Summary
Différents modèles d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAo) sont utilisés dans la recherche expérimentale sur les accidents vasculaires cérébraux. Ici, un modèle expérimental d’AVC de MCAo transitoire via l’artère carotide externe (ECA) est décrit, qui vise à imiter l’AVC humain, dans lequel le thrombus cérébrovasculaire est enlevé en raison d’une lyse spontanée du caillot ou d’un traitement.
Abstract
L’AVC est la troisième cause de mortalité la plus fréquente et la principale cause d’invalidité acquise chez les adultes dans les pays développés. À ce jour, les options thérapeutiques sont limitées à une petite proportion de patients victimes d’un AVC dans les premières heures suivant l’AVC. De nouvelles stratégies thérapeutiques sont largement étudiées, en particulier pour prolonger la fenêtre de temps thérapeutique. Ces recherches actuelles comprennent l’étude d’importantes voies physiopathologiques après un AVC, telles que l’inflammation post-AVC, l’angiogenèse, la plasticité neuronale et la régénération. Au cours de la dernière décennie, les groupes de recherche indépendants se sont de plus en plus préoccupés par la faible reproductibilité des résultats expérimentaux et des résultats scientifiques. Pour surmonter la soi-disant « crise de la réplication », des modèles standardisés détaillés pour toutes les procédures sont nécessaires de toute urgence. Dans le cadre d’un effort au sein du consortium de recherche « ImmunoStroke » (https://immunostroke.de/), un modèle murin standardisé d’occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne (MCAo) est proposé. Ce modèle permet la restauration complète du flux sanguin lors de l’élimination du filament, simulant la lyse thérapeutique ou spontanée des caillots qui se produit dans une grande proportion des accidents vasculaires cérébraux humains. La procédure chirurgicale de ce modèle d’AVC « filament » et les outils pour son analyse fonctionnelle sont présentés dans la vidéo d’accompagnement.
Introduction
L’AVC est l’une des causes les plus fréquentes de décès et d’invalidité dans le monde. Bien qu’il existe principalement deux formes distinctes d’AVC, ischémique et hémorragique, 80 à 85% de tous les cas d’AVC sont ischémiques1. Actuellement, seuls deux traitements sont disponibles pour les patients victimes d’AVC ischémique : le traitement pharmacologique avec un activateur tissulaire recombinant du plasminogène (rtPA) ou une thrombectomie mécanique. Cependant, en raison de la fenêtre de temps thérapeutique étroite et des multiples critères d’exclusion, seul un nombre restreint de patients peut bénéficier de ces options de traitement spécifiques. Au cours des deux dernières décennies, la recherche préclinique et translationnelle sur les AVC s’est concentrée sur l’étude des approches neuroprotectrices. Cependant, tous les composés qui ont atteint les essais cliniques n’ont jusqu’à présent montré aucune amélioration pour le patient2.
Étant donné que les modèles in vitro ne peuvent pas reproduire avec précision toutes les interactions cérébrales et les mécanismes physiopathologiques de l’AVC, les modèles animaux sont cruciaux pour la recherche préclinique sur l’AVC. Cependant, il n’est pas possible d’imiter tous les aspects de l’AVC ischémique humain dans un seul modèle animal, car l’AVC ischémique est une maladie très complexe et hétérogène. Pour cette raison, différents modèles d’AVC ischémiques ont été développés au fil du temps chez différentes espèces. La photothrommbose des artérioles cérébrales ou l’occlusion distale permanente de l’artère cérébrale moyenne (ACM) sont des modèles couramment utilisés qui induisent de petites lésions définies localement dans le néocortex3,4. En plus de ceux-ci, le modèle de course le plus couramment utilisé est probablement le soi-disant « modèle de filament », dans lequel une occlusion transitoire de MCA est obtenue. Ce modèle consiste en une introduction transitoire d’un filament de suture à l’origine du MCA, conduisant à une réduction brutale du flux sanguin cérébral et à un infarctus important subséquent des régions cérébrales sous-corticales et corticales5. Bien que la plupart des modèles d’AVC imitent les occlusions MCA 6,le « modèle de filament » permet une délimitation précise du temps ischémique. La reperfusion par élimination de filament imite le scénario clinique humain de restauration du flux sanguin cérébral après une lyse spontanée ou thérapeutique (rtPA ou thrombectomie mécanique). À ce jour, différentes modifications de ce « modèle de filament » ont été décrites. Dans l’approche la plus courante, décrite pour la première fois par Longa et al. en 19895, un filament revêtu de silicium est introduit via l’artère carotide commune (CCA) à l’origine du MCA7. Bien qu’il s’agisse d’une approche largement utilisée, ce modèle ne permet pas une restauration complète du flux sanguin pendant la reperfusion, car le CCA est ligaturé de manière permanente après l’élimination du filament.
