22, aber eine eingehende Charakterisierung des SG fehlt noch bei vielen Herzerkrankungen, die mit VA einhergehen. Mausmodelle, die diese Pathologien nachahmen, ermöglichen es, neuronale Umbauten zu untersuchen, die möglicherweise dem Auftreten von Arrhythmien vorausgehen12,23. Diese können durch weitere morphologische und funktionelle Analysen zur autonomen Charakterisierung des Herzens und des Nervensystems ergänzt werden. Im vorliegenden Protokoll stellen wir ein grundlegendes Repertoire an Methoden zur Verfügung, die es ermöglichen, das murine SG zu sezieren und zu charakterisieren, um das Verständnis von VA zu verbessern.

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Protocol

Alle Verfahren mit Tieren wurden vom Animal Care and Use Committee des Landes Hamburg (ORG870, 959) und dem Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (LANUV, 07/11) genehmigt und entsprechen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren der Nationalen Gesundheitsinstitute (2011). Die Studien wurden mit männlichen und weiblichen (im Alter von 10-24 Wochen) C57BL/6-Mäusen (Stocknummer 000664, Jackson Laboratories) und Mäusen homozygot (db/db) oder heterozygot (db/het; Kontrolle) für die Diabetes-Spontanmutation (Leprdb; BKS. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, Lagernummer 000642, Jackson Laboratories). Die Autoren haben die vorliegenden Protokolle ohne Variationen für Mäuse im Alter von bis zu 60 Wochen verwendet.

1. Lage und Dissektion von murinen Sternganglien

HINWEIS: Obwohl Beschreibungen und Zeichnungen meist bei größeren Arten verfügbar sind, haben einige Publikationen zuvor den Standort des SG bei Ratten24 und Mäusen25 mit anatomischen Methoden bzw. fluoreszierenden Reporterlinien beschrieben.

  1. 50 ml eiskalte (3-4 °C) heparinisierte (20 Einheiten/ml, siehe Materialtabelle)phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) vorbereiten. Führen Sie die Dissektion des SG bei Raumtemperatur (RT) durch.
  2. Betäubung der Maus durch Inhalation von 3%-5% Isofluran gemäß den institutionellen und lokalen Richtlinien. Überprüfen Sie eine ausreichende Anästhesie durch Verlust des Pedalentzugsreflexes. Enthaupten Sie Mäuse oder führen Sie eine zervikale Dislokation durch.
    HINWEIS: Eine falsche zervikale Dislokation kann zu einem Bruch der Wirbelsäule und einer Schädigung der Brustgefäße führen, was zu Blutungen führt, die die Vorbereitung oder das Durchtrennen der Sympathischkette behindern, so dass SG nicht in ihrer richtigen Position sind. Daher ist es wichtig, dass erfahrenes Personal zervikale Dislokationen durchführt oder Tiere in tiefer Sedierung enthauptet.
  3. Besprühen Sie die Haut mit Ethanol und öffnen Sie den Thorax mit zwei Einschnitten entlang der vorderen Achsellinien mit einer Mayo-Schere und einer schmalen Musterzette. Schneiden Sie die Membran ab und entfernen Sie die Vorderseite des Brustkorbs.
  4. Entfernen Sie das Herz-Lungen-Paket, indem Sie die Aorta und die Hohlvene mit einer Londoner Zeilzette direkt über dem Zwerchfell greifen und mit der Strabismus-Schere alle Gefäße und das Bindegewebe in der Nähe der Wirbelsäule darunter schneiden.
  5. Spülen Sie den Thorax gründlich mit heparinisiertem PBS mit einer Kunststoff-Einwegpipette, bis alle Blutspuren entfernt sind.
  6. Legen Sie den Rumpf unter ein Stereomikroskop-Vorbereitungsfernglas und sorgen Sie mit externen Lichtquellen für eine gute Beleuchtung im Thorax.
  7. Lokalisieren Sie die erste Rippe und die Longus-Colli-Muskeln.
    HINWEIS: Die SG befinden sich bilateral, parallel zur Wirbelsäule am Ast zwischen der ersten Rippe und der Wirbelsäule, in einer Rille seitlich zu den Longus Colli Muskeln24. Die flache Seite des SG befindet sich neben den Longus-Colli-Muskeln. Je nach Präparat können Teile der sympathischen Kette bereits als weiße, schräge Fasern parallel zur Wirbelsäule sichtbar sein. Diese können bis zum SG zurückverfolgt werden.
  8. Verwenden Sie vorsichtig die Spitze der Dumont #5/45-Zette, um das Bindegewebe seitlich dem Longus-Colli-Muskel auszusetzen.
  9. Drehen Sie die Zette um 180° und verwenden Sie die flache Seite, um das SG zu greifen und mit minimalem Druck herauszuziehen.
  10. Wiederholen Sie dies mit dem zweiten SG.
  11. Beide SG in eine mit kaltem PBS gefüllte Schale (6 cm Durchmesser) geben und mit entsprechender Vergrößerung inspizieren. Entfernen Sie bei Bedarf überschüssige Gefäße, Fettgewebe und größere Nerven.
    HINWEIS: Autonome Ganglien sind von einer Bindegewebskapsel umgeben, die aus Kollagenfasern und Fibroblasten26,27besteht. Die Durchlässigkeit dieser Kapseln scheint zwischen den Arten, verschiedenen Arten von Ganglien26 und Alter28zu variieren. Mit der Dumont #5/45-Zette und gegebenenfalls der Federschere so viel Bindegewebe wie möglich entfernen.
  12. Fahren Sie je nach Ziel des Experiments mit Abschnitt 2, 3 oder 5 dieses Protokolls fort.

