A sinalização sistêmica de cálcio acionada por glutamato extracelular é fundamental para a indução de respostas de defesa vegetal a ferimentos mecânicos e ataque herbívoro em plantas. Este artigo descreve um método para visualizar a dinâmica espacial e temporal de ambos os fatores usando plantas arabidopsis thaliana expressando biosensores fluorescentes sensíveis ao cálcio e glutamato.
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Artigo de método
Imagens em campo amplo e em tempo real de sinais de feridas locais e sistêmicas em Arabidopsis
Neste artigo
Resumo
Resumo
As plantas respondem a tensões mecânicas, como ferimentos e herbívoros, induzindo respostas de defesa tanto nas partes danificadas quanto nas partes distais não danificadas. Após o ferimento de uma folha, ocorre um aumento na concentração de íons de cálcio citosos (sinal ca2+) no local da ferida. Este sinal é rapidamente transmitido para folhas não danificadas, onde as respostas de defesa são ativadas. Nossa pesquisa recente revelou que o glutamato vazando das células feridas da folha para o apoplasto ao seu redor serve como um sinal de ferimento. Este glutamato ativa os canais permeáveis ca2+ semelhantes ao receptor de glutamato, o que leva à propagação de sinal Ca2+ de longa distância em toda a planta. As características espaciais e temporais desses eventos podem ser capturadas com imagens em tempo real de plantas vivas expressando biosensores fluorescentes geneticamente codificados. Aqui introduzimos um método de imagem em tempo real em toda a planta para monitorar a dinâmica dos sinais ca2+ e mudanças no glutamato apoplástico que ocorrem em resposta ao ferimento. Esta abordagem usa um microscópio de fluorescência de campo largo e plantas de Arabidopsis transgênicas expressando Ca2+ à base de Proteína Fluorescente Verde (GFP) e biosensores de glutamato. Além disso, apresentamos metodologia para facilmente provocar a propagação de sinal Ca2+ induzida por feridas e glutamato. Este protocolo também pode ser aplicado a estudos sobre outras estações vegetais para ajudar a investigar como a sinalização sistêmica da planta pode estar envolvida em suas redes de sinalização e resposta.
Introdução
As plantas não podem escapar de estresses bióticos, por exemplo, insetos que se alimentam deles, por isso desenvolveram sofisticados sistemas de sensoriamento de estresse e transdução de sinais para detectar e, em seguida, proteger-se de desafios como herbívoro1. Ao ferir ou atacar herbívoros, as plantas iniciam respostas rápidas de defesa, incluindo o acúmulo do ácido jasmônico fitohormônio (JA) não apenas no local ferido, mas também em órgãos distais não danificados2. Este JA então ambos desencadeiam respostas de defesa nos tecidos diretamente danificados e induz preventivamente defesas nas partes não danificadas da pl....
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Protocolo
1. Preparação do material vegetal
- Em um microtubo de 1,5 mL, a superfície esteriliza as sementes de Arabidopsis thaliana (adesão Col-0) expressando gCaMP3 ou CHIB-iGluSnFR tremendo com 20% (v/v) NaClO por 3 min e depois lave 5 vezes com água destilada estéril.
NOTA: As linhas transgênicas de Arabidopsis expressando GCaMP3 ou CHIB-iGluSnFR foram descritas anteriormente6. - Em um capô estéril, semeear 13 sementes esterilizadas pela superfície em uma placa de Petri de plástico quadrado de 10 cm, preenchida com 30 mL estéril (autoclaved) Murashige e Skoog (MS) médio [1x sais MS, 1% (p/v) sacarose, 0,01% (w/v) ....
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Resultados
A propagação de sinais de [Ca2+]cyt e [Glu]apo em resposta ao ferimento é apresentada na Figura 3, Figura 4, Filme S1e Filme S2. Cortar a petiola da folha 1 em plantas expressando GCaMP3 (em 0 s) levou a um aumento significativo nocite [Ca2+] que foi rapidamente induzido localmente através da vasculatura (aos 40 s) (Figur.......
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Discussão
A sinalização sistêmica é importante para que as plantas respondam a estímulos ambientais externos localizados e, em seguida, mantenham sua homeostase em todo o nível da planta. Embora não estejam equipados com um sistema nervoso avançado como animais, eles empregam comunicação rápida dentro e entre órgãos com base em fatores como sinais elétricos móveis (e possivelmente hidráulicos) e ondas propagadoras de ROS e Ca2+ 46,47. O protocolo descrito acima .......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por bolsas da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (17H05007 e 18H05491) para MT, da Fundação Nacional de Ciência (IOS1557899 e MCB2016177) e da Administração Nacional de Aeronáutica e Espaço (NNX14AT25G e 80NSSC19K0126) para a SG.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Arabidopsis express GCaMP3 | Saitama University | ||
| Arabidopsis express CHIB-iGluSnFR | Saitama University | ||
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | ||
| L-Glutamato | FUJIFILM Wako | 072-00501 | Dissolvido em meio de crescimento líquido [1/2x sais de MS, 1% (p/v) de sacarose e 0,05% (p/v) de MES; pH 5,1 ajustado com 1N KOH]. |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | ||
| Murashige e Skoog (MS) médio | FUJIFILM Wako | 392-00591 | composição: 1x sais MS, 1% (p/v) de sacarose, 0,01% (p/v) de mioinositol, 0,05% (p/v) MES e 0,5% (p/v) goma gelana; pH 5,7 ajustado com 1N KOH. |
| Nikon SMZ25 estereomicroscópio | Nikon | ||
| NIS-Elements Análise AR Nikon | |||
| 1x lente objetiva (P2-SHR PLAN APO) Câmera | Nikon | ||
| sCMOS (ORCA-Flash4.0 V2) | Fotônica Hamamatsu | C11440-22CU | |
| Placa de Petri de plástico quadrada | Simport | D210-16 |
Referências
- Wu, J., Baldwin, I. T. Herbivory-induced signalling in plants: perception and action. Plant, Cell & Environment. 32 (9), 1161-1174 (2009).
- Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in Jasmonate Signaling for Multistress Resilience. Annual Revie....
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Reimpressões e permissões
