Summary
La préparation pulmonaire isolée du lapin est un outil de référence dans la recherche pulmonaire. Cette publication vise à décrire la technique telle que développée pour l’étude des mécanismes physiologiques et pathologiques impliqués dans la réactivité des voies respiratoires, la préservation des poumons et la recherche préclinique dans la transplantation pulmonaire et l’œdème pulmonaire.
Abstract
Le système de perfusion pulmonaire isolé a été largement utilisé dans la recherche pulmonaire, contribuant à élucider le fonctionnement interne des poumons, à la fois micro et macroscopique. Cette technique est utile dans la caractérisation de la physiologie et de la pathologie pulmonaires en mesurant les activités métaboliques et les fonctions respiratoires, y compris les interactions entre les substances circulatoires et les effets des substances inhalées ou perfusées, comme dans les tests de drogues. Alors que les méthodes in vitro impliquent le tranchage et la culture de tissus, le système de perfusion pulmonaire ex vivo isolé permet de travailler avec un organe fonctionnel complet rendant possible l’étude d’une fonction physiologique continue tout en recréant la ventilation et la perfusion. Cependant, il convient de noter que les effets de l’absence d’innervation centrale et de drainage lymphatique doivent encore être pleinement évalués. Ce protocole vise à décrire l’assemblage de l’appareil pulmonaire isolé, suivi de l’extraction chirurgicale et de la canulation des poumons et du cœur à partir d’animaux de laboratoire expérimentaux, ainsi qu’à afficher la technique de perfusion et le traitement du signal des données. La viabilité moyenne du poumon isolé varie entre 5 et 8 h; pendant cette période, la perméabilité capillaire pulmonaire augmente, provoquant un œdème et des lésions pulmonaires. La fonctionnalité du tissu pulmonaire préservé est mesurée par le coefficient de filtration capillaire (Kfc), utilisé pour déterminer l’étendue de l’œdème pulmonaire dans le temps.
Introduction
Brodie et Dixon ont décrit pour la première fois le système de perfusion pulmonaire ex-vivo en 1903 1. Depuis lors, il est devenu un outil de référence pour étudier la physiologie, la pharmacologie, la toxicologie et la biochimie des poumons2,3. La technique offre un moyen cohérent et reproductible d’évaluer la viabilité des greffes de poumons et de déterminer l’effet des médiateurs inflammatoires tels que l’histamine, les métabolites de l’acide arachidonique et la substance P, entre autres, ainsi que leurs interactions lors de phénomènes pulmonaires tels que la bronchoconstriction, l’atélectasie et l’œdème pulmonaire. Le système pulmonaire isolé a été une technique clé pour dévoiler le rôle important des poumons dans l’élimination des amines biogènes de la circulation générale4,5. De plus, le système a été utilisé pour évaluer la biochimie du surfactant pulmonaire6. Au cours des dernières décennies, le système de perfusion pulmonaire ex vivo est devenu une plate-forme idéale pour la recherche sur la transplantation pulmonaire7. En 2001, une équipe dirigée par Stig Steen a décrit la première application clinique du système de perfusion pulmonaire ex-vivo en l’utilisant pour reconditionner les poumons d’un donneur de 19 ans, initialement rejeté par les centres de transplantation en raison de ses blessures. Le poumon gauche a été prélevé et perfusé pendant 65 minutes; par la suite, il a été transplanté avec succès chez un homme de 70 ans atteint de BPCO8. D’autres recherches sur le reconditionnement des poumons à l’aide de la perfusion ex vivo ont mené à la mise au point de la technique torontoise de perfusion pulmonaire prolongée pour évaluer et traiter les poumons de donneurs blessés9,10. Sur le plan clinique, le système de perfusion pulmonaire ex vivo s’est avéré être une stratégie sûre pour augmenter les bassins de donneurs en traitant et en reconditionnant les poumons de donneurs inférieurs aux normes, ne présentant aucune différence significative dans les risques ou les résultats par rapport aux donneurs critères standard10.