2. Immunhistochemie-Protokoll für die gesamte Montierung

HINWEIS: Dieses Protokoll ist von kardialen Ganzkettfärbungen4,29angepasst. Führen Sie Inkubationsschritte für jedes einzelne SG in einer Vertiefung einer 96-Well-Platte durch und verwenden Sie 100 μL (für antikörperhaltige Lösungen) bis 200 μL (für alle anderen Lösungen) der Lösung, um eine vollständige Abdeckung zu gewährleisten. Überprüfen Sie regelmäßig die Abdeckung und das korrekte Eintauchen des SG mit einem Fernglas. Entfernen Sie Flüssigkeiten manuell mit einer 200 μL Pipette mit einer zusätzlichen 10 μL Spitze auf der 200 μL Spitze. Dies verhindert eine Aspiration des SG in der Pipettenspitze. Verwenden Sie frisch zubereitete Lösungen und sterile Flüssigkeiten, um Bakterienwachstum zu verhindern.

  1. Fix SG für die Histologie für 2 h bei RT in 4% methanolfreiem Paraformaldehyd (PFA)/PBS.
  2. Verarbeiten Sie SG so schnell wie möglich, aber sie können an dieser Stelle 2-4 Wochen bei 4-6 °C in PBS mit 0,02% (w/v) Natriumazid gelagert werden.
  3. Bereiten Sie sudanesische Schwarzstofflösung (1% Sudan Schwarz w/ v in 100% Ethanol) zur Reduzierung der Autofluoreszenz und Verbesserung des Signal-Hintergrund-Verhältnisses30 vor. 2-3 h auf einem Magnetrührer bei RT auflösen.
    HINWEIS: Verwenden Sie die Stammlösung für maximal 6-8 Wochen, entsorgen Sie sie früher, wenn Sedimentation auftritt.
  4. Bereiten Sie sudanesische schwarze Arbeitslösung vor, indem Sie die Stammlösung für 30 Minuten mit voller Geschwindigkeit (13.000 x g)zentrifugieren, um Ablagerungen zu entfernen und den Bestand in 70% Ethanol auf eine Endkonzentration von 0,25% Sudan Black zu verdünnen.
  5. Behandeln Sie SG mit Dents Bleichmittel, um die Antikörperpermeabilisierung zu verbessern31. Bereiten Sie dent-Bleichmittel frisch vor, indem Sie Methanol (MeOH), Wasserstoffperoxidlösung 30% (w/w) inH2Ound Dimethylsulfoxid (DMSO) im Verhältnis 4:1:1 mischen. Fügen Sie 200 μL pro SG hinzu und legen Sie die Platte für 1 h bei RT auf einen Orbitalschüttler.
  6. Führen Sie eine absteigende MeOH-Serie zur Rehydratation durch, indem Sie jeweils 10 Minuten auf einem Orbitalschüttler inkubieren: 100% MeOH, 75% MeOH/ PBS, 50% MeOH / PBS, 25% MeOH / PBS.
  7. Führen Sie eine Permeabilisierung durch, indem Sie SG zweimal für jeweils 60 Minuten in PBS/1% Triton-X-100 bei RT inkubieren.
  8. Entfernen Sie die Permeabilisierungslösung aus dem SG und fügen Sie die Sudan Black Working Solution hinzu. Inkubieren Sie für 2 h bei RT auf einem Orbitalschüttler.
  9. In der Zwischenzeit eine Blockierungslösung vorbereiten, indem Sie 5% Rezeptor-Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Triton-X-100 in PBS einem 15-ml-Gefäß hinzufügen und es auf einem Walzenschüttler für ca. 5-10 min auflösen lassen. Dekantieren Sie durch einen vorgefertigten Papierfilter, um Schmutz zu entfernen.
  10. Entfernen Sie Sudan Schwarz sehr vorsichtig, indem Sie die Platte kippen und vorsichtig von der aufrechten Seite pipettieren.
    HINWEIS: Es ist nicht möglich, das SG in Sudan schwarz zu sehen. Verwenden Sie eine starke Lichtquelle und arbeiten Sie langsam. Ab diesem Schritt sind SG schwarz gefärbt, was die Sichtbarkeit verbessert. Wenn an dieser Stelle zusätzliches Bindegewebe um SG herum zu sehen ist, entfernen Sie es mit Dumont #5/45-Zette und Federschere.
  11. Fügen Sie 200 μL PBS/0,1% Triton-X-100 (PBS-T) hinzu und waschen Sie es 5 Minuten bei RT auf einem Orbitalschüttler.
  12. Entfernen Sie PBS-T, indem Sie es mit einer Pipette absaugen und 2 Mal wiederholen.
  13. PBS entfernen; 200 μL Blocklösung hinzufügen und bei 4 °C über Nacht auf einem Orbitalschüttler inkubieren.
  14. Bereiten Sie am nächsten Tag Lösungen vor, indem Sie primäre Antikörper in die Blockierungslösung geben. Passen Sie Antikörperkonzentrationen aus etablierten Protokollen an.
    HINWEIS: Fügen Sie ein SG als Antikörperkontrolle ohne primären Antikörper ein (inkubiert mit Antigen-vorabsorbiertem Antikörper oder IgG, falls verfügbar, oder Blockierender Puffer).
  15. Führen Sie die primäre Antikörperinkubation für 36-48 h bei 4 °C auf einem Orbitalschüttler durch. Für Zellgrößenmessungen und die Färbung sympathischer Neuronen verwenden Sie Antikörper gegen Tyrosinhydroxylase (siehe Materialtabelle für Antikörperempfehlungen).
    HINWEIS: Legen Sie die 96-Well-Platte in eine Nasskammer (z. B. Kunststoffbox, die mit ddH2O-benetzten Papiertüchern ausgekleidet ist), um eine Verdunstung an dieser Stelle zu verhindern.
  16. Entfernen Sie die Antikörperlösung vorsichtig und fügen Sie 200 μL PBS-T hinzu. Legen Sie die Platte für 30 minuten auf einen Orbitalschüttler.
  17. Entfernen Sie PBS-T und wiederholen Sie den Waschschritt 5 weitere Male.
  18. Bereiten Sie die sekundäre Antikörper-Arbeitslösung vor, indem Sie fluoreszierende Alexa-markierte sekundäre Antikörper vor der Verwendung für 1 Minute mit voller Geschwindigkeit (13.000 x g)zentrifugieren. Verdünnen Sie die entsprechenden sekundären Antikörper entsprechend den primären Antikörpern 1:500 in der Blocklösung und fügen Sie sie zu SG hinzu. Fügen Sie 1 μg/ml Bisbenzimid H33342 Trihydrochlorid (Hoechst-Färbung) hinzu, wenn eine Kernfärbung gewünscht wird. 12-24 h bei 4 °C auf einem Orbitalschüttler inkubieren.
  19. Entfernen Sie die Antikörperlösung vorsichtig und fügen Sie 200 μL PBS-T hinzu. Legen Sie die Platte für 30 minuten auf einen Orbitalschüttler.
  20. Entfernen Sie PBS-T und wiederholen Sie den Waschschritt 5 weitere Male. Verwenden Sie für den letzten Schritt PBS ohne Triton.
  21. Zum Einbetten 50-100 μL fluoreszierendes Montagemedium (siehe Materialtabelle)auf einem Glasobjektträger verteilen und unter Vorbereitung ein Fernglas legen. Verwenden Sie die Dumont #5/45-Heft, um SG von der 96-Well-Platte aufzunehmen und überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, indem Sie ein Ende auf ein Filterpapier (z. B. Whatman-Trockenpad) tauchen und auf den Tropfen legen.
  22. Verwenden Sie die Dumont #5/45-Zette, um die Positionierung mit der entsprechenden Vergrößerung zu korrigieren.
  23. Legen Sie vorsichtig einen Glasdeckel (20 mm x 20 mm) neben das SG und steigen Sie langsam ab.
    HINWEIS: Die Verwendung von zu viel Montagemedium führt zu einer Bewegung des SG oder zu einem Verheddern der Nerven. Entfernen Sie in diesem Fall schnell die Abdeckung und wiederholen Sie die Schritte 2.9-2.21.
  24. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei RT im Dunkeln trocknen. Die Lagerung der gefärbten Probe ist für mindestens 4-6 Wochen bei 4 °C möglich.

