Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מערכת זלוף ריאות מבודדת במודל הארנב

Published: July 15, 2021 doi: 10.3791/62734
Automatic Translation
2, 1, 1, 1
1Departamento de Investigación en Hiperreactividad Bronquial, Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias, 2Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México

Summary

הכנת ריאות ארנב מבודד הוא כלי סטנדרטי זהב במחקר ריאתי. פרסום זה נועד לתאר את הטכניקה כפי שפותחה לחקר מנגנונים פיזיולוגיים ופתולוגיים המעורבים בתגובה בדרכי הנשימה, שימור ריאות ומחקר פרה-אקליני בהשתלת ריאות ובבצקת ריאות.

Abstract

מערכת זלוף הריאות המבודדת נמצאת בשימוש נרחב במחקר ריאתי, ותרמה לתרומת הפעילות הפנימית של הריאות, הן מיקרו והן מקרוסקופית. טכניקה זו שימושית באפיון פיזיולוגיה ופתולוגיה ריאתית על ידי מדידת פעילויות מטבוליות ותפקודים נשימתיים, כולל אינטראקציות בין חומרים במחזור הדם והשפעות של חומרים בשאיפה או חדורים, כמו בבדיקות סמים. בעוד שיטות במבחנה כרוכות חיתוך פולחן של רקמות, מערכת זלוף ריאות ex vivo מבודד מאפשר לעבוד עם איבר פונקציונלי מלא המאפשר את המחקר של פונקציה פיזיולוגית מתמשכת תוך יצירה מחדש של אוורור וזלוף. עם זאת, יש לציין כי ההשפעות של היעדר innervation מרכזי ניקוז לימפתי עדיין צריך להיות מוערך במלואו. פרוטוקול זה נועד לתאר את ההרכבה של מנגנון הריאות המבודד, ואחריו מיצוי כירורגי ו cannulation של ריאות ולב מחיות מעבדה ניסיוניות, כמו גם להציג את טכניקת זלוף ועיבוד אותות של נתונים. הכדאיות הממוצעת של הריאות המבודדות נעה בין 5-8 שעות; במהלך תקופה זו, חמיץ נימים ריאתי עולה, גרימת בצקת ופגיעה בריאות. הפונקציונליות של רקמת ריאות שהשתמרה נמדדת על ידי מקדם סינון נימי (Kfc), המשמש לקביעת היקף בצקת הריאות לאורך זמן.

Introduction

ברודי ודיקסון תיארו לראשונה את מערכת זלוף הריאות לשעבר בשנת 1903 1. מאז, הוא הפך לכלי תקן זהב לחקר הפיזיולוגיה, הפרמקולוגיה, טוקסיקולוגיה וביוכימיה של הריאות2,3. הטכניקה מציעה דרך עקבית וניתנת לשחזור להעריך את הכדאיות של השתלות ריאות, ולקבוע את ההשפעה של מתווכים דלקתיים כגון היסטמין, מטבוליטים חומצה ארכידונית, וחומר P, בין היתר, כמו גם את האינטראקציות שלהם במהלך תופעות ריאות כגון ברונכוקונסטריה, אטלקטטזיס, בצקת ריאות. מערכת הריאות המבודדת הייתה טכניקה מרכזית בחשוף התפקיד החשוב של הריאות בחיסול אמינים ביוגניים ממחזור הדם הכללי4,5. בנוסף, המערכת שימשה להערכת הביוכימיה של פעילי שטח ריאתיים6. במהלך העשורים האחרונים, מערכת זלוף הריאות לשעבר הפכה לפלטפורמה אידיאלית למחקר השתלת ריאות7. בשנת 2001 תיאר צוות בראשות סטיג סטיין את היישום הקליני הראשון של מערכת זלוף הריאות ex-vivo על ידי שימוש בו כדי לשחזר את ריאותיו של תורם בן 19, שנדחה בתחילה על ידי מרכזי השתלה בשל פציעותיו. הריאה השמאלית נקצרה וחולבה במשך 65 דקות; לאחר מכן, הוא הושתל בהצלחה בגבר בן 70 עם COPD8. מחקר נוסף על שיפוץ ריאות באמצעות זלוף ex-vivo הוביל לפיתוח טכניקת טורונטו עבור זלוף ריאות מורחב כדי להעריך ולטפל ריאות תורם פצוע9,10. מבחינה קלינית, מערכת זלוף הריאות ex-vivo הוכיחה להיות אסטרטגיה בטוחה כדי להגדיל את מאגרי התורמים על ידי טיפול ושיפוץ ריאות תורם תת-סטנדרטי, הצגת שום הבדל משמעותי בסיכונים או תוצאות נגד תורמים קריטריונים סטנדרטיים10.

