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Medicine

알레르기 진단을 위한 호염기구 활성화 검사

Published: May 31, 2021 doi: 10.3791/62600
Automatic Translation
*1,2, *2, 2,3, 1,2,4,5
1Allergy Unit, Hospital Regional Universitario de Málaga, 2Allergy Research Group, Instituto de Investigación Biomédica de Málaga-IBIMA, 3Universidad de Málaga, Departamento de Biología celular, Genética y Fisiología, Universidad de Málaga, 4Departamento de Medicina, Universidad de Málaga, 5Nanostructures for Diagnosing and Treatment of Allergic Diseases Laboratory, Andalusian Center for Nanomedicine and Biotechnology-BIONAND
* These authors contributed equally

Summary

호염기구 활성화 시험은 유세포 분석에 의한 활성화 마커의 측정을 통해 특정 자극의 존재하에 호염기구 활성화의 검출을 기반으로 IgE 매개 알레르기 반응을 평가하기위한 보완적인 체외 진단 시험입니다.

Abstract

호염기구 활성화 검사(BAT)는 식품, 곤충독, 약물 및 일부 형태의 만성 두드러기에 대한 IgE 매개 알레르기 반응의 평가에서 임상 병력, 피부 검사(ST) 및 특이 IgE(sIgE) 판정 외에 사용할 수 있는 보완적인 체외 진단 검사입니다. 그러나 진단 알고리즘에서이 기술의 역할은 매우 다양하고 잘 결정되지 않습니다.

BAT는 유세포 분석에 의한 활성화 마커 (예 : CD63, CD203c)의 측정을 통해 알레르겐 / 약물 가교 IgE 활성화에 대한 호염구 반응의 측정을 기반으로합니다. 이 검사는 특히 심각한 생명을 위협하는 반응을 경험하는 피험자에서 알레르기 진단을 확인하기 위해 통제된 챌린지 검사를 피하는 데 유용하고 보완적인 도구가 될 수 있습니다. 일반적으로 BAT의 성능은 i) 알레르겐 / 약물이 ST에서 위양성 결과를 생성하는 경우 고려되어야합니다. ii) ST 또는 sIgE 측정에 사용할 알레르겐 / 약물 공급원이 없습니다. iii) 환자 병력과 ST 또는 sIgE 결정 사이에 불일치가 있습니다. iv) 증상은 ST가 전신 반응을 초래할 수 있음을 시사합니다. v) 범인 알레르겐 / 약물을 확인하기 위해 CCT를 고려하기 전에. 테스트의 주요 한계는 특히 약물 알레르기에서 최적이 아닌 민감도, 샘플 추출 후 24시간 이내에 테스트를 수행해야 하는 필요성, 절차, 농도 및 세포 마커 측면에서 실험실 간의 표준화 부족과 관련이 있습니다.

Introduction

IgE 매개 알레르기 진단은 임상 병력, 피부 검사(ST), 혈청 특이적 IgE(sIgE)의 정량화, 그리고 필요한 경우 통제 챌린지 검사(CCT)1,2,3,4,5,6을 기반으로 합니다. 그러나 정확한 정보가 부족할 수 있으므로 임상 병력을 신뢰할 수 없으며 ST 및 CCT는 심각한 생명을 위협하는 반응을 경험하는 피험자에게 금기 일 수있는 위험이없는 절차가 아닙니다 1,2,3,4,5,6 . 검증되고 상용화된 불소 효소 면역 분석법에 의한 sIgE 측정이 소수의 알레르겐 및 약물에만 사용할 수 있다는 사실과 함께 이러한 문제는 호염기구 활성화 검사(BAT)와 같은 다른 시험관 내 기능 분석의 중요한 역할을 강조했습니다.

호염기구는 알레르겐 / 약물 노출 후 세포 표면의 고 친화성 수용체 (FcεRI)에 결합 된 인접한 sIgE의 가교 결합시 활성화되는 IgE 매개 알레르기 반응에 관여하는 핵심 이펙터 세포입니다. 호염기구 활성화는 세포질 내 분비 과립 7,8,9에 포함 된 미리 형성된 새로운 합성 염증 매개체의 세포 탈과립 및 방출을 유발합니다. BAT는 자극 (알레르겐 또는 약물)의 존재하에 호염기구 활성화를 모방하려고 시도하고 유세포 분석 7,10에 의해 호염기구 활성화 마커의 발현 변화를 결정하는 시험관 내 방법입니다. 호염기구 (IgE +, CCR3 +, CRTH2 +, CD203c +)를 확인하고 형광 색소 표지 항체 7,10의 조합을 사용하여 세포 활성화 (주로 CD63 및 CD203c의 상향 조절)를 측정하는 다양한 전략이 있습니다. 임상적으로 검증된 최고의 활성화 마커 11,12,13,14인 CD63은 히스타민을 함유하는 분비 과립에 고정된 막 단백질로, 세포 활성화 및 과립과 막의 융합 후 호염기구 표면 15,16,17,18,19,20,21 에 발현됩니다. . CD203c는 호염기구에서 구성적으로 발현되고 FcεRI 자극 후에 상향조절되는 표면 마커이며, 이는 또한 BAT 15,22,23,24,25에서 신뢰할 수 있는 결과를 보여주었습니다. 게다가, CD6326과 동시 발현하는 것으로 보인다.

지난 수십 년 동안 BAT는 약물, 음식 또는 흡입제와 같은 다양한 유발 요인뿐만 아니라 아래에 설명된 대로 일부 형태의 만성 두드러기에서 유발되는 IgE 매개 알레르기 반응의 진단에 유용한 것으로 나타났습니다. 그러나 진단 알고리즘에서이 기술의 위치는 매우 다양하고 잘 결정되지 않습니다.

약물 과민증
BAT는 선택된 약물 및 환자, 특히 ST의 진단 가치가 대부분의 약물에 대해 잘 확립되지 않았기 때문에 심각한 반응을 경험하는 사람들에게 보완 검사로서 유용한 것으로 나타났습니다 제한된 수의 약물27,28,29,30에 대해 검증되고 표준화되기 때문입니다. 또한 sIgE의 정량화는 ST 27,28,29,30,31,32보다 민감도가 낮은 제한된 수의 약물에 대해서만 가능합니다. 따라서 약물 과민증의 진단은 일반적으로 약물 도발 테스트에 의존하며, 이는 심각한 생명을 위협하는 반응을 경험하는 피험자에게 금기 일 수 있습니다33.

베타락탐(BL)20,34,35,36,37,38,39, 신경근 차단제(NMBA)19,22,40,41,42, 43,44,45, 플루오로 퀴놀론 (FQ) 46,47,48,49, 피라 졸론50,51,52, 방사선 조영제 (RCM) 53,54,55,56 및 백금 화합물 57,58,59 . BAT는 각각 51.7-66.9 %와 89.2-97.8 % 사이의 민감도와 특이도를 갖는 것으로보고되었습니다. 양성 및 음성 예측값은 각각 93.4% 및 66.3% 사이의 범위로 기재되어있다 27,31. 더욱이, BAT는 약물 탈감작 동안 부작용의 위험이 높은 환자에서 CD63에 비해 CD203c 발현이 증가하기 때문에 백금 화합물로 탈감작하는 동안 획기적인 반응에 대한 예측 바이오마커로서 제안되었다57.

BAT는 반응이 호염기구 탈과립을 수반 할 때 약물 과민증에만 유용하다는 점에 유의해야합니다. 따라서, 사이클로옥시게나제 142의 효소적 억제로부터 발생하는 반응에는 유용하지 않다.

음식 알레르기
BAT는 전체 알레르겐 추출물 또는 단일 알레르겐에 대한 혈청 sIgE의 측정이 종종 모호하기 때문에 식품 알레르기에 대한 잠재적 인 진단 도구로 부상했으며, 이는 약물 과민증과 유사하게 비용이 많이 들고 위험이없는 절차60입니다. 여러 연구에서 우유 61,62, 계란 61,63, 밀 64,65,66,67,68, 땅콩 63,69,70,71,72, 헤이 즐 넛 73,74,75,76과 관련된 결과를 보여주었습니다. ,77, 조개78, 복숭아 79,80,81, 사과 21, 셀러리, 당근82,83.

혈청 내 ST 및 sIgE에 비해 식품 알레르기 진단에서 BAT의 주요 부가가치는 더 높은 특이성과 유사한 민감도를 나타낸다는 것입니다. 따라서 BAT는 임상적으로 알레르기가 있는 환자와 높은 특이도(75-100%)와 민감도(77-98%)63,69,84를 모두 갖는 민감하지만 내성이 있는 피험자를 구별하는 데 유용한 도구입니다. 민감도 및 특이도 값은 알레르겐 및 표현형(예: 구강 알레르기 증후군 대 아나필락시스), 연령 및 지리 관련 감작 패턴과 같은 기타 요인에 따라 달라집니다(63,85).

