Summary
중간 대뇌 동맥 폐색의 다른 모델 (MCAo) 실험 적인 뇌졸중 연구에 사용 됩니다. 여기서, 외부 경동맥(ECA)을 통한 과도 MCAo의 실험적인 뇌졸중 모델이 기술되며, 이는 자발적인 혈전 용해 또는 치료로 인해 뇌혈관 혈전이 제거되는 인간의 뇌졸중을 모방하는 것을 목표로 한다.
Abstract
뇌졸중은 사망률의 세 번째 가장 흔한 원인과 선진국에서 성인 장애의 주요 원인입니다. 현재까지 치료 옵션은 뇌졸중 후 첫 번째 시간 이내에 뇌졸중 환자의 작은 비율로 제한됩니다. 새로운 치료 전략은 광범위하게 조사되고있다, 특히 치료 시간 기간을 연장하기 위해. 이러한 현재 조사는 뇌졸중 후 염증, 혈관 신생, 신경 가소성 및 재생과 같은 중요한 병리학적 경로에 대한 연구를 포함합니다. 지난 10 년 동안, 독립적 인 연구 그룹 중 실험 결과 및 과학적 결과의 가난한 재현성에 대한 우려가 증가하고있다. 소위 "복제 위기"를 극복하기 위해서는 모든 절차에 대한 상세한 표준화 모델이 절실히 필요합니다. "면역 스트로크" 연구 컨소시엄(https://immunostroke.de/) 내에서의 노력으로, 일시적인 중형 동맥 폐색(MCAo)의 표준화된 마우스 모델이 제안된다. 이 모델은 필라멘트를 제거하면 혈류를 완전히 복원하여 인간 뇌졸중의 큰 비율로 발생하는 치료 또는 자발적응고 리시스를 시뮬레이션할 수 있습니다. 이 "필라멘트" 뇌졸중 모델및 기능 분석을 위한 도구의 외과 적 절차는 함께 제공되는 비디오에서 입증됩니다.
Introduction
뇌졸중은 전 세계적으로 사망과 장애의 가장 흔한 원인 중 하나입니다. 뇌졸중, 허혈성 및 출혈의 두 가지 형태가 주로 있지만, 모든 뇌졸중 케이스의 80-85 %는 허혈성1입니다. 현재, 허혈성 뇌졸중 환자만 사용할 수 있습니다: 재조합 조직 플라스미노겐 활성제 (rtPA) 또는 기계 혈전 절제술을 가진 약리학적 치료. 그러나, 좁은 치료 시간 창 및 다중 배제 기준 때문에, 단지 선택된 수의 환자만이 이러한 특정 치료 옵션으로부터 혜택을 받을 수 있다. 지난 2 년 동안, 전임상 및 번역 뇌졸중 연구는 신경 보호 접근의 연구에 초점을 맞추고있다. 그러나, 임상 시험에 도달한 모든 화합물은 지금까지 환자에 대한 개선이 없음을 보여주었습니다2.
체외 모델은 뇌졸중의 모든 뇌 상호 작용 및 병리학 적 메커니즘을 정확하게 재현 할 수 없기 때문에 동물 모델은 전임상 뇌졸중 연구에 매우 중요합니다. 그러나, 단일 동물 모형에 있는 인간 허혈성 치기의 모든 양상을 모방하는 것은 허혈성 치기가 매우 복잡하고 이기종질병이기 때문에, 가능하지 않습니다. 이러한 이유로, 다른 허혈성 뇌졸중 모델은 다른 종에서 시간이 지남에 따라 개발되었습니다. 중대뇌동맥의 뇌동맥 또는 영구탈폐의 광혈전증(MCA)은 신피질3,4에서작고 국소적으로 정의된 병변을 유도하는 일반적으로 사용되는 모델이다. 그 외에, 가장 일반적으로 사용되는 스트로크 모델은 아마도 MCA의 일시적인 폐색이 달성되는 소위 "필라멘트 모델"입니다. 본 모델은 MCA의 기원에 봉합사 필라멘트의 일시적인 도입으로 구성되며, 이는 대뇌 혈류의 급격한 감소와 피코르피질 및 피질 뇌영역5의 후속 큰 경색으로 이어진다. 대부분의 스트로크 모델은 MCA 오클루전 6을모방하지만" "필라멘트 모델"은 허혈성 시간을 정확하게 제한할 수 있습니다. 필라멘트 제거에 의한 재관류는 자발적 또는 치료 후 대뇌 혈류 회복의 인간 임상 시나리오를 모방 (rtPA 또는 기계적 혈전 절제술) 응고 용해. 현재까지 이 "필라멘트 모델"의 다른 수정 사항이 설명되었습니다. 가장 일반적인 접근 방식에서, 먼저 Longa 외에의해 설명 . 1989년5년,실리콘 코팅 필라멘트는 MCA7의기원에 대한 일반적인 경동맥(CCA)을 통해 도입된다. 그것은 널리 사용되는 접근이지만, 이 모델은 CCA가 필라멘트를 제거 한 후 영구적으로 결찰되기 때문에 재관류 동안 혈류의 완전한 복원을 허용하지 않습니다.
