Imagens em campo amplo e em tempo real de sinais de feridas locais e sistêmicas em Arabidopsis

As plantas não podem escapar de estresses bióticos, por exemplo, insetos que se alimentam deles, por isso desenvolveram sofisticados sistemas de sensoriamento de estresse e transdução de sinais para detectar e, em seguida, proteger-se de desafios como herbívoro¹. Ao ferir ou atacar herbívoros, as plantas iniciam respostas rápidas de defesa, incluindo o acúmulo do ácido jasmônico fitohormônio (JA) não apenas no local ferido, mas também em órgãos distais não danificados². Este JA então ambos desencadeiam respostas de defesa nos tecidos diretamente danificados e induz preventivamente defesas nas partes não danificadas da planta. Em Arabidopsis, o acúmulo de JA induzido pelo ferimento foi detectado em folhas distais e intactas em apenas alguns minutos de danos em outros lugares da planta sugerindo que um sinal rápido e de longa distância está sendo transmitido da folha³ferida . Vários candidatos, como ca^2+,espécies reativas de oxigênio (ROS) e sinais elétricos, foram propostos para servir como esses sinais de ferida de longa distância nas plantas^4,5.

Ca²⁺ é um dos mais versáteis e onipresentes segundo elementos mensageiros em organismos eucarióticos. Nas plantas, a mastigação de lagartas e o ferimento mecânico causam aumentos drásticos na concentração citosolic Ca²⁺ ([Ca²⁺]_cyt) tanto na folha ferida quanto em folhas distantes desenroladas^6,7. Este sinal sistêmico Ca²⁺ é recebido por proteínas de sensoriamento intracelular Ca^2+,que levam à ativação de vias de sinalização de defesa a jusante, incluindo a biossíntese JA^8,9. Apesar de inúmeros desses relatos que sustentam a importância dos sinais de Ca²⁺ nas respostas de feridas vegetais, as informações sobre as características espaciais e temporais dos sinais Ca²⁺ induzidos pelo ferimento são limitadas.

A imagem em tempo real usando indicadores Ca²⁺ geneticamente codificados é uma ferramenta poderosa para monitorar e quantificar a dinâmica espacial e temporal dos sinais Ca^2+. Até o momento, foram desenvolvidas versões desses sensores que permitem a visualização de sinais ca²⁺ ao nível de uma única célula, para tecidos, órgãos e até plantas inteiras¹⁰. O primeiro biosensor geneticamente codificado para Ca²⁺ usado em plantas foi a proteína bioluminescente aequorin derivada da água-viva Aequorea victoria¹¹. Embora esta proteína quemiluminescente tenha sido usada para detectar alterações de Ca²⁺ em resposta a várias tensões nas plantas^{12,13,14,15,16,17,18}, não é adequada para imagens em tempo real devido ao sinal extremamente baixo luminescente que produz. Os indicadores Ca²⁺ baseados em Förster Resonance Energy Transfer (FRET), como os cameleons Amarelos, também foram usados com sucesso para investigar a dinâmica de uma gama de eventos de sinalização Ca²⁺ nas usinas^{19,20,21,22,23,24}. Estes sensores são compatíveis com abordagens de imagem e, mais comumente, são compostos pela proteína de ligação Ca²⁺ calmodulin (CaM) e um peptídeo de ligação de CaM (M13) de uma quinase da cadeia de luz da miosina, tudo fundido entre duas proteínas fluorforas, geralmente uma Proteína Fluorescente Cyan (CFP) e uma variante de Proteína Fluorescente Amarela (YFP)¹⁰. A ligação Ca²⁺ ao CaM promove a interação entre CaM e M13 levando a uma mudança conformacional do sensor. Essa mudança promove a transferência de energia entre o PCP e o YFP, o que aumenta a intensidade da fluorescência do YFP, diminuindo a emissão de fluorescência do PCP. O monitoramento dessa mudança de CFP para fluorescência YFP fornece então uma medida do aumento do nível Ca^2+. Além desses sensores FRET, biosensores ca²⁺ baseados em proteína única (FP) como GCaMP e R-GECO, também são compatíveis com abordagens de imagem vegetal e são amplamente utilizados para estudar as alterações_{de citos} [Ca²⁺] devido à sua alta sensibilidade e facilidade de uso^{25,26,27,28,29,30}. Os GCaMPs contêm um único GFP circularmente permutado (cp), novamente fundido ao CaM e ao peptídeo M13. A interação dependente de Ca²⁺entre CaM e M13 provoca uma mudança conformacional no sensor que promove uma mudança no estado de protonação do cpGFP, aumentando seu sinal fluorescente. Assim, à medida que os níveis de Ca²⁺ aumentam, o sinal cpGFP aumenta.