단일 알레르겐 성분을 사용하는 BAT는 잠재적으로 일부 식품 알레르겐61,80에 대한 진단 정확도를 향상시킬 수 있습니다. 종자 저장 단백질 (예 : 땅콩의 Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 및 Ara h 6)을 사용한 연구가 있습니다 86; 지질 전달 단백질 (예를 들어, 복숭아로부터의 Prup3 및 땅콩으로부터의 Ara h9)80,86; 및 Bet v 1 동족체 (예 : 땅콩의 Ara h 8) 87. 다른 잠재적 유용성은 꽃가루-음식 알레르기 증후군 21,87,88, 붉은 고기에 대한 알레르기89, 또는 음식-의존적 운동-유도된 아나필락시스(66)의 경우에 범인 알레르겐의 확인과 관련된다.

흥미롭게도 BAT는 땅콩 및 우유 알레르기 환자의 연구에서 관찰 된 바와 같이 더 심한 반응을 가진 환자가 활성화 된 호염기구의 비율이 더 높기 때문에 알레르기 반응의 중증도 및 역치에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다 84,90,91; 미량의 알레르겐에 반응하는 환자는 더 큰 호염기구 민감도 84,90,92를 보입니다. 이러한 데이터는 BAT가 면밀한 추적 관찰 및보다 강화 된 교육이 필요한 고위험 알레르기 환자를 식별하는 데 유용 할 수 있음을 시사합니다93. 더욱이, BAT는 식품 챌린지 반응(70,91,92,94) 및 반응성 임계값(90,95)을 예측하여 식품이 언제 안전하게 (재)도입될 수 있는지를 결정하는 데 도움을 줄 수 있다고 보고 되었다(84). 그러나 이러한 결과는 일부 연구에서 논란의 여지가 있습니다 63,96 더 많은 연구가 필요합니다.

반면에 BAT는 시간이 지남에 따라 자연적으로 또는 면역 조절 치료하에 식품 알레르기의 해결을 모니터링하는 데 사용되어 왔으며, 지금까지 경구 식품 챌린지에 의해서만 평가되었으며 관련 위험 및 비용은 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106입니다. ,107,108. 또한, 오말리주맙 치료 동안 호염기구 활성화가 감소하지만 치료 중단 후 증가함에 따라 식품 알레르기에서 오말리주맙의 효과를 모니터링하는 데에도 사용되었습니다109.

흡입제 알레르기
BAT는 sIgE 정량화 및 ST에 의해 진단이 일상적으로 확립 될 수 있기 때문에 흡입 알레르기에 거의 도움이되지 않습니다. 그러나 국소 알레르기 성 비염 (검출 할 수없는 수준의 sIgE 및 양성 비강 도발 검사가있는 음성 ST)의 경우 BAT는 사례110의 50 %에서 진단을 허용했습니다. 호염기구 민감도와 비강/기관지 도발 검사에 대한 반응, 천식 중증도와 오말리주맙111,112 치료의 효능 사이의 상관관계가 추가로 보고되었습니다.

BAT는 또한 IgG 항체 113,114,115,116,117을 차단하는 간섭으로 인해 면역 요법 동안 호염기구 감수성이 감소함에 따라 집 먼지 진드기 및 꽃가루에 대한 알레르겐 면역 요법을 모니터링하는 데 사용되었습니다.

Hymenoptera독 알레르기
hymenoptera 독 알레르기의 진단은 일상적으로 ST 및 혈청 sIgE를 기반으로합니다. BAT는 높은 민감도 (85-100 %)와 특이도 (83-100 %)를 보여 주었으며 모호한 결과를 산출하는 경우 또는 독 알레르기의 암시적인 임상 병력이 있지만 검출 할 수없는 sIgE 및 음성 ST118,119가있는 환자에게 유용하다고보고되었습니다. 그러나, BAT는 이들 반응(120,121)에 대한 중증도를 예측하지 못하는 것으로 보인다.

환자의 최대 60 %가 말벌과 봉독 모두에 sIgE를 나타내며 우성 알레르겐의 식별은 적절한 면역 요법 치료에 중요합니다. 이러한 경우, BAT는 우성 알레르겐119122123124의 확인에 유용한 것으로 보고되었다. 꿀벌 및 말벌 독의 주요 알레르겐에 대한 sIgE는 두 독 모두에 대해 이중 양성인 환자에서 BAT의 유용성을 감소시킬 수 있지만, 주로 sIgE 결정에서 음성 결과를 가진 대상체에서 유용한 정보를 제공합니다123.

일부 연구에서는 BAT가 독 면역 요법의 축적 단계에서 부작용에 대한 예측 바이오마커로 유용할 수 있다고 제안하는데, 이는 이 치료 옵션이 호염기구 감수성을 감소시키는 것으로 보고되었기 때문입니다. 그러나 반응성은 감소하지 않으며이 BAT 유틸리티는 오늘날 논란의 여지가있는 13,120,125,126,127,128,129,130입니다.

두드러기 및 혈관 부종
만성 두드러기 환자의 서브세트는 비만 세포 표면 상에 존재하는 FcεRI 또는 IgE-FcεRI 복합체를 표적으로 하는 자가알레르겐에 대한 IgE 자가항체 및 IgG 자가항체로 인해 자가면역 병태생리학을 갖는다(131,132). 임상 실습에서 이러한 유형의 만성 두드러기의 진단은 우발적 인 감염의 위험이있는 양성자가 혈청 ST에 의존했습니다. BAT는 만성 두드러기가 의심되는 환자를 진단하고 모니터링하기위한 체외 검사로 제안되었습니다. 호염기구의 표면에서 CD63 및 CD203c 발현은 모두 만성 두드러기 환자로부터의 혈청 자극 후에 증가되는 것으로 보고되었으며, 활성 자가항체 133,134,135,136,137의 검출을 보여준다. 최근 BAT 양성 환자는 두드러기 활동 점수로 평가되는 가장 활동적인 질병 상태를 경험하는 경우가 많으며 BAT138 음성인 환자에 비해 3차 치료(사이클로스포린 A 또는 오말리주맙)와 함께 더 많은 용량의 항히스타민제가 필요한 것으로 보고되었습니다.

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Protocol

의정서 수행은 헬싱키 선언 원칙에 따라 수행되었으며 지역 윤리위원회 (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, Spain)의 승인을 받았습니다. 모든 피험자는 연구 조사에 대해 구두로 통보 받았으며 해당 정보에 입각 한 동의서에 서명했습니다.

참고: 현재 프로토콜은 저자가 매일 사용하는 BAT 절차에 대해 자세히 설명합니다. 그러나 이것은 표준화 된 방법이 아니며 다른 저자가 발표 한 절차와의 차이점이 있습니다. 주요 프로토콜 변형은 자극 완충액에서 IL-3의 사용, 자극과의 인큐베이션 시간, 호염기구 탈과립을 중지하는 방법 및 유세포 분석 전략과 관련이 있습니다. 더욱이, BAT를 위한 상이한 상업적으로 이용가능한 키트는 제조자에 의해 추천된 특정 프로토콜들을 포함한다.

1. 샘플 준비

  1. 9mL 헤파린화 튜브에서 말초 혈액을 수집하고 실험 프로토콜에 필요할 때까지 로터에서 샘플을 실온(RT)으로 유지합니다.
  2. 음성 대조군(튜브 2개), 양성 대조군(튜브 2개) 및 다양한 농도의 알레르겐/약물(테스트한 각 알레르겐/약물 농도당 튜브 1개)에 대해 5mL 세포분석기 튜브에 라벨을 붙입니다. 튜브가 미끄러지지 않고 완벽하게 맞는 랙에 튜브를 놓습니다.
  3. 2 % (v / v) hepes, 78 mg / L NaCl, 3.7 mg / L KCl, 7.8 mg / L CaCl 2, 3.3 mg / L MgCl2, 1 g / L HSA를 포함하는 이중 증류수에 자극 완충액을 준비하십시오. pH를 7.4로 조정하고 IL-3을 2ng/mL로 추가합니다. 보통 100mL를 준비하고 2.5mL 분취량으로 나누어 -20°C에서 동결시킨다.
  4. PBS-트윈-20 0.05%(v/v)(PBS-T)에서 양성 대조군 준비: 양성 대조군 1, N-포르밀메티오닐-류실-페닐알라닌(fMLP)(4μM), 호염기구의 품질을 확인; 양성 대조군 2, IgE 매개 양성 대조군으로서의 항 -IgE (0.05 mg / mL).
  5. PBS-T에서 알레르겐 / 약물을 원하는 최종 농도의 2x로 준비하십시오.
    참고: 사용되는 최적의 알레르겐/약물 농도는 광범위한 농도를 사용하여, 용량-반응 곡선에 의해, 그리고 동일한 프로토콜 단계139에 따른 세포독성 연구에 의해 미리 결정되어야 한다.