3. In-situ-Hybridisierung der gesamten Montierung

HINWEIS: Die Ganzkilierung in situ-Hybridisierung des SG wird aus dem Organ von Corti32 und dem kommerziellen RNA-Fluoreszenz-in-situ-Protokoll adaptiert (siehe Materialtabelle). Beziehen Sie Sonden für die interessierenden Gene und Puffer und Lösungen vom Lieferanten. Alle Inkubationsschritte werden bei RT durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Verwenden Sie steriles PBS. Wenn Sie mehrere SG in einer Vertiefung färben möchten, verwenden Sie mindestens 150 μL Puffer und Lösungen.

  1. Führen Sie die Dissektion des SG wie in den Schritten 1.1-1.13 beschrieben durch.
  2. Fixieren Sie SG für 1 h in 200 μL 4% MeOH-freiem PFA/PBS in einer Vertiefung einer 96-Well-Platte, die auf einem Orbitalschüttler platziert ist.
  3. Waschen Sie SG dreimal für jeweils 30 minuten in 0,1% Tween-20/PBS auf einem Orbitalschüttler.
  4. Dehydrieren Sie SG in der MeOH/PBS-Serie durch anschließende Inkubation in 50% MeOH/PBS, 70% MeOH/PBS und 100% MeOH für jeweils 10 min auf einem Orbitalschüttler.
  5. SG bei -20 °C in 100% MeOH über Nacht lagern.
  6. Am nächsten Tag den Inkubator auf 40 °C vorwärmen. Überprüfen Sie die Temperatur mit einem Thermometer.
  7. Rehydrieren Sie SG in umgekehrter MeOH/PBS-Serie (100% MeOH, 70% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS) für jeweils 10 min.
  8. Waschen Sie SG dreimal für jeweils 5 minuten in PBS.
  9. In der Zwischenzeit beginnen Sie mit dem Vorwärmen der Sonden durch Inkubation bei 40 °C für 10 min, gefolgt von einer Abkühlung für 10 min.
  10. Inkubieren Sie SG in 200 μL Protease III für 15 min.
  11. Optional: Führen Sie eine Sudan-Schwarzbehandlung durch, um die Autofluoreszenz gemäß den Abschnitten 2.3, 2.4 und 2.8 dieses Protokolls zu löschen, wenn eine anschließende Immunfluoreszenzfärbung geplant ist.
  12. SG in 200 μL 0,1% Tween-20/PBS 3x für jeweils 5 min auf einem Orbitalschüttler waschen.
  13. Optional: Wenn eine Co-Färbung mit mehreren Sonden gewünscht ist, verdünnen Sie Kanal-2 (50x) und Kanal-3-Sonde (50x) in Kanal-1-Sonde (1x).
  14. SG mit 100 μL Sonde für das interessierenden Gen abdecken und über Nacht bei 40 °C mit leichter Rührung inkubieren. Legen Sie die 96-Well-Platte für alle Inkubationsschritte in eine Nasskammer bei 40 °C.
    HINWEIS: Fügen Sie ein SG als Negativkontrolle ein, indem Sie eine Sonde gegen ein bakterielles Gen (z. B. Dihydro-Dipicolinat-Reduktase, Dapb)verwenden, um in späteren Schritten auf unspezifische Bindung von Amplifikationsreagenzien zu überprüfen.
  15. Sg im mitgelieferten Waschpuffer 3x für je 15 min auf einem Orbitalshatter waschen.
  16. Vorwärmen Sie Amp1-3, HRP-C1 und HRP-Blocker auf RT. Wenn eine Co-Färbung mit Kanal-2 und/oder Kanal-2-Sonde gewünscht ist, hrP-C2 und HRP-C3 vorwärmen.
  17. Fixieren Sie SG für 10 min bei RT in 4% PFA/ PBS auf einem Orbitalschüttler.
  18. Sg in 200 μL mitgeliefertem Waschpuffer 3x für je 5 min auf einem Orbitalschüttler bei RT waschen.
  19. Zur Verstärkung SG mit 100 μL Amp1 für 35 min bei 40 °C auf einem Orbitalschüttler inkubieren.
  20. Entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit und waschen Sie SG in 200 μL des mitgelieferten Waschpuffers 3x für jeweils 5 min bei RT auf einem Orbitalschüttler.
  21. Inkubieren Sie SG mit 100 μL Amp2 für 35 min bei 40 °C auf einem Orbitalschüttler.
  22. Wiederholen Sie Schritt 3.18.
  23. Inkubieren Sie SG mit 100 μL Amp3 für 20 min bei 40 °C auf einem Orbitalschüttler.
  24. Wiederholen Sie Schritt 3.18.
  25. Inkubieren Sie SG mit 100 μL mitgeliefertem Multiplex FL v2 HRP-C1 für 20 min bei 40 °C auf einem Orbitalschüttler.
  26. Wiederholen Sie Schritt 3.18.
  27. Opalkonjugierte sekundäre Antikörper 1:1.000 in 200 μL zugeführtem TSA-Puffer vorbereiten und SG für 35 min bei 40 °C auf einem Orbitalschüttler inkubieren. Schützen Sie vor Licht während der Inkubation und ab diesem Schritt.
  28. Wiederholen Sie Schritt 3.18.
  29. Inkubieren Sie SG in 100 μL des mitgelieferten Multiplex FL v2 HRP-Blockers für 15 min bei 40 °C auf einem Orbitalschüttler.
  30. Wiederholen Sie Schritt 3.18.
  31. Optional: Für die Co-Färbung mit der Channel-2-Sonde wiederholen Sie die Schritte 3.25-3.30 mit dem mitgelieferten Multiplex FL v2 HRP-C2.
  32. Optional: Für die Co-Färbung mit der Channel-3-Sonde wiederholen Sie die Schritte 3.25-3.30 mit dem mitgelieferten Multiplex FL v2 HRP-C3.
  33. Im Falle einer nachfolgenden immunfluoreszierenden Färbung führen Sie die Schritte 2.13-2.25 dieses Protokolls durch.
  34. Inkubieren Sie in 1% BSA/PBS für 30 min auf einem Orbitalschüttler.
  35. Inkubieren Sie SG für 30 min in 1 μg/ml Bisbenzimid H33342 Trihydrochlorid (Hoechst-Färbung) in 1% BSA/PBS, wenn eine Kernfärbung gewünscht ist, und/oder fügen Sie Alexa-gekoppeltes Weizenkeimagglutinin (WGA, 1:500) auf einem Orbitalschüttler hinzu.
  36. Wiederholen Sie Schritt 3.18.
  37. Einbetten wie in den Schritten 2.19-2.22 beschrieben.