היתרון העיקרי של מערכת זלוף הריאות המבודדת הוא שניתן להעריך את הפרמטרים הניסיוניים באיבר פונקציונלי מלא המשמר את תפקודו הפיזיולוגי תחת מערך מעבדה מלאכותי. יתר על כן, הוא מאפשר מדידה ומניפולציה של אוורור מכני ריאתי לנתח את המרכיבים של פיזיולוגיה ריאתית כגון התנגדות דרכי הנשימה, התנגדות כלי דם כוללת, חילופי גזים, היווצרות בצקת, אשר עד כה לא ניתן למדוד בדיוק vivo על חיות מעבדה2. ראוי לציין, את הרכב הפתרון שבו הריאה מנוטרלת ניתן לשלוט באופן מלא, המאפשר תוספת של חומרים כדי להעריך את ההשפעות שלהם בזמן אמת איסוף מדגם מ זלוף למחקר נוסף11. חוקרים העובדים עם מערכת הריאות המבודדת צריכים לזכור כי אוורור מכני גורם לריקבון רקמת הריאה המקצרת את זמן השימוש שלה. נפילה הדרגתית זו בפרמטרים מכניים יכולה להתעכב באופן משמעותי על ידי ניפוח יתר של הריאות מדי פעם במהלך הניסוי4. ובכל זאת, ההכנה בדרך כלל לא יכולה להימשך יותר משמונה שעות. שיקול נוסף במערכת זלוף הריאות לשעבר הוא היעדר ויסות עצבים מרכזי וניקוז לימפתי. ההשפעות של היעדרם עדיין לא מובנות במלואן ועלול להיות מקור להטיה בניסויים מסוימים.

טכניקת מערכת זלוף הריאות המבודדת יכולה להתבצע במודל הארנב עם רמה גבוהה של עקביות ושחזור. עבודה זו מתארת את ההליכים הטכניים והניתוחיים ליישום טכניקת זלוף הריאות המבודדת ex-vivo כפי שפותחה עבור מודל הארנב במכון נאסיונאל דה אנפרמדדס Respiratorias במקסיקו סיטי, בכוונה לחלוק את התובנות ולספק מדריך ברור על צעדים מרכזיים ביישום מודל ניסיוני זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מערכת זלוף מבודד במודל הארנב כבר בשימוש נרחב במעבדת Hyperresponsiveness הסימפונות במכון הלאומי הלאומי דה Enfermedades Respiratorias. הפרוטוקול כולל ארנבות ניו זילנדיות במשקל משוער של 2.5-3 ק"ג. כל בעלי החיים נשמרו בתנאי ויבריום סטנדרטיים והאכלת ליביטום על פי ההנחיות המקסיקניות הרשמיות לחיות מעבדה (NOM 062-ZOO-1999) ותחת המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (מהדורה 8, 2011). כל ההליכים בבעלי חיים ושיטות טיפול בבעלי חיים שהוצגו בפרוטוקול זה אושרו בעבר על ידי ועדת האתיקה של המכון הלאומי הלאומי של Enfermedades Respiratorias.

הערה: הכנת מערכת זלוף הריאות המבודדת כרוכה במוות מכוון של בעל חיים בהרדמה ובאמצעות המתת חסד.

1. ציוד והכנת מנגנון.