2. 염색 혼합 준비

  1. 형광 색소로 표지된 단클론 항체를 제조업체의 권장 항체 농도 또는 이전 항체 적정에 따라 자극 완충액에 추가합니다. 이 프로토콜에서는 호염기구 식별을 위해 각 항체 (CCR3-APC 및 CD203c-PE)를 1μL를 추가합니다. 호염기구 활성화를 위한 CD63-FITC)자극 완충액 20μL당 140 .
    알림: 염색 혼합물 준비를 빛으로부터 보호하십시오.
  2. 각 튜브에 23μL의 염색 혼합물을 추가합니다.

3. 혈액 자극

  1. 튜브 1과 2(음성 대조군)에 100μL의 PBS-T를, 튜브 3에 100μL의 fMLP를, 튜브 4에 100μL의 항-IgE를, 다음 튜브에 다양한 알레르겐/약물 농도 100μL를 추가합니다. 시약을 예열하기 위해 중간 교반이 있는 항온조에서 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
  2. 용혈을 피하기 위해 각 튜브에 100μL의 혈액을 부드럽게 추가합니다. 튜브를 부드럽게 와동시키고 중간 교반이 있는 자동 온도 조절 욕조에서 37°C에서 25분 동안 배양합니다.
  3. 튜브를 4 ° C에서 최소 5 분 동안 유지하면서 탈과립을 중지하십시오.
    참고: 필요한 경우 프로토콜을 4°C에서 30-45분 동안 일시 중지할 수 있습니다.141,142,143.

4. 적혈구 용해

  1. 적혈구를 용해시키기 위해 각 튜브에 2mL의 1x 용해 완충액을 추가합니다. 각 튜브를 소용돌이하고 RT에서 5 분 동안 배양합니다.
    참고: 이 단계에서 세포는 완충액에 포함된 고정제(포름알데히드)로 인해 고정됩니다.
  2. 4°C에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 따라 내서 랙을 싱크대로 뒤집습니다. 세포는 튜브의 바닥에 남아 있습니다.
  3. 세포를 세척하기 위해 각 튜브에 3mL의 PBS-T를 추가합니다. 각 튜브를 소용돌이.
  4. 4°C에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 따라 내서 랙을 싱크대로 뒤집습니다.
    알림: 유세포 분석기가 획득 될 때까지 빛으로부터 보호되는 샘플을 4 ° C에 보관하십시오.

5. 유세포 분석 획득

  1. 유세포분석기(예: BD FACSCalibur 유세포분석기)로 샘플을 수집합니다. 유세포 분석기를 컴퓨터 소프트웨어에 연결하고 세포 분석기가 준비 될 때까지 기다립니다. 템플릿 및 계측기 설정을 로드합니다(표 1).
  2. 샘플 수집을 시작합니다.
  3. 활성화된 호염기구(139)의 선택을 위해 다음의 세포분석기 전략을 사용한다.
    1. 측면 산란 (SSC)-전방 산란 (FSC) 플롯에서 림프구를 게이트합니다.
    2. 림프구 집단에서 호염기구를 CCR3+CD203c+ 세포로 게이트합니다. 튜브 당 최소 500 개의 호염기구를 획득하십시오.
    3. CCR3 - CD63 플롯을 표시하여 활성화 마커로 CD63을 사용하여 활성화를 분석합니다. 음성 대조군 튜브를 사용하여 CD63 음성 역치를 약 2.5%로 설정합니다.
    4. 모든 샘플을 수집합니다.

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Representative Results

알레르겐 또는 약물로 수행 된 BAT는 IgE 의존성 과민 반응을 조사 할 수 있습니다. 호염기구 반응성은 최상의 결과(34 )를 얻기 위해 적어도 2개의 최적 농도로 측정되어야 하며, 활성화는 세포 표면 상의 CD63의 상향조절에 의해 가시화된다. 더욱이 알레르겐의 경우, 호염기구 반응성을 확인하기 위해, 다중 감소 알레르겐 농도에서 반응성을 측정함으로써 호염기구 민감도를 분석해야 한다(114). 이 측정을 통해 "CD-sens"141로 표현할 수있는 50 % 호염기구 (EC50)의 반응을 유도하는 알레르겐 농도를 결정할 수 있습니다. 투여량 곡선 (AUC) 아래 면적의 측정은 호염기구 반응성 및 호염기구 민감도 모두를 함께 평가하기 위해 최근에 제안되었다58.

BAT 결과를 분석하기 위한 유세포분석 전략은 그림 1 및 그림2 에 나와 있으며 SSC-FSC 플롯의 게이트 림프구(1단계), 림프구 집단의 호염기구를 CCR3+CD203c+ 세포로 게이팅(2단계), 활성화 마커로 CD63을 사용하여 활성화를 분석하기 위한 CCR3 - CD63 플롯을 보여줍니다(3단계). 그림은 약물(그림 1) 및 알레르겐(그림 2)에 대해 얻은 BAT 결과의 대표적인 예를 보여줍니다.

Figure 1
그림 1: 유세포분석에 의한 약물 호염기구 활성화 시험의 대표적인 분석 . (A) 림프구 + 호염기구 집단을 선택하기위한 SSC-FSC 플롯. (B) 림프구 집단에서 호염기구를 CCR3 + CD203c 세포로 게이트하는 CCR3-CD203c 플롯. (c) 음성 대조군, 양성 대조군 및 약물에 대한 활성화 마커로서 CD63을 사용하여 활성화를 분석하는 CCR3-CD63 플롯. 각 패널에 나타난 값은 세포의 백분율을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: 유세포분석에 의한 알레르겐 호염기구 활성화 시험의 대표적인 분석 . (A) 림프구 + 호염기구 집단을 선택하기위한 SSC-FSC 플롯. (B) 림프구 집단에서 호염기구를 CCR3+CD203c+ 세포로 게이트하는 CCR3-CD203c 플롯. (C) 음성 대조군 및 알레르겐 농도 감소에 대한 결과를 보여주는 활성화 마커로서 CD63을 사용하여 활성화를 분석하기 위한 CCR3-CD63 플롯(Ara h 9). 각 패널에 나타난 값은 세포의 백분율을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

광원(레이저) 488nm 코히어런트 사파이어TM 공냉식 아르곤 이온 레이저; 20 밀리와트; 633-nm JDS 단상TM HeNe 공냉식 레이저; 17 밀리와트
광 흥분성 파장 블루 레이저 : 488 nm; 적색 레이저: 633nm
흥분 파장에서의 광원 전력 청색 레이저: 20 mW; 적색 레이저: 17mW
광학 필터 SSC : 488/10; FITC: 530/30, PE:585/42, APC: 660/20
광학 검출기 FSC, SSC, FL1-H FITC, FL2-H PE, FL4-H APC
광학 검출기 타이 공냉식 아르곤 이온 레이저
광학 경로 BD 팔각형 (488 nm 레이저 라인); BD 트라이곤(633nm 레이저 라인)

표 1: 유세포분석기 요구 사항

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Discussion

BAT는 IgE 매개 알레르기 반응의 평가를위한 보완적인 체외 진단 검사로, 약물, 음식 또는 흡입제와 같은 다양한 유발 요인에 의해 유도 된 반응의 진단뿐만 아니라 일부 형태의 만성 두드러기에서 유용한 것으로 나타났습니다. 일반적으로 i) 알레르겐/약물이 ST에서 위양성 결과를 생성하는 경우 BAT 성능을 고려해야 합니다. ii) 알레르겐 / 약물을 ST 또는 sIgE 정량화에 사용할 수 없습니다. iii) 임상 병력과 ST 또는 sIgE 결정 사이의 불일치가 존재합니다. iv) 증상은 ST가 전신 반응을 유도 할 수 있음을 시사합니다. v) 범인 알레르겐 / 약물 확인을위한 CCT 이전10.