Para investigar a dinâmica dos sinais ca²⁺ gerados em resposta a ferimentos mecânicos ou alimentação herbívora, utilizamos plantas transgênicas arabidopsis thaliana expressando uma variante GCaMP, GCaMP3, e um microscópio de fluorescência de campo largo⁶. Esta abordagem conseguiu visualizar a transmissão rápida de um sinal Ca²⁺ de longa distância do local da ferida em uma folha para toda a planta. Assim, um aumento no_cite [Ca²⁺] foi imediatamente detectado no local da ferida, mas este sinal Ca²⁺ foi então propagado para as folhas vizinhas através da vasculatura poucos minutos após o ferimento. Além disso, descobrimos que a transmissão desse sinal de ferida sistêmica rápida é abolida em plantas arabidopsis com mutações em dois genes semelhantes a receptores de glutamato, Glutamato Receptor Like (GLR), GLR3.3 e GLR3.6⁶. Os GLRs parecem funcionar como canais de aminoácidos fechados Ca²⁺ envolvidos em diversos processos fisiológicos, incluindo resposta à ferida^3,crescimento do tubo de pólen^31,desenvolvimento raiz^32,resposta fria³³e imunidade inata³⁴. Apesar dessa função fisiológica bem compreendida e ampla das GLRs, as informações sobre suas propriedades funcionais, como sua especificidade de ligante, seletividade de íons e localização subcelular, são limitadas³⁵. No entanto, estudos recentes relataram que GLR3.3 e GLR3.6 estão localizados nos phloem e xilem, respectivamente. As GLRs vegetais têm semelhanças com receptores de glutamato ionotrópicos (iGluRs)³⁶ em mamíferos, que são ativados por aminoácidos, como glutamato, glicina e D-serina no sistema nervoso mamífero³⁷. De fato, demonstramos que a aplicação de glutamato de 100 mM, mas não outros aminoácidos, no local da ferida induz um sinal ca²⁺ rápido e de longa distância em Arabidopsis,indicando que o glutamato extracelular provavelmente age como sinal de ferida nas plantas⁶. Esta resposta é abolida no mutante glr3.3/glr3.6 sugerindo que o glutamato pode estar agindo através de um ou ambos esses canais semelhantes a receptores e, de fato, o AtGLR3.6 foi recentemente mostrado como fechado por esses níveis de glutamato³⁸.

Nas plantas, além de seu papel como aminoácido estrutural, o glutamato também foi proposto como um importante regulador de desenvolvimento³⁹; no entanto, sua dinâmica espacial e temporal são mal compreendidas. Assim como no Ca²⁺, vários indicadores geneticamente codificados para glutamato foram desenvolvidos para monitorar a dinâmica deste aminoácido em células vivas^40,41. IGluSnFR é um biosensor de glutamato uni FP baseado em GFP composto por cpGFP e uma proteína de ligação de glutamato (GLT) da Escherichia coli^42,43. A mudança conformacional do iGluSnFR, que é induzido pela ligação de glutamato ao GLI, resulta em uma emissão de fluorescência GFP aprimorada. Para investigar se o glutamato extracelular age como uma molécula de sinalização na resposta à ferida vegetal, conectamos a sequência iGluSnFR com a sequência básica de secreção de peptídeo de sinal de chitinase (CHIB-iGluSnFR) para localizar esse biosensor no espaço apoplásico⁶. Esta abordagem permitiu a imagem de quaisquer alterações na concentração de glutamato apoplástico ([Glu]_apo) usando plantas de Arabidopsis transgênicas expressando este sensor. Detectamos aumentos rápidos no sinal iGluSnFR no local do ferimento. Esses dados apoiam a ideia de que o glutamato vaza das células/tecidos danificados para o apoplasto ao ferimento e age como um sinal de dano ativando as GLRs e levando ao sinal Ca²⁺ de longa distância nas plantas⁶.