4. Bildgebung und Analyse von mausen Stellatganglien

  1. Führen Sie konfokale Mikroskopie von eingebettetem SG in der lokalen Bildgebungseinrichtung durch.
  2. Wenn Zellgrößenmessungen erforderlich sind, bilden Sie SG für Tyrosinhydroxylase (siehe Materialtabelle)mit 200-facher Vergrößerung und nehmen Sie 4-6 zufällige Bilder von jedem SG auf.
  3. Analysieren Sie Bilder mit der ImageJ33-Software, um die Zellgröße zu schätzen (z. B. mit einer Stifttabelle, siehe Materialtabelle). Verwenden Sie die freie Handauswahl,umkreisen Sie jede Zelle und klicken Sie auf Analyse | Messen, um die Zellfläche zu erhalten. Achten Sie darauf, nur intakte, vollständig sichtbare Zellen einzubeziehen, die sich gut im SG befinden.
  4. Mit dieser Methode können Sie etwa 100 Zellen pro SG messen.
  5. Lassen Sie einen verblindeten Prüfarzt die Schritte 4.2-4.3 durchführen, wenn Sie SG von verschiedenen Mäusen vergleichen möchten. Verwenden Sie eine Häufigkeitsverteilung in statistiker Software, um Größenunterschiede zwischen Gruppen34zu visualisieren.

5. Molekulare Analysen von mausinen Sternganglien

HINWEIS: Fügen Sie je nach experimentellem Design Steuerelemente ein. Dies könnte SG mit unterschiedlichen Genotypen und Krankheitshintergrund und/oder anderen autonomen Ganglien sein, wie z.B. das sympathische obere zervikale Ganglion (im Halsbereich gelegen, siehe detaillierte Beschreibung in Ziegler et al.35)oder parasympathische Ganglien (wie intrakardiale Ganglien, siehe Jungen et al.4).