  1. סידור ציוד:
    1. הגדר שולחן ניתוח עם גודל בהתאם למשקל הארנב.
    2. הר את הכיסוי של בית החזה המלאכותי על עמוד הפלדה עם תא הזכוכית מתחת ואת מכונת ההנשמה עם משאבת רולר על ידי הצדדים.
    3. ודא כי הכיסוי נוטה בקלות יש צינורית קנה הנשימה בקנה אחד עם קנה הנשימה כדי לאפשר חיבור מהיר יותר.
  2. בית החזה המלאכותי:
    הערה: זהו חלק חיוני של המערכת. הוא מורכב מתא זכוכית מצופה מים החתום על ידי כיסוי מיוחד. הכיסוי עובד כמחזיק האיברים עם החיבורים כדי לנפח את קנה הנשימה ואת כלי הדם המוטמעים בו.
    1. הקימו סילון ונטורי המופעל על ידי אוויר דחוס כדי ליצור את הלחץ השלילי בתוך בית החזה המלאכותי.
      הערה: מודול בקרת האוורור (VCM) מאפשר התאמות נפרדות של לחצים מעוררי השראה ותפוגת קצה, כמו גם קצב נשימה והיחס בין משך מעורר השראה למשך המחזור הכולל.
  3. מנגנון:
    1. ודא כי מנגנון עובד בדרך כלל מורכב עמוד פלדה ראשי רכוב על צלחת בסיס מחזיק את בית החזה המלאכותי, עם pneumotachometer ומתמר משקל ממוקם מעליו ומאחורי סליל התחממות מראש עם מלכודת בועה.
    2. חבר מתמר לחץ דיפרנציאלי אחד לדשא ריאות ועוד אחד ללחץ התאי. הגדר זוג אחר של מתמרים לחץ מאחורי בית החזה כדי למדוד זלוף ולחצים ורידים.
    3. חבר את מלאי ההחלפה מתחת למחמצן עם אלקטרודה ברמה ומערכת האוורור ליד המנגנון.

2. מיצוי כירורגי של בלוק לב ריאה.