Au cours de la dernière décennie, un nombre croissant de groupes de recherche se sont intéressés à la modélisation de l’AVC chez la souris à l’aide de ce « modèle de filament ». Cependant, la variabilité considérable de ce modèle et le manque de normalisation des procédures sont quelques-unes des raisons de la grande variabilité et de la faible reproductibilité des résultats expérimentaux et des découvertes scientifiques rapportés jusqu’à présent2,8. Une cause potentielle de la « crise de réplication » actuelle, en référence à la faible reproductibilité entre les laboratoires de recherche, est les volumes d’infarctus d’AVC non comparables entre les groupes de recherche utilisant la même méthodologie expérimentale9. En fait, après avoir mené la première étude préclinique randomisée contrôlée multicentrique10, nous avons pu confirmer que le manque de normalisation suffisante de ce modèle expérimental d’AVC et des paramètres de résultat ultérieurs étaient les principales raisons de l’échec de la reproductibilité dans les études précliniques entre laboratoires indépendants11 . Ces différences drastiques dans les tailles d’infarctus qui en résultent, malgré l’utilisation du même modèle d’AVC, constituent à juste titre une menace non seulement pour la recherche de confirmation, mais aussi pour les collaborations scientifiques en raison du manque de modèles robustes et reproductibles.
À la lumière de ces défis, nous avons cherché à développer et à décrire en détail la procédure d’un modèle MCAo transitoire standardisé tel qu’utilisé pour les efforts de recherche collaboratifs au sein du consortium de recherche « ImmunoStroke » (https://immunostroke.de/). Ce consortium vise à comprendre les interactions cerveau-immunité qui sous-tendent les principes mécanistes de la récupération après un AVC. En outre, des méthodes histologiques et fonctionnelles connexes pour l’analyse des résultats de l’AVC sont présentées. Toutes les méthodes sont basées sur des procédures opérationnelles normalisées établies utilisées dans tous les laboratoires de recherche du consortium ImmunoStroke.
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Protocol
Les expériences rapportées dans cette vidéo ont été menées conformément aux directives nationales pour l’utilisation d’animaux de laboratoire, et les protocoles ont été approuvés par les comités gouvernementaux allemands (Regierung von Oberbayern, Munich, Allemagne). Des souris mâles C57Bl/6J âgées de dix semaines ont été utilisées et logées sous température contrôlée (22 ± 2 °C), avec une période de cycle lumière-obscurité de 12 h et un accès ad libitum aux aliments et à l’eau en granulés.
1. Préparation du matériel et des instruments
- Connectez la couverture chauffante pour maintenir la température de la zone d’opération et la température corporelle de la souris pendant l’anesthésie à 37 ° C.
- Ciseaux et pinces autoclaves, préparez une solution d’éthanol à 70% et gardez à disposition une pommade pour les yeux au dexpanthénol, plusieurs morceaux de coton et une suture en polyester tressé enduit 5-0 prêt à l’emploi. Préparez une seringue de 1 mL avec une solution saline à 0,9 % (sans aiguille) pour garder le site d’incision de l’animal hydraté. Préparer le gaz d’anesthésie (100% O2 + isoflurane).
- Préparez un support pour la sonde laser Doppler en coupant l’extrémité d’une pointe de pipette de 10 μL (longueur de 3 à 5 mm).
REMARQUE: Tous les instruments sont stérilisés à l’aide d’un stérilisateur à billes chaudes. Les surfaces sont également désinfectées avant et après la chirurgie avec un spray désinfectant microbien. Avant la chirurgie, les zones entourant la tête et la poitrine des souris sont désinfectées avec un spray de désinfection des plaies.
2. Préparation du laser Doppler
- Injecter l’analgésie à la souris 30 minutes avant la chirurgie (4 mg/kg de carprofène et 0,1 mg/kg de buprénorphine, par voie intrapéritonéale).
- Anesthésiez la souris en la plaçant dans la chambre d’induction avec un débit d’isoflurane de 4% jusqu’à l’arrêt des mouvements spontanés du corps et des vibrisses.
- Placez la souris en position couchée dans la zone d’opération avec son nez dans le masque d’anesthésie. Maintenez la concentration d’isoflurane à 4% pendant une autre minute, puis réduisez-la et maintenez-la à 2%.