  1. Bereiten Sie ein 2-ml-Röhrchen mit 500 μL Phenol/Guanidinthiocyanat-Lösung (z. B. Qiazol) pro Tier vor und halten Sie flüssigen Stickstoff für das Schock-Frosting bereit oder ziehen Sie kommerzielle Lösungen zum Schutz von RNA in Betracht (optional, siehe Materialtabelle)36. Arbeiten Sie schnell für die RNA-Isolierung.
  2. Führen Sie die Dissektion des SG wie in den Schritten 1.1-1.13 beschrieben durch.
  3. Tauchen Sie beide SG sofort direkt in ein Röhrchen mit Phenol/Guanidinthiocyanat-Lösung und Schockfrost-Röhrchen in flüssigen Stickstoff.
  4. Bis zur Weiterverarbeitung bei -80 °C lagern.
  5. Für die Gewebelyse Röhrchen mit SG auftauen lassen, bis Phenol/Guanidinthiocyanatlösung verflüssigt ist und zwei 7 mm Edelstahlperlen hinzufügen. Kühlen Sie die Metallteile des Gewebehomogenisators (Kugel- oder Mischermühle, z.B. Tissue Lyser II) auf Trockeneis und Zentrifuge bei 4 °C ab.
  6. Zentrifugenröhrchen bei 500 x g für 1 min bei 4 °C, so dass SG am Boden des Rohres sind.
  7. Schläuche in die Metallteile des Tissue Lyser geben und 1 min bei 20 Hz lysieren.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 5.6 und 5.7 bis zu 5 Mal, bis kein intaktes Gewebe nachweisbar ist.
  9. Die Flüssigkeit in ein frisches 1,5 ml Röhrchen geben.
  10. Führen Sie die RNA-Isolierung mit einem säulenbasierten RNA-Isolationskit (z. B. miRNeasy Mini-Kit) gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
  11. Elute RNA in 20 μL RNase-freiem Wasser und Messung der Konzentration mit einem Spektralphotometer.
    HINWEIS: Um eine Kontamination der gereinigten RNA mit genomischer DNA auszuschließen, schlagen wir vor, eine Polymerase-Kettenreaktion mit genomischen Primern und 1 μL RNA als Vorlage durchzuführen, anstatt abzüglich der Reverse-Transkriptase-Kontrolle. Dies spart eine erhebliche Menge an RNA. Wenn RNA kontaminiert ist, verwenden Sie Exon-Intron-Grenzprimer oder Intron-Flankenprimer für die anschließende quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion.
  12. Verwenden Sie 250 ng SG RNA, um die cDNA-Synthese durchzuführen und etablierte Protokolle zu verwenden. Hier wurde ein hochleistungsfähiges cDNA-Reverse-Transkriptions-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.
  13. Verdünnen Sie auf eine Endkonzentration von 2,5 ng/μL cDNA und führen Sie eine quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion mit den entsprechenden Sonden gemäß den festgelegten Protokollen durch. Hier wurde der TaqMan Assay (siehe Materialtabelle)mit 10 ng cDNA pro Reaktion durchgeführt.
    HINWEIS: Führen Sie für jedes Gen eine Kontroll ohne Vorlage durch, um falsch positive Ergebnisse auszuschließen.
  14. Normalisieren Sie die Genexpression Ihres interessierenden Gens auf einem Haushaltungsgen (z. B. Cdkn1b),um die relative Genexpression zwischen verschiedenen Gruppen von SG zu vergleichen.

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt, wie das SG identifiziert und seziert werden kann. Abbildung 1A zeigt eine schematische Zeichnung des Ortes, während Abbildung 1B den Blick in den Thorax nach Entfernung des Herz-Lungen-Pakets darstellt. Der linke und rechte Longus-Colli-Muskel medial vom SG und der Brustkorb sind wichtige Orientierungspunkte. Die Dissektion erfolgt entlang der gepunkteten Linien zwischen den Muskeln und der ersten Rippe. Das SG und die sympathische Kette werden als weiße Strukturen sichtbar (Abbildung 1C). Abbildung 1D zeigt eine Vergrößerung der Region zwischen dem linken Longus-Colli-Muskel und der ersten Rippe, in der sich das linke SG befindet. Die Morphologie des SG unterscheidet sich zwischen den Individuen. Es besteht oft aus einer Fusion der unteren Zervix- und der ersten bis zur dritten Brustganglien24. Eine Sorte, die der Experimentator in murinem SG erwartenkann,ist in Abbildung 1E, F dargestellt, wo links und rechts SG von fünf männlichen C57Bl6-Wildtypmäusen fotografiert werden.

Die Auswertung der groben anatomischen Übersicht sowie zelluläre und subzelluläre Analysen von Zellen im SG, die das Herz innervieren, können durch Ganz-Mount-Techniken auf Protein- und RNA-Ebene durchgeführt werden. Eine Übersicht über ein SG finden Sie in Abbildung 2. Myokard-sympathische Fasern stammen aus Zellkörpern im SG. Diese werden durch Färbung mit einem Antikörper gegen Tyrosinhydroxylase (TH) sichtbar gemacht. TH-exprimierende neuronale Somata sind von Nervenfasern umgeben, die positiv auf Cholinacetyltransferase (ChAT) färben. Dies sind höchstwahrscheinlich präsynaptischeFasern 37,38. Eine beispielhafte Vergrößerung aus TH- und ChAT-Co-Labeling ist in Abbildung 2Adargestellt. Gliazellen, die neuronale Zellkörper umgeben, können durch Färbung für S100B sichtbar gemacht werden. Dies ist in Abbildung 2B in Kombination mit dem neuronalen Marker PGP9.5 dargestellt. Abbildung 2C-F zeigt beispielhafte Analysen zur Untersuchung des SG auf subzellulärer Ebene unter Verwendung von In-situ-Hybridisierung und immunfluoreszierender Co-Färbung. Die Protein-TH-(Abbildung 2C,rot) und mRNA-Moleküle von Tubb3 (Abbildung 2D, weiß) werden in großen neuronalen Zellkörpern exprimiert, während mRNA von S100b (Abbildung 2E, grün) auch in umgebenden Gliazellen nachweisbar ist. In der Verschmelzung (Abbildung 2F) ist sichtbar, dass einige Neuronen für TH negativ sind, aber Tubb3exprimieren, während S100b mRNAs auch in umgebenden Zellen nachgewiesen werden können, wie in der Vergrößerung in Abbildung 2Gdargestellt.