Le principal avantage du système de perfusion pulmonaire isolée est que les paramètres expérimentaux peuvent être évalués dans un organe fonctionnel complet qui préserve sa fonction physiologique dans une configuration de laboratoire artificiel. En outre, il permet la mesure et la manipulation de la ventilation mécanique pulmonaire pour analyser les composants de la physiologie pulmonaire tels que la résistance des voies respiratoires, la résistance vasculaire totale, les échanges gazeux et la formation d’œdèmes, qui à ce jour ne peuvent pas être mesurés avec précision in vivo sur des animaux de laboratoire2. Notamment, la composition de la solution avec laquelle le poumon est perfusé peut être entièrement contrôlée, ce qui permet l’ajout de substances pour évaluer leurs effets en temps réel et le prélèvement d’échantillons à partir de la perfusion pour une étude plus approfondie11. Les chercheurs travaillant avec le système pulmonaire isolé doivent garder à l’esprit que la ventilation mécanique provoque la carie du tissu pulmonaire raccourcissant son temps utile. Cette chute progressive des paramètres mécaniques peut être considérablement retardée par hypergonflage des poumons occasionnellement pendant la durée de l’expérience4. Pourtant, la préparation ne peut généralement pas durer plus de huit heures. Une autre considération pour le système de perfusion pulmonaire ex-vivo est l’absence de régulation nerveuse centrale et de drainage lymphatique. Les effets de leur absence ne sont pas encore entièrement compris et pourraient potentiellement être une source de biais dans certaines expériences.
La technique du système de perfusion pulmonaire isolée peut être réalisée dans le modèle de lapin avec un degré élevé de cohérence et de reproductibilité. Ce travail décrit les procédures techniques et chirurgicales pour la mise en œuvre de la technique de perfusion pulmonaire isolée ex-vivo telle que développée pour le modèle de lapin à l’Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias à Mexico, dans le but de partager les idées et de fournir un guide clair sur les étapes clés dans l’application de ce modèle expérimental.
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Protocol
Le système de perfusion isolé dans le modèle de lapin a été largement utilisé dans le laboratoire d’hyperréactivité bronchique de l’Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias. Le protocole inclut les lapins néo-zélandais d’un poids approximatif de 2,5 à 3 kg. Tous les animaux ont été gardés dans des conditions de vivarium standard et nourris ad libitum conformément aux directives officielles mexicaines pour les animaux de laboratoire (NOM 062-ZOO-1999) et au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (8e édition, 2011). Toutes les procédures animales et les méthodes de soins aux animaux présentées dans ce protocole ont été préalablement approuvées par le Comité d’éthique de l’Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias.
REMARQUE: La préparation du système de perfusion pulmonaire isolé implique la mort délibérée d’un animal sous anesthésie et par euthanasie.
1. Équipement et préparation des appareils.
- Disposition de l’équipement :
- Installez une table d’opération avec une taille en fonction du poids du lapin.
- Montez le couvercle du thorax artificiel sur la colonne en acier avec la chambre en verre en dessous et le ventilateur avec une pompe à rouleaux sur les côtés.
- Assurez-vous que la couverture est facilement inclinée pour avoir la canule trachéale alignée avec la trachée pour permettre une connexion plus rapide.
- Thorax artificiel :
REMARQUE: C’est une partie essentielle du système. Il se compose d’une chambre en verre enveloppée d’eau scellée par un couvercle spécial. La couverture fonctionne comme le porte-organe avec les connexions pour canuler la trachée et les vaisseaux qui y sont intégrés.- Installez un jet de venturi actionné par de l’air comprimé pour générer la pression négative à l’intérieur du thorax artificiel.
REMARQUE: Le module de contrôle de la ventilation (VCM) permet des ajustements séparés des pressions inspiratoires et expiratoires ainsi que de la fréquence respiratoire et du rapport entre la durée inspiratoire et la durée totale du cycle.
- Installez un jet de venturi actionné par de l’air comprimé pour générer la pression négative à l’intérieur du thorax artificiel.
- Appareil:
- Assurez-vous qu’un appareil fonctionnant normalement se compose d’une colonne principale en acier montée sur une plaque de base tenant le thorax artificiel, avec le pneumotachymètre et le transducteur de poids situés au-dessus et derrière la bobine de préchauffage avec un piège à bulles.
- Connectez un transducteur de pression différentielle au pneumotachymètre et un autre à la pression de la chambre. Placez un couple différent de transducteurs de pression derrière le thorax pour mesurer la perfusion et les pressions veineuses.
