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Medicine

Basophiler Aktivierungstest zur Allergiediagnostik

Published: May 31, 2021 doi: 10.3791/62600
Automatic Translation
*1,2, *2, 2,3, 1,2,4,5
1Allergy Unit, Hospital Regional Universitario de Málaga, 2Allergy Research Group, Instituto de Investigación Biomédica de Málaga-IBIMA, 3Universidad de Málaga, Departamento de Biología celular, Genética y Fisiología, Universidad de Málaga, 4Departamento de Medicina, Universidad de Málaga, 5Nanostructures for Diagnosing and Treatment of Allergic Diseases Laboratory, Andalusian Center for Nanomedicine and Biotechnology-BIONAND
* These authors contributed equally

Summary

Der basophile Aktivierungstest ist ein ergänzender in-vitro-diagnostischer Test zur Bewertung von IgE-vermittelten allergischen Reaktionen basierend auf dem Nachweis einer basophilen Aktivierung in Gegenwart eines spezifischen Stimulus durch die Messung von Aktivierungsmarkern durch Durchflusszytometrie.

Abstract

Der Basophilenaktivierungstest (BAT) ist ein ergänzender In-vitro-Diagnosetest , der zusätzlich zur klinischen Anamnese, zum Hauttest (ST) und zur spezifischen IgE-Bestimmung (sIgE) bei der Beurteilung von IgE-vermittelten allergischen Reaktionen auf Lebensmittel, Insektengift, Medikamente sowie einige Formen chronischer Urtikaria verwendet werden kann. Die Rolle dieser Technik in den Diagnosealgorithmen ist jedoch sehr variabel und nicht gut bestimmt.

Die BVT basiert auf der Bestimmung der basophilen Reaktion auf die IgE-Aktivierung durch Allergen-/Wirkstoffvernetzung durch die Messung von Aktivierungsmarkern (wie CD63, CD203c) mittels Durchflusszytometrie. Dieser Test kann ein nützliches und ergänzendes Werkzeug sein, um kontrollierte Provokationstests zur Bestätigung der Allergiediagnose zu vermeiden, insbesondere bei Probanden mit schweren lebensbedrohlichen Reaktionen. Im Allgemeinen sollte die Leistung der BVT in Betracht gezogen werden, wenn i) das Allergen/Arzneimittel falsch positive Ergebnisse bei ST liefert; ii) es gibt keine Allergen-/Arzneimittelquelle, die für die ST- oder sIgE-Bestimmung verwendet werden kann; iii) es besteht Diskrepanz zwischen der Anamnese und der ST- oder sIgE-Bestimmung; iv) Symptome deuten darauf hin, dass ST zu einer systemischen Reaktion führen kann; v) bevor ein CCT in Betracht gezogen wird, um das schuldige Allergen / Medikament zu bestätigen. Die Haupteinschränkungen des Tests beziehen sich auf die nicht optimale Empfindlichkeit, insbesondere bei Arzneimittelallergien, die Notwendigkeit, den Test nicht länger als 24 Stunden nach der Probenextraktion durchzuführen, und die fehlende Standardisierung zwischen Laboratorien in Bezug auf Verfahren, Konzentrationen und Zellmarker.

Introduction

Die IgE-vermittelte Allergiediagnose basiert auf der klinischen Anamnese, Hauttests (STs), der Quantifizierung von serumspezifischen IgE (sIgE) und, falls erforderlich und indiziert, kontrollierten Provokationstests (CCTs)1,2,3,4,5,6. Die klinische Anamnese kann jedoch unzuverlässig sein, da es an genauen Informationen mangeln kann und STs und CCTs keine risikofreien Verfahren sind, die bei Patienten mit schweren lebensbedrohlichen Reaktionen kontraindiziert werden können 1,2,3,4,5,6 . Diese Probleme, zusammen mit der Tatsache, dass die Bestimmung von sIgE durch validierte und kommerzielle Fluorenzym-Immunoassays nur für wenige Allergene und Medikamente verfügbar ist, haben die wichtige Rolle anderer funktioneller In-vitro-Assays wie dem Basophilenaktivierungstest (BAT) hervorgehoben.

Basophile sind wichtige Effektorzellen, die an IgE-vermittelten allergischen Reaktionen beteiligt sind, die bei Vernetzung benachbarter sIgE, die an hochaffine Rezeptoren (FcεRI) auf der Zelloberfläche gebunden sind, nach Allergen- / Arzneimittelexposition aktiviert werden. Die basophile Aktivierung löst die Zelldegranulation und Freisetzung von vorgeformten und neu synthetisierten Entzündungsmediatoren aus, die in intrazytoplasmatischen Sekretionsgranula 7,8,9 enthalten sind. BAT ist eine In-vitro-Methode, die versucht, die basophile Aktivierung in Gegenwart eines Stimulus (Allergen oder Arzneimittel) nachzuahmen und Veränderungen in der Expression basophiler Aktivierungsmarker durch Durchflusszytometrie 7,10 zu bestimmen. Es gibt verschiedene Strategien zur Identifizierung von Basophilen (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) und zur Messung der Zellaktivierung (hauptsächlich Hochregulierung von CD63 und CD203c) mit Kombinationen von fluorochrommarkierten Antikörpern 7,10. CD63, der beste klinisch validierte Aktivierungsmarker 11,12,13,14, ist ein Membranprotein, das an den sekretorischen Granula verankert ist, die Histamin enthalten, das nach Zellaktivierung und Fusion des Granulats mit der Membran auf der basophilen Oberfläche exprimiert wird 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c ist ein Oberflächenmarker, der konstitutiv auf Basophilen exprimiert und nach FcεRI-Stimulation hochreguliert wird, was auch zuverlässige Ergebnisse in BAT 15,22,23,24,25 gezeigt hat. Außerdem scheint es mit CD6326 zu koexprimieren.