지난 10 년 동안, 연구 그룹의 증가 수는이 "필라멘트 모델"을 사용하여 마우스에서 뇌졸중모델링에 관심이있다. 그러나, 이 모델의 상당한 가변성과 절차의 표준화의 부족은 지금까지 보고된 실험 결과 및 과학적 결과의 높은 가변성과 불량한 재현성에 대한 이유 중일부이며, 지금까지보고된 과학적 연구 결과는2,8이다. 연구 실험실 중 낮은 재현성을 지칭하는 현재의 "복제 위기"의 잠재적 원인은 동일한 실험 방법론9를사용하여 연구 그룹 간의 비교할 수 없는 스트로크 경부물이다. 실제로, 제1전 무작위대조멀티센터시험연구를수행한 후, 본 실험적 뇌졸중 모델과 후속 결과 파라미터의 충분한 표준화가 부족한 것이 독립적인 실험실 간의 전임상 연구에서 재현성이 실패한 주된 이유임을 확인할 수있었다(11) . 동일한 스트로크 모델을 사용했음에도 불구하고 이러한 급격한 차이는 검증 연구에 대한 위협뿐만 아니라 견고하고 재현 가능한 모델의 부족으로 인한 과학적 협업에 대한 위협을 정당하게 제기합니다.
이러한 과제에 비추어, 우리는 "면역 스트로크" 연구 컨소시엄(https://immunostroke.de/)의 공동 연구 노력에 사용되는 표준화된 일시적인 MCAo 모델의 절차를 개발하고 설명하는 것을 목표로 했습니다. 이 컨소시엄은 뇌졸중 회복의 기계론 적 원칙의 근간을 이해하는 것을 목표로합니다. 또한, 뇌졸중 결과 분석을 위한 조직학적 및 관련 기능적 방법이 제시된다. 모든 방법은 ImmunoStroke 컨소시엄의 모든 연구 실험실에서 사용되는 확립된 표준 운영 절차를 기반으로 합니다.
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Protocol
이 비디오에서 보고된 실험은 실험 동물의 사용에 대한 국가 지침에 따라 수행되었으며, 의정서는 독일 정부 위원회(독일 뮌헨의 레지에룽 폰 오버바이엔)에 의해 승인되었다. 10주 된 남성 C57Bl/6J 마우스는 12h 광암 사이클 기간과 펠릿 식품 및 물 광고 리비툼에 대한 액세스를 통해 제어 온도(22 ± 2°C)로 사용되고 보관되었습니다.
1. 재료 및 계측기의 준비
- 37°C에서 마취 시 수술 영역과 마우스 체온의 온도를 유지하기 위해 열 담요를 연결합니다.
- Autoclave 가위와 집게, 70% 에탄올 용액을 준비하고 사용 가능한 덱스파테놀 눈 연고, 면 여러 조각, 5-0 코팅 된 편조 폴리 에스테르 봉합사를 사용할 수 있습니다. 동물의 절개 부위를 수화하기 위해 0.9% 식염수 용액(바늘 없이)으로 1mL 주사기를 준비합니다. 마취 가스 (100 % O2 + 이소플루란)를 준비하십시오.
- 10 μL 파이펫 팁(3-5mm 길이)의 끝을 절단하여 레이저 도플러 프로브에 대한 홀더를 준비합니다.
참고: 모든 기기는 뜨거운 비드 멸균제를 사용하여 멸균됩니다. 표면은 또한 미생물 소독제 스프레이와 수술 전후에 소독됩니다. 수술 전에, 마우스의 머리와 가슴을 둘러싼 지역은 상처 소독 스프레이로 소독됩니다.
2. 레이저 도플러의 준비
- 수술 전 30분 전에 마우스에 진통증을 주입하십시오(4 mg/kg 카프로펜과 0,1 mg/kg 부프레노르핀, 인내).
- 자발적인 신체 운동과 비브리세이의 중단될 때까지 4%의 이소플루란 유량으로 유도 챔버에 마우스를 마취한다.
- 마취 마스크에 코가 있는 수술 부위에 마우스를 놓습니다. 이소플루란 농도를 또 다른 분 동안 4%로 유지한 다음, 이를 줄이고 2%로 유지합니다.
- 마우스 체온을 37°C에서 유지하기 위한 관련 피드백 제어 가열 패드를 설정하고, 수술 시술 전반에 걸쳐 온도를 모니터링하기 위해 직장 프로브를 부드럽게 삽입한다.
- 두 눈에 덱스파테놀 눈 연고를 발라주세요.