- Connectez le stock de changement sous l’oxygénateur avec une électrode de niveau et le système de ventilation à côté de l’appareil.
2. Extraction chirurgicale du bloc cardiopulmonaire.
- Anesthésie:
- Utilisez une combinaison d’un sédatif (xylazine) et d’un barbiturique (pentobarbital).
REMARQUE: Différents cocktails anesthésiques peuvent être utilisés sans effet sur les résultats expérimentaux. - Tout d’abord, sédater les lapins néo-zélandais en bonne santé avec une seule injection intramusculaire de chlorhydrate de xylazine (3-5 mg / kg). Assurez-vous que les lapins restent calmes et détendus pour permettre une manipulation ultérieure après quelques minutes de l’injection.
- Après la sédation, utiliser les veines auriculaires marginales (latérales) comme accès pour anesthésier les lapins avec une injection intraveineuse de pentobarbital sodique (28 mg / kg).
- Utilisez une combinaison d’un sédatif (xylazine) et d’un barbiturique (pentobarbital).
- Surveillance:
- Pour éviter une anesthésie insuffisante ou une dépression excessive des fonctions cardiaques et respiratoires, surveillez les paramètres suivants. Pour évaluer la profondeur de l’anesthésie, effectuez un test de pincement des orteils.
- Assurez-vous que la membrane muqueuse est rose. Les nuances bleues ou grises indiquent une hypoxie.
- Assurez-vous que la fréquence cardiaque se situe entre 120 et 135 battements/min et que la température corporelle ne descend pas en dessous de 36,5 °C.
- Placement de l’animal :
- Rasez le torse du lapin et placez l’animal sur la table d’opération en position couchée. Placez le système de ventilation près de la table, derrière la tête du lapin, pour permettre de connecter les canules rapidement après la trachéotomie afin d’éviter des dommages tissulaires.
- Incision et trachéotomie :
- Disséquez la peau avec une incision de la ligne médiane ventrale de 3 à 5 cm du diaphragme jusqu’au cou.
- Avec les ciseaux opératoires, coupez les 2/3 antérieurs de la trachée entre deux anneaux cartilagineux pour insérer la canule trachéale à travers la membrane fibreuse trachéale.
- Insérez un 5 mm (diamètre extérieur; OD) canule trachéale à travers la membrane fibreuse trachéale et utilisez une suture de soie 4-0 pour la fixer soigneusement.
- Placez une pince ou une pince à épiler sous la trachée pour vous assurer que la canule ne se plie pas contre la trachée.
- Ventilation à pression positive :
- Tant que les poumons restent à l’extérieur du thorax artificiel, utilisez une pompe respiratoire de petite espèce pour ventiler une pression positive afin d’éviter l’effondrement des poumons pendant la chirurgie.
- Initier la ventilation par la canule trachéale reliée à la pompe respiratoire rapidement après la trachéotomie et avant l’ouverture du thorax.
- Réglez le volume courant à 10 mL/kg.
REMARQUE: Selon la configuration de l’expérience et le modèle de thorax artificiel, fournir une ventilation en pression positive par la même pompe de ventilation utilisée pour fournir une pression négative ou une autre, ce qui permet une recanulation rapide.
- Thoracotomie et exsanguination :
- Pour accéder à la cavité thoracique, utilisez un scalpel ou des ciseaux pour ouvrir la paroi du thorax et effectuez une sternotomie médiale jusqu’au tiers supérieur du thorax.
- Maintenez les moitiés du thorax ouvertes par deux rétracteurs. Plusieurs battements de poumon entourent généralement le cœur.
- Localisez la veine cave supérieure et inférieure et référez-les avec des fils.
- Avant l’exsanguination de l’animal, identifiez le ventricule droit et injectez 1000 UI/kg d’héparine.
- Immédiatement après l’injection, ligaturez la veine cave supérieure et inférieure avec le fil pré-bouclé et effectuez une exsanguination.
- Récolte cœur-poumon :
- Récoltez le bloc cardiopulmonaire doucement et rapidement. Utilisez une dissection numérique directe ou des ciseaux à ressort pour séparer le tissu conjonctif de manière à retirer les poumons du thorax.
- Disséquez le système vasculaire dans la région, ainsi que l’œsophage.