In den letzten Jahrzehnten hat sich BVT als nützlich bei der Diagnose von IgE-vermittelten allergischen Reaktionen erwiesen, die durch verschiedene Auslöser wie Medikamente, Nahrungsmittel oder Inhalationsmittel induziert werden, sowie bei einigen Formen der chronischen Urtikaria, wie unten beschrieben. Die Position dieser Technik in den Diagnosealgorithmen ist jedoch sehr variabel und nicht gut bestimmt.

Überempfindlichkeit gegen Medikamente
BAT hat sich als ergänzender Test für ausgewählte Arzneimittel und Patienten als nützlich erwiesen, insbesondere für diejenigen, bei denen schwere Reaktionen auftreten, da der diagnostische Wert von ST für die meisten Arzneimittel nicht gut etabliert ist, da sie für eine begrenzte Anzahl von Arzneimitteln validiert und standardisiert sind27,28,29,30. Darüber hinaus ist die Quantifizierung von sIgE nur für eine begrenzte Anzahl von Arzneimitteln verfügbar, mit geringerer Empfindlichkeit als ST 27,28,29,30,31,32. Daher beruht die Diagnose einer Arzneimittelüberempfindlichkeit in der Regel auf einem Drogenprovokationstest, der bei Probanden mit schweren lebensbedrohlichen Reaktionen kontraindiziert sein kann33.

Vielversprechende Ergebnisse wurden für die Anwendung von BAT bei ausgewählten Patienten berichtet, die über sofortige Überempfindlichkeitsreaktionen auf verschiedene Arzneimittel wie Betalactame (BLs)20,34,35,36,37,38,39, neuromuskuläre Blocker (NMBAs)19,22,40,41,42, 43,44,45, Fluorchinolone (FQs)46,47,48,49, Pyrazolone 50,51,52, Radiokontrastmittel (RCM)53,54,55,56 und Platinverbindungen57,58,59 . Es wurde berichtet, dass BAT eine Sensitivität und Spezifität zwischen 51,7-66,9 % bzw. 89,2-97,8 % aufweist; und positive und negative prädiktive Werte werden zwischen 93,4% und 66,3% bzw.27,31 beschrieben. Darüber hinaus wurde BAT als prädiktiver Biomarker für Durchbruchreaktionen während der Desensibilisierung mit Platinverbindungen vorgeschlagen, da die CD203c-Expression im Vergleich zu CD63 bei Patienten mit hohem Risiko für Nebenwirkungen während der Desensibilisierung von Arzneimitteln erhöht ist57.

Es ist anzumerken, dass BVT bei Arzneimittelüberempfindlichkeit nur dann nützlich ist, wenn die Reaktion eine basophile Degranulation beinhaltet; Daher ist es nicht nützlich bei Reaktionen, die aus einer enzymatischen Hemmung der Cyclooxygenase 142 resultieren.

Lebensmittelallergie
BVT hat sich als potenzielles Diagnoseinstrument für Nahrungsmittelallergien herausgestellt, da die Bestimmung von Serum-sIgE für den gesamten Allergenextrakt oder einzelne Allergene oft mehrdeutig ist und eine orale Nahrungsprovokation zur Bestätigung der Diagnose erfordert, was ähnlich wie bei der Arzneimittelüberempfindlichkeit ein kostspieliges und nicht risikofreies Verfahren ist60. Mehrere Studien haben relevante Ergebnisse mit Kuhmilch 61,62, Ei 61,63, Weizen 64,65,66,67,68, Erdnuss 63,69,70,71,72, Haselnuss 73,74,75,76 gezeigt ,77, Schalentiere78, Pfirsich 79,80,81, Apfel21, Sellerie und Karotte82,83.

Der Hauptmehrwert von BAT bei der Diagnose von Nahrungsmittelallergien im Vergleich zu STs und sIgE im Serum besteht darin, dass es eine höhere Spezifität und ähnliche Sensitivität aufweist. Daher ist BAT ein nützliches Instrument, um klinisch allergische Patienten von sensibilisierten, aber toleranten Probanden zu unterscheiden, die sowohl eine hohe Spezifität (75-100%) als auch eine hohe Sensitivität (77-98%) aufweisen63,69,84. Sensitivitäts- und Spezifitätswerte hängen vom Allergen und anderen Faktoren wie Phänotypen (z. B. orales Allergiesyndrom versus Anaphylaxie), Alter und geografisch bedingten Sensibilisierungsmustern ab63,85.