- Réglez le coussin chauffant à rétroaction contrôlée associé pour maintenir la température corporelle de la souris à 37 ° C et insérez doucement la sonde rectale pour surveiller la température tout au long des interventions chirurgicales.
- Appliquez la pommade pour les yeux au dexpanthénol sur les deux yeux.
- Désinfectez la peau et les cheveux entourant l’œil et l’oreille gauches avec de l’éthanol à 70%.
- Coupez le cuir chevelu entre l’oreille gauche et l’œil (1 cm de long) pour exposer l’os du crâne.
- Coupez et retirez le muscle temporal pour visualiser le MCA sous le crâne.
- Fixez avec de la colle la partie extérieure de la pointe en tenant la sonde / fibre Doppler laser sur le dessus du MCA gauche avec de la colle. Ensuite, collez la peau pour fermer la plaie autour du porte-pointe. Appliquez 2-3 gouttes de colle durcisseuse pour accélérer le processus. Assurez-vous que la fibre laser Doppler n’est pas collée et peut être facilement retirée du porte-embout à tout moment.
3. Modèle MCAo transitoire (occlusion)
- Tournez la souris en position couchée. Mettez le museau dans le cône d’anesthésie et fixez les pattes avec du ruban adhésif.
- Désinfectez la peau et les cheveux entourant la poitrine et faites une incision médiane de 2 cm de long dans le cou.
- Utilisez une pince pour séparer la peau et les glandes sous-maxillaires. Utilisez des rétracteurs pour maintenir le muscle sternomastoïde, exposer le champ chirurgical et trouver l’artère carotide commune gauche (ACC). Disséquez le CCA libre du tissu conjonctif et des nerfs environnants (sans endommager le nerf vagal) et effectuez une ligature transitoire avant la bifurcation.
- Disséquez l’artère carotide externe (ECA) et nouez un nœud permanent à la partie visible la plus distale. Placez une autre suture sous l’ECA, près de la bifurcation, et préparez un nœud lâche à utiliser plus tard.
- Disséquez l’artère carotide interne (ICA) et placez-y un clip microvasculaire, à 5 mm au-dessus de la bifurcation. Assurez-vous de ne pas endommager le nerf vagal.
- Couper un petit trou dans l’ECA entre les ligatures serrées et lâches; veillez à ne pas couper toute la COUR.
- Introduisez le filament et avancez-le vers le CCA. Resserrez la ligature lâche dans l’ECA autour de la lumière pour fixer rapidement le filament dans cette position et éviter les saignements lors du retrait du clip microvasculaire.
- Retirez le clip microvasculaire et insérez le filament à travers l’ICA jusqu’à ce que l’origine du MCA soit atteinte en détectant une forte réduction (>80%) du flux sanguin cérébral mesurée par le laser Doppler. Fixez le filament dans cette position en resserrant davantage le nœud autour de l’ECA.
REMARQUE: Lorsque le filament va dans la direction appropriée, il avance en douceur et aucune résistance ne doit être observée. - Enregistrez les valeurs Doppler laser avant et après l’insertion du filament.
- Retirez l’enrouleur et déplacez le muscle sternomastoïde et les glandes sous-maxillaires avant de suturer la plaie. Retirez la sonde laser Doppler et placez l’animal dans une chambre de récupération à 37 °C pendant 1 h (jusqu’à l’élimination du filament).
4. Modèle MCAo transitoire (Reperfusion)
- Anesthésiez la souris en la plaçant dans la chambre d’induction avec un débit d’isoflurane de 4% jusqu’à l’arrêt des mouvements spontanés du corps et des vibrisses.
- Appliquez la pommade pour les yeux au dexpanthénol sur les deux yeux.
- Placez la souris en position couchée dans la zone d’opération avec son museau dans le masque d’anesthésie. Maintenez la concentration d’isoflurane à 4% pendant une autre minute, puis réduisez-la et maintenez-la à 2%. Fixez les pattes de l’animal avec du ruban adhésif.
- Insérez la sonde laser Doppler dans le support de la sonde.
- Retirez la suture de la plaie, utilisez une pince pour séparer la peau et les glandes sous-maxillaires. Utilisez des rétracteurs pour tirer doucement le muscle sternomastoïde et exposer le champ chirurgical.
- Desserrez la suture ECA qui resserre le filament et tirez doucement le filament. Évitez d’endommager le revêtement silicone-caoutchouc du filament pendant le retrait.
- Attachez fermement la suture ECA.
- Confirmer l’augmentation du flux sanguin cérébral dans le dispositif laser Doppler (>80% de la valeur initiale avant reperfusion).