- Couper à travers le manubrium sterni pour étendre la sternotomie médiale vers la canule trachéale, libérant la trachée des deux côtés du tissu de connexion.
- Maintenant, réséquez la trachée au-dessus de la canule trachéale. Tirez doucement la canule dans un axe craniocaudal pendant que la fixation dorsale de la trachée et des poumons est réséquée.
- Canulation:
- Soulevez les poumons isolés du thorax et placez-les soigneusement sur une gaze stérile sur une boîte de Pétri.
- Pour prévenir l’atélectasie, ventilez les poumons à l’aide d’une ventilation à pression positive avec une pression expiratoire positive (PEEP) fixée à 2 cmH2O.
- Retirez les ventricules en les coupant du cœur au niveau de la rainure auriculo-ventriculaire.
- Après avoir ouvert les deux ventricules, introduire la canule de l’artère pulmonaire OD 4,6 mm pour le lapin avec un panier à travers l’artère pulmonaire et introduire la canule de l’oreillette gauche OD 5,9 mm pour le lapin avec le panier à travers la valve mitrale dans l’oreillette gauche.
- Utilisez une suture de soie 4-0 dans l’artère pulmonaire et l’oreillette gauche pour fixer les canules. Inclure les tissus environnants dans les ligatures de l’artère pulmonaire et de l’oreillette gauche pour éviter la distension de ces structures.
- Injecter 250 mL de solution isotonique saline à travers les canules artérielles pour rincer le sang restant du lit vasculaire.
3. Technique de perfusion.
- Coup monté:
- Placez soigneusement les poumons isolés dans la chambre pulmonaire.
- Fixez la trachée au transducteur sur le couvercle de la chambre.
- Connectez les vaisseaux cannulés au système de perfusion.
- Fermez la chambre et fixez-la avec la serrure rotative.
REMARQUE: Le circuit de perfusion à recirculation se compose d’un réservoir veineux ouvert, d’une pompe péristaltique, d’un échangeur de chaleur et d’un piège à bulles. - À ce stade, fixez le couvercle de la chambre et passez sur un robinet d’arrêt pour passer de la ventilation à pression positive à la ventilation à pression négative. Pour vérifier la ventilation à pression négative des poumons et la fermeture étanche à l’air de la chambre, inspectez l’excursion respiratoire du poumon et la pression de la chambre sur le manomètre.
- Perfuser les poumons avec 200 mL de perfusat artificiel sans sang (un tampon bicarbonate de Krebs-Ringer contenant 2,5% d’albumine bovine).
- Commencez le débit de perfusat à 3 mL/min/kg, puis augmentez lentement le débit sur une période de 5 minutes jusqu’à 5 mL/min/kg. Atteignez un débit de 8 mL/min/kg au cours des 5 minutes suivantes, puis après une autre période de 5 minutes, atteignez un flux maximal de 10 mL/min/kg. Prenez soin d’éviter que l’air ne pénètre dans le circuit.
REMARQUE: Maintenir le pH et la température du perfusat dans les plages physiologiques (pH 7,4-7,5; température, 37 °C-38 °C). Pour ajuster le pH, ajoutez Du NaHCO3 (1N) ou augmentez le flux de dioxyde de carbone. Vous pouvez également utiliser du HCl (0,1 N) pour acidifier.
- Paramètres:
- Vérifiez si les paramètres de perfusion et de ventilation prédéterminés sont réglés au besoin.
- Ventiler les poumons avec de l’air humidifié à une fréquence de 30 bpm, un volume courant de 10 mL/kg et une pression expiratoire finale (Pe) de 2 cmH2O.
REMARQUE: La pression artérielle pulmonaire (0-20 mmHg) correspond à la hauteur du niveau de liquide dans l’oxygénateur ou le réservoir en centimètres au-dessus du tronc pulmonaire, tandis que la pression veineuse pulmonaire correspond à la hauteur de la chambre d’équilibrage de pression au-dessus de l’oreillette gauche. Les deux valeurs peuvent être modifiées. Notez que la pression de l’oreillette gauche est également de 0 à 20 mmHg.
- Atteindre les conditions de la zone 3 :
- Utilisez les deux cathéters reliés aux orifices latéraux des canules fixées dans l’artère pulmonaire, l’oreillette gauche et les transducteurs de pression pour mesurer les pressions artérielle (Pa) et veineuse (Pv).