BVT unter Verwendung einzelner Allergenkomponenten kann möglicherweise die diagnostische Genauigkeit für einige Lebensmittelallergeneverbessern 61,80. Es gibt Studien mit Samenspeicherproteinen (z. B. Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 und Ara h 6 aus Erdnüssen)86; Lipidtransferproteine (z.B. Pru p 3 aus Pfirsich und Ara h 9 aus Erdnüssen)80,86; und Bet v 1 Homologe (z. B. Ara h 8 aus Erdnuss)87. Andere mögliche Nutzen beziehen sich auf die Identifizierung des Täterallergens in Fällen von Pollen-Nahrungsmittel-Allergie-Syndrom 21,87,88, Allergie gegen rotes Fleisch 89 oder lebensmittelabhängiger belastungsinduzierter Anaphylaxie66.

Interessanterweise kann die BVT Aufschluss über den Schweregrad und die Schwelle allergischer Reaktionen geben, da Patienten mit schwereren Reaktionen einen größeren Anteil an aktivierten Basophilen aufweisen, wie in Studien mit Erdnuss- und Kuhmilchallergikern beobachtetwurde 84,90,91; und Patienten, die auf Spuren des Allergens reagieren, zeigen eine größere basophile Empfindlichkeit 84,90,92. Diese Daten deuten darauf hin, dass BAT nützlich sein kann, um allergische Hochrisikopatienten zu identifizieren, die eine engere Nachsorge und eine intensivere Aufklärung benötigen93. Darüber hinaus wurde berichtet, dass BVT die Reaktionen auf Lebensmittelherausforderungen 70,91,92,94 und die Reaktivitätsschwellen 90,95 vorhersagen kann, um festzustellen, wann Lebensmittel sicher (wieder) eingeführt werden können 84. Diese Ergebnisse sind jedoch in einigen Studien umstritten63,96 und weitere Forschung sind erforderlich.

Andererseits wurde BVT verwendet, um das Abklingen von Nahrungsmittelallergien, entweder auf natürliche Weise oder unter immunmodulatorischen Behandlungen, im Laufe der Zeit zu überwachen, was bisher nur durch orale Nahrungsmittelprovokation mit den damit verbundenen Risiken und Kosten bewertet wurde. 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107,108. Darüber hinaus wurde es auch verwendet, um die Wirkung von Omalizumab bei Nahrungsmittelallergien zu überwachen, da die basophile Aktivierung während der Behandlung mit Omalizumab abnimmt, aber nach Beendigung der Behandlung zunimmt109.

Inhalationsallergie
BAT ist selten vorteilhaft bei Inhalationsallergien, da die Diagnose routinemäßig durch sIgE-Quantifizierung und ST gestellt werden kann. In Fällen von lokaler allergischer Rhinitis (nicht nachweisbare sIgE-Werte und negative STs mit positiven nasalen Provokationstests) hat die BVT jedoch in 50% der Fälle eine Diagnose ermöglicht110. Es wurde ferner über eine Korrelation zwischen der basophilen Empfindlichkeit und dem Ansprechen auf nasale/bronchiale Provokationstests sowie zwischen dem Schweregrad des Asthmas und der Wirksamkeit der Behandlung mit Omalizumab111,112 berichtet.

BAT wurde auch verwendet, um die Allergenimmuntherapie für Hausstaubmilben und Pollen zu überwachen, da die basophile Empfindlichkeit während der Immuntherapie abnimmt, wahrscheinlich aufgrund der Interferenz der blockierenden IgG-Antikörper 113,114,115,116,117.

Hymenoptera-Giftallergie
Die Diagnose einer Hymenoptera-Giftallergie basiert routinemäßig auf ST und Serum-sIgE. BAT hat eine hohe Sensitivität (85-100%) und Spezifität (83-100%) gezeigt und es wurde berichtet, dass es in Fällen nützlich ist, die zu mehrdeutigen Ergebnissen führen, oder bei Patienten mit einer suggestiven klinischen Vorgeschichte einer Giftallergie, aber nicht nachweisbarem sIgE und negativem ST118,119. Die BVT scheint jedoch keinen Schweregrad für diese Reaktionen vorherzusagen120,121.

Bis zu 60% der Patienten zeigen sIgE sowohl für Wespen- als auch für Bienengift, und die Identifizierung eines dominanten Allergens ist entscheidend für eine adäquate Immuntherapie. In diesen Fällen hat sich die BVT als nützlich bei der Identifizierung des dominanten Allergens 119,122,123,124 erwiesen. Obwohl sIgE zu den Hauptallergenen von Bienen- und Wespengiften den Nutzen von BAT bei Patienten mit doppelter Positivität für beide Gifte verringern kann, liefert es nützliche Informationen, hauptsächlich bei Probanden mit negativen Ergebnissen bei sIgE-Bestimmungen123.