- Enregistrez les valeurs Doppler laser avant et après le retrait du filament.
- Ouvrez la ligature transitoire avant la bifurcation du CCA.
- Retirez l’enrouleur et déplacez le muscle sternomastoïde et les glandes sous-maxillaires avant de suturer la plaie. Placer l’animal dans une chambre de récupération à 37 °C pendant 1 h pour récupérer de l’anesthésie.
- Après la récupération, retournez les souris dans leurs cages dans une pièce à température contrôlée.
- Prenez soin des animaux en ajoutant des granulés de nourriture humide et de l’hydrogel dans de petites boîtes de Pétri sur le sol de la cage jusqu’au jour 3 après la chirurgie.
- Injecter une analgésie toutes les 12 h pendant 3 jours après la chirurgie (4 mg/kg de carprofène et 0,1 mg/kg de buprénorphine).
5. Opération simulée
- Effectuer toutes les procédures décrites ci-dessus, y compris la ligature des artères et l’introduction du filament (étapes 1-3.7).
- Retirez le filament immédiatement après son insertion. Ensuite, placez l’animal dans la chambre de récupération pendant 1 h.
- Placez à nouveau l’animal dans la zone d’opération et retirez la ligature transitoire du CCA pour assurer une restauration complète du flux sanguin cérébral.
- Suturez la plaie et placez l’animal dans une chambre de récupération à 37 °C pendant 1 h pour récupérer de l’anesthésie. Après la récupération, retournez les souris dans leurs cages dans une pièce à température contrôlée.
- Prenez soin des animaux en ajoutant des granulés de nourriture humide et de l’hydrogel dans de petites boîtes de Pétri sur le sol de la cage jusqu’au jour 3 après la chirurgie.
- Injecter une analgésie toutes les 12 h pendant 3 jours après la chirurgie (4 mg/kg de carprofène et 0,1 mg/kg de buprénorphine).
6. Neuroscore
- Effectuez le Neuroscore toujours à la même heure de la journée et utilisez des vêtements chirurgicaux pour maintenir une « odeur neutre » entre les chirurgiens individuels.
- Laissez les souris reposer pendant 30 minutes dans la pièce avec une cage « ouverte » avant le test.
- Observez chaque élément du tableau 1 et du tableau 2 pendant 30 s.
7. Perfusion intracardiaque
- Préparer une seringue de 20 mL contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)-héparine (2 U/mL) et la placer à 1 m au-dessus du banc pour faciliter la perfusion par gravité. (FACULTATIF: Effectuer une perfusion intracardiaque avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) à l’aide d’une seringue de 20 mL contenant 4% de PFA dans pbS, pH 7,4).
- Injecter par voie intrapéritonéale 100 μL de kétamine et de xylazine (120 et 16 mg/kg de poids corporel, respectivement). Attendez 5 min et confirmez l’arrêt des mouvements spontanés du corps et des vibrisses.
- Fixez l’animal en position couchée et désinfectez la surface abdominale du corps avec de l’éthanol à 70%.
- Faites une incision de 3 cm de long dans l’abdomen; couper le diaphragme, les côtes et le sternum pour visualiser complètement le cœur.
- Faites une petite incision dans l’oreillette droite et insérez la canule de perfusion dans le ventricule gauche.
- Perfuser avec 20 mL de PBS-héparine.
- Après perfusion, décapiter l’animal et retirer le cerveau.
- Congeler le cerveau sur de la glace sèche en poudre et conserver à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
8. Volumétrie de l’infarctus
- Pour la cryosection, utilisez un cryostat pour couper les cerveaux en sections de 20 μm d’épaisseur tous les 400 μm. Placez les sections sur les diapositives et rangez-les à −80 °C jusqu’à ce qu’elles soient utilisées.
- Coloration au violet crésyl (CV)
- Préparer la solution colorante en remuant et en chauffant (60 °C) 0,5 g d’acétate CV dans 500 mL deH2Ojusqu’à dissolution des cristaux. Une fois la solution refroidie, conservez-la dans une bouteille sombre. Réchauffer à 60 °C et filtrer avant chaque utilisation.
- Laissez sécher les lames à température ambiante pendant 30 min. Immergez-les dans de l’éthanol à 95 % pendant 15 min, dans de l’éthanol à 70 % pendant 1 min, puis dans de l’éthanol à 50 % pendant 1 min.
- Immerger les toboggans dans de l’eau distillée pendant 2 min; rafraîchir l’eau distillée et placer les toboggans dans l’eau pendant 1 min. Ensuite, immergez les lames dans la solution de coloration préchauffée pendant 10 min à 60 °C. Laver les lames deux fois à l’eau distillée pendant 1 min.