실험 프로토콜과 관련하여 테스트에 적합한 혈액 샘플을 얻기 위해 고려해야 할 여러 가지 중요한 측면이 있습니다. 전신 스테로이드 146 및 경구 코르티코 스테로이드를 포함한 면역 억제제 147은 호염기구 반응 146 (항히스타민 제 및 국소 스테로이드는 BAT 결과에 영향을 미치지 않음)의 감소로 인해 검사 전에 피해야합니다 146. 시험은 감염 또는 활동성 만성 염증 상태 동안 수행되어서는 안됩니다148. 반응과 시험 사이의 간격 시간은 시간 42,52,149에 따른 sIgE 수준의 음성화로 인해 1 년을 넘지 않아야합니다. 검사는 신선한 전혈로 수행되며 혈액 추출 후 24 시간 이내에 수행해야합니다150,151. EDTA 또는 산 구연산염 덱 스트로스를 안정제로 사용하면 호염기구가 탈과립되지 않기 때문에 혈액을 헤파린 안정화 튜브에 수집해야하지만 칼슘152를 첨가 한 후에 사용할 수 있습니다. 반면에 시험에 사용 된 자극에는 부형제가 포함되어서는 안됩니다. 이러한 이유로 표준화 된 알레르겐 추출물, 재조합 또는 정제 된 알레르겐, 순수 활성 성분 또는 정맥 주사 가능한 약물 제제가 권장됩니다. 또한 약물의 화학적 특성을 고려해야합니다. 예를 들어, 일부 약물은 용액에서 불안정하여 각 시험 전에 신선하게 준비되어야 하며, 다른 약물은 광불안정하며 광으로부터 분석을 보호하면서 수행되어야 한다(48). 독성 및 비특이적 활성화는 테스트된 각 알레르겐/약물에 대해 평가되어야 하며 확인된 환자와 함께 ROC 곡선을 평가해야 하며 내성 대조군을 분석하여 컷오프를 결정해야 합니다. 마지막으로, BAT 분석에서 두 양성 대조군의 중요성을 강조해야합니다. fMLP는 G-단백질 결합 fMLP 수용체를 통해 호염기구 활성화를 유도하는 박테리아 펩타이드이다. 이러한 이유로, 비-IgE 매개 활성화16의 양성 대조군으로서 종종 사용된다. 항-IgE 또는 대안적으로 항-FcεRI는 IgE-매개 호염기구 활성화의 양성 대조군으로서 사용된다. non-IgE 및 IgE 매개 양성 대조군 모두가있는 상태에서 호염기구 활성화가 없으면 호염기구의 품질이 충분하지 않거나 실험 프로토콜에서 실수가 없음을 시사합니다. 대조적으로, fMLP로 활성화되었지만 항 -IgE 또는 항 -FcεRI로 활성화되지 않은 호염기구는 비 반응 호염기구로 지정되며, 일반 인구의 6-17 %가 BAT 63,84,153에서 FcεRI를 통한 자극에 반응하지 않는 것으로 추정됩니다. 무반응은 낮은 수준의 Syk 포스파타제 154,155,156과 CD45 157의 증가 된 수준과 관련이있을 수 있습니다. 연구에 따르면 시험관 내 분석에서 IL-3158의 존재하에 비 반응 호염기구가 반응자로 변할 수 있지만 비 반응 호염기구는 여전히 BAT에서 검출 될 수 있으며 이러한 경우 결과는 평가를 위해 고려 될 수 없습니다.

호염기구 프라이밍 사이토카인인 IL-3의 포함과 관련하여 일반적인 합의는 존재하지 않습니다. IL-3의 사용은 짧은 전처리후 자체적으로 CD63 상향조절을 유도하지 않으면서 CD63-기반 BAT에서 호염기구 반응성을 향상시키는 것으로 보고되었다 7,159,160. 그러나 또 다른 연구에서는 IL-3가 기준선161에서 CD63 발현을 상향 조절한다고 제안합니다. 대조적으로, CD203c 기반 BAT의 경우, 연구에 따르면 IL-3 프라이밍은 호염기구를 휴지시킴으로써 CD203c 발현을 향상시켜 자극되지 않은 호염기구와 자극된 호염기구 사이의 차이를 감소시키고 BAT 민감도를 감소시킨다는 것을 확인했습니다159,161.

다양한 게이팅 전략을 사용하여 호염기구 집단을 식별하고 유동 세포측정법에 의한 호염기구 활성화를 분석할 수 있습니다. 호염기구는 상이한 선택 마커 옵션 162,163,164를 통해 확인될 수 있는 저측 산란 세포이며, BAT165,166의 진단 효율에 영향을 미칠 수 있는 핵심 포인트이다. 세포 마커 선택은 호염기구를 다른 세포 집단과 구별하는 특이성과 휴지기 및 활성화된 세포에 대한 세포 마커 발현을 기반으로 해야 합니다. 가장 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 호염기구 선택 마커는 CD193 (CCR3) (비만 세포, Th2 림프구162 및 호산구에서도 발현됨), CD123 (HLA-DR+ 형질세포양 수지상 세포에서도 발현됨), CD203c (호염기구에서만 발현되고 호염기구 활성화 후 상향조절됨) 및 FcεRI (비만 세포의 만능 전구세포에서도 발현됨)139입니다. 이러한 세포 마커를 기반으로 하고 SSC와 조합하여, 보다 일반적인 선택 전략은 SSC 낮은 CCR3+, SSC 낮은 CCR3+CD203c+(이 프로토콜에 적용됨), SSC 낮은 CD123+HLA-DR−, SSC 낮은 CD203c+CD123+HLA-DR−, SSC낮은FcεRI+HLA-DR−(항원 제시 세포 및 단핵구 제외 146,161 ,162,163), SSC 낮은 CD203c+CRTH2+CD3-(T 세포 제외)164, SSC 낮은 CD203c+ 또는 SSC 낮은 CCR3+CD123+10,162,166, SSC낮은CD123+(CD3-CD14-CD19-CD20-)167,168 및 SSC 낮은 IgE+169,170, 후자는 IgE 수치가낮은환자의 제한으로 인해 권장되지 않습니다. 호염기구 집단의 정확한 선택 후, 활성화는 일반적으로 호염기구 표면상의 발현이 호염기구 탈과립 및 히스타민 방출 16,172,173과 직접 관련이있는 분비 과립 16,171의 막에 위치한 CD63의 검출을 통해 검출된다. 또 다른 옵션은 CD203c의 분석이지만, IL-3159,161에 의한 상향 조절로 인해 민감도가 낮지 만 휴식 호염기구에서 구성 적으로 발현되고 활성화 된 호염기구에서 상향 조절됩니다.

호염기구 활성화는 각 분석에 대한 임계값으로서 설정된 음성 대조군과 비교하여 CD63 양성 세포(CD63-기반 BAT)의 백분율 또는 CD203c 평균 형광 강도(MFI)(CD203c-기반 BAT)의 변이를 측정함으로써 검출된다. 음성 대조군에서 2.5% CD63 양성 세포(자극되지 않은 세포)의 역치는 통제된 챌린지 테스트와 비교하여 가장 정확한 BAT 결과를 결정하기 위해 권장됩니다. 양성에 대한 고려는 테스트 된 자극에 따라 다릅니다. 호염기구 활성화는 자극의 존재 하에 CD63 양성 호염기구의 백분율을 음성 대조군에서 CD63 양성 호염기구의 백분율로 나눈 값이 확인된 알레르기 환자 및 건강한 기증자로부터 얻은 데이터의 ROC 곡선 분석에 의해 계산된 컷오프보다 높으면 자극에 대해 양성으로 간주됩니다.

BAT 성능은 IgE 매개 호염기구 활성화에 관여하는 포스포이노시타이드 3-키나아제의 강력하고 특이적인 억제제인 워트만닌(WTM)16,174,175의 억제 효과를 분석하여 IgE 의존성 및 IgE 비의존성 호염기구 활성화를 구별할 수 있습니다. 억제 분석은 자극과 함께 인큐베이션하기 전에 5분 동안 37°C에서 WTM(1μM)으로 혈액을 인큐베이션함으로써 수행된다. WTM을 사용한 BAT 억제가 올바른지 확인하려면 양성 대조군 항 -IgE의 억제를 관찰해야하지만 양성 대조군 fMLP의 억제는 관찰하지 않아야합니다.

불행히도 절차, 농도 및 마커 측면에서 서로 다른 실험실 간의 표준화는 없습니다. 향후 다기관 연구는 센터 간 결과를 비교하고 테스트를 임상적으로 표준화 및 검증하는 방법을 표준화하는 데 필요합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

클라우디아 코라자의 귀중한 영어 지원에 감사드립니다. 이 작업은 MIECO의 보건 연구소 '카를로스 III'(ISCIII) (ERDF가 공동 자금을 지원하는 보조금: "Una manera de hacer Europa"; 보조금 번호 PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 및 레틱 아라디알 RD16/0006/0001; 안달루시아 지역 보건부(보조금 번호 PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID는 임상 조사자(B-0001-2017)이고 AA는 수석 박사후 계약(RH-0099-2020)을 보유하고 있으며, 둘 다 안달루시아 지역 보건부(ESF 공동 자금 지원: "Andalucía se mueve con Europa")의 지원을 받습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile Corning 352008
APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody BioLegend 310708
BD FACSCalibur Flow Cytometer BD Biosciences
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
FITC anti-human CD63 Antibody BioLegend 353006
HEPES (1 M) Thermo-Fisher 15630106
Lysing Solution 10x concentrated BD Biosciences 349202
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
N-Formyl-Met-Leu-Phe Sigma-Aldrich F3506
PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody BioLegend 324606
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Purified Mouse Anti-Human IgE BD Biosciences 555857
Recombinant Human IL-3 R&D Systems 203-IL
Sheath Fluid BD Biosciences 342003
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
TUBE 9 mL LH Lithium Heparin Greiner Bio-One 455084
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379