Einige Studien deuten darauf hin, dass BAT als prädiktiver Biomarker für Nebenwirkungen während der Aufbauphase der Giftimmuntherapie nützlich sein kann, da diese Behandlungsoption die basophile Empfindlichkeit verringert. Die Reaktivität nimmt jedoch nicht ab und dieses BAT-Dienstprogramm ist heutzutage umstritten 13,120,125,126,127,128,129,130.

Urtikaria und Angioödem
Eine Untergruppe von Patienten mit chronischer Urtikaria hat eine autoinmune Pathophysiologie aufgrund von IgE-Autoantikörpern gegen Autoallergene und IgG-Autoantikörpern, die auf FcεRI- oder IgE-FcεRI-Komplexe abzielen, die auf der Mastzelloberfläche131,132 vorhanden sind. In der klinischen Praxis stützt sich die Diagnose dieser Art von chronischer Urtikaria auf positive autologe Serum-ST, die das Risiko einer versehentlichen Infektion birgt. BAT wurde als In-vitro-Test zur Diagnose und Überwachung von Patienten mit Verdacht auf chronische Urtikaria vorgeschlagen. Es wurde berichtet, dass sowohl die CD63- als auch die CD203c-Expression auf der Oberfläche von Basophilen nach Stimulation mit Seren von Patienten mit chronischer Urtikaria erhöht war, was den Nachweis der aktiven Autoantikörper 133,134,135,136,137 zeigt. Kürzlich wurde berichtet, dass Patienten mit positiver BAT häufig den aktivsten Krankheitszustand aufweisen, der anhand des Urtikaria-Aktivitätsscores beurteilt wird, und höhere Dosen von Antihistaminika zusammen mit Drittlinienbehandlungen (Ciclosporin A oder Omalizumab) benötigen als Patienten mit negativem BAT138.

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Protocol

Die Protokolldurchführung wurde gemäß den Prinzipien der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der lokalen Ethikkommission (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, Spanien) genehmigt. Alle Probanden wurden mündlich über die Forschungsstudie informiert und unterschrieben die entsprechende Einwilligungserklärung.

HINWEIS: Das vorliegende Protokoll beschreibt das BAT-Verfahren, das die Autoren täglich anwenden. Dies ist jedoch keine standardisierte Methode und es gibt Unterschiede zu Verfahren, die von anderen Autoren veröffentlicht wurden. Die wichtigsten Protokollmodifikationen beziehen sich auf die Verwendung von IL-3 im Stimulationspuffer, die Inkubationszeit mit dem Stimulus, die Methode zum Stoppen der basophilen Degranulation und die Durchflusszytometriestrategien. Darüber hinaus enthalten verschiedene kommerziell erhältliche Kits für BVT spezifische, vom Hersteller empfohlene Protokolle.

1. Probenvorbereitung

  1. Sammeln Sie peripheres Blut in 9 ml heparinisierten Röhrchen und halten Sie die Probe bei Raumtemperatur (RT) in einem Rotor, bis sie für das experimentelle Protokoll erforderlich ist.
  2. Kennzeichnen Sie 5-ml-Zytometerröhrchen für Negativkontrollen (2 Röhrchen), Positivkontrollen (2 Röhrchen) und unterschiedliche Konzentrationen von Allergenen/Arzneimitteln (1 Röhrchen pro getesteter Allergen-/Arzneimittelkonzentration). Legen Sie die Schläuche in ein Gestell, wo die Schläuche perfekt passen, ohne zu verrutschen.
  3. Einen Stimulationspuffer in doppelt destilliertem Wasser herstellen, das 2% (v/v) HEPES, 78 mg/L NaCl, 3,7 mg/L KCl, 7,8 mg/L CaCl2, 3,3 mg/L MgCl2, 1 g/L HSA enthält. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein und fügen Sie IL-3 bei 2 ng / ml hinzu. Normalerweise 100 ml vorbereiten und in 2,5 ml Aliquots teilen, um bei -20 °C eingefroren zu werden.
  4. Positivkontrollen in PBS-Tween-20 0,05% (v/v) (PBS-T): Positivkontrolle 1, N-Formylmethionyl-Leucyl-phenylalanin (fMLP) (4 μM), um die Qualität der Basophilen zu bestätigen; Positivkontrolle 2, Anti-IgE (0,05 mg/ml) als IgE-vermittelte Positivkontrolle.
  5. Bereiten Sie das Allergen / Medikament in PBS-T bei 2x der gewünschten Endkonzentration vor.
    ANMERKUNG: Die optimalen zu verwendenden Allergen-/Arzneimittelkonzentrationen müssen zuvor unter Verwendung eines breiten Konzentrationsbereichs, durch Dosis-Wirkungs-Kurven und durch Zytotoxizitätsstudien nach denselben Protokollschritten139 bestimmt werden.