Aqui, descrevemos um método de imagem em tempo real em toda a planta usando biosensores geneticamente codificados para monitorar e analisar a dinâmica dos sinais de glutamato Ca²⁺ de longa distância e extracelulares em resposta ao ferimento⁶. A disponibilidade de microscopia de fluorescência de campo amplo e plantas transgênicas expressando biosensores geneticamente codificados fornece uma abordagem poderosa, mas facilmente implementada para detectar sinais de longa distância rapidamente transmitidos, como ondas ca^2+.

1. Preparação do material vegetal

1. Em um microtubo de 1,5 mL, a superfície esteriliza as sementes de Arabidopsis thaliana (adesão Col-0) expressando gCaMP3 ou CHIB-iGluSnFR tremendo com 20% (v/v) NaClO por 3 min e depois lave 5 vezes com água destilada estéril.
   NOTA: As linhas transgênicas de Arabidopsis expressando GCaMP3 ou CHIB-iGluSnFR foram descritas anteriormente⁶.
2. Em um capô estéril, semeear 13 sementes esterilizadas pela superfície em uma placa de Petri de plástico quadrado de 10 cm, preenchida com 30 mL estéril (autoclaved) Murashige e Skoog (MS) médio [1x sais MS, 1% (p/v) sacarose, 0,01% (w/v) mioinositol, 0,05% (w/v) MES e 0,5% (w/v) goma gellan; pH 5,7 ajustado com 1N KOH]. Substitua a tampa e enrole com fita cirúrgica.
3. Após a incubação no escuro a 4 °C por 2 dias, coloque as placas horizontalmente a 22 °C em uma câmara de crescimento sob luz contínua (90-100 μmol m^-2 s^-1) durante aproximadamente 2 semanas antes do uso. Após 2 semanas, conte o número de folhas arabidopsis do mais velho para o caçula⁴⁴ (Figura 1). As respostas da ferida se movem preferencialmente da folha danificada (n) para as folhas numeradas n ± 3 e n ± 5⁶.
   NOTA: Neste protocolo, a placa de Petri será aberta para a imagem dos efeitos da ferida e glutamato sob um microscópio de fluorescência. Portanto, as etapas subsequentes deste experimento devem ser conduzidas sob condições de ambiente controladas pela temperatura e umidade. Isso porque os sinais ca²⁺ também são provocados por mudanças nessas condições ambientais. Também é sabido que a luz azul, emitida do microscópio durante o registro para excitação da fluorescência da proteína biosensor, pode provocar um aumento da concentração citosolica Ca^{2+ 45} e, portanto, a planta deve ser aclimatada à irradiação da luz azul por vários minutos antes de iniciar o experimento.

2. Preparação química

1. Dissolver L-Glutamato em um meio de crescimento líquido [sais de 1/2x MS, 1% (w/v) sacarose e 0,05% (w/v) MES; pH 5.1 ajustado com 1N KOH] para fazer uma solução de trabalho de 100 mM.
   NOTA: Evite o uso de sais de glutamato, como glutamato de sódio, para evitar potenciais efeitos relacionados à cação na dinâmica ca^2+.