- Immerger les lames dans de l’éthanol à 95% pendant 2 min. Placez-les dans de l’éthanol à 100% pendant 5 min; rafraîchir l’éthanol à 100% et replacer les lames dans l’éthanol pendant 2 min. Ensuite, couvrez les diapositives avec un support de montage.
- Analyse (Figure 4C)
- Scannez les lames et analysez le volume de l’infarctus indirect par la méthode Swanson12 pour corriger l’œdème à l’aide de l’équation suivante :
(Aire ischémique) = (région ischémique)-((hémisphère ipsilatéral)-(hémisphère controlatéral))
- Scannez les lames et analysez le volume de l’infarctus indirect par la méthode Swanson12 pour corriger l’œdème à l’aide de l’équation suivante :
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Representative Results
Le modèle décrit ici est une modification du modèle de course « filament » couramment utilisé, qui consiste à introduire un filament recouvert de silicium à travers l’ECA pour bloquer transitoirement l’origine du MCA(Figure 1). Après avoir retiré le filament, seul le flux sanguin dans l’ECA est définitivement arrêté, ce qui permet une recanalisation complète du CCA et de l’ICA. Cela permet une reperfusion adéquate du cerveau(Figure 2),similaire à la situation observée après une thrombolyse pharmacologique réussie ou une thrombectomie mécanique chez des patients humains. De plus, ce travail décrit également une méthode de mesure du flux sanguin cérébral pendant les procédures d’occlusion et de reperfusion en fixant une canule connectée à la sonde laser Doppler au crâne au-dessus du territoire MCA.
Le taux de mortalité global de l’intervention chirurgicale est de <5% lorsqu’elle est effectuée par un chirurgien qualifié. Aux premiers moments après le MCAo, les animaux présentent généralement de graves déficits posturaux et de mouvement, une faiblesse générale et une perte de poids corporel13. Ces déficits graves sont transitoires et les animaux montrent une activité améliorée après environ 1 semaine; ainsi, les déficits sont plus spécifiques pour les symptômes neurologiques focaux.
Les déficits comportementaux après occlusion du MCA ont été évalués par le composite Neuroscore14; les déficits généraux et focaux ont été mesurés 24 h et 3 j après la chirurgie. Le Neuroscore général intègre 5 items (Tableau 1), y compris l’évaluation de la fourrure, des oreilles, des yeux, de la posture et de l’activité spontanée, avec un score maximum de 18. Le Neuroscore focal comprend 7 éléments(tableau 2),y compris l’évaluation de la symétrie corporelle, de la démarche, de l’escalade, du comportement circulaire, de la symétrie des membres antérieurs, du cyclisme obligatoire et de la réponse des moustaches, avec un score maximum de 28. L’échelle composite varie de 0 (pas de déficit) à 46 (déficiences graves). Les animaux victimes d’AVC présentaient un changement significatif dans le Neuroscore composite et focal, mais pas dans le Neuroscore général, par rapport aux animaux simulés (Figure 3).
La volumétrie de l’infarctus a également été réalisée à l’aide de la coloration au violet crésyl des sections cérébrales coronales en série 24 heures après l’induction de l’AVC. La moyenne du volume de l’infarctus était de 61,69 mm3,ce qui représente 48 % de l’hémisphère cérébral affecté(Figure 4). Lorsqu’il est effectué par un chirurgien qualifié, la variabilité globale de ce modèle d’AVC est faible, avec un coefficient de variation de <6%. La zone lésionnelle comprend le cortex somatosensoriel et moteur ainsi que des structures sous-corticales telles que le striatum(Figure 4).