2. Zubereitung der Färbemischung

  1. Geben Sie monoklonale Antikörper, die mit Fluorochrom markiert sind, nach der vom Hersteller empfohlenen Antikörperkonzentration oder durch vorherige Antikörpertitration in den Stimulationspuffer. In diesem Protokoll fügen wir 1 μL jedes Antikörpers hinzu (CCR3-APC und CD203c-PE zur basophilen Identifizierung; CD63-FITC zur basophilen Aktivierung)140 pro 20 μL Stimulationspuffer.
    HINWEIS: Schützen Sie die Zubereitung der Färbemischung vor Licht.
  2. Fügen Sie 23 μL Färbemischung zu jedem Röhrchen hinzu.

3. Blutstimulation

  1. Fügen Sie 100 μL PBS-T zu den Röhrchen 1 und 2 (Negativkontrolle), 100 μL fMLP zu Röhre 3, 100 μL Anti-IgE zu Röhre 4 und 100 μL der verschiedenen Allergen-/Arzneimittelkonzentrationen zu den folgenden Röhrchen hinzu. 10 min bei 37 °C in einem Thermostatbad mit mittlerem Rühren inkubieren, um Reagenzien vorzuwärmen.
  2. Fügen Sie vorsichtig 100 μL Blut in jedes Röhrchen hinzu, um Hämolyse zu vermeiden. Die Schläuche vorsichtig durchwirbeln und 25 min bei 37 °C in einem Thermostatbad mit mittlerem Rühren inkubieren.
  3. Stoppen Sie die Degranulation und halten Sie die Röhrchen mindestens 5 min bei 4 °C.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier bei 4 °C für 30-45 min pausiert werden, fallserforderlich 141,142,143.

4. Erythrozyten lysieren

  1. Fügen Sie 2 ml 1x Lysepuffer zu jedem Röhrchen hinzu, um Erythrozyten zu lysieren. Jedes Röhrchen vorvertreiben und 5 min bei RT inkubieren.
    HINWEIS: In diesem Schritt werden Zellen aufgrund von Fixiermitteln (Formaldehyd), die im Puffer enthalten sind, fixiert.
  2. Zentrifugieren bei 300 x g bei 4 °C für 5 min. Dekantieren Sie den Überstand und kippen Sie das Gestell in ein Waschbecken. Zellen verbleiben am Boden der Röhrchen.
  3. Fügen Sie 3 ml PBS-T zu jedem Röhrchen hinzu, um die Zellen zu waschen. Wirbeln Sie jede Röhre.
  4. Zentrifugieren bei 300 x g bei 4 °C für 5 min. Dekantieren Sie den Überstand und kippen Sie das Gestell in ein Waschbecken.
    HINWEIS: Bewahren Sie die Proben bis zur Erfassung des Durchflusszytometers bei 4 °C vor Licht geschützt auf.

5. Erfassung der Durchflusszytometrie

  1. Erfassen Sie Proben mit einem Durchflusszytometer (z. B. BD FACSCalibur Durchflusszytometer). Verbinden Sie das Durchflusszytometer mit der Computersoftware und warten Sie, bis das Zytometer bereit ist. Laden Sie die Vorlagen- und Geräteeinstellungen (Tabelle 1).
  2. Starten Sie die Probenerfassung.
  3. Verwenden Sie die folgenden Zytometerstrategien zur Auswahl aktivierter Basophiler139.
    1. Gate der Lymphozyten aus dem Diagramm Seitenstreuung (SSC) - Vorwärtsstreuung (FSC).
    2. Gate die Basophilen aus der Lymphozytenpopulation als CCR3+CD203c+ Zellen. Erwerben Sie mindestens 500 Basophile pro Röhre.
    3. Zeigen Sie ein CCR3 - CD63-Diagramm an, um die Aktivierung mit CD63 als Aktivierungsmarker zu analysieren. Stellen Sie den negativen Schwellenwert CD63 mit den negativen Kontrollröhrchen auf ca. 2,5% ein.
    4. Erfassen Sie alle Proben.

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Representative Results

BVT, die mit Allergenen oder Arzneimitteln durchgeführt wird, ermöglicht die Untersuchung von IgE-abhängigen Überempfindlichkeitsreaktionen. Die basophile Reaktivität sollte in mindestens zwei optimalen Konzentrationen gemessen werden, um die besten Ergebnisse zu erzielen34 und die Aktivierung wird durch die Hochregulierung von CD63 auf der Zelloberfläche visualisiert. Im Falle von Allergenen sollte darüber hinaus zur Bestätigung der basophilen Reaktivität die basophile Empfindlichkeit analysiert werden, indem die Reaktivität bei mehreren abnehmenden Allergenkonzentrationen gemessen wird114. Dieses Maß ermöglicht die Bestimmung der Allergenkonzentration, die die Reaktion von 50% Basophilen (EC50) induziert, die als "CD-sens"141 ausgedrückt werden kann. Die Messung der Fläche unter der Dosiskurve (AUC) wurde kürzlich vorgeschlagen, um sowohl die basophile Reaktivität als auch die basophile Empfindlichkeit zusammen zu bewerten58.