3. Configuração do microscópio e condução de imagens em tempo real

1. Ligue o estereóquio de fluorescência motorizada equipado com uma lente objetiva de 1x (NA = 0,156) e uma câmera sCMOS(Figura 2) e configure as configurações do dispositivo para irradiar com uma luz de excitação de 470/40 nm e adquirir uma luz de emissão passando por um filtro de 535/50 nm.
   NOTA: Qualquer microscópio de fluorescência sensível ao GFP pode ser usado para detectar sinais GCaMP3 e iGluSnFR em tempo real, mas uma lente objetiva de baixa potência e uma câmera altamente sensível com um chip sCMOS largo são recomendados para adquirir sinais de toda a planta. O objetivo de baixa potência permite a imagem de toda a resposta de uma planta arabidopsis e o uso de uma câmera altamente sensível permite a rápida aquisição de dados necessários para capturar o curso de tempo rápido da onda Ca²⁺ acionada pela ferida. Para o microscópio de fluorescência utilizado neste estudo, os valores máximos do campo de visão e resolução temporal são de 3 cm x 3 cm e 30 quadros por segundo (fps), respectivamente.
2. Retire a tampa e coloque o prato sob a lente objetiva.
3. Verifique o sinal de fluorescência da planta e, em seguida, aguarde aproximadamente 30 minutos no escuro até que as plantas sejam adaptadas às novas condições ambientais. Esta etapa de adaptação é necessária porquemudanças na umidade provocam a elevação_{de citos} em plantas que podem interferir em qualquer evento relacionado à ferida.
4. Ajuste o foco e a ampliação para ver toda a planta no campo de visão. No protocolo atual, foi utilizada uma ampliação de 0,63x.
5. Antes de iniciar a imagem em tempo real, configure os parâmetros de aquisição para detectar os sinais de fluorescência usando software de imagem de microscópio. As configurações para imagem no protocolo atual são: tempo de exposição e intervalo definidos para 1,8 s e 2 s (ou seja, 0,5 fps), respectivamente. Defina o tempo de gravação para 11 min.
6. Imagem por 5 minutos antes de iniciar o experimento para aclimatar a planta à irradiação de luz azul do microscópio, em seguida, começar a gravar clicando em Run Now, ou o comando equivalente no software de microscópio que está sendo usado. Para determinar a fluorescência média da linha de base, grave pelo menos 10 quadros (ou seja, pelo menos 20 s no protocolo atual) antes de ferir ou apresentar aplicação de glutamato (ver Seção 4).
   1. Para imagens em tempo real de_cite induzido por ferida [Ca²⁺] e [Glu]_apo alterações, corte a petiole ou a região média da folha L1 com tesoura(Figura 3 e Figura 4).
   2. Para imagens em tempo real de alterações de_cite de glutamato [Ca^2+],corte a borda (aproximadamente 1 mm da ponta) da folha 1 através da veia principal com a tesoura. Após pelo menos 20 min de período de recuperação, aplique 10 μL de glutamato de 100 mM na superfície cortada da folha(Figura 5).
      NOTA: Este pré-corte foi necessário para permitir o acesso de glutamato ao apoplast da folha, a fim de desencadear respostas. Além disso, a aplicação de uma gota de água destilada na superfície cortada da folha L1 foi considerada fundamental para evitar que as amostras se desselicissem durante a recuperação antes da aplicação do glutamato.
7. Depois de terminar a gravação de 11 minutos, salve os dados.

4. Análise de dados

1. Para análise da intensidade da fluorescência ao longo do tempo, defina uma região de interesse (ROI) no local onde a intensidade da fluorescência deve ser analisada(Figura 6 e Figura 7). Para o cálculo de velocidade da onda Ca^2+, defina 2 ROIs (ROI1 e ROI2) para análise. No software de imagem, clique em | de Medição de Tempo Defina | Círculo. Meça a distância entre ROI1 e ROI2 clicando em Anotações e | | de comprimento Linha Simples (Figura 6).
2. Meça os valores de fluorescência bruta (F) em cada ROI ao longo do tempo clicando em Measure. Exporte dados brutos para um software de planilha para converter o sinal de fluorescência em números em cada ponto de tempo clicando em All to Excel | Exportação.
3. Determine o valor da fluorescência da linha de base, que é definido como F₀, calculando a média de F sobre os primeiros 10 quadros (ou seja, antes do tratamento) nos dados registrados.
4. Normalize os dados F (calculando ΔF/F) usando a equação ΔF/F = (F−F₀)/F₀, onde ΔF é a mudança dependente do tempo na fluorescência.
5. Para a análise de ondas de velocidade de onda Ca^2+, defina um ponto de elevação significativo do sinal acima dos valores pré-estimulados como representando a detecção de um aumento de Ca²⁺ em cada ROI (t₁ e t₂) usando o critério de elevação para 2× o desvio padrão (2x SD) que é calculado a partir dos dados F₀ usando software estatístico. 95% dos dados do F₀ estão dentro de 2x SD da média, indicando que um aumento do sinal acima desse nível por acaso é ≤5%. Calcule a diferença de tempo do aumento de Ca²⁺ entre ROI1 e ROI2 [t₂- t₁ time-lag (Δt)] e meça a distância entre ROI1 e ROI2, então determine as velocidades de qualquer onda Ca^2+.