- Réglez les pressions de base au niveau du hile pulmonaire (référence zéro).
- Mener les expériences dans des conditions de ventilation de la zone 3. Pour y parvenir, attendez 10-15 min pour obtenir un équilibre caractérisé par un état isogravimétrique.
- Assurez-vous que la pression veineuse est supérieure à la pression alvéolaire (Palv) et que la pression artérielle reste supérieure aux deux (Pa > Pv > Palv) pour que les conditions de la zone 3 se produisent.
- Assurez-vous que le poids des poumons reste constant et que les pressions artérielles et auriculaires gauches sont stables pour atteindre les conditions de la zone 3 afin d’ouvrir un nombre maximal de vaisseaux pulmonaires et de maintenir le contenu du lit microvasculaire pendant l’expérience.
REMARQUE: La mesure de Kfc en tant qu’indicateur d’œdème pulmonaire n’a aucune variation entre un système de perfusion manuel et automatique.
- Contrôle électronique et traitement du signal: Assurez-vous que le flux respiratoire, les changements de poids, la pression microvasculaire, le volume courant, la résistance vasculaire, entre autres, sont enregistrés sur une unité électronique centrale multiple qui intègre les signaux provenant des transducteurs et les affiche sur le système d’évaluation.
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Representative Results
Le système de perfusion pulmonaire isolé permet la manipulation d’organes pour la biopsie, la collecte d’échantillons de perfusion et la collecte de données en temps réel de paramètres physiologiques. Le système isolé peut être utilisé pour tester de nombreuses hypothèses impliquant différentes fonctions et phénomènes pulmonaires, de l’activité métabolique et enzymatique à la formation d’œdème et aux périodes de conservation pour les greffes pulmonaires.
La figure 1 montre un diagramme du système de perfusion pulmonaire isolé entièrement assemblé ainsi que le système de ventilation et l’acquisition de données calculées. Le composant de perfusion du système garantit que le perfusat circule constamment dans les poumons isolés. L’artère pulmonaire est canulée pour fournir une perfusion d’entrée, tandis que l’écoulement de perfusate est fourni en cannulant l’oreillette gauche du cœur. Le perfusat est passé à l’aide de la pompe à rouleaux afin que le perfusate passe à travers l’échangeur de chaleur, puis à travers le piège à bulles dans l’artère pulmonaire et enfin dans le lit vasculaire pulmonaire. La composante ventilation du système permet au milieu de ventilation de s’écouler constamment au-delà de l’extrémité distale du pneumotachymètre directement via la canule trachéale dans les poumons.
La figure 2 montre la concentration de MAO (figure 2A) et de 5-HT (figure 2B) dans un poumon isolé conservé à 4 °C pendant 24 h. Les niveaux de sérotonine et de monoamine oxydase ont été déterminés à partir d’échantillons de liquide intravasculaire obtenus à différents moments et analysés par ELISA. La concentration de 5-HT a culminé après 15 minutes de conservation, puis a diminué au cours des 6 heures suivantes. Par la suite, les niveaux de perfusion ont montré une augmentation non statistiquement significative jusqu’à la 24ème heure. Les niveaux de MAO ont montré un comportement similaire, culminant après 15 minutes de conservation, puis diminuant au cours des six heures suivantes jusqu’à la 24e heure12. La figure 3 montre les taux de libération de 5-HT et de MAO, exprimés en pourcentage de la valeur initiale, mesurés pendant 24 h dans une préparation pulmonaire isolée à 4 °C. Au cours de la première heure de conservation, les niveaux de 5-HT ont augmenté plus haut que la MAO et ont diminué dans les 6 heures suivant leur recapturation par les cellules endothéliales et les plaquettes ainsi que par le catabolisme médié par la MAO12.
La figure 4 montre la NEP (densités optiques/mg protéine/min) et l’activité enzymatique ACE (densités optiques/mg protéine/min) au fil du temps dans une préparation pulmonaire isolée. L’activité neP (figure 4A) a été déterminée par analyse spectrophotométrique en utilisant N-Dansyl-D-Ala-Gly-pnitro-Phe-Gly comme substrat NEP suivi d’une addition d’énalapril pour inhiber l’ECA. L’activité de l’ECA (figure 4B) a été déterminée par une analyse spectrophotométrique utilisant l’énalapril comme substrat de l’ECA, suivie de l’ajout de phosphoramidon pour inhiber la NEP. Étant donné que les deux solutions contenaient de l’énalapril, l’activité de l’ECA a été calculée comme la différence de fluorescence entre les échantillons avec et sans énalapril13.