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References

  1. Mayorga, C., et al. In vitro tests for drug hypersensitivity reactions: an ENDA/EAACI Drug Allergy Interest Group position paper. Allergy. 71 (8), 1103-1134 (2016).
  2. Romano, A., et al. Towards a more precise diagnosis of hypersensitivity to beta-lactams - an EAACI position paper. Allergy. 75 (6), 1300-1315 (2020).
  3. Garvey, L. H., et al. An EAACI position paper on the investigation of perioperative immediate hypersensitivity reactions. Allergy. 74 (10), 1872-1884 (2019).
  4. Gomes, E. R., et al. Drug hypersensitivity in children: report from the pediatric task force of the EAACI Drug Allergy Interest Group. Allergy. 71 (2), 149-161 (2016).
  5. Ansotegui, I. J., et al. IgE allergy diagnostics and other relevant tests in allergy, a World Allergy Organization position paper. World Allergy Organization Journal. 13 (2), 100080 (2020).
  6. Jeebhay, M. F., et al. Food processing and occupational respiratory allergy- An EAACI position paper. Allergy. 74 (10), 1852-1871 (2019).
  7. Ebo, D. G., et al. Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives. Allergy. 61 (9), 1028-1039 (2006).
  8. Bochner, B. S. Systemic activation of basophils and eosinophils: markers and consequences. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 106 (5), Suppl 292-302 (2000).
  9. Ghannadan, M., et al. Detection of novel CD antigens on the surface of human mast cells and basophils. International Archives of Allergy and Immunology. 127 (4), 299-307 (2002).
  10. Hoffmann, H. J., et al. The clinical utility of basophil activation testing in diagnosis and monitoring of allergic disease. Allergy. 70 (11), 1393-1405 (2015).
  11. Sainte-Laudy, J., Sabbah, A., Drouet, M., Lauret, M. G., Loiry, M. Diagnosis of venom allergy by flow cytometry. Correlation with clinical history, skin tests, specific IgE, histamine and leukotriene C4 release. Clinical & Experimental Allergy. 30 (8), 1166-1171 (2000).
  12. Sturm, G. J., et al. The CD63 basophil activation test in Hymenoptera venom allergy: a prospective study. Allergy. 59 (10), 1110-1117 (2004).
  13. Erdmann, S. M., et al. The basophil activation test in wasp venom allergy: sensitivity, specificity and monitoring specific immunotherapy. Allergy. 59 (10), 1102-1109 (2004).
  14. De Weck, A. L., et al. Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. International Archives of Allergy and Immunology. 146 (3), 177-189 (2008).
  15. Buhring, H. J., Streble, A., Valent, P. The basophil-specific ectoenzyme E-NPP3 (CD203c) as a marker for cell activation and allergy diagnosis. International Archives of Allergy and Immunology. 133 (4), 317-329 (2004).
  16. Knol, E. F., Mul, F. P., Jansen, H., Calafat, J., Roos, D. Monitoring human basophil activation via CD63 monoclonal antibody 435. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 88 (3), Pt 1 328-338 (1991).
  17. Fureder, W., Agis, H., Sperr, W. R., Lechner, K., Valent, P. The surface membrane antigen phenotype of human blood basophils. Allergy. 49 (10), 861-865 (1994).
  18. Sanz, M. L., et al. Allergen-induced basophil activation: CD63 cell expression detected by flow cytometry in patients allergic to Dermatophagoides pteronyssinus and Lolium perenne. Clinical & Experimental Allergy. 31 (7), 1007-1013 (2001).
  19. Monneret, G., et al. Monitoring of basophil activation using CD63 and CCR3 in allergy to muscle relaxant drugs. Clin Immunol. 102 (2), 192-199 (2002).
  20. Sanz, M. L., et al. Flow cytometric basophil activation test by detection of CD63 expression in patients with immediate-type reactions to betalactam antibiotics. Clinical & Experimental Allergy. 32 (2), 277-286 (2002).
  21. Ebo, D. G., et al. Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 64 (1), 28-33 (2005).
  22. Sudheer, P. S., Hall, J. E., Read, G. F., Rowbottom, A. W., Williams, P. E. Flow cytometric investigation of peri-anaesthetic anaphylaxis using CD63 and CD203c. Anaesthesia. 60 (3), 251-256 (2005).
  23. Binder, M., Fierlbeck, G., King, T., Valent, P., Buhring, H. J. Individual hymenoptera venom compounds induce upregulation of the basophil activation marker ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3 (CD203c) in sensitized patients. International Archives of Allergy and Immunology. 129 (2), 160-168 (2002).
  24. Hauswirth, A. W., et al. Recombinant allergens promote expression of CD203c on basophils in sensitized individuals. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 110 (1), 102-109 (2002).
  25. Boumiza, R., et al. Marked improvement of the basophil activation test by detecting CD203c instead of CD63. Clinical & Experimental Allergy. 33 (2), 259-265 (2003).
  26. Macglashan, D. Expression of CD203c and CD63 in human basophils: relationship to differential regulation of piecemeal and anaphylactic degranulation processes. Clinical & Experimental Allergy. 40 (9), 1365-1377 (2010).
  27. Mayorga, C., Dona, I., Perez-Inestrosa, E., Fernandez, T. D., Torres, M. J. The Value of In Vitro Tests to DiminishDrug Challenges. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
  28. Brockow, K., et al. General considerations for skin test procedures in the diagnosis of drug hypersensitivity. Allergy. 57 (1), 45-51 (2002).
  29. Brockow, K., et al. Skin test concentrations for systemically administered drugs -- an ENDA/EAACI Drug Allergy Interest Group position paper. Allergy. 68 (6), 702-712 (2013).
  30. Torres, M. J., et al. Approach to the diagnosis of drug hypersensitivity reactions: similarities and differences between Europe and North America. Clinical and Translational Allergy. 7, 7 (2017).
  31. Mayorga, C., et al. In vitro tests for drug hypersensitivity reactions: an ENDA/EAACI Drug Allergy Interest Group position paper. Allergy. 71 (8), 1103-1134 (2016).
  32. Mayorga, C., et al. Controversies in drug allergy: In vitro testing. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (1), 56-65 (2019).
  33. Aberer, W., et al. Drug provocation testing in the diagnosis of drug hypersensitivity reactions: general considerations. Allergy. 58 (9), 854-863 (2003).
  34. De Week, A. L., et al. Diagnosis of immediate-type beta-lactam allergy in vitro by flow-cytometric basophil activation test and sulfidoleukotriene production: a multicenter study. Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology. 19 (2), 91-109 (2009).
  35. Abuaf, N., et al. Comparison of two basophil activation markers CD63 and CD203c in the diagnosis of amoxicillin allergy. Clinical & Experimental Allergy. 38 (6), 921-928 (2008).
  36. Torres, M. J., et al. The diagnostic interpretation of basophil activation test in immediate allergic reactions to betalactams. Clinical & Experimental Allergy. 34 (11), 1768-1775 (2004).
  37. Torres, M. J., et al. Clavulanic acid can be the component in amoxicillin-clavulanic acid responsible for immediate hypersensitivity reactions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 502-505 (2010).
  38. Eberlein, B., et al. A new basophil activation test using CD63 and CCR3 in allergy to antibiotics. Clinical & Experimental Allergy. 40 (3), 411-418 (2010).
  39. Sanchez-Morillas, L., et al. Selective allergic reactions to clavulanic acid: a report of 9 cases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 126 (1), 177-179 (2010).
  40. Leysen, J., et al. Allergy to rocuronium: from clinical suspicion to correct diagnosis. Allergy. 66 (8), 1014-1019 (2011).
  41. Ebo, D. G., et al. Flow-assisted diagnostic management of anaphylaxis from rocuronium bromide. Allergy. 61 (8), 935-939 (2006).
  42. Kvedariene, V., et al. Diagnosis of neuromuscular blocking agent hypersensitivity reactions using cytofluorimetric analysis of basophils. Allergy. 61 (3), 311-315 (2006).
  43. Hagau, N., Gherman-Ionica, N., Sfichi, M., Petrisor, C. Threshold for basophil activation test positivity in neuromuscular blocking agents hypersensitivity reactions. Allergy Asthma Clin Immunol. 9 (1), 42 (2013).
  44. Uyttebroek, A. P., et al. Flowcytometric diagnosis of atracurium-induced anaphylaxis. Allergy. 69 (10), 1324-1332 (2014).
  45. Abuaf, N., et al. Validation of a flow cytometric assay detecting in vitro basophil activation for the diagnosis of muscle relaxant allergy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), Pt 1 411-418 (1999).
  46. Aranda, A., et al. In vitro evaluation of IgE-mediated hypersensitivity reactions to quinolones. Allergy. 66 (2), 247-254 (2011).
  47. Fernandez, T. D., et al. Hypersensitivity to fluoroquinolones: The expression of basophil activation markers depends on the clinical entity and the culprit fluoroquinolone. Medicine (Baltimore). 95 (23), 3679 (2016).