- 왼쪽 눈과 귀를 둘러싼 피부와 머리카락을 70%의 에탄올로 소독합니다.
- 두개골 뼈를 드러내기 위해 왼쪽 귀와 눈 (1cm 길이) 사이에 두피를 잘라냅니다.
- 두개골 아래 MCA를 시각화하기 위해 시간근육을 자르고 은퇴하십시오.
- 접착제로 왼쪽 MCA 위에 레이저 도플러 프로브 / 섬유를 들고 팁의 외부 부분을 접착제로 고정합니다. 그런 다음 피부를 접착제로 덮어 팁 홀더 주변의 상처를 닫습니다. 경화 접착제 2-3 방울을 바르면 공정 속도를 높이게 됩니다. 레이저 도플러 섬유가 접착되지 않고 언제든지 팁 홀더에서 쉽게 제거 할 수 있는지 확인하십시오.
3. 일시적인 MCAo 모델 (폐색)
- 마우스를 척추 위치로 바꿔 놓습니다. 주전자를 마취 콘에 넣고 테이프로 발을 고정합니다.
- 가슴을 둘러싼 피부와 머리카락을 소독하고 목에 2cm 길이의 중간 절개를 합니다.
- 집게를 사용하여 피부와 하황을 분리합니다. 흉골 근육을 잡고 수술 장을 노출하고 왼쪽 일반적인 경동맥 (CCA)을 찾기 위해 re트랙터를 사용합니다. 결합 조직및 주변 신경으로부터 CCA를 해부하고 (골신경신경을 해치지 않고) 양분화 전에 일시적인 결찰을 수행한다.
- 외부 경동맥(ECA)을 해부하고 가장 단면이 보이는 부분에 영구 매듭을 묶는다. 다른 봉합사를 ECA 아래에 놓고 분기에 가깝게 놓고 나중에 사용할 느슨한 매듭을 준비합니다.
- 내부 경동맥(ICA)을 해부하고 미세 혈관 클립을 분기 위에 5mm 를 배치합니다. 골갈 신경을 손상시키지 않도록 하십시오.
- 꽉 와 느슨한 결찰 사이의 ECA에 작은 구멍을 잘라; 전체 ECA를 잘라하지 않도록주의하십시오.
- 필라멘트를 소개하고 CCA쪽으로 진행하십시오. 루멘 주위의 ECA의 느슨한 결찰을 조여 서 곧 해당 위치에 있는 필라멘트를 고정하고 미세 혈관 클립을 제거할 때 출혈을 피하십시오.
- 레이저 도플러에 의해 측정된 대뇌 혈류에서 급격한 감소(>80%)를 검출하여 MCA의 기원에 도달할 때까지 마이크로혈관 클립을 제거하고 ICA를 통해 필라멘트를 삽입한다. ECA 주변의 매듭을 더 조여이 위치에서 필라멘트를 수정합니다.
참고: 필라멘트가 적절한 방향으로 가면 원활하게 진행되며 저항을 관찰해서는 안 됩니다. - 필라멘트 삽입 전후의 레이저 도플러 값을 기록합니다.
- 재반을 제거하고 상처를 봉합하기 전에 흉골 근육과 하수 땀샘을 재배치하십시오. 레이저 도플러 프로브를 제거하고 동물을 37°C에서 1시간 동안 (필라멘트 제거까지)에 놓습니다.
4. 일시적인 MCAo 모델 (재관전)
- 자발적인 신체 운동과 비브리세이의 중단될 때까지 4%의 이소플루란 유량으로 유도 챔버에 마우스를 마취한다.
- 두 눈에 덱스파테놀 눈 연고를 발라주세요.
- 마취 마스크에 주미가 있는 수술 부위에 마우스를 놓습니다. 이소플루란 농도를 또 다른 분 동안 4%로 유지한 다음, 이를 줄이고 2%로 유지합니다. 테이프로 동물의 발을 고정합니다.
- 레이저 도플러 프로브를 프로브 홀더에 삽입합니다.
- 상처 봉합사를 제거하고, 집게를 사용하여 피부와 아방선샘을 분리합니다. 방종을 사용하여 흉골 근육을 부드럽게 당기고 수술장을 노출하십시오.
- 필라멘트를 조여주는 ECA 봉합사를 풀고 필라멘트를 부드럽게 당깁니다. 제거 하는 동안 필라멘트의 실리콘 고무 코팅을 손상 하지 마십시오.
- ECA 봉합사를 단단히 묶습니다.
- 레이저 도플러 장치의 대뇌 혈류 증가를 확인합니다(>80% 레퍼퓨전 전 초기 값의).
- 필라멘트 제거 전후에 레이저 도플러 값을 기록합니다.
- CCA에서 분기하기 전에 일시적인 결찰을 엽니다.