La figure 5 montre l’effet de la préservation pulmonaire sur la perméabilité capillaire (mKfc) pendant une période de 24 h dans le système de perfusion pulmonaire isolé du modèle de lapin. Un groupe témoin (n = 6), évalué immédiatement après la récolte, avait une erreur-type mKfc de 2,8 ± 0,8 (mL/min/cmH2O/g), en revanche, le poumon perfusé a subi une augmentation progressive du mKfc obtenant un score de 7,5 ± 1,4 (n = 6) à 6 h, 10,8 ± 2,3 (n = 6) à 12 h et a atteint 16,3 ± 2,5 (n = 6) après 24 h de conservation13.
La figure 6 montre l’effet de différents additifs sur la perméabilité capillaire du système de perfusion pulmonaire isolé dans diverses conditions. Un incrément de pression soudain de 10 cmH2O est généré par une obstruction partielle de l’écoulement veineux pour mesurer la perméabilité du lit capillaire à travers le coefficient de filtration capillaire (Kfc). Pour mesurer le Kfc, le tube de sortie qui sort du ventricule gauche vers le réservoir de Krebs a été partiellement serré. Ensuite, la pince partielle a été maintenue pendant 3 minutes en s’assurant que l’incrément de pression atteignait 10 cmH2O. Le serrage a été relâché et le débit normal a continué. Cette manœuvre a été enregistrée comme un incrément de la pression artérielle et une augmentation du poids pulmonaire. Ce dernier paramètre est considéré comme le Kfc.
Figure 1 : Diagramme du système de perfusion pulmonaire isolé. Cette figure a été modifiée à partir de Hugo Sachs Elektronik (HSE), Harvard Apparatus14. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Concentration de sérotonine (5-HT) et de monoamine oxydase (MAO) impliquées dans le métabolisme pulmonaire et la perméabilité vasculaire. La concentration de (A) MAO et (B) 5-HT dans un poumon isolé conservé à 4°C pendant 24 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : Taux de libération de sérotonine (5-HT) et de monoamine oxydase (MAO). Les taux de libération de 5-HT et de MAO, exprimés en pourcentage de la valeur initiale, mesurés pendant 24 h dans une préparation pulmonaire isolée à 4 °C. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 : Activité enzymatique de l’endopeptidase neutre (NEP) et de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ECA). Activité enzymatique de (A) NEP et (B) ACE à travers le temps dans un poumon isolé conservé à 4 °C jusqu’à 24 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 : Effet de la préservation pulmonaire sur la perméabilité capillaire (mKfc). Les données montrent l’effet de la préservation pulmonaire sur la perméabilité capillaire (mKfc) pendant une période de 24 heures dans le système de perfusion pulmonaire isolé dans le modèle de lapin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Effet de différents additifs sur la perméabilité capillaire. L’effet de différents additifs dans la perméabilité capillaire du système de perfusion pulmonaire isolé dans diverses conditions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce travail présente une vue d’ensemble du système de perfusion pulmonaire isolé, une technique essentielle dans la recherche en physiologie pulmonaire. Le système de perfusion pulmonaire isolée offre un grand degré de polyvalence dans ses utilisations et permet l’évaluation de plusieurs paramètres pertinents dans le test d’un large éventail d’hypothèses15. Un système pulmonaire isolé est un outil présent dans le monde entier qui, au cours de la dernière décennie, a encore établi sa pertinence pour les évaluations spécifiques aux organes et a également élargi son utilité en tant qu’extension des technologies de pointe et des nouvelles thérapies impliquant des cellules souches mésenchymateuses16 et l’ingénierie du génome CRISPR / Cas917, entre autres. Les domaines de recherche actuels sur la perfusion pulmonaire ex vivo couvrent largement les stratégies anti-inflammatoires, la gestion et la prévention des lésions de ventilation, le traitement anti-rejet et la performance de l’œdème anti-pulmonaire15.