  48. Mayorga, C., et al. Fluoroquinolone photodegradation influences specific basophil activation. International Archives of Allergy and Immunology. 160 (4), 377-382 (2013).
  49. Rouzaire, P., et al. Negativity of the basophil activation test in quinolone hypersensitivity: a breakthrough for provocation test decision-making. International Archives of Allergy and Immunology. 157 (3), 299-302 (2012).
  50. Hagau, N., Longrois, D., Petrisor, C. Threshold for positivity and optimal dipyrone concentration in flow cytometry-assisted basophil activation test. Allergy, Asthma & Immunology Research. 5 (6), 383-388 (2013).
  51. Gamboa, P. M., et al. Use of CD63 expression as a marker of in vitro basophil activation and leukotriene determination in metamizol allergic patients. Allergy. 58 (4), 312-317 (2003).
  52. Gomez, E., et al. Immunoglobulin E-mediated immediate allergic reactions to dipyrone: value of basophil activation test in the identification of patients. Clinical & Experimental Allergy. 39 (8), 1217-1224 (2009).
  53. Pinnobphun, P., Buranapraditkun, S., Kampitak, T., Hirankarn, N., Klaewsongkram, J. The diagnostic value of basophil activation test in patients with an immediate hypersensitivity reaction to radiocontrast media. Annals of Allergy, Asthma & Immunology. 106 (5), 387-393 (2011).
  54. Salas, M., et al. Diagnosis of immediate hypersensitivity reactions to radiocontrast media. Allergy. 68 (9), 1203-1206 (2013).
  55. Chirumbolo, S. Basophil activation test (BAT) in the diagnosis of immediate hypersensitivity reactions to radiocontrast media. Allergy. 68 (12), 1627-1628 (2013).
  56. Dona, I., et al. Hypersensitivity Reactions to Multiple Iodinated Contrast Media. Frontiers in Pharmacology. 11, 575437 (2020).
  57. Giavina-Bianchi, P., Galvao, V. R., Picard, M., Caiado, J., Castells, M. C. Basophil Activation Test is a Relevant Biomarker of the Outcome of Rapid Desensitization in Platinum Compounds-Allergy. Journal of Allergy and Clinical Immunology Practice. 5 (3), 728-736 (2017).
  58. Iwamoto, T., et al. Evaluation of basophil CD203c as a predictor of carboplatin-related hypersensitivity reaction in patients with gynecologic cancer. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 35 (9), 1487-1495 (2012).
  59. Iwamoto, T., et al. Carboplatin-induced severe hypersensitivity reaction: role of IgE-dependent basophil activation and FcepsilonRI. Cancer Science. 105 (11), 1472-1479 (2014).
  60. Muraro, A., et al. EAACI food allergy and anaphylaxis guidelines: diagnosis and management of food allergy. Allergy. 69 (8), 1008-1025 (2014).
  61. Sato, S., et al. Basophil activation marker CD203c is useful in the diagnosis of hen's egg and cow's milk allergies in children. International Archives of Allergy and Immunology. 152, Suppl 1 54-61 (2010).
  62. Ciepiela, O., et al. Basophil activation test based on the expression of CD203c in the diagnostics of cow milk allergy in children. European Journal of Medical Research. 15, Suppl 2 21-26 (2010).
  63. Ocmant, A., et al. Basophil activation tests for the diagnosis of food allergy in children. Clinical & Experimental Allergy. 39 (8), 1234-1245 (2009).
  64. Carroccio, A., et al. A comparison between two different in vitro basophil activation tests for gluten- and cow's milk protein sensitivity in irritable bowel syndrome (IBS)-like patients. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (6), 1257-1263 (2013).
  65. Tokuda, R., et al. Antigen-induced expression of CD203c on basophils predicts IgE-mediated wheat allergy. Allergology International. 58 (2), 193-199 (2009).
  66. Chinuki, Y., et al. CD203c expression-based basophil activation test for diagnosis of wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (5), 1404-1406 (2012).
  67. Carroccio, A., et al. Non-celiac wheat sensitivity diagnosed by double-blind placebo-controlled challenge: exploring a new clinical entity. Am J Gastroenterol. 107 (12), 1898-1906 (2012).
  68. Carroccio, A., et al. A cytologic assay for diagnosis of food hypersensitivity in patients with irritable bowel syndrome. Clin Gastroenterol Hepatol. 8 (3), 254-260 (2010).
  69. Santos, A. F., et al. Basophil activation test discriminates between allergy and tolerance in peanut-sensitized children. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 645-652 (2014).
  70. Glaumann, S., et al. Basophil allergen threshold sensitivity, CD-sens, IgE-sensitization and DBPCFC in peanut-sensitized children. Allergy. 67 (2), 242-247 (2012).
  71. Javaloyes, G., et al. Performance of different in vitro techniques in the molecular diagnosis of peanut allergy. Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology. 22 (7), 508-513 (2012).
  72. Glaumann, S., Nopp, A., Johansson, S. G., Borres, M. P., Nilsson, C. Oral peanut challenge identifies an allergy but the peanut allergen threshold sensitivity is not reproducible. PLoS One. 8 (1), 53465 (2013).
  73. Elizur, A., et al. NUT Co Reactivity - ACquiring Knowledge for Elimination Recommendations (NUT CRACKER) study. Allergy. 73 (3), 593-601 (2018).
  74. Cucu, T., De Meulenaer, B., Bridts, C., Devreese, B., Ebo, D. Impact of thermal processing and the Maillard reaction on the basophil activation of hazelnut allergic patients. Food Chem Toxicol. 50 (5), 1722-1728 (2012).
  75. Worm, M., et al. Impact of native, heat-processed and encapsulated hazelnuts on the allergic response in hazelnut-allergic patients. Clinical & Experimental Allergy. 39 (1), 159-166 (2009).
  76. Brandstrom, J., et al. Basophil allergen threshold sensitivity and component-resolved diagnostics improve hazelnut allergy diagnosis. Clinical & Experimental Allergy. 45 (9), 1412-1418 (2015).
  77. Lotzsch, B., Dolle, S., Vieths, S., Worm, M. Exploratory analysis of CD63 and CD203c expression in basophils from hazelnut sensitized and allergic individuals. Clinical and Translational Allergy. 6, 45 (2016).
  78. Ebo, D. G., Bridts, C. H., Hagendorens, M. M., De Clerck, L. S., Stevens, W. J. Scampi allergy: from fancy name-giving to correct diagnosis. Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology. 18 (3), 228-230 (2008).
  79. Gamboa, P. M., et al. Component-resolved in vitro diagnosis in peach-allergic patients. Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology. 19 (1), 13-20 (2009).
  80. Gamboa, P. M., et al. Two different profiles of peach allergy in the north of Spain. Allergy. 62 (4), 408-414 (2007).
  81. Diaz-Perales, A., et al. Recombinant Pru p 3 and natural Pru p 3, a major peach allergen, show equivalent immunologic reactivity: a new tool for the diagnosis of fruit allergy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 111 (3), 628-633 (2003).
  82. Erdmann, S. M., Heussen, N., Moll-Slodowy, S., Merk, H. F., Sachs, B. CD63 expression on basophils as a tool for the diagnosis of pollen-associated food allergy: sensitivity and specificity. Clinical & Experimental Allergy. 33 (5), 607-614 (2003).
  83. Erdmann, S. M., et al. In vitro analysis of birch-pollen-associated food allergy by use of recombinant allergens in the basophil activation test. International Archives of Allergy and Immunology. 136 (3), 230-238 (2005).
  84. Rubio, A., et al. Benefit of the basophil activation test in deciding when to reintroduce cow's milk in allergic children. Allergy. 66 (1), 92-100 (2011).
  85. Decuyper, I. i, et al. Performance of basophil activation test and specific IgG4 as diagnostic tools in nonspecific lipid transfer protein allergy: Antwerp-Barcelona comparison. Allergy. 75 (3), 616-624 (2020).
  86. Mayorga, C., et al. Basophil response to peanut allergens in Mediterranean peanut-allergic patients. Allergy. 69 (7), 964-968 (2014).
  87. Glaumann, S., et al. Evaluation of basophil allergen threshold sensitivity (CD-sens) to peanut and Ara h 8 in children IgE-sensitized to Ara h 8. Clinical and Molecular Allergy. 13 (1), 5 (2015).
  88. Wolbing, F., et al. The clinical relevance of birch pollen profilin cross-reactivity in sensitized patients. Allergy. 72 (4), 562-569 (2017).
  89. Commins, S. P., et al. Delayed clinical and ex vivo response to mammalian meat in patients with IgE to galactose-alpha-1,3-galactose. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (1), 108-115 (2014).
  90. Santos, A. F., et al. Distinct parameters of the basophil activation test reflect the severity and threshold of allergic reactions to peanut. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (1), 179-186 (2015).
  91. Song, Y., et al. Correlations between basophil activation, allergen-specific IgE with outcome and severity of oral food challenges. Annals of Allergy, Asthma & Immunology. 114 (4), 319-326 (2015).