Abbildung 3 zeigt mögliche quantitative Analysen und Fallstricke für die Untersuchung des murinen SG. Bilder von TH-gefärbtem SG (Abbildung 3A) können für Zellgrößenmessungen verwendet werden, wie sie beispielhaft für ein Mausmodell von Diabetes durchgeführt wurden. Neuronale Somata aus Kontroll-SG (db/het) waren 388,8 ± 123,8 μm2 vs. bei diabetischem SG (db/db) 407,33 ± 139,6 μm2 (Abbildung 3B,n = 2 SG, 100 Zellen pro SG pro Genotyp, P = 0,348, Daten wurden mit Mann-Whitney-Test verglichen). Abbildung 3C zeigt die Expression von Genen aus verschiedenen Zelltypen des SG (n = 6-7). Die Bündelung beider SG von einem Tier ermöglicht Genexpressionsmessungen von etwa 24 Assays (12 Gene in Duplikaten). Typischerweise normalisieren wir Proben für Cdkn1b (nachgewiesen bei Ct-Werten von 25,4 ± 0,97) sowie den neuronalen Marker Neun/Rbfox3 (32,5 ± 0,7), wenn es notwendig ist, andere Zelltypen und die neuronale Reinheit der Dissektion zu berücksichtigen. Gene, die wir für die Charakterisierung molekularer Prozesse im SG für nützlich befunden haben, sind das sympathische Gen Th (22,4 ± 1,6), Chat, das auf eine cholinerge Transdifferenzierung hinweisen könnte (ausgedrückt bei Ct-Werten von 30,8 ± 1,3) und Gap43, ein Marker für neuronale Keimung (nachweisbar bei Ct-Werten von 22,4 ± 1,4). Gene, die im nicht-neuronalen Zelltyp exprimiert werden, sind S100b (für Gliazellen, 27,3 ± 1,2), Ki-67 (für proliferierende Zellen, 33,0 ± 1,6) und Cd45 (für Immunzellen, 30,2 ± 1,1).

Das SG ist von einer Kapsel aus Bindegewebe26umgeben, visualisiert durch Hämatoxylin- und Eosinfärbung in Abbildung 3D,E. Gelegentlich beobachteten wir Inkonsistenzen bei der Antikörper-basierten Färbung, wie in Abbildung 3Fgezeigt, höchstwahrscheinlich aufgrund einer unvollständigen Entfernung der Kapsel. Während ChAT- und TH-Flecken nur in einigen Teilen des SG nachweisbar sind, sind mit DAPI gegengefärbte Kerne durchgehend nachweisbar. Die gepunktete Linie im zusammengeführten Bild trennt erfolgreiches Färben (rechts von der Linie) von erfolglosem Färben (links von der Linie).

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde als P-Wert von <0,05 definiert; Die statistische Analyse wurde mit kommerzieller Software durchgeführt.

Figure 1
Abbildung 1: Lage, Dissektion und Morphologie der murinen Sternganglien. (A) Schematische Darstellung der Lage der Sternganglien (SG). (B) Blick in den Thorax nach Entfernung der Herz-Lungen-Packung. Es ist wichtig zu beachten, dass die SG die meiste Zeit nicht sofort sichtbar sind. Die Longus-Colli-Muskeln befinden sich seitlich von der Wirbelsäule entfernt. Die SG befinden sich seitlich von den Muskeln an der Verbindung mit der ersten Rippe. Sezieren Sie vorsichtig seitlich zu den Muskeln (Bereich, der durch eine gepunktete Linie gekennzeichnet ist), um die Ganglien freizulegen. Nach der Dissektion können Ganglien (links und rechts, LSG bzw. RSG) und die sympathische Kette als weiße, lange Strukturen erkannt werden. (C) Eine exemplarische Dissektion, die die Ganglien und anatomischen Landmarken zeigt. (D) Vergrößerung des LSG. (E) LSG und (F) RSG von wildtypischen, männlichen C57Bl6-Mäusen (16 Wochen) wurden seziert und fotografiert, um die Variationen in Morphologie und Größe zu zeigen. Der Maßstabsbalken entspricht 1.000 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Visualisierung verschiedener Zelltypen in murinen Stellatganglien durch Ganzkojomenimmunhistochemie und In-situ-Hybridisierung. (A) Grobübersicht eines murinen Stellatganglions (SG), das für den sympathischen Marker Tyrosinhydroxylase (TH) und Cholinacetyltransferase (ChAT) gefärbt ist. Die Vergrößerung zeigt TH-positive Zellkörper und das Vorhandensein von ChAT-positiven, höchstwahrscheinlich präsynaptischen Nervenfasern, die neuronale Somata umgeben. (B) Gliazellen, die neuronale Zellkörper umhüllen, können durch Färbung für S100B, hier in Kombination mit dem neuronalen Marker PGP9.5, visualisiert werden. (C, D , E,F) Mikroskopische Aufnahmen von einer SG-gefärbten ganzen Montierung über eine Kombination aus Immunhistochemie für TH (rot) und In-situ-Hybridisierung für Tubb3 (D, weiß) und S100b (E, grün). Kerne werden mit DAPI (blau) gegengefärbt. (F) Die Verschmelzung zeigt, dass nicht alle neuronalen (Tubb3-positiven)Zellen TH-positiv sind. S100b mRNAs können innerhalb neuronaler Somata, aber auch umgebenden Zellen nachgewiesen werden, wie durch einen Pfeil in der Vergrößerung in (G) gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Mögliche quantitative Analysen und Fallstricke. (A) Bilder von Tyrosin-Hydroxylase (TH)-gefärbtem SG können für Zellgrößenmessungen mit ImageJ verwendet werden. (B) Dies wurde in einem Mausmodell für Diabetes durchgeführt (100 Zellen pro SG, n = 2 SG pro Genotyp, Daten wurden mit Mann-Whitney-Test verglichen). (C) Beispielhafte Gene, die im SG exprimiert werden und für die Charakterisierung molekularer Prozesse nützlich sein könnten. Cdkn1b sowie der neuronale Marker Neun/Rbfox3 (um das Vorhandensein anderer Zelltypen zu berücksichtigen) können zur Normalisierung verwendet werden. Tyrosinhydroxylase (Th) dient als sympathischer Marker, Cholinacetyltransferase (Chat) für cholinerge Transdifferenzierung, Gap43 für neuronale Keimung. Gene, die in nicht-neuronalen Zelltypen exprimiert werden, sind S100b (Gliazellen), Ki-67 (proliferierende Zellen) und Cd45 (Immunzellen). (D) Hämatoxylin- und Eosinfärbung eines formalinfixierten SG visualisiert Bindegewebe und Zellen auf der Oberseite des SG. (E) Vergrößerung aus dem boxed Bereich. (F) Bei einigen Gelegenheiten beobachteten wir ein Versagen bei der Antikörper-basierten Färbung, höchstwahrscheinlich aufgrund einer unvollständigen Entfernung der Kapsel. Während ChAT (rot) und TH (grün) nur in einigen Teilen des SG nachweisbar sind, sind mit DAPI (dunkelblau) gegengefärbte Kerne durchgehend nachweisbar. Die gepunktete Linie im zusammengeführten Bild trennt erfolgreiches Färben (rechts von der Linie) von erfolglosem Färben (links von der Linie). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Das Verständnis zellulärer und molekularer Prozesse in Neuronen und Gliazellen des sympathischen Nervensystems, die dem Ausbruch der VA vorausgehen, ist von großem Interesse, da plötzlicher Herzstillstand weltweit die häufigste Todesursache bleibt5. Daher stellen wir im aktuellen Manuskript ein grundlegendes Repertoire an Methoden zur Verfügung, um das murine SG – ein murines Element innerhalb dieses Netzwerks – zu identifizieren und anschließend Analysen auf RNA-, Protein- und zellulärer Ebene durchzuführen.