Un assemblage correct de l’appareil est nécessaire pour garantir un bon recueil des données. Comme le montre la figure 1 , l’ensemble du système se compose d’une chambre humide à pression négative fixée à un système de ventilation et d’un système de perfusion qui imite les fonctions respiratoire et circulatoire des poumons, respectivement. Les deux systèmes sont connectés à un système d’acquisition de données qui permet l’ajout d’appareils de mesure qui peuvent être adaptés aux besoins de n’importe quel protocole. Le processus chirurgical de prélèvement du bloc cardio-pulmonaire doit être effectué rapidement, de préférence par du personnel expérimenté, afin d’éviter des lésions tissulaires supplémentaires afin de maintenir le poumon aussi intact que possible afin que la fonction physiologique puisse continuer sans autre interférence pendant l’expérience. Le système permet également la collecte d’échantillons de perfusion en temps réel qui peuvent être utilisés pour déterminer l’effet de certaines molécules dans différentes fonctions pulmonaires (par exemple, l’effet de l’héparine sur la préservation pulmonaire).
Afin d’obtenir une bonne répartition du flux de perfusion entre les vaisseaux pulmonaires, à savoir les capillaires, les conditions de la zone 3 doivent être obtenues. Les conditions de la zone 1 sont définies comme la région où la pression artérielle tombe en dessous de la pression alvéolaire, se rapprochant généralement de la pression atmosphérique. Lorsque cela se produit, les capillaires s’aplatissent, ce qui rend impossible le flux sanguin ou la perfusion. Dans des circonstances normales, la zone 1 ne peut exister car la pression artérielle est suffisante pour garantir la distribution du débit. Cependant, les conditions de la zone 1 peuvent apparaître si la pression artérielle baisse ou si la pression alvéolaire augmente (comme c’est le cas lors de la ventilation en pression positive). Les conditions de la zone 1 conduisent à un poumon ventilé non perfusé qui est incapable d’effectuer un échange gazeux. Dans les conditions de la zone 2, la pression artérielle est supérieure à la pression alvéolaire. Cependant, la pression veineuse reste inférieure à la pression alvéolaire, ce qui entraîne un flux de perfusion déterminé par la différence entre les pressions artérielle et alvéolaire. Ce comportement peut être modélisé à l’aide d’une résistance Starling. Les conditions de la zone 3 sont déterminées par la différence entre les pressions artérielles et veineuses. L’augmentation du débit de perfusion dans la zone 3 se produit parce que les capillaires se disséminent, conditionnant l’ouverture d’un nombre maximal de vaisseaux pulmonaires.
L’unité du système se compose de sept modules: deux modules d’amplification de transducteur analogique (TAM-A) équipés d’un signal graphique à barres LED analogique pour surveiller les signaux dynamiques (pression artérielle, flux d’air respiratoire, force de contraction, etc.), un module d’amplification de transducteur numérique (TAM-D) avec un affichage numérique numérique conçu pour surveiller les signaux pulsatiles à changement lent; un servocontrôleur pour module de perfusion (SCP) qui fonctionne avec les amplificateurs TAM-A et TAM-D pour le contrôle de la perfusion des perfusions d’organes isolés à l’aide de la pompe péristaltique, la vitesse de la pompe peut être réglée en mode pression constante ou contrôlée manuellement via le SCP; un module d’équilibre de l’œdème (EBM) qui mesure le poids des poumons; un module de contrôle de la ventilation (VCM) pour contrôler la ventilation à pression positive et négative, et un module de compteur de minuterie (TCM) qui peut être réglé pour déclencher le VCM pour effectuer des cycles d’inspiration profonds.