- 재트랙터를 제거하고 상처를 봉합하기 전에 흉골 근육과 하반신을 재배치하십시오. 동물을 마취에서 회복하기 위해 1 h에 대해 37 °C의 회복실에 동물을 놓습니다.
- 복구 후, 온도 조절 실에서 자신의 케이지에 마우스를 반환합니다.
- 수술 후 3일까지 케이지 바닥에 작은 페트리 접시에 젖은 음식 펠릿과 하이드로겔을 추가하여 동물을 돌봐주세요.
- 수술 후 3d에 대해 12시간마다 진통증을 주입하십시오(4 mg/kg 카프로펜과 0.1 mg/kg 부프레노르핀).
5. 샴 작업
- 동맥의 결찰 및 필라멘트의 도입을 포함하여 위에서 설명한 바와 같은 모든 절차를 수행한다(1-3.7단계).
- 삽입 직후 필라멘트를 제거합니다. 그런 다음 동물을 회복실에 1시간 동안 배치합니다.
- 동물을 수술 부위에 다시 배치하고 CCA의 일시적인 결단을 제거하여 완전한 대뇌 혈류 회복을 보장합니다.
- 상처를 봉합하고, 마취로부터 회복하기 위해 1 h에 대한 37 °C에서 복구 챔버에 동물을 배치합니다. 복구 후, 온도 조절 실에서 자신의 케이지에 마우스를 반환합니다.
- 수술 후 3일까지 케이지 바닥에 작은 페트리 접시에 젖은 음식 펠릿과 하이드로겔을 추가하여 동물을 돌봐주세요.
- 수술 후 3d에 대해 12시간마다 진통증을 주입하십시오(4 mg/kg 카프로펜과 0.1 mg/kg 부프레노르핀).
6. 신경 점수
- 항상 하루의 동시에 신경 점수를 수행하고, 개별 외과 의사 사이의 "중립적 인 냄새"를 유지하기 위해 수술복을 사용합니다.
- 마우스가 시험 전에 "열린" 케이지로 방에서 30분 동안 휴식을 취하게 하십시오.
- 표 1과 표 2의 각 항목을 30s에 관찰합니다.
7. 심장 내 관류
- 인산염 완충식식염(PBS)-헤파린(2 U/mL)을 함유한 20mL 주사기를 준비하고 중력 구동 관류를 용이하게 하기 위해 벤치 위에 1m를 배치한다. (선택 사항: PBS, pH 7.4에서 4% PFA를 함유한 20mL 주사기를 사용하여 4% 파라포름알데히드(PFA)로 심내 관류를 수행합니다.
- 케타민과 자일라진의 100 μL을 내장하여 주입하십시오(각각 120 mg/kg 의 체중). 5 분 기다려야하고 자발적인 신체 운동과 vibrissae의 중단을 확인합니다.
- 동물을 척추 자세로 고정하고 복부 체면을 70%의 에탄올로 소독합니다.
- 복부에 3cm 길이의 절개를 하십시오. 다이어프램, 갈비뼈, 흉골을 잘라 심장을 완전히 시각화합니다.
- 오른쪽 아트리움에 작은 절개를 하고, 좌심실에 관류 캐뉼라를 삽입합니다.
- PBS 헤파린 20mL로 퍼퓨즈.
- 수혈 후, 동물을 참수하고 뇌를 제거합니다.
- 가루 드라이 아이스에 뇌를 동결하고 추가 사용까지 -80 °C에 저장합니다.
8. 경색 볼륨
- 저온 절제의 경우, 저온을 사용하여 뇌를 400 μm마다 20 μm 두께의 섹션으로 자른다. 슬라이드에 섹션을 놓고 슬라이드를 사용할 때까지 -80 °C에 슬라이드를 저장합니다.
- 크레실 바이올렛 (CV) 염색
- 결정이 용해될 때까지 H2O의500mL에서 CV 아세테이트 0.5g을 교반 및 가열(60°C) 0.5g의 염색 용액을 준비한다. 용액이 식은 후 어두운 병에 보관하십시오. 60 °C로 다시 가열하고 모든 사용 전에 필터링합니다.
- 30 분 동안 실온에서 슬라이드를 건조하게하십시오. 15분 동안 95% 에탄올에 넣고, 70%에탄올로 1분, 50%에탄올에 1분 동안 담가 두어 드시면 1분 동안 에탄올을 넣습니다.
- 2 분 동안 증류수에 슬라이드를 담급; 증류수를 새로 고치고 슬라이드를 물에 1분 동안 놓습니다. 그 후, 60°C에서 10분 동안 예열된 스테인딩 용액에 슬라이드를 담급니다. 슬라이드를 증류수로 2회 세척하여 1분 동안 세척합니다.
- 슬라이드를 95% 에탄올로 2분 동안 담가 두십시오. 5 분 동안 100 % 에탄올에 놓습니다. 100% 에탄올을 새로 고치고 슬라이드를 에탄올에 다시 2분 동안 놓습니다. 그런 다음 슬라이드를 장착 매체로 덮습니다.