Die Durchflusszytometrie-Strategie zur Analyse der BAT-Ergebnisse ist in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt und umfasst Gating-Lymphozyten aus dem SSC-FSC-Diagramm (Schritt 1), Gating-Basophile aus der Lymphozytenpopulation als CCR3+CD203c+-Zellen (Schritt 2) mit einem CCR3-CD63-Diagramm zur Analyse der Aktivierung mit CD63 als Aktivierungsmarker (Schritt 3). Die Abbildungen zeigen repräsentative Beispiele für BAT-Ergebnisse, die für Arzneimittel (Abbildung 1) und Allergene (Abbildung 2) erzielt wurden.

Figure 1
Abbildung 1: Repräsentative Analyse des basophilen Wirkstoffaktivierungstests mittels Durchflusszytometrie . (A) SSC-FSC-Diagramm zur Auswahl der Lymphozyten+Basophilenpopulation. (B) CCR3-CD203c-Diagramm zur Gate-Basophilie aus der Lymphozytenpopulation als CCR3+CD203c-Zellen. (C) CCR3-CD63-Diagramm zur Analyse der Aktivierung unter Verwendung von CD63 als Aktivierungsmarker für Negativkontrolle, Positivkontrolle und Arzneimittel. Die in jedem Bereich angezeigten Werte stellen den Prozentsatz der Zellen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Analyse des Allergen-Basophil-Aktivierungstests mittels Durchflusszytometrie . (A) SSC-FSC-Diagramm zur Auswahl der Lymphozyten+Basophilenpopulation. (B) CCR3-CD203c-Diagramm zur Gate-Basophilie aus der Lymphozytenpopulation als CCR3+CD203c+ -Zellen. (C) CCR3-CD63-Diagramm zur Analyse der Aktivierung unter Verwendung von CD63 als Aktivierungsmarker, der Ergebnisse für die Negativkontrolle und die Verringerung der Allergenkonzentrationen zeigt (Ara h 9). Die in jedem Bereich angezeigten Werte stellen den Prozentsatz der Zellen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Lichtquellen (Laser) 488 nm Coherent SapphireTM luftgekühlter Argon-Ionen-Laser; 20 mW; 633-nm JDS UniphaseTM HeNe luftgekühlter Laser; 17 mW
Lichtanregungswellenlänge Blauer Laser:488 nm; Roter Laser: 633 nm
Lichtquellenleistung bei der exzitatorischen Wellenlänge Blauer Laser: 20 mW; Roter Laser: 17 mW
Optische Filter SSC: 488/10; FITC: 530/30, PE:585/42, APC: 660/20
Optische Detektoren FSC, SSC, FL1-H FITC, FL2-H PE, FL4-H APC
Optische Detektoren Luftgekühlter Argon-Ionen-Laser
Optische Pfade BD-Achteck (488 nm Laserlinie); BD Trigons (633 nm Laserlinie)

Tabelle 1: Anforderungen an Durchflusszytometer

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Discussion

BAT ist ein ergänzender in-vitro-diagnostischer Test zur Beurteilung von IgE-vermittelten allergischen Reaktionen, der sich bei der Diagnose von Reaktionen, die durch verschiedene Auslöser wie Medikamente, Lebensmittel oder Inhalationsmittel ausgelöst werden, sowie bei einigen Formen chronischer Urtikaria als nützlich erwiesen hat. Im Allgemeinen sollte die BAT-Leistung in Betracht gezogen werden, wenn i) das Allergen/Arzneimittel falsch positive Ergebnisse bei ST liefert; ii) das Allergen/Arzneimittel steht nicht für die ST- oder sIgE-Quantifizierung zur Verfügung; iii) Diskordanz zwischen klinischer Anamnese und ST- oder sIgE-Bestimmung besteht; iv) Symptome deuten darauf hin, dass ST eine systemische Reaktion auslösen kann; v) vor CCT für die Bestätigung des Allergens/Arzneimittels10.