Figure 1: Schéma d’accès et d’occlusion intraluminale du MCA. Le filament (ligne pointillée) est inséré entre les nœuds de suture proximale et distale dans l’ECA et avancé le long de l’ICA jusqu’à ce qu’il atteigne l’origine du MCA (voir encadré). Une fois en place, l’ECA est ligaturé avec une suture pour fixer le filament. Abréviations : ACA = artère cérébrale antérieure; BA = artère basilaire; CCA = artère carotide commune; ECA = artère carotide externe; ICA = artère carotide interne; MCA = artère cérébrale moyenne; APC = artère communicante postérieure; PTG = artère ptérygopalatine. Ce chiffre a été modifié à partir de Jackman etal. 15. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Flux sanguin pendant l’occlusion et la reperfusion. Le flux sanguin est enregistré avant et après l’insertion du filament et avant et après le retrait du filament. Une réduction du flux sanguin a été observée lors de l’occlusion et la restauration du flux sanguin lors de la reperfusion. Chaque couleur représente un animal. Abréviations: MCA = artère cérébrale moyenne; CBF = flux sanguin cérébral; A.U. = unités arbitraires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Neuroscore pour les déficits fonctionnels après tMCAo. (A) Total, (B) focal, et (C) Neuroscore général avant et 24 h et 3 d après tMCAo. Bars ouverts: simulacre; Barres noires: tMCAo. n=10 par groupe. *p < 0,05. Abréviations : tMCAo = occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne; BL = avant tMCAo. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Analyse volumétrique de l’infarctus et résultat de l’infarctus 24 h après tMCAo. (A) Sections cérébrales coronales représentatives du cresyl violet tous les 400 μm à 24 h après tMCAo. Des lignes pointillées délimitent la zone de la lésion. (B) Analyse du volume d’infarctus de 10 cerveaux (chaque point représentant un cerveau individuel) 24 h après tMCAo. La ligne rouge horizontale représente la moyenne (61,69 mm3),les barres d’erreur indiquent l’écart type (3,78 mm3). (C) Image représentative pour le calcul du volume de l’infarctus à partir d’une section coronale violette crésylique. Bleu = hémisphère controlatéral; Rouge = hémisphère ipsilatéral; Zone rayée pâle = région ischémique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Point temporel de la notation | score | ||
| Neuroscore général | Cheveux | 0. Cheveux propres et propres | |
| 1. Piloérection localisée et cheveux sales dans 2 parties du corps (nez et yeux) | |||
| 2. Piloerection et cheveux sales dans les parties du corps >2 | |||
| Oreilles (souris sur une paillasse ouverte) | 0. Normal (les oreilles sont étirées latéralement et derrière, elles réagissent en se redressant suite au bruit) | ||
| 1. Étirés latéralement mais pas derrière (un ou les deux), ils réagissent au bruit | |||
| 2. Identique à 1. AUCUNE réaction au bruit. | |||
| Yeux (souris sur OBT) | 0. Ouvrir, nettoyer et suivre rapidement l’environnement environnant | ||
| 1. Ouvert et caractérisé par du mucus aqueux. Suivez lentement l’environnement environnant | |||
| 2. Ouvert et caractérisé par un mucus foncé | |||
| 3. Ellipsoïdal de forme et caractérisé par un mucus sombre | |||
| 4. Fermé | |||
| Posture (placez la souris sur la paume et balancez-la doucement) | 0. La souris se tient en position verticale avec le dos parallèle à la paume. Pendant le swing, il se tient rapidement. | ||
| 1. La souris est bosselée. Pendant la balançoire, il aplatit le corps pour gagner en stabilité. | |||
| 2. La tête ou une partie du tronc repose sur la paume. | |||
| 3. La souris se trouve d’un côté, à peine capable de récupérer la position verticale. | |||
| 4. La souris se trouve dans une position couchée, incapable de récupérer la position verticale. | |||
| Activité de Spontaneos (souris sur OBT) | 0.La souris est alerte et explore activement. | ||
| 1.La souris semble alerte, mais elle est calme et lente. | |||
| 2.La souris explore par intermittence et lentement. | |||
| 3.La souris est somnolente et engourdie, peu de mouvements sur place. | |||
| 4.No mouvements spontanés | |||
| Score total pour la notation générale | |||
| (normal=0 max=18) | |||
Tableau 1 : Neuroscore général. Les animaux ont reçu entre 0 et 4 points, selon la gravité, pour chacun des cinq déficits généraux mesurés. Les scores sur les différents domaines sont ensuite ajoutés pour fournir un score général total allant de 0 à 18. Ce tableau a été modifié à partir de Clark et al.14 . Abréviation : OBT = paillasse ouverte.