- 분석(그림 4C)
- 슬라이드를 스캔하고 Swanson메서드(12)에 의해 간접 적인 경색 볼륨을 분석하여 다음 방정식을 사용하여 부종에 대해 수정합니다.
(허혈 영역) = (허혈성 영역)-((입실 반구)-(반대반구))
- 슬라이드를 스캔하고 Swanson메서드(12)에 의해 간접 적인 경색 볼륨을 분석하여 다음 방정식을 사용하여 부종에 대해 수정합니다.
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Representative Results
여기서 설명된 모델은 일반적으로 사용되는 "필라멘트" 스트로크 모델의 변형으로, 이는 MCA의 기원을 일시적으로 차단하기 위해 ECA를 통해 실리콘 코팅 필라멘트를 도입하는 것으로 구성된다(도1). 필라멘트를 제거한 후, ECA의 혈류만 영구적으로 중단되어 CCA와 ICA의 완전한 재운하화를 허용합니다. 이것은 뇌의 적절한 재관전을 허용(도 2),인간 환자에서 성공적인 약리학적 혈전 성 또는 기계적 혈전 절제술 후 관찰 된 상황과 유사. 더욱이, 이 작품은 또한 MCA 영토를 통해 두개골에 레이저 도플러 프로브에 연결된 캐뉼라를 고정하여 폐색 및 재관류 절차 도중 대뇌 혈류를 측정하는 방법을 설명합니다.
외과 수술의 전반적인 사망률은 <5%입니다. MCAo 후 초기 시점에서, 동물은 일반적으로 심각한 자세 및 운동 적자를 제시, 일반적인 약점, 체중 에 손실13. 이러한 심각한 적자는 일시적이며, 동물은 약 1 주일 후에 향상된 활동을 보여줍니다; 따라서, 적자는 초점 신경 학적 증상에 대 한 더 구체적이다.
MCA 폐색 후 행동 적자는 복합 신경 점수에 의해 평가되었다14; 일반 및 초점 적자는 수술 후 24 시간 및 3d를 측정했다. 일반 신경점수는 모피, 귀, 눈, 자세, 자발적 활동의 평가를 포함하여 5가지항목(표 1)을통합하고 최대 점수는 18점을 제공합니다. 초점 신경 점수는 신체 대칭, 걸음걸이, 등반, 순환 동작, 앞다리 대칭, 강제 사이클링 및 수염 반응의 평가를 포함하여 7 가지 항목(표 2)으로구성되며 최대 점수는 28 입니다. 복합 척도는 0(적자 없음)에서 46(중증 손상)까지 다양합니다. 뇌졸중 동물은 합성 및 초점 신경 점수에 상당한 변화를 제시하지만, 일반적인 신경 점수에서, 가짜 동물에 비해(도 3).
경색 부피는 또한 뇌졸중 유도 후 24 시간 관상 연쇄 뇌 섹션의 크레실 바이올렛 염색을 사용하여 수행되었다. 경피량 평균은 61.69 mm3으로,영향을 받는 뇌반구의 48%를 나타낸다(도4). 숙련된 외과 의사에 의해 수행 될 때, 이 뇌졸중 모델의 전반적인 가변성은 낮은, <6%의 변화의 계수와. 병변 영역은 striatum(도 4)과같은 피질 구조뿐만 아니라 소마토 감각 및 모터 피질을 포함한다.
