A preparação isolada do pulmão do coelho é uma ferramenta padrão-ouro na pesquisa pulmonar. Esta publicação tem como objetivo descrever a técnica desenvolvida para o estudo de mecanismos fisiológicos e patológicos envolvidos na reatividade das vias aéreas, preservação pulmonar e pesquisa pré-plínica em transplante de pulmão e edema pulmonar.
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Artigo de método
Sistema de Perfusão pulmonar isolado no modelo coelho
Neste artigo
Resumo
Resumo
O sistema isolado de perfusão pulmonar tem sido amplamente utilizado em pesquisas pulmonares, contribuindo para elucidar o funcionamento interno dos pulmões, tanto micro quanto macroscopicamente. Esta técnica é útil na caracterização da fisiologia pulmonar e patologia medindo atividades metabólicas e funções respiratórias, incluindo interações entre substâncias circulatórias e os efeitos de substâncias inaladas ou perfumadas, como no teste de drogas. Enquanto os métodos in vitro envolvem o corte e a colheita de tecidos, o sistema isolado de perfusão pulmonar ex vivo permite trabalhar com um órgão funcional completo possibilitando o estudo de uma função fisiológica contínua ao mesmo tempo em que recria ventilação e perfusão. No entanto, deve-se notar que os efeitos da ausência de inervação central e drenagem linfática ainda devem ser totalmente avaliados. Este protocolo tem como objetivo descrever a montagem do aparelho pulmonar isolado, seguido da extração cirúrgica e cannulação de pulmões e coração de animais de laboratório experimentais, bem como exibir a técnica de perfusão e processamento de sinais dos dados. A viabilidade média do pulmão isolado varia entre 5-8 h; durante esse período, a permeabilidade capilar pulmonar aumenta, causando edema e lesão pulmonar. A funcionalidade do tecido pulmonar preservado é medida pelo coeficiente de filtragem capilar (Kfc), usado para determinar a extensão do edema pulmonar ao longo do tempo.
Introdução
Brodie e Dixon descreveram pela primeira vez o sistema de perfusão pulmonar ex-vivo em 1903 1. Desde então, tornou-se uma ferramenta padrão-ouro para estudar a fisiologia, farmacologia, toxicologia e bioquímica dos pulmões2,3. A técnica oferece uma forma consistente e reprodutível de avaliar a viabilidade dos transplantes de pulmão, e determinar o efeito de mediadores inflamatórios como histamina, metabólitos ácido aracidônico e substância P, entre outros, bem como suas interações durante fenômenos pulmonares como broncoconstrição, atelectasia e edema pulmonar. O sistema pulmon....
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Protocolo
O sistema isolado de perfusão no modelo coelho tem sido amplamente utilizado no Laboratório de Hiperresponsividade Brônquica no Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias. O protocolo inclui coelhos neozelandeses com um peso aproximado de 2,5-3 kg. Todos os animais foram mantidos em condições padrão de vivarium e alimentação ad libitum em conformidade com as diretrizes oficiais mexicanas para animais de laboratório (NOM 062-ZOO-1999) e sob o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (8ª edição, 2011). Todos os procedimentos de animais e métodos de cuidado animal apresentados neste protocolo foram previamente aprovados pelo Comitê de....
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Resultados
O sistema isolado de perfusão pulmonar permite manipulação de órgãos para biópsia, coleta de amostras de perfusão e coleta de dados em tempo real de parâmetros fisiológicos. O sistema isolado pode ser usado para testar muitas hipóteses envolvendo diferentes funções e fenômenos pulmonares, desde atividade metabólica e enzimática até períodos de formação e preservação de edema para transplantes de pulmão.
A Figura 1 exibe um diagrama do sistema de perfusão pulmonar .......
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Discussão
Este trabalho apresenta uma visão geral do sistema isolado de perfusão pulmonar, uma técnica essencial na pesquisa de fisiologia pulmonar. O sistema isolado de perfusão pulmonar oferece um grande grau de versatilidade em seus usos e permite a avaliação de vários parâmetros relevantes no teste de uma ampla gama de hipóteses15. Um sistema pulmonar isolado é uma ferramenta com presença mundial que, na última década, estabeleceu ainda mais sua relevância para avaliações específicas de órgãos e também .......