In Bezug auf das experimentelle Protokoll gibt es verschiedene wichtige Aspekte, die berücksichtigt werden müssen, um geeignete Blutproben für den Test zu erhalten. Systemische Steroide 146 und Immunsupressoren, einschließlich oraler Kortikosteroide,147 sollten vor dem Test wegen einer Abnahme der basophilen Reaktion 146 vermieden werden (Antihistaminika und topische Steroide beeinflussen die BAT-Ergebnisse nicht)146. Der Test sollte nicht während einer Infektion oder aktiver chronischer entzündlicher Zustände durchgeführt werden148. Die Intervallzeit zwischen der Reaktion und dem Test sollte aufgrund der berichteten Negativisierung der sIgE-Spiegel im Laufe der Zeit nicht länger als 1 Jahr sein42,52,149. Der Test wird mit frischem Vollblut durchgeführt und darf nicht länger als 24 h nach der Blutentnahme150.151 durchgeführt werden. Blut muss in heparinstabilisierten Röhrchen gesammelt werden, da Basophile nicht degranulieren, wenn EDTA oder Säurecitratdextrose als Stabilisator verwendet werden, obwohl es nach Zugabe von Calcium152 verwendet werden könnte. Auf der anderen Seite sollte der im Test verwendete Stimulus keine Hilfsstoffe enthalten; Aus diesem Grund werden standardisierte Allergenextrakte, rekombinante oder gereinigte Allergene, reine Wirkstoffe oder intravenöse injizierbare Arzneimittelpräparate empfohlen. Darüber hinaus müssen chemische Eigenschaften der Medikamente berücksichtigt werden. Zum Beispiel sind einige Arzneimittel in Lösung instabil und müssen vor jedem Test frisch zubereitet werden, und andere sind photolabil und müssen unter Schutz des Assays vor dem Lichtdurchgeführt werden 48. Toxizität und unspezifische Aktivierung sollten für jedes getestete Allergen / Medikament bewertet werden, und ROC-Kurven mit bestätigten Patienten und tolerante Kontrollen müssen analysiert werden, um den Cut-off zu bestimmen. Schließlich sollte die Bedeutung beider Positivkontrollen bei der Analyse der BVT hervorgehoben werden. fMLP ist ein bakterielles Peptid, das eine basophile Aktivierung durch den G-Protein-gekoppelten fMLP-Rezeptor induziert. Aus diesem Grund wird es häufig als Positivkontrolle der nicht-IgE-vermittelten Aktivierung verwendet16. Anti-IgE oder alternativ Anti-FcεRI werden als Positivkontrollen der IgE-vermittelten basophilen Aktivierung verwendet. Keine basophile Aktivierung in Gegenwart von nicht-IgE- und IgE-vermittelten positiven Kontrollen deutet auf eine unzureichende Qualität der Basophilen oder Fehler im experimentellen Protokoll hin. Im Gegensatz dazu werden Basophile, die mit fMLP, aber nicht mit Anti-IgE oder Anti-FcεRI aktiviert sind, als Non-Responder-Basophile bezeichnet, wobei geschätzt wird, dass 6-17% der Allgemeinbevölkerung nicht auf die Stimulation durch FcεRI in BAT 63,84,153 ansprechen, obwohl sie normale Dichten von Zelloberflächen-IgE exprimieren. Die Nichtansprechbarkeit könnte mit niedrigen Spiegeln der Syk-Phosphatase 154.155.156 zusammen mit erhöhten CD45-157-Spiegeln zusammenhängen. Obwohl Studien gezeigt haben, dass Non-Responder-Basophile in Gegenwart von IL-3158 in In-vitro-Assays zu Respondern werden können, können Non-Responder-Basophile immer noch in BVT nachgewiesen werden, und in diesen Fällen können die Ergebnisse nicht für die Bewertung berücksichtigt werden.

Über die Aufnahme von IL-3, einem basophilen Priming-Zytokin, besteht kein allgemeiner Konsens. Es wurde berichtet, dass die Verwendung von IL-3 die basophile Reaktionsfähigkeit bei CD63-basierter BAT verbessert, ohne eine CD63-Hochregulierung nach einer kurzen Vorbehandlung selbst zu induzieren 7,159,160. Eine andere Studie legt jedoch nahe, dass IL-3 die CD63-Expression zu Studienbeginn161 hochreguliert. Im Gegensatz dazu bestätigen Studien im Fall von CD203c-basiertem BAT, dass IL-3-Priming die CD203c-Expression durch ruhende Basophile verbessert, Unterschiede zwischen unstimulierten und stimulierten Basophilen verringert und die BAT-Sensitivität verringert 159.161.