그림 1: 액세스 및 내막 MCA 폐색에 대한 구성표입니다. 필라멘트(점선)는 ECA의 근위및 단부 봉합사 매듭 사이에 삽입되고 MCA의 기원에 도달할 때까지 ICA를 따라 진행됩니다(인세트 참조). 일단 제자리에, ECA는 필라멘트를 해결하기 위해 봉합사로 결찰된다. 약어: ACA = 전방 뇌동맥; BA = 바실라 동맥; CCA = 일반적인 경동맥; ECA = 외부 경동맥; ICA = 내부 경동맥; MCA = 중간 뇌동맥; PCA = 동맥을 통신하는 후방; PTG = pterygopalatine 동맥. 이 그림은 잭맨 등에서수정되었습니다. 15. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 폐색 및 재관전 중 혈류. 혈류는 필라멘트 삽입 전후에 필라멘트 제거 전후에 등록됩니다. 혈류량의 감소는 폐색 과 재구류 동안 혈류의 복원 중에 관찰되었다. 모든 색상은 하나의 동물을 나타냅니다. 약어: MCA = 중간 뇌동맥; CBF = 대뇌 혈류; A.U. = 임의 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: tMCAo. (A)총,(B)초점 후 기능적 적자에 대한 신경 점수,(C)tMCAo 후 24 시간 및 3 d 전에 일반 신경 점수. 오픈 바: 가짜; 블랙 바: tMCAo. 그룹당 n=10. *p < 0.05. 약어: tMCAo = 일시적인 중형 동맥 폐색; BL = tMCAo 전에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 체적 경색 분석 및 tMCAo 후 24 시간 후 의 경색 결과 24 h. (A)대표적인 크레실 보라색 스테인드 관상 동맥 뇌 섹션 마다 400 μm 24 시간 tMCAo 후. 대시 선은 병변 영역을 해칠 수 있습니다. (B)tMCAo 후 24 시간 10 뇌 (하나의 개별 뇌를 나타내는 각 점)의 경포볼륨의 분석. 수평 빨간색 선은 평균(61.69 mm3)을나타내며, 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다(3.78 mm3). (C)크레실 바이올렛 코로나절으로부터의 광피 계산을 위한 대표적인 이미지. 파란색 = 반대 반구; 빨간색 = 입시 측 반구; 창백한 줄무늬 영역 = 허혈 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 득점 시간 | 점수 | ||
| 일반 신경 점수 | 머리 | 0. 모발을 깔끔하고 깨끗 | |
| 1. 신체 부위 2개(코와 눈)에 현지화된 필로직기와 더러운 모발 | |||
| 2. >2 신체 부위의 필로직기와 더러운 머리카락 | |||
| 귀(열린 벤치 탑의 마우스) | 0. 보통 (귀는 측면과 뒤에 뻗어, 그들은 다음 소음을 곧게하여 반응) | ||
| 1. 측면으로 뻗어 있지만 뒤에 (하나 또는 둘 다) 그들은 소음에 반응 | |||
| 2. 1과 동일합니다. 노이즈에 대한 반응이 없습니다. | |||
| 눈(OBT의 마우스) | 0. 주변 환경을 열고 깨끗하고 빠르게 따라가십시오. | ||
| 1. 개방및 수성 점액이 특징입니다. 주변 환경을 천천히 따라 | |||
| 2. 오픈 및 어두운 점액특징 | |||
| 3. 타원 모양과 어두운 점액특징 | |||
| 4. 폐쇄 | |||
| 자세(마우스를 손바닥에 놓고 부드럽게 스윙) | 0. 마우스는 손바닥에 평행한 뒷면으로 똑바로 서 있습니다. 스윙 하는 동안, 그것은 급속 하 게 서. | ||
| 1. 마우스가 고비를 맞고 서 있다. 스윙 하는 동안, 그것은 안정성을 얻기 위해 몸을 평평하게. | |||
| 2. 트렁크의 머리 또는 부분은 손바닥에 놓여 있습니다. | |||
| 3. 마우스는 한쪽에 놓여 있으며, 직립 위치를 간신히 복구 할 수 있습니다. | |||
| 4. 마우스는 직립 위치를 복구 할 수없는 경향이 위치에 있다. | |||
| 자발신 활동 (OBT에 마우스) | 0. 마우스가 경고되고 적극적으로 탐색합니다. | ||
| 1. 마우스는 경고 보인다, 하지만 그것은 침착 하 고 부진. | |||
| 2. 마우스는 간헐적이고 느리게 탐색합니다. | |||
| 3. 마우스는 솜놀림과 마비, 그 자리에서 몇 가지 움직임. | |||
| 4.No 자발적인 움직임 | |||
| 일반 점수합계 | |||
| (보통=0 최대=18) | |||
표 1: 일반 신경 점수. 동물은 측정 된 5 개의 일반 적자 각각에 대해 심각도에 따라 0과 4 점 사이에서 수신했습니다. 그런 다음 다른 영역의 점수가 추가되어 0에서 18까지의 총 일반 점수를 제공합니다. 이 표는 클라크 외14에서 수정되었습니다. 약어: OBT = 열린 벤치탑.