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Divulgações
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer à doutora Bettina Sommer Cervantes pelo apoio na redação deste manuscrito, e kitzia Elena Lara Safont por seu apoio às ilustrações.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubulação Tygon E-Lab de 2 paradas, 3,17 mm de diâmetro, 12/pacote, preto/branco | Sachs Elektronik | 73-4312 | |
| Adaptador para ventilação com pressão positiva no IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Fornecimento alternativo de gás livre de pressão para IPL-4: Para fornecer à traqueia uma mistura de gases diferente do ar ambiente durante a ventilação negativa | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
| Unidade Base para o Pulmão Perfundido Isolado de Coelho para Fetal | de Porco Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
| Soro bovino A2: D41albumina liofilizado em pó | sigma | 3912 | 500 g |
| Cloreto de cálcio, CaCl2· 2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
| Frascos criogênicos | Corning | 430659 | 2 mL |
| de D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
| Transdutor Diferencial de Baixa Pressão DLP2.5, Faixa +- 2,5 cmH2O, Conector HSE | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
| Transdutor de Pressão Diferencial MPX, Faixa +- 100 cmH2O, Conector HSE | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
| Eppendorf tubes | |||
| Etanol tubos | Caledon | ||
| Falcon | 14 mL | ||
| Bomba Peristáltica Harvard P-230 (Completa com Caixa de Controle e Acionamento do Motor P-230) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
| Pneumotacômetro Linear Aquecido 0 a 10 L / min faixa de fluxo | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
| Controlador de Aquecedor para Pneumotacômetro Único 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
| Heparina | PISA | 5000 UI | |
| Coluna HPLC (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4,6 mm |
| Filtro de Seringa Hidrofílica | Millex | SLLGR04NL | |
| de Núcleo IPL-4 de 4 mm para Pulmão de Coelho Isolado para Porco Fetal, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Sistema de núcleo IPL-4 para pulmão isolado de coelho para fetal, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Reservatório de vidro revestido para solução tampão, com fritas e tubos, 6,0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
| Lauda Termostático Circulador, Tipo E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Volume de Banho, Faixa de Temperatura 20 a 150° C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
| Cânula de Átrio Esquerdo para Coelho com Cesta, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
| Transdutor de Pressão Arterial de Baixo Alcance P75 para Módulo PLUGSYS | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
| Sulfato de magnésio heptahidratado, MgSO4· 7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
| Tubo de Microcentrífuga | Corning | 430909 | |
| Opção de Controle de Ventilação por Pressão Negativa com Regulador de Pressão para IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
| Coelhos | |||
| PISABENTAL (Pentobarbital de sódio) | PISA | Q-7833-215 | |
| Estojo PLUGSYS, Tipo 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
| Módulo Contador de Tempo PLUGSYS TCM | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
| Módulo Amplificador Transdutor PLUGSYS (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
| Módulo Amplificador Transdutor PLUGSYS (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
| Módulo de Controle de Ventilação PLUGSYS VCM-4R com Regulador de Pressão | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
| Cloreto de potássio, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
| Di-hidrogenofosfato de potássio, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
| PROCIN (cloridrato de xilacina) | PISA | Q-7833-099 | |
| Cânula de Artéria Pulmonar para Coelho com Cesta, OD 4,6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
| Faca | de bisturi | ||
| Servo controlador de serotonina 5-HT | |||
| para perfusão (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
| Snap Cap Tubo de microcentrífuga | Costar | 3620 | 1,7 mL |
| Bicarbonato de sódio, NaHCO < sub>3< / sub> | sigma | S6014 | |
| Cloreto de sódio, NaCl. | sigma | S9888 | |
| Luvas cirúrgicas nº 7 1/2 | |||
| Luvas cirúrgicas nº 8 | |||
| Tubos Taygon | |||
| para coelho, OD 5,0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |
Referências
- Dixon, W. E. Contributions to the physiology of the lungs: Part I. The bronchial muscles, their innervation, and the action of drugs upon them. The Journal of Physiology. 29 (2), 97-173 (1903).
- Nelson, K., et al.
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Reimpressões e permissões