La forte prévalence mondiale des affections pulmonaires et respiratoires et les limites des options thérapeutiques actuelles imposent une plus grande demande de greffes pulmonaires, car elles restent le traitement de référence pour les patients atteints d’une maladie pulmonaire en phase terminale18. Le système de perfusion pulmonaire ex-vivo représente une excellente plate-forme pour tester des thérapies ciblées dans la recherche fondamentale et clinique. Sur le plan clinique, le système de perfusion ex-vivo peut être utilisé pour évaluer le tissu du greffon à l’extérieur du corps, ce qui permet de tester l’organe isolé avant la transplantation, aidant ainsi à recueillir des données cliniques pour un pronostic plus précis sur l’efficacité de la greffe. L’utilisation rationnelle du système de perfusion pulmonaire isolé pourrait aider à optimiser la chirurgie de transplantation pulmonaire, ce qui en ferait une procédure plus sûre et plus élective. Le modèle pulmonaire isolé est également utile dans la recherche fondamentale de techniques avancées de diagnostic et de thérapie telles que l’instillation de cellules souches mésenchymateuses et d’autres thérapies à médiation immunitaire; de nombreux rapports ont montré le potentiel de la technique de perfusion ex vivo en tant que plate-forme pour poursuivre les recherches sur la préservation pulmonaire dans le développement de techniques permettant d’éviter les lésions d’ischémie-reperfusion et l’œdème pulmonaire, prolongeant ainsi la viabilité des organes15. Certaines étapes de dépannage et limitations associées au modèle pulmonaire isolé sont principalement le temps court disponible de cette technique pour la génération possible d’œdème induit par la limitation du drain lymphatique ainsi que l’effet systémique de la technique. La détermination du coefficient de filtration capillaire (Kfc) est un critère fiable pour mesurer la fonctionnalité du tissu pulmonaire préservé et établir l’étendue de l’œdème au fil du temps. Aucune différence n’a été trouvée entre les déterminations manuelles et automatiques de Kfc19.
Alors que l’utilisation du système de perfusion pulmonaire isolée se popularise et que de nouvelles thérapies modifient le paysage clinique, la technique de perfusion ex vivo devient un choix facultatif pour améliorer les résultats des patients dans différentes pathologies pulmonaires, ainsi que pour augmenter le bassin de donneurs pulmonaires potentiels sans compromettre la sécurité du receveur, promettant une nouvelle ère dans la préservation pulmonaire et la transplantation pulmonaire. L’émergence de la pandémie de Covid-19 et l’augmentation de la prévalence de la MPOC18,20 dans la population mondiale soulignent la nécessité de poursuivre la recherche fondamentale sur la physiologie pulmonaire, la préservation pulmonaire et la transplantation pulmonaire, ainsi que la recherche préclinique de nouvelles thérapies en vue de la médecine translationnelle. De plus, le modèle de lapin ex-vivo est un modèle accessible et pratique pour former les résidents et les étudiants dans le domaine de la pneumologie, en particulier ceux impliqués dans la chirurgie thoracique et l’ECMO. Tout laboratoire impliqué dans des protocoles de recherche respiratoire ou thoracopulmonaire est encouragé à considérer le système de perfusion pulmonaire isolé dans le cadre de ses outils quotidiens pour ses expériences.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier la Ph.D. Bettina Sommer Cervantes pour son soutien dans la rédaction de ce manuscrit, et Kitzia Elena Lara Safont pour son soutien avec les illustrations.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1864 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
| Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
| Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder | sigma | 3912 | 500 g |
| Calcium chloride, CaCl2·2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
| Cryogenic vials | Corning | 430659 | 2 mL |
| D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
| Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
| Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
| Eppendorf tubes | |||
| Ethanol absolute HPLC grade | Caledon | ||
| Falcon tubes | 14 mL | ||
| Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
| Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
| Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
| Heparin | PISA | 5000 UI | |
| HPLC Column (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4.6 mm |
| Hydrophilic Syringe Filter | Millex | SLLGR04NL | 4 mm |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
| Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
| Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
| Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
| Microcentrifuge Tube | Corning | 430909 | |
| Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
| New Zeland rabbits | |||
| PISABENTAL (Pentobarbital sodium) | PISA | Q-7833-215 | |
| PLUGSYS Case, Type 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
| PLUGSYS TCM Time Counter Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
| PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
| Potassium chloride, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
| PROCIN (Xylacine clorhydrate) | PISA | Q-7833-099 | |
| Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
| Scalpel knife | |||
| Serotonin 5-HT | |||
| Servo Controller for Perfusion (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
| Snap Cap Microcentrifuge Tube | Costar | 3620 | 1.7 mL |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| Sodium chloride, NaCl. | sigma | S9888 | |
| Surgical gloves No. 7 1/2 | |||
| Surgical gloves No. 8 | |||
| Taygon tubes | Masterflex | ||
| Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |
References
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