| 득점 시간 | 점수 | ||
| 초점 신경 점수 | 바디 대칭 (OBT의 마우스, 코 꼬리 선을 관찰) | 0. 보통 (신체 : 정상적인 자세, 벤치에서 상승 트렁크, 몸 아래에 기대어 앞다리와 뒷다리. 꼬리: 스트레이트) | |
| 1. 약간의 비대칭 (몸 : 몸 아래에 기대어 앞다리와 뒷다리와 한쪽에 기대어. 꼬리: 약간 구부러져) | |||
| 2. 적당 한 비대칭 (몸: 앞다리와 뒷다리 뻗어 한쪽에 기대어. 꼬리: 약간 구부러져) | |||
| 3. 눈에 띄는 비대칭 (몸 : 구부러진, 한쪽은 OBT에 놓여 있다. 꼬리: 구부러진) | |||
| 4. 극단적 인 비대칭 (몸 : 매우 구부러진, 한쪽은 지속적으로 OBT에 놓여 있다. 꼬리: 매우 구부러져) | |||
| 걸음걸이 (OBT에 마우스. 관찰되지 않은) | 0. 일반 (걸음걸이는 유연하고 대칭적이며 빠를 수 있습니다) | ||
| 1. 뻣뻣하고 유연하지 않습니다 (혹등 보행, 일반 마우스보다 느립니다) | |||
| 2. 비대칭 움직임으로 절뚝 거리고 | |||
| 3. 떨림, 표류, 떨어지는 | |||
| 4. 자발적으로 걷지 않는다(마우스 를 부드럽게 밀어서 자극할 때 는 3단계 이상) | |||
| 등반 (45o 표면에 마우스. 마우스를 그립 표면의 중앙에 놓습니다) | 0. 보통 (마우스가 빨리 올라갑니다) | ||
| 1. 변형, 사지 약점으로 등반 | |||
| 2. 슬로프에 보관, 미끄러지거나 오르지 않습니다. | |||
| 3. 경사면을 아래로 밀어, 실패를 방지하기 위한 실패한 노력 | |||
| 4. 즉시 슬라이드, 실패를 방지하기 위한 노력 없음 | |||
| 순환 동작(OBT의 마우스, 무료 관찰) | 0. 결석 한 순환 동작 | ||
| 1. 주로 한쪽 회전 | |||
| 2. 한쪽으로 원을 그리지만, 끊임없이 는 것은 아니지만 | |||
| 3. 원한은 지속적으로 한쪽으로 | |||
| 4. 피벗, 흔들기 또는 무브먼트 | |||
| 앞다리 대칭 (꼬리에 의해 매달려 마우스) | 0. 정상 | ||
| 1. 빛 비대칭 : 반대 측점 의 가벼운 굴곡 | |||
| 2. 표시 비대칭 : 콘트라 탈지의 표시 굴곡, 몸은 약간 ipsilateral 측에 구부러 | |||
| 3. 눈에 띄는 비대칭 : 트렁크에 부착 된 반대쪽 앞다리 | |||
| 4. 약간의 비대칭, 몸/사지 움직임 없음 | |||
| 강제 순환 (벤치에 앞다리, 꼬리에 의해 중단 된 뒷다리 : 그것은 모순 사지 마비의 존재를 밝혀) | 0. 결석. 두 앞다리의 정상적인 확장 | ||
| 1. 한쪽으로 돌리는 경향 (마우스는 두 앞다리를 모두 확장하지만 바람직하게는 한쪽으로 바뀌기 시작합니다). | |||
| 2. 한쪽으로 원을 그리는 (마우스는 건강한 마우스에 비해 움직임이 느린 한쪽으로 변합니다) | |||
| 3. 한쪽으로 피벗속도가 느려서 (마우스가 전체 원을 수행하지 못하는 한쪽으로 회전) | |||
| 4. 진행하지 않습니다 (트렁크의 앞 부분은 벤치에 누워, 느리고 짧은 움직임) | |||
| 수염 반응(OBT의 마우스) | 0. 정상 | ||
| 1. 빛 비대칭 (마우스는 모순 측에 자극 할 때 천천히 철수) | |||
| 2. 눈에 띄는 비대칭 (반대측에 자극될 때 응답 없음) | |||
| 3. 반대로 응답 부재, 자극 할 때 느린 응답 | |||
| 4. 양측간 부재자 대응 | |||
| 초점 적자에 대한 총 점수 | |||
| (보통=0 최대=28) | |||
표 2: 초점 신경 점수. 동물은 측정된 7개의 일반 적자각각에 대한 심각도에 따라 0과 4점 사이에서 수신했습니다. 그런 다음 다른 영역의 점수가 추가되어 0에서 28까지의 총 초점 점수를 제공합니다. 이 표는 클라크 외14에서 수정되었습니다. 약어: OBT = 열린 벤치탑.
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Discussion
본 프로토콜은 표준화된 일시적인 MCAo 모델을 확립하기 위해 독일 다중 센터 연구 컨소시엄("ImmunoStroke")의 합의에 기초한 실험스트로크 모델을 설명합니다. MCA의 기원에 ECA를 통해 실리콘 코팅 필라멘트를 도입하여 확립된 과도 MCAo 모델은 폐색 기간 후 동맥 재관전을 달성하기 위해 가장 널리 사용되는 스트로크 모델 중 하나입니다. 따라서 이 절차는 번역관련 스트로크 모델로 간주될 수 있습니다.
비디오에 제시된 "필라멘트 모델"은 두개골 절제술을 요구하지 않고 폐색 된 선박의 완전한 재관류를 달성하는 것과 같은 이전에 설명 된 다른 스트로크 모델에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 그러나, 외과 적 개입의 복잡성은 침략적 인 수술과 기관 및 골신경에 가까운 다른 동맥의 정확한 조작을 포함하기 때문에 제한으로 간주 될 수있다. 마취제에 동물의 긴 노출은 또한 고려하는 중요한 요인이 될 수 있습니다, 신경 보호 및 뇌졸중 결과에 마취의 영향은 이미 잘 문서화된16. 마지막으로, 이 외과 수술의 복잡성에도 불구하고, 훈련 된 외과 의사에 의해 수행 될 때 약 20 분에서 완료 할 수 있습니다.