A propagação de sinais de [Ca2+]cyt e [Glu]apo em resposta ao ferimento é apresentada na Figura 3, Figura 4, Filme S1e Filme S2. Cortar a petiola da folha 1 em plantas expressando GCaMP3 (em 0 s) levou a um aumento significativo nocite [Ca2+] que foi rapidamente induzido localmente através da vasculatura (aos 40 s) (Figura 3 e Filme S1). Posteriormente, o sinal foi rapidamente propagado para folhas vizinhas (folha 3 e 6) em poucos minutos (aos 80 s) (Figura 3 e Filme S1).

Ao cortar a folha 1 em plantas expressando CHIB-iGluSnFR, observou-se um rápido aumento deapo [Glu] em torno da região de corte (em 2 s). Este sinal foi propagado através da vasculatura localmente em poucos minutos (aos 160 s), mas não foi observado em folhas sistêmicas(Figura 4 e Filme S2).

Para a imagem em tempo real da propagação de sinal Ca2+ desencadeada pela aplicação de glutamato, a borda (aproximadamente 1 mm da ponta) da folha 1 em plantas expressando GCaMP3 foi cortada como mostrado na Figura 5A e no Filme S3. Cortar a borda da folha 1 causou um aumento decite local [Ca2+] (em 40 s), mas este sinal desapareceu em poucos minutos (em 124 s). Depois de esperar aproximadamente 10 minutos para a planta se recuperar, 10 μL de glutamato de 100 mM foi aplicado na superfície cortada da folha 1, o que causou um rápido e significativo aumento decit [Ca2+] localmente (aos 56 s) e propagação de sinal para folhas distais (a 104 s) (Figura 5B e Filme S4).

Para medir as mudanças nocite [Ca2+] induzido pelo ferimento na folha sistêmica, dois ROIs (ROI1 e ROI2) foram definidos na região base e ponta da folha 6 em plantas expressando GCaMP3 como mostrado na Figura 6A. A mudança de curso de tempo da intensidade do sinal GCaMP3 no ROI1 e ROI2 ao cortar a petiola da folha 1 foi medida(Figura 6B). Um aumento significativo docit [Ca2+] no ROI1 foi detectado anteriormente ao do ROI2 (Figura 6B). [Ca2+] cyt atingiu aproximadamente 100 s após o ferimento, durou mais de 10 minutos, e exibiu duas fases(Figura 6B).

Para determinar as velocidades da onda Ca2+ sobre o ferimento mecânico, o ponto de tempo de um aumento significativo de sinal acima dos valores pré-estimulados no ROI1 e ROI2 foi determinado (time-lag; ver Seção 4) (Figura 6C). Como a distância entre ROI1 e ROI2 foi de 2,7 mm neste caso (Figura 6A), a velocidade do sinal Ca2+ na folha 6 foi calculada como 0,15 mm/s. Para medir as alterações [glu]apo em resposta ao dano mecânico, o ROI1 foi definido nas proximidades do local de corte da folha marcado como L1 como mostrado na Figura 7A. [Glu] apo assinatura no ROI1 exibiu um único pico em aproximadamente 100 s após o ferimento(Figura 7B).