Verschiedene Gating-Strategien können verwendet werden, um basophile Populationen zu identifizieren und die basophile Aktivierung durch Durchflusszyotmetrie zu analysieren. Basophile sind Low-Side-Scatter-Zellen, die durch verschiedene Selektionsmarkeroptionen identifiziert werden können 162,163,164, was ein Schlüsselpunkt ist, der die diagnostische Effizienz von BAT 165,166 beeinflussen könnte. Die Zellmarkerauswahl sollte auf der Spezifität zur Unterscheidung von Basophilen aus anderen Zellpopulationen sowie auf der Zellmarkerexpression auf ruhenden und aktivierten Zellen basieren. Die bekanntesten und am häufigsten verwendeten basophilen Selektionsmarker sind: CD193 (CCR3) (auch exprimiert auf Mastzellen, Th2-Lymphozyten162 und Eosinophilen), CD123 (auch exprimiert auf HLA-DR+ plasmazytoiden dendritischen Zellen), CD203c (ausschließlich auf Basophilen exprimiert und nach basophiler Aktivierung hochreguliert) und FcεRI (auch exprimiert auf pluripotenten Vorläuferzellen von Mastzellen)139. Basierend auf diesen Zellmarkern und in Kombination mit SSC sind häufigere Selektionsstrategien SSC niedrig CCR3+, SSC niedrig CCR3+CD203c+ (angewendet in diesem Protokoll), SSC niedrig CD123+HLA-DR−, SSC niedrig CD203c+CD123+HLA-DR−, SSCniedrigFcεRI+HLA-DR− (zum Ausschluss von Antigen-präsentierenden Zellen und Monozyten 146,161 ,162,163), SSC niedrig CD203c+CRTH2+CD3- (um T-Zellen auszuschließen)164, SSC niedrig CD203c+ oder SSC niedrig CCR3+CD123+10,162,166, SSCniedrigCD123+(CD3-CD14-CD19-CD20-)167,168 und SSCniedrigerIgE+169,170, obwohl letzteres aufgrund von Einschränkungen bei Patienten mit niedrigen IgE-Spiegeln nicht empfohlen wird. Nach genauer Auswahl der basophilen Population wird die Aktivierung in der Regel durch den Nachweis von CD63 nachgewiesen, das sich in der Membran des sekretorischen Granulats 16,171 befindet, dessen Expression auf der basophilen Oberfläche direkt mit der basophilen Degranulation und Histaminfreisetzung16,172,173 korreliert. Eine weitere Möglichkeit ist die Analyse von CD203c, obwohl die Sensitivität aufgrund seiner Hochregulierung durch IL-3159,161, konstitutiv auf ruhenden Basophilen und hochreguliert auf aktivierten Basophilen, geringer ist.

Die basophile Aktivierung wird durch Messung des Prozentsatzes der CD63-positiven Zellen (CD63-basierter BAT) oder der Variationen der mittleren CD203c-Fluoreszenzintensität (MFI) (CD203c-basierter BVT) im Vergleich zu einem Negativkontrollwert als Schwellenwert für jeden Assay nachgewiesen. Ein Schwellenwert von 2,5% CD63-positiven Zellen in der Negativkontrolle (nicht stimulierte Zellen) wird empfohlen, um die genauesten BAT-Ergebnisse im Vergleich zu einem kontrollierten Challenge-Test zu bestimmen. Die Berücksichtigung der Positivität hängt vom getesteten Reiz ab. Die basophile Aktivierung gilt als positiv für einen Stimulus, wenn der Prozentsatz der CD63-positiven Basophilen in Gegenwart des Stimulus geteilt durch den Prozentsatz der CD63-positiven Basophilen in der Negativkontrolle höher ist als der durch die ROC-Kurvenanalyse berechnete Cut-off von Daten von bestätigten allergischen Patienten und gesunden Spendern.

Die BAT-Leistung ermöglicht die Unterscheidung zwischen IgE-abhängiger und IgE-unabhängiger basophiler Aktivierung durch Analyse der hemmenden Wirkung von Wortmannin (WTM)16,174,175, einem potenten und spezifischen Inhibitor der Phosphoinositid-3-Kinase, der an der IgE-vermittelten basophilen Aktivierung beteiligt ist. Der Inhibitionstest wird durchgeführt, indem Blut mit WTM (1 μM) bei 37 °C für 5 min vor der Inkubation mit dem Stimulus inkubiert wird. Um zu bestätigen, dass die BAT-Hemmung mit WTM korrekt ist, muss eine Hemmung der Positivkontrolle Anti-IgE, nicht aber der Positivkontrolle fMLP beobachtet werden.

Leider gibt es keine Standardisierung zwischen verschiedenen Laboratorien in Bezug auf Verfahren, Konzentrationen und Marker. Zukünftige multizentrische Studien sind erforderlich, um die Methode zu standardisieren, um die Ergebnisse zwischen Zentren zu vergleichen und den Test klinisch zu standardisieren und zu validieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Wir danken Claudia Corazza für ihre unschätzbare Unterstützung in englischer Sprache. Diese Arbeit wurde vom Institute of Health ''Carlos III'' (ISCIII) des MINECO unterstützt (Zuschuss kofinanziert durch EFRE: "Una manera de hacer Europa"; Fördernummern PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 und RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Andalusisches Regionalministerium für Gesundheit (Förder-Nr. PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID ist ein klinischer Prüfarzt (B-0001-2017) und AA hat einen Senior Postdoc-Vertrag (RH-0099-2020), beide unterstützt vom andalusischen Regionalgesundheitsministerium (kofinanziert durch ESF: "Andalucía se mueve con Europa").

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile Corning 352008
APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody BioLegend 310708
BD FACSCalibur Flow Cytometer BD Biosciences
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
FITC anti-human CD63 Antibody BioLegend 353006
HEPES (1 M) Thermo-Fisher 15630106
Lysing Solution 10x concentrated BD Biosciences 349202
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
N-Formyl-Met-Leu-Phe Sigma-Aldrich F3506
PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody BioLegend 324606
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Purified Mouse Anti-Human IgE BD Biosciences 555857
Recombinant Human IL-3 R&D Systems 203-IL
Sheath Fluid BD Biosciences 342003
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
TUBE 9 mL LH Lithium Heparin Greiner Bio-One 455084
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379

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