  1. הרדמה:
    1. השתמש בשילוב של סם הרגעה (קסילאסין) וברביטורט (פנטוברביטל).
      הערה: קוקטיילים הרדמה שונים ניתן להשתמש ללא השפעה על תוצאות ניסיוניות.
    2. ראשית, להסתים את הארנבים הניו זילנדיים הבריאים עם הזרקה תוך שרירית אחת של קסילאסין הידרוכלוריד (3-5 מ"ג/ק"ג). ודא כי הארנבים להישאר רגוע ונינוח כדי לאפשר מניפולציה נוספת לאחר כמה דקות של הזריקה.
    3. לאחר ההרעשה, השתמש בוורידים השוליים (לרוחב) האוזן כגישה להרדמת הארנבים עם הזרקה תוך ורידי של נתרן פנטוברביטל (28 מ"ג/ק"ג).
  2. ניטור:
    1. כדי למנוע הרדמה לא מספקת או דיכאון מוגזם של תפקודי לב ונשימה, לפקח על הפרמטרים הבאים. כדי להעריך את עומק ההרדמה, בצע בדיקת צביטת בוהן.
    2. ודא כי הקרום הרירי הוא ורוד. גוונים כחולים או אפורים מצביעים על היפוקסיה.
    3. ודא כי קצב הלב הוא בין 120-135 פעימות/ דקה, וכי טמפרטורת הגוף אינה יורדת מתחת 36 °C (5 °F).
  3. מיקום בעלי חיים:
    1. מגלחים את פלג פלג עליון של הארנב ומניחים את החיה על שולחן הניתוחים בתנוחה עלית. מניחים את מערכת האוורור ליד השולחן, מאחורי ראשו של הארנב, כדי לאפשר חיבור הצינורית במהירות לאחר קנה הנשימה כדי למנוע נזק tissular.
  4. חצירה ו tracheotomy:
    1. לנתח את העור עם פירוק קו חציוני גחוני של 3-5 ס"מ מן הסרעפת עד הצוואר.
    2. עם המספריים הפועלים, לחתוך את 2/3 של קנה הנשימה בין שתי טבעות סחוס כדי להכניס את צינורית קנה הנשימה דרך קרום סיבי קנה הנשימה.
    3. הכנס 5 מ"מ (קוטר חיצוני; OD) צינורית קנה הנשימה דרך קרום סיבי קנה הנשימה ולהשתמש 4-0 תבר משי כדי לתקן את זה בזהירות.
    4. מניחים מלקחיים או פינצטה מתחת לקנה הנשימה כדי להבטיח שהזנובה לא תתכופף כנגד קנה הנשימה.
  5. אוורור בלחץ חיובי:
    1. כל עוד הריאות נשארות מחוץ לבית החזה המלאכותי, השתמש במשאבת נשימה של מינים קטנים כדי לאוורר לחץ חיובי על מנת למנוע קריסת ריאות במהלך הניתוח.
    2. ליזום אוורור דרך צינור קנה הנשימה מחובר משאבת הנשימה במהירות לאחר tracheotomy ולפני בית החזה נפתח.
    3. הגדר את עוצמת הגאות והשפל ב- 10 מ"ל/ק"ג.
      הערה: בהתאם להגדרת הניסוי ודגם בית החזה המלאכותי, ספק אוורור בלחץ חיובי על ידי אותה משאבת אוורור המשמשת לאספקת לחץ שלילי או אחר, המעניקה שינון מחדש מהיר.
  6. ניקור חזה ודמום:
    1. כדי לגשת לחלל בית החזה, השתמש באזמל או במספריים כדי לפתוח את דופן בית החזה ולבצע סטרנוטומיה בינונית עד לשליש העליון של בית החזה.
    2. החזק את חצאי בית החזה פתוחים על ידי שני מפסקים. מספר מדפים ריאות בדרך כלל מקיפים את הלב.
    3. לוקליזציה של הוועד העליון והנחית והפנים אותם עם חוטים.
    4. לפני חיקת החיה, לזהות את החדר הימני ולהזריק 1000 ממשק משתמש / קילוגרם של הפרין.
    5. מיד לאחר ההזרקה, ליגט את הוועד העליון והנחית עם החוט טרום לולאה ולבצע פימום.
  7. קציר לב-ריאה:
    1. קציר את בלוק לב ריאה בעדינות ובמהירות. השתמש ביתור דיגיטלי ישיר או מספריים קפיציים כדי להפריד את רקמת החיבור כדי להסיר את הריאות מבית החזה.
    2. לנתח את כלי היתווה באזור, כמו גם את הוושט.
    3. חותכים דרך המנובריום סטרני כדי להרחיב את החזה המהודרת לכיוון צינורית קנה הנשימה, ומשחררים את קנה הנשימה משני הצדדים מרקמות חיבור.
    4. עכשיו, לכרות את קנה הנשימה מעל צינור קנה הנשימה. משכו בעדינות את הצינורית בציר קרניובודאלי כאשר הקיבעון של קנה הנשימה והריאות נפלט.
  8. קנוניציה:
    1. הרימו את הריאות המבודדות מחוץ לבית החזה והניחו אותן בזהירות על גזה סטרילית על צלחת פטרי.
    2. כדי למנוע אטאלקתזיס, יש לאוורר את הריאות באמצעות אוורור בלחץ חיובי עם לחץ חיובי של תפוגת קצה (PEEP) שנקבע על 2 ס"מH2O.
    3. הסר את החדרים על ידי חיתוך אותם את הלב ברמה של חריץ atrioventricular.
    4. לאחר פתיחת שני החדרים, להציג את צינורית עורק הריאות OD 4.6 מ"מ עבור הארנב עם סל דרך עורק הריאות ולהציג את צינורית אטריום שמאל OD 5.9 מ"מ עבור הארנב עם הסל דרך שסתום מיטרלי לתוך האטריום השמאלי.
    5. השתמש תיל משי 4-0 בעורק הריאות והשאיר אטריום כדי לתקן את הצינוריות. כלול את הרקמות שמסביב קשירה של עורק הריאות ואטריום שמאל כדי למנוע את distension של מבנים אלה.
    6. הזריק 250 מ"ל של תמיסת תמיסת מלח איזוטונית דרך הצינורית העורקים כדי לשטוף את הדם הנותר ממיטת כלי הדם.

3. טכניקת זלוף.