  92. Chinthrajah, R. S., et al. Development of a tool predicting severity of allergic reaction during peanut challenge. Annals of Allergy, Asthma & Immunology. 121 (1), 69-76 (2018).
  93. Santos, A. F., Shreffler, W. G. Road map for the clinical application of the basophil activation test in food allergy. Clinical & Experimental Allergy. 47 (9), 1115-1124 (2017).
  94. Santos, A. F., et al. Biomarkers of severity and threshold of allergic reactions during oral peanut challenges. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 146 (2), 344-355 (2020).
  95. Reier-Nilsen, T., et al. Predicting reactivity threshold in children with anaphylaxis to peanut. Clinical & Experimental Allergy. 48 (4), 415-423 (2018).
  96. Chapuis, A., et al. h 2 basophil activation test does not predict clinical reactivity to peanut. Journal of Allergy and Clinical Immunology Practice. 6 (5), 1772-1774 (2018).
  97. Patil, S. U., et al. Early decrease in basophil sensitivity to Ara h 2 precedes sustained unresponsiveness after peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 144 (5), 1310-1319 (2019).
  98. Chinthrajah, R. S., et al. Sustained outcomes in oral immunotherapy for peanut allergy (POISED study): a large, randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 study. Lancet. 394 (10207), 1437-1449 (2019).
  99. Kim, E. H., et al. Long-term sublingual immunotherapy for peanut allergy in children: Clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 144 (5), 1320-1326 (2019).
  100. Tsai, M., Mukai, K., Chinthrajah, R. S., Nadeau, K. C., Galli, S. J. Sustained successful peanut oral immunotherapy associated with low basophil activation and peanut-specific IgE. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (3), 885-896 (2020).
  101. Nachshon, L., et al. Efficacy and Safety of Sesame Oral Immunotherapy-A Real-World, Single-Center Study. Journal of Allergy and Clinical Immunology Practice. 7 (8), 2775-2781 (2019).
  102. Goldberg, M. R., et al. Efficacy of baked milk oral immunotherapy in baked milk-reactive allergic patients. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 136 (6), 1601-1606 (2015).
  103. Keet, C. A., et al. The safety and efficacy of sublingual and oral immunotherapy for milk allergy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (2), 448-455 (2012).
  104. Matsui, T., et al. Changes in passively-sensitized basophil activation to alphaS1-casein after oral immunotherapy. Immunity, Inflammation and Disease. 8 (2), 188-197 (2020).
  105. Giavi, S., et al. Oral immunotherapy with low allergenic hydrolysed egg in egg allergic children. Allergy. 71 (11), 1575-1584 (2016).
  106. Jones, S. M., et al. Clinical efficacy and immune regulation with peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 124 (2), 292-300 (2009).
  107. Burks, A. W., et al. Oral immunotherapy for treatment of egg allergy in children. New England Journal of Medicine. 367 (3), 233-243 (2012).
  108. Elizur, A., et al. Clinical and laboratory 2-year outcome of oral immunotherapy in patients with cow's milk allergy. Allergy. 71 (2), 275-278 (2016).
  109. Gernez, Y., et al. Basophil CD203c levels are increased at baseline and can be used to monitor omalizumab treatment in subjects with nut allergy. International Archives of Allergy and Immunology. 154 (4), 318-327 (2011).
  110. Gomez, E., et al. Role of the basophil activation test in the diagnosis of local allergic rhinitis. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (4), 975-976 (2013).
  111. Nopp, A., et al. Basophil allergen threshold sensitivity: a useful approach to anti-IgE treatment efficacy evaluation. Allergy. 61 (3), 298-302 (2006).
  112. Dahlen, B., et al. Basophil allergen threshold sensitivity, CD-sens, is a measure of allergen sensitivity in asthma. Clinical & Experimental Allergy. 41 (8), 1091-1097 (2011).
  113. Lalek, N., Kosnik, M., Silar, M., Korosec, P. Immunoglobulin G-dependent changes in basophil allergen threshold sensitivity during birch pollen immunotherapy. Clinical & Experimental Allergy. 40 (8), 1186-1193 (2010).
  114. Schmid, J. M., Wurtzen, P. A., Dahl, R., Hoffmann, H. J. Early improvement in basophil sensitivity predicts symptom relief with grass pollen immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 741-744 (2014).
  115. Sharif, H., et al. Immunologic mechanisms of a short-course of Lolium perenne peptide immunotherapy: A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 144 (3), 738-749 (2019).
  116. Kim, S. H., et al. Changes in basophil activation during immunotherapy with house dust mite and mugwort in patients with allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 8 (1), 6 (2018).
  117. Feng, M., et al. Allergen Immunotherapy-Induced Immunoglobulin G4 Reduces Basophil Activation in House Dust Mite-Allergic Asthma Patients. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 30 (2020).
  118. Korosec, P., et al. Clinical routine utility of basophil activation testing for diagnosis of hymenoptera-allergic patients with emphasis on individuals with negative venom-specific IgE antibodies. International Archives of Allergy and Immunology. 161 (4), 363-368 (2013).
  119. Ebo, D. G., Hagendorens, M. M., Bridts, C. H., De Clerck, L. S., Stevens, W. J. Hymenoptera venom allergy: taking the sting out of difficult cases. Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology. 17 (6), 357-360 (2007).
  120. Ebo, D. G., et al. Flow-assisted quantification of in vitro activated basophils in the diagnosis of wasp venom allergy and follow-up of wasp venom immunotherapy. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 72 (3), 196-203 (2007).
  121. Ott, H., Tenbrock, K., Baron, J., Merk, H., Lehmann, S. Basophil activation test for the diagnosis of hymenoptera venom allergy in childhood: a pilot study. Klin Padiatr. 223 (1), 27-32 (2011).
  122. Eberlein-Konig, B., Rakoski, J., Behrendt, H., Ring, J. Use of CD63 expression as marker of in vitro basophil activation in identifying the culprit in insect venom allergy. Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology. 14 (1), 10-16 (2004).
  123. Eberlein, B., Krischan, L., Darsow, U., Ollert, M., Ring, J. Double positivity to bee and wasp venom: improved diagnostic procedure by recombinant allergen-based IgE testing and basophil activation test including data about cross-reactive carbohydrate determinants. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (1), 155-161 (2012).
  124. Sturm, G. J., et al. Inconsistent results of diagnostic tools hamper the differentiation between bee and vespid venom allergy. PLoS One. 6 (6), 20842 (2011).
  125. Zitnik, S. E., et al. Monitoring honeybee venom immunotherapy in children with the basophil activation test. Pediatric Allergy and Immunology. 23 (2), 166-172 (2012).
  126. Kosnik, M., Silar, M., Bajrovic, N., Music, E., Korosec, P. High sensitivity of basophils predicts side-effects in venom immunotherapy. Allergy. 60 (11), 1401-1406 (2005).
  127. Celesnik, N., et al. Short-term venom immunotherapy induces desensitization of FcepsilonRI-mediated basophil response. Allergy. 67 (12), 1594-1600 (2012).
  128. Nullens, S., et al. Basophilic histamine content and release during venom immunotherapy: insights by flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (3), 173-178 (2013).
  129. Bidad, K., Nawijn, M. C., Van Oosterhout, A. J., Van Der Heide, S., Elberink, J. N. Basophil activation test in the diagnosis and monitoring of mastocytosis patients with wasp venom allergy on immunotherapy. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 86 (3), 183-190 (2014).
  130. Eberlein-Konig, B., Schmidt-Leidescher, C., Behrendt, H., Ring, J. Predicting side-effects in venom immunotherapy by basophil activation. Allergy. 61 (7), 897 (2006).
  131. Kikuchi, Y., Kaplan, A. P. Mechanisms of autoimmune activation of basophils in chronic urticaria. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 107 (6), 1056-1062 (2001).
  132. Huston, D. P., Sabato, V. Decoding the Enigma of Urticaria and Angioedema. Journal of Allergy and Clinical Immunology Practice. 6 (4), 1171-1175 (2018).
  133. Netchiporouk, E., et al. Positive CD63 Basophil Activation Tests Are Common in Children with Chronic Spontaneous Urticaria and Linked to High Disease Activity. International Archives of Allergy and Immunology. 171 (2), 81-88 (2016).
  134. Irinyi, B., et al. Extended diagnostic value of autologous serum skin test and basophil CD63 expression assay in chronic urticaria. British Journal of Dermatology. 168 (3), 656-658 (2013).