Figura 1: Numeração de folhas de roseta arabidopsis. As folhas arabidopsis são numeradas do mais antigo ao mais jovem (painel esquerdo). Um diagrama esquemático da posição das folhas é indicado no painel direito. L: folha, C: cotilledons. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Um microscópio de fluorescência usado neste estudo. [Ca2+]cyt e [Glu]apo dynamics foram imagens com um estereóscópio de fluorescência de campo largo. R: Controlador remoto, O: 1x lente objetiva, C: câmera sCMOS, T: Tubo de inclinação trinocular, S: Estágio, P: Material vegetal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Transmissão de sinal Ca2+ induzida por feridas. O corte da petiola (seta branca, 0 s) da folha 1 (L1) na planta expressando GCaMP3 desencadeou um aumento decito local [Ca2+] (seta vermelha, 40 s) que foi transmitido para folhas sistêmicas [folha 3 (L3) e folha 6 (L6)] (setas laranjas, 80 s). Barra de escala, 5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Elevação deapo acionada pela ferida [Glu]. Cortar a folha 1 (L1) (seta branca, 0 s) em plantas expressando CHIB-iGluSnFR causou uma rápida elevação de [Glu]apo (seta vermelha, 80 s) que se propagava através da vasculatura (seta laranja, 160 s). Barra de escala, 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Transmissão de sinal Ca2+ acionada por glutamato. (A) Cortar a borda (aproximadamente 1 mm da ponta) da folha 1 (L1) em plantas expressas GCaMP3 (seta branca, 0 s) causou um aumentode cite [Ca2+] (seta vermelha, 40 s). (B) A aplicação de glutamato de 100 mM à superfície cortada de L1 (seta branca, 0 s) causou um aumento decite local [Ca2+] (seta vermelha, 56 s) que rapidamente se propum a folhas distais [por exemplo, folha 3 (L3), folha 4 (L4) e folha 6 (L6)] (setas laranjas, 104 s). Barras de escala, 5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: [Ca2+] assinaturade cito em folhas sistêmicas em resposta ao ferimento mecânico. (A) Uma imagem expandida da folha 6 (L6) em plantas expressas GCaMP3 é mostrada na Figura 3. ROI1 (círculo azul) e ROI2 (círculo rosa) foram definidos na região de base e ponta, respectivamente. A seta branca indica o local de corte da petiole da folha 1 (L1). Neste caso, a distância entre ROI1 e ROI2 foi de 2,7 mm. (B) Quantificação de assinaturasde cite [Ca2+] em ROI1 e ROI2. Alterações na intensidade da fluorescência foram analisadas por meio de software de imagem. (C) Um traço expandido de dados em (B) entre 0 e 80 s. Os pontos de detecção de um aumento de Ca2+ no ROI1 e ROI2 foram definidos como t1 e t2, respectivamente,utilizando como critério um aumento para 2x o desvio padrão dos valores de pré-estimulação (2x SD, linha pontilhada). O valor de t2 - t1 foi definido como time-lag (Δt) no protocolo atual. A seta preta indica o tempo de corte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: [Glu] assinaturaapo em resposta ao ferimento mecânico. (A) Uma imagem expandida da folha 1 (L1) em plantas expressas CHIB-iGluSnFR é mostrada na Figura 4. O ROI1 foi montado nas proximidades do local do corte. A seta branca indica a região do corte. (B) A quantitação da assinatura de [Glu]apo no ROI1 é monitorada usando software de imagem. A seta preta indica o tempo de corte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme S1: Transmissão Ca2+ de longa distância após ferimentos mecânicos. O ferimento mecânico na petiola da folha 1 (L1) causou um aumentode cite [Ca2+] transmitido para folhas distais [por exemplo, folha 3 (L3) e folha 6 (L6)]. Clique aqui para baixar este filme.

Filme S2: Elevação dos níveis de glutamato apoplástico em resposta ao corte. O ferimento mecânico da folha 1 (L1) causou um aumento imediato noapo[Glu] . Clique aqui para baixar este filme.

Filme S3: Elevação dosníveis decite [Ca2+]em resposta ao corte. O ferimento mecânico na borda da folha 1 (L1) causou uma elevação decite local e imediata [Ca2+]. Clique aqui para baixar este filme.

Filme S4: Aplicação de glutamato desencadeia aumentos sistêmicos [Ca2+]cyt. A aplicação de glutamato de 100 mM acionou a transmissão Ca2+ para folhas sistêmicas [por exemplo, folha 3 (L3), folha 4 (L4) e folha 6 (L6)]. Clique aqui para baixar este filme.

Os autores não têm conflitos de interesse.