Eine Herausforderung des murinen SG ist seine Größe und die begrenzte Anzahl von Zellen39. Aus diesem Zusammenhang werden verschiedene Tiermodelle wie Ratten40,Hunde22und Schweine41 für Studien am SG verwendet. Dennoch gibt es eine Vielzahl von gut etablierten Krankheitsmodellen für kardiale Phänotypen bei Mäusen, von denen einige bereits in verschiedenen Aspekten der Herzinnervation und Arrhythmie charakterisiert wurden, wie Modelle für Diabetes23, Myokardinfarkt42oder Myokarditis43. Daher sind weitere Studien des murinen SG gerechtfertigt, um die autonome Dysfunktion im Lichte der VA weiter zu charakterisieren. Diese können durch andere Ansätze zur Untersuchung der Innervation des murinen Herzens wie funktionelle Experimente4,23,44 einschließlich in-vivo-Stimulation des SG23ergänzt werden.

Aufgrund seiner geringen Größe und seiner Lage innerhalb der Brusthöhle24ist die Manipulation des murinen SG in vivo eine Herausforderung, obwohl es erfolgreich durchgeführt wurde23. Aus diesem Grund konzentrieren sich einige Studien daher auf die oberen Halsganglien, die sich besser zugänglich im Hals befinden, stromaufwärts des SG in der sympathischen Kette hinter der Carotisverzweigung in innere und äußere Halsschlagadern24,35. Es wurde gezeigt, dass die kardiale Denervierung durch Entfernung der oberen Halsganglien Myokardentzündungen, Hypertrophie und Herzfunktionsstörungen nach Myokardinfarkt abschwächt35. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die oberen halsalen Ganglien verschiedene Regionen des Herzens innervieren, am prominentesten die vordere Seite45. Darüber hinaus kam eine kürzlich durchgeführte eingehende Literaturrecherche zu dem Schluss, dass die Rolle der Halsganglien bei der sympathischen Innervation des Herzens beim Menschen unklar bleibt46. Dies unterstreicht die Bedeutung der Charakterisierung des SG für Studien zur herzsympathischen Innervation.

Es ist wichtig zu beachten, dass das Herz nicht das einzige Ziel des SG ist. Unter anderem werden Lungen47 und Schweißdrüsen in der Vorpfeppe48 auch von Fasern innerviert, die aus dem SG stammen, letztere sind eine Ausnahme von der sympathischen Physiologie, da sie Cholinacetyltransferase37exprimieren. Die vorübergehende Blockade der SG wird im Hinblick auf entzündliche Prozesse bei akuten Lungenverletzungen49 oder zur Behandlung von Hitzewallungen und Schlafstörungen50untersucht; daher könnten die vorliegenden Protokolle ein Repertoire für mechanistische Fragen in diesen Bereichen bieten. Bei der Fokussierung auf Herzkrankheitsmodelle sollte bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden, dass Herzneuronen nicht durch Morphologie oder elektrophysiologische Eigenschaften von nicht-kardialen Neuronen unterschieden werden können51. Dies kann durch retrograde Verfolgung erreicht werden, wodurch gezeigt wurde, dass sich die Lage der neuronen, die zum Herzen projizieren, in den kraniomedialen Teilen des SG52befindet.

Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass neben verschiedenen Arten von Neuronen sympathische Ganglien aus umhüllenden Glia, sogenannten Satellitengliazellen oder Satellitenzellen bestehen, die durch Expression des Gliamarkers S100B53gekennzeichnet sind. Während wenig über die Rolle dieser Zellen bei kardiovaskulären Pathologien bekannt ist, wurde die Gliaaktivierung und Expression des glialfibrillären sauren Proteins (GFAP) bei SG von Patienten mit Arrhythmien beschrieben18.

Einige Fallstricke sollten bei den vorgestellten Methoden beachtet werden: Wir beobachteten bei einigen Gelegenheiten Inkonsistenzen bei der Antikörper-basierten Färbung und stellten die Hypothese auf, dass eine unvollständige Entfernung der Bindegewebskapsel, die das SG umhüllt, schuld sein könnte, da sie beschrieben wurden, um in der Permeabilität zwischen verschiedenen Arten von Ganglien zu variieren26. Die mechanische Entfernung der Kapsel mit einer feinen Zette wurde im oberen Halsganglion von Ratten bis zum postnatalen Tag 1028 beschrieben und die Enthitzung wird in der Literatur für erwachsene Ratten SG54,55 und Mäuse56erwähnt . Die Entfernung der SG-Kapsel kann zwischendem 28. Lebensjahr und – aufgrund von Größenunterschieden – der Art variieren. Nach unserer Erfahrung sind die frische Dissektion, die Entfernung von möglichst viel Bindegewebe mittels feiner Zünzette und die gründliche Permeabilisierung, wie im vorliegenden Protokoll beschrieben, wichtige Faktoren für eine erfolgreiche Färbung. Bei der quantitativen Real-Time-PCR sind schnelles Arbeiten und effiziente Lyse unerlässlich. Die Bündelung beider SGs aus einem Tier ermöglichte zuverlässig die Analyse von bis zu 12 verschiedenen Genen (bei Duplikaten).