| Point temporel de la notation | score | ||
| Focal Neuroscore | Symétrie corporelle (souris sur OBT, observer la ligne nez-queue) | 0. Normal (Corps: posture normale, tronc surélevé du banc, avec les membres antérieurs et postérieurs penchés sous le corps. Queue : droite) | |
| 1. Légère asymétrie (Corps: se penche d’un côté avec les membres antérieurs et postérieurs penchés sous le corps. Queue : légèrement pliée) | |||
| 2. Asymétrie modérée (Corps: s’appuie d’un côté avec les membres antérieurs et postérieurs étirés. Queue : légèrement pliée) | |||
| 3. Asymétrie proéminente (Corps: plié, d’un côté se trouve sur l’OBT. Queue : pliée) | |||
| 4. Asymétrie extrême (Corps: très plié, d’un côté se trouve constamment sur l’OBT. Queue : très courbée) | |||
| Démarche (souris sur OBT. Observé sans être dérangé) | 0. Normal (la démarche est flexible, symétrique et rapide) | ||
| 1. Rigide, inflexible (marche à bosse, souris plus lente que la normale) | |||
| 2. Boiterie, avec des mouvements asymétriques | |||
| 3. Tremblements, dérive, chute | |||
| 4. Ne marche pas spontanément (lorsqu’il est stimulé en poussant doucement la souris ne marche pas plus de 3 pas) | |||
| Escalade (souris sur une surface de 45o. Placez la souris au centre de la surface de préhension) | 0. Normal (la souris grimpe rapidement) | ||
| 1. Ascensions avec tension, faiblesse des membres présente | |||
| 2. S’accroche à la pente, ne glisse pas et ne grimpe pas | |||
| 3. Glisse vers le bas de la pente, effort infructueux pour éviter l’échec | |||
| 4. Glisse immédiatement, aucun effort pour éviter l’échec | |||
| Comportement circulaire (souris sur OBT, observation libre) | 0. Comportement circulaire absent | ||
| 1. Virages principalement d’un côté | |||
| 2. Cercles d’un côté, mais pas constamment | |||
| 3. Cercles constamment d’un côté | |||
| 4. Pivotement, balancement ou absence de mouvement | |||
| Symétrie du membre antérieur (souris suspendue par la queue) | 0. Normal | ||
| 1. Asymétrie légère: légère flexion du membre antérieur controlatéral | |||
| 2. Asymétrie marquée: flexion marquée du membre controlatéral, le corps se plie légèrement du côté ipsilatéral | |||
| 3. Asymétrie proéminente : le membre antérieur controlatéral adhère au tronc | |||
| 4. Légère asymétrie, pas de mouvement du corps / membre | |||
| Cercle obligatoire (membres antérieurs sur le banc, membres postérieurs suspendus par la queue : il révèle la présence de la paralysie du membre controlatéral) | 0. Absent. Extension normale des deux membres antérieurs | ||
| 1. Tendance à se tourner d’un côté (la souris étend les deux membres antérieurs, mais commence à tourner de préférence d’un côté) | |||
| 2. Cercles d’un côté (la souris se tourne d’un côté avec un mouvement plus lent par rapport aux souris en bonne santé) | |||
| 3. Pivote lentement d’un côté (la souris se tourne vers un côté sans effectuer un cercle complet) | |||
| 4. N’avance pas (la partie avant du coffre repose sur le banc, mouvements lents et brefs) | |||
| Réponse de la moustache (souris sur l’OBT) | 0. Normal | ||
| 1. Asymétrie légère (la souris se retire lentement lorsqu’elle est stimulée du côté controlatéral) | |||
| 2. Asymétrie proéminente (pas de réponse lorsqu’elle est stimulée du côté controlatéral) | |||
| 3. Absence de réponse contralatérale, réponse lente lorsqu’elle est stimulée ipsilatéralement | |||
| 4. Absence de réponse bilatérale | |||
| Score total pour les déficits focaux | |||
| (normal=0 max=28) | |||
Tableau 2 : Neuroscore focal. Les animaux ont reçu entre 0 et 4 points selon la gravité de chacun des sept déficits généraux mesurés. Les scores sur les différents domaines sont ensuite ajoutés pour fournir un score focal total allant de 0 à 28. Ce tableau a été modifié à partir de Clark et al.14 . Abréviation : OBT = paillasse ouverte.
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Discussion
Le présent protocole décrit un modèle expérimental d’AVC basé sur l’accord consensuel d’un consortium de recherche multicentrique allemand (« ImmunoStroke ») pour établir un modèle MCAo transitoire standardisé. Le modèle transitoire MCAo établi en introduisant un filament recouvert de silicium à travers l’ECA à l’origine du MCA est l’un des modèles de course les plus largement utilisés pour obtenir une reperfusion artérielle après une période d’occlusion délimitée. Par conséquent, cette procédure peut être considérée comme un modèle d’AVC pertinent sur le plan de la traduction.