이전에 설명된 "필라멘트" 뇌졸중프로토콜(17)과는 달리, 여기서 설명된 방법은 또한 폐색 및 재구상 동안 대뇌 혈류의 측정을 허용한다. 재관류 중 혈류 모니터링은 뇌졸중 재관전 손상을 방지하기 위한 중요한 매개 변수가 될 수있습니다(18).이는 혈전 혈관의 재항을 위한 약리학적 또는 혈관 내정간섭을 겪고 있는 환자에게 해로운 결과를 초래하는 것으로 알려져 있다. MCAo19이후 대뇌 혈류 회복의 결과 사이의 불일치에도 불구하고 뇌졸중 후 혈류 회복의 가변성은 뇌의 병리학적 및 생화학적 사건뿐만 아니라 뇌졸중마우스(20)의경색적 볼륨 및 신경학적 결핍에 영향을 미칠 수 있다. 따라서,이 모델에서 혈류와 그 기록의 완전한 복원은 특히 번역 뇌졸중 연구에서 마우스 중 재현 가능한 경적을 보장하기위한 요구 사항입니다.
외과 수술 중 전반적인 사망률은 5 % 미만이며 주로 미리 정의 된 배제 기준으로 인한 마취 합병증, 출혈 또는 희생에 의해 발생합니다. 이 치기 모형은, 그러나, 치기 유도 후에 첫번째 24-48 시간 내의 적당한 사망률을 제시합니다, 치기 마우스의 적당한 집단을 달성하기 위하여 실험 당 필요한 동물의 수를 증가시킬 수 있는. 경피량의 관점에서, 이 모형은 반구의 50%까지 포괄하는 병변으로, 큰 경색을 유도합니다. 그것은 또한 뇌 부종을 생산, 다른 뇌 영역에 영향을 미치는, 피 질 및 피 질 영역을 포함 하 여.
스트로크 모델의 낮은 가변성과 높은 재현성을 달성하기 위해, 20분 > 1) 수술 시간을 포함하여 여러 가지 배제 기준을 고려해야 합니다. 2) >20% CCA가 리그화될 때 혈류 감소의 (단계 3.3); 3) 폐색 시 혈류 감소< 80% 초기 전폐물 값; 및 4) 혈류량은 재관류 율 <80% 전재값대비 10분 증가한다. 숙련되고 훈련된 외과 의사의 경우 수술 시간 기준으로 인해 동물을 제외하지 않습니다. 그러나, 동물의 10-15%는 CCA 결찰에 따라 혈류량의 20% 감소를 보여주고, 5-10%는 각각 폐색 또는 재구주입 도중 혈류량에 있는 적당한 감소 또는 증가를 보여주지 않습니다. 따라서 이러한 기준에 따라 동물을 제외한 후성공률은 약 75~85%이다.
또한, 동물은 MCAo (체중, 온도 및 기본적인 생리적 행동) 후에 매일 검사되어 질병, 통증 또는 불편 행동을 제어합니다. 이러한 일반 치료 외에도 로타로드시험(21,끈적끈적한 라벨 테스트22,코너 테스트23)또는 실린더테스트(24)와같은 감각 운동 기능 장애를 평가하기 위한 모든 알려진 테스트에도 불구하고 초점 뇌 허혈 후 특정 행동 분석을 위해 여러 가지 검사가 개발되었다. 여기서, 본 뇌졸중 모델의 확립을 위해 선택된 동물들은 초점및 일반 적자를 평가하였으며, 필라멘트 모델은 또한 초점(감각 또는 모터)적자(25)에무관하게 사이토카인-질병 행동을 유도하기 때문이다. 종합하면, 여기에 설명된 "필라멘트" 뇌졸중 모델은 기본 및 번역 스트로크 연구를 위한 귀중한 모델입니다. 이 모델은 실험실 전체에서 스트로크 모델을 조화시키는 데 사용되는 표준화된 스트로크 모델로 제안됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 경쟁 이익이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 제안과 토론을 위한 면역 스트로크 컨소시엄 (FOR 2879, 치기 복구에 면역 세포에서)의 우리의 모든 협력 파트너에게 감사드립니다. 이 작품은 독일 시스템 신경학을 위한 뮌헨 클러스터(EXC 2145 SyNergy - ID 390857198)의 틀 내에서 독일의 우수 전략에 따라 도이치 포르충스게마인샤프트(DFG, 독일 연구 재단)와 LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 및 LL-112-122/1의 보조금하에 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
References
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