Obwohl die Funktion und grobe Anatomie von SG seit Jahrzehnten untersucht wird und jeder einzelne Kardiomyozyt von sympathischen Fasern innerviert wird46,bleiben viele offene Fragen. So bleibt beispielsweise unklar, warum sympathische Neuronen des SG bei ischämischer21 und nicht-ischämischer Herzinsuffizienz, in Tiermodellen sowie bei Patienten20vorübergehend zu einem cholinergen Phänotyp transdifferenzieren. Kürzlich beschrieb unsere Gruppe eine Rolle von S100B-positiven Gliazellen, die auch im murinen SG vorhanden sind, bei der Nervenkeimung im Herznervensystem29. Ob diese Zellen für die sympathische Nervenkeimung nach einer Verletzung im Zusammenhang mit VA11,12relevant sind, muss in zukünftigen Studien aufgeklärt werden. Wichtig ist, dass innovative Ansätze wie Optogenetik52 und Transkriptomanalysen36 etablierte Methoden wie neuronales Tracing ergänzen können, um das Verständnis des sympathischen Nervensystems und seiner Rolle in der kardialen Elektrophysiologie zu vertiefen.

Zusammenfassend ermöglicht dieses Repertoire dem unerfahrenen Forscher, eine grundlegende Charakterisierung des SG in murinen Modellen von Herzerkrankungen durchzuführen. Wir hoffen, dass dies die Verwendung, Kombination und Schaffung neuartiger Methoden anregen wird. Dies könnte dazu beitragen, das Verständnis der zugrunde liegenden zellulären und molekularen Prozesse in sympathischen Neuronen zu verbessern, die für den Beginn und die Aufrechterhaltung von VA verantwortlich sein könnten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Die Autoren danken Hartwig Wieboldt für die hervorragende technische Unterstützung und der UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf für die Bereitstellung von Mikroskopen und Unterstützung. Diese Forschung wurde vom DZHK (Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung) [FKZ 81Z4710141] gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate TPP 92097 RNAscope
Adhesion Slides SuperFrost plus  25 x 75 x 1 mm R. Langenbrinck 03-0060 Microscopy
Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. Serva 11924.03 Whole mount staining
bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA B2261 Whole mount staining
Chicken anti neurofilament EMD Millipore AB5539 Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck, KGA, Darmstadt, Germany D8418 Whole mount staining
Donkey anti chicken IgY Alexa 647  Merck, KGA, Darmstadt, Germany AP194SA6 Whole mount staining
Donkey anti goat IgG Alexa 568  Thermo Fisher Scientific A11057 Whole mount staining
Donkey anti rabbit IgG Alexa 488  Thermo Fisher Scientific A21206 Whole mount staining
Drying block 37-100 mm Whatman (Sigma Aldrich) WHA10310992  Whole mount staining
Eosin Y Sigma Aldrich E4009 Whole mount staining
Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) Th.Geyer 2212.5000 Whole mount staining
Eukitt mounting medium AppliChem 253681.0008 Whole mount staining
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 Whole mount staining
Fluoromount-G + DAPI Southern Biotech 0100-20 Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferase EMD Millipore AP144P Whole mount staining
H2O2 30% (w/w) Merck, KGA, Darmstadt, Germany H1009 Whole mount staining
Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml Rotexmedica PZN: 3862340 Preparation SG
High-capacity cDNA reverse transctiption kit Life technologies  4368813 RNA isolation
Isoflurane (Forene) Abbott Laboratories 2594.00.00 Preparation SG
Mayer's hemalum solution Merck 1.09249.0500 Whole mount staining
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Whole mount staining
Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller Marienfeld 0101040 Whole mount staining
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 RNA isolation
NanoDrop 2000c Thermo Fisher Scientific ND-2000C RNA isolation
Opal 570 Reagent Pack Akoya Bioscience FP1488001KT RNAscope
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free  Alfa Aesar 43368 Whole mount staining
Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm Th.Geyer 7691202 Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tablets Gibco 18912-014 Whole mount staining
Pinzette Dumont SS Forceps FineScienceTools 11203-25 Preparation SG
QIAzol Lysis Reagent Qiagen  79306 RNA isolation
Rabbit anti tyrosine hydroxylase EMD Millipore AB152 Whole mount staining
RNAlater Merck R0901-100ML RNA isolation (optional)
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 biotechne (ACD) 323100 RNAscope
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 biotechne (ACD) 431738-C2 RNAscope
RNAscope Probe-Mm-Tubb3 biotechne (ACD) 423391 RNAscope
Stainless steel beads 7 mm  Qiagen  69990 RNA isolation
Sudan black B Roth 0292.2 Whole mount staining
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan mastermix Applied biosystems 4370074 Gene Expression analysis 
Tissue Lyser II Qiagen 85300 RNA isolation
Triton X-100 10% solution Sigma-Aldrich 93443-100ml Whole mount staining
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-100ML RNAscope
Wacom bamboo pen Wacom CTL-460/K Cell size measurements
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 Sigma-Aldrich WHA10311647 Whole mount staining
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate Thermo Fisher Scientific W21404 RNAscope

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Medizin Ausgabe 166 sympathisches Nervensystem Sternganglien intrakardiales autonomes Nervensystem ventrikuläre Arrhythmie Neuromorphologie Elektrophysiologie
Lage, Dissektion und Analyse des Murin-Stellat-Ganglions
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Scherschel, K., Bräuninger, H., … More

Scherschel, K., Bräuninger, H., Glufke, K., Jungen, C., Klöcker, N., Meyer, C. Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion. J. Vis. Exp. (166), e62026, doi:10.3791/62026 (2020).

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