Le « modèle de filament » présenté dans la vidéo présente certains avantages par rapport à d’autres modèles d’AVC décrits précédemment, tels que ne pas nécessiter de craniotomie et obtenir une reperfusion complète du vaisseau obstrué transitoirement. Cependant, la complexité de l’intervention chirurgicale pourrait être considérée comme une limitation, car elle comprend une chirurgie invasive et une manipulation précise des différentes artères à proximité de la trachée et du nerf vagal. La longue exposition de l’animal aux anesthésiques pourrait également être un facteur critique à considérer, car l’impact des anesthésiques sur la neuroprotection et les résultats des accidents vasculaires cérébraux a déjà été bien documenté16. Enfin, malgré la complexité de cette intervention chirurgicale, elle peut être réalisée en environ 20 minutes lorsqu’elle est réalisée par un chirurgien qualifié.
Contrairement aux protocoles d’AVC « filament » précédemment décrits17,la méthode décrite ici permet également de mesurer le flux sanguin cérébral pendant les phases d’occlusion et de reperfusion. La surveillance du flux sanguin pendant la reperfusion pourrait être un paramètre important pour prévenir les lésions de reperfusion d’AVC18, qui sont connues pour causer des conséquences délétères chez les patients subissant des interventions pharmacologiques ou endovasculaires pour la recanalisation des vaisseaux thrombosés. Malgré les écarts entre les conséquences de la restauration du flux sanguin cérébral après MCAo19, la variabilité de la restauration du flux sanguin après un AVC peut influencer les événements physiopathologiques et biochimiques dans le cerveau, ainsi que le volume de l’infarctus et les déficits neurologiques des souris AVC20. Par conséquent, dans ce modèle, la restauration complète du flux sanguin et son enregistrement sont des exigences pour assurer des infarctus reproductibles chez la souris, en particulier dans les études translationnelles sur les accidents vasculaires cérébraux.
La mortalité globale pendant l’intervention chirurgicale est inférieure à 5% et est principalement causée par des complications anesthésiques, des saignements ou des sacrifices dus à des critères d’exclusion prédéfinis. Ce modèle d’AVC présente, cependant, un taux de mortalité modéré dans les 24 à 48 premières heures après l’induction de l’AVC, ce qui pourrait augmenter le nombre d’animaux nécessaires par expérience pour obtenir une cohorte adéquate de souris AVC. En termes de volume d’infarctus, ce modèle induit de grands infarctus, avec des lésions englobant jusqu’à 50% de l’hémisphère. Il produit également un œdème cérébral, affectant différentes régions du cerveau, y compris les régions corticales et sous-corticales.
Pour obtenir une faible variabilité et une reproductibilité élevée du modèle d’AVC, plusieurs critères d’exclusion doivent être pris en compte, notamment: 1) le temps de fonctionnement > 20 min; 2) >20 % de la réduction du flux sanguin lorsque le CCA est ligaturé (étape 3.3); 3) réduction du débit sanguin pendant l’occlusion < 80% de la valeur initiale de pré-occlusion; et 4) augmentation du débit sanguin 10 min après le taux de reperfusion <80% par rapport à la valeur de pré-reperfusion. Pour un chirurgien expérimenté et formé, aucun animal n’est exclu en raison du critère du temps d’opération. Cependant, 10 à 15% des animaux présentent une réduction de 20% du flux sanguin lors de la ligature de la DPA, et 5 à 10% ne montrent aucune réduction ou augmentation adéquate du flux sanguin pendant l’occlusion ou la reperfusion, respectivement. Par conséquent, le taux de réussite après exclusion des animaux sur la base de ces critères est d’environ 75 à 85%.
En outre, les animaux sont examinés quotidiennement après MCAo (poids corporel, température et comportement physiologique de base) pour contrôler le comportement de maladie, de douleur ou d’inconfort. En plus de ce soin général, plusieurs tests ont été développés pour l’analyse comportementale spécifique après ischémie cérébrale focale, malgré tous les tests connus pour évaluer le dysfonctionnement sensorimoteur, tels que le test Rotarod21,le test Sticky label22,le test Corner23,ou le test Cylinder24. Ici, les animaux sélectionnés pour l’établissement de ce modèle d’AVC ont été évalués pour les déficits focaux et généraux, puisque le modèle de filament induit également un comportement de maladie des cytokines indépendant des déficits focaux (sensoriels ou moteurs)25. Pris ensemble, le modèle d’AVC « filament » décrit ici est un modèle précieux pour la recherche fondamentale et translationnelle sur l’AVC. Ce modèle est proposé comme modèle normalisé d’AVC à utiliser pour harmoniser les modèles d’AVC entre les laboratoires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions tous nos partenaires de collaboration des consortiums ImmunoStroke (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) pour leurs suggestions et discussions. Ce travail a été financé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne dans le cadre du Cluster de Munich pour la neurologie des systèmes (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) et dans le cadre des subventions LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 et LL-112/1-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
References
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