  135. Chen, Q., et al. Basophil CD63 expression in chronic spontaneous urticaria: correlation with allergic sensitization, serum autoreactivity and basophil reactivity. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 31 (3), 463-468 (2017).
  136. Wedi, B., Novacovic, V., Koerner, M., Kapp, A. Chronic urticaria serum induces histamine release, leukotriene production, and basophil CD63 surface expression--inhibitory effects ofanti-inflammatory drugs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 105 (3), 552-560 (2000).
  137. Yasnowsky, K. M., et al. Chronic urticaria sera increase basophil CD203c expression. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1430-1434 (2006).
  138. Curto-Barredo, L., et al. Basophil Activation Test identifies the patients with Chronic Spontaneous Urticaria suffering the most active disease. Immunity, Inflammation and Disease. 4 (4), 441-445 (2016).
  139. Santos, A. F., Alpan, O., Hoffmann, H. J. Basophil activation test: Mechanisms and considerations for use in clinical trials and clinical practice. Allergy. , (2021).
  140. Boumiza, R., Debard, A. L., Monneret, G. The basophil activation test by flow cytometry: recent developments in clinical studies, standardization and emerging perspectives. Clinical and Molecular Allergy. 3, 9 (2005).
  141. Aljadi, Z., et al. Activation of basophils is a new and sensitive marker of biocompatibility in hemodialysis. Artif Organs. 38 (11), 945-953 (2014).
  142. Rasmussen, P., Spillner, E., Hoffmann, H. J. Inhibiting phosphatase SHIP-1 enhances suboptimal IgE-mediated activation of human blood basophils but inhibits IgE-mediated activation of cultured human mast cells. Immunology Letters. 210, 40-46 (2019).
  143. Mueller-Wirth, N., et al. IgE-mediated chlorhexidine allergy-Cross-reactivity with other biguanide disinfectants. Allergy. 75 (12), 3237-3247 (2020).
  144. Johansson, S. G., et al. Passive IgE-sensitization by blood transfusion. Allergy. 60 (9), 1192-1199 (2005).
  145. Ariza, A., et al. Basophil activation after nonsteroidal anti-inflammatory drugs stimulation in patients with immediate hypersensitivity reactions to these drugs. Cytometry A. 85 (5), 400-407 (2014).
  146. Sturm, G. J., et al. The basophil activation test in the diagnosis of allergy: technical issues and critical factors. Allergy. 64 (9), 1319-1326 (2009).
  147. Iqbal, K., Bhargava, K., Skov, P. S., Falkencrone, S., Grattan, C. E. A positive serum basophil histamine release assay is a marker for ciclosporin-responsiveness in patients with chronic spontaneous urticaria. Clinical and Translational Allergy. 2 (1), 19 (2012).
  148. Korosec, P., et al. high-affinity IgE receptors, and CCL2 in human anaphylaxis. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (3), 750-758 (2017).
  149. Fernandez, T. D., et al. Negativization rates of IgE radioimmunoassay and basophil activation test in immediate reactions to penicillins. Allergy. 64 (2), 242-248 (2009).
  150. Kwok, M., Lack, G., Santos, A. F. Improved standardisation of the whole blood basophil activation test to peanut. Clinical and Translational Allergy. 8 (26), Suppl 2 15-16 (2017).
  151. Mukai, K., et al. Assessing basophil activation by using flow cytometry and mass cytometry in blood stored 24 hours before analysis. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 889-899 (2017).
  152. Sousa, N., Martinez-Aranguren, R., Fernandez-Benitez, M., Ribeiro, F., Sanz, M. L. Comparison of basophil activation test results in blood preserved in acid citrate dextrose and EDTA. Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology. 20 (6), 535-536 (2010).
  153. Knol, E. F., Koenderman, L., Mul, F. P., Verhoeven, A. J., Roos, D. Differential activation of human basophils by anti-IgE and formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine. Indications for protein kinase C-dependent and -independent activation pathways. European Journal of Immunology. 21 (4), 881-885 (1991).
  154. Macglashan, D. W. Basophil activation testing. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (4), 777-787 (2013).
  155. Macglashan, D., Moore, G., Muchhal, U. Regulation of IgE-mediated signalling in human basophils by CD32b and its role in Syk down-regulation: basic mechanisms in allergic disease. Clinical & Experimental Allergy. 44 (5), 713-723 (2014).
  156. Macglashan, D. Subthreshold desensitization of human basophils re-capitulates the loss of Syk and FcepsilonRI expression characterized by other methods of desensitization. Clinical & Experimental Allergy. 42 (7), 1060-1070 (2012).
  157. Grochowy, G., Hermiston, M. L., Kuhny, M., Weiss, A., Huber, M. Requirement for CD45 in fine-tuning mast cell responses mediated by different ligand-receptor systems. Cell Signaling. 21 (8), 1277-1286 (2009).
  158. Schroeder, J. T., Chichester, K. L., Bieneman, A. P. Human basophils secrete IL-3: evidence of autocrine priming for phenotypic and functional responses in allergic disease. Journal of Immunology. 182 (4), 2432-2438 (2009).
  159. Ocmant, A., et al. Flow cytometry for basophil activation markers: the measurement of CD203c up-regulation is as reliable as CD63 expression in the diagnosis of cat allergy. Journal of Immunology Methods. 320 (1-2), 40-48 (2007).
  160. Gentinetta, T., et al. Individual IL-3 priming is crucial for consistent in vitro activation of donor basophils in patients with chronic urticaria. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 128 (6), 1227-1234 (2011).
  161. Sturm, E. M., et al. CD203c-based basophil activation test in allergy diagnosis: characteristics and differences to CD63 upregulation. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 78 (5), 308-318 (2010).
  162. Hausmann, O. V., et al. Robust expression of CCR3 as a single basophil selection marker in flow cytometry. Allergy. 66 (1), 85-91 (2011).
  163. Nucera, E., et al. Utility of Basophil Activation Test for monitoring the acquisition of clinical tolerance after oral desensitization to cow's milk: Pilot study. United European Gastroenterol Journal. 3 (3), 272-276 (2015).
  164. Imoto, Y., et al. Peripheral basophil reactivity, CD203c expression by Cryj1 stimulation, is useful for diagnosing seasonal allergic rhinitis by Japanese cedar pollen. Immunity, Inflammation and Disease. 3 (3), 300-308 (2015).
  165. Konstantinou, G. N., et al. EAACI taskforce position paper: evidence for autoimmune urticaria and proposal for defining diagnostic criteria. Allergy. 68 (1), 27-36 (2013).
  166. Santos, A. F., Becares, N., Stephens, A., Turcanu, V., Lack, G. The expression of CD123 can decrease with basophil activation: implications for the gating strategy of the basophil activation test. Clinical and Translational Allergy. 6, 11 (2016).
  167. Dijkstra, D., et al. Identification and quantification of basophils in the airways of asthmatics following segmental allergen challenge. Cytometry A. 85 (7), 580-587 (2014).
  168. Dijkstra, D., Meyer-Bahlburg, A. Human Basophils Modulate Plasma Cell Differentiation and Maturation. Journal of Immunology. 198 (1), 229-238 (2017).
  169. Sihra, B. S., Kon, O. M., Grant, J. A., Kay, A. B. Expression of high-affinity IgE receptors (Fc epsilon RI) on peripheral blood basophils, monocytes, and eosinophils in atopic and nonatopic subjects: relationship to total serum IgE concentrations. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 99 (5), 699-706 (1997).
  170. Dehlink, E., Baker, A. H., Yen, E., Nurko, S., Fiebiger, E. Relationships between levels of serum IgE, cell-bound IgE, and IgE-receptors on peripheral blood cells in a pediatric population. PLoS One. 5 (8), 12204 (2010).
  171. Hoffmann, H. J., Frandsen, P. M., Christensen, L. H., Schiotz, P. O., Dahl, R. Cultured human mast cells are heterogeneous for expression of the high-affinity IgE receptor FcepsilonRI. International Archives of Allergy and Immunology. 157 (3), 246-250 (2012).
  172. Ebo, D. G., et al. Analyzing histamine release by flow cytometry (HistaFlow): a novel instrument to study the degranulation patterns of basophils. Journal of Immunology Methods. 375 (1-2), 30-38 (2012).
  173. Macglashan, D. Marked differences in the signaling requirements for expression of CD203c and CD11b versus CD63 expression and histamine release in human basophils. International Archives of Allergy and Immunology. 159 (3), 243-252 (2012).
  174. Torres, M. J., et al. Clavulanic acid can be the component in amoxicillin-clavulanic acid responsible for immediate hypersensitivity reactions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 502-505 (2010).
  175. Ariza, A., et al. Pyrazolones metabolites are relevant for identifying selective anaphylaxis to metamizole. Scientific Reports. 6, 23845 (2016).

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