  1. ההתקנה:
    1. מניחים את הריאות המבודדות בזהירות לתוך תא הריאות.
    2. חבר את קנה הנשימה למשתנה על מכסה התא.
    3. חבר את כלי השיט המנוצלים למערכת ההזדווגות.
    4. סגור את התא ותאבטח אותו עם המנעול הסיבובי.
      הערה: מעגל הזלוף המחודש מורכב ממאגר ורידים פתוח, משאבה פרייסטלית, מחליף חום ומלכודת בועה.
    5. בשלב זה, חבר את מכסה התא ולעבור מעל stopcock לעבור חיובי אוורור לחץ שלילי. כדי לבדוק את אוורור הלחץ השלילי של הריאות וסגירה אטומה של התא, בדוק את טיול הנשימה של לחץ הריאות והתא על מד הלחץ.
    6. לחדיר את הריאות עם 200 מ"ל של זלוף מלאכותי ללא דם (מאגר ביקרבונט קרבס-רינגר המכיל 2.5% אלבומין בקר).
    7. התחל את זרימת זלוף ב 3 מ"ל / דקה / קילוגרם, ולאחר מכן לאט להגביר את הזרימה על פני תקופה של 5 דקות ל 5 מ"ל / דקה / קילוגרם. להגיע לזרימה של 8 מ"ל / דקה / קילוגרם במהלך 5 הדקות הבאות ולאחר תקופה נוספת 5 דקות להגיע שטף מקסימלי של 10 מ"ל / דקה / קילוגרם. שמור על הימנעות מאוויר מלהיכנס למעגל.
      הערה: לשמור על ה- pH ועל הטמפרטורה של זלוף בטווחים פיזיולוגיים (pH 7.4-7.5; טמפרטורה, 37 °C(38 °F) כדי להתאים את ה- pH, הוסף NaHCO3 (1N) או הגדל את זרימת הפחמן הדו-חמצני. לחלופין, השתמש HCl (0.1N) כדי חומצה.
  2. פרמטרים:
    1. בדוק אם הפרמטרים שנקבעו מראש של זלוף ואוורור מוגדרים כנדרש.
    2. לאוורר את הריאות עם אוויר לח בתדר של 30 bpm, נפח גאות ושפל של 10 מ"ל / קילוגרם, ולחץ תפוגה קצה (Pe) של 2 cmH2O.
      הערה: לחץ עורקי ריאתי (0-20 מ"מ כ"ג) מתאים לגובה רמת הנוזל בחמצן או במאגר בסנטימטרים מעל תא המטען הריאתי, בעוד לחץ ורידים ריאתי מתאים לגובה תא שיווי משקל הלחץ מעל האטריום השמאלי. ניתן לשנות את שני הערכים. שים לב כי לחץ אטריום שמאל הוא גם 0-20 מ"מ כ"ג.
  3. השגת תנאי אזור 3:
    1. השתמש בשני הצנתרים המחוברים ליציאות הצדדיות של הצינורית המאובטחות בעורק הריאות, אטריום שמאלי ומתמרי לחץ כדי למדוד את הלחצים העורקיים (Pa) והווריים (Pv).
    2. הגדר את הלחצים הבסיסיים ברמת hilum הריאות (אפס הפניה).
    3. לערוך את הניסויים בתנאי אוורור באזור 3. כדי להשיג זאת, לחכות 10-15 דקות כדי להשיג שיווי משקל המאופיין במצב איזוגרבימטרי.
    4. ודא כי הלחץ ורידים גבוה יותר מאשר הלחץ המכתשי (Palv) ואת הלחץ העורקי נשאר גבוה יותר מאשר שניהם (Pa > Pv > Palv) עבור תנאי אזור 3 להתרחש.
    5. ודא כי משקל הריאות נשאר קבוע ועורקי ולחצי עזיבות שמאל יציבים כדי להשיג תנאי אזור 3 כדי לפתוח מספר מרבי של כלי ריאות ולשמור על תוכן המיטה microvascular במהלך הניסוי.
      הערה: המדידה של Kfc כאינדיקטור לבצלת ריאות אין וריאציה בין מערכת הידנית למערכת זלוף אוטומטית.
  4. שליטה אלקטרונית ועיבוד אותות: ודאו כי זרימת הנשימה, שינויי משקל, לחץ מיקרו-וסקולרי, נפח גאות ושפל, התנגדות כלי דם, בין היתר, רשומים ביחידת אלקטרוניקה מרכזית מרובה המשלבת אותות המגיעים מהמתמרים ומציגה אותם במערכת ההערכה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מערכת זלוף הריאות המבודדת מאפשרת מניפולציה של איברים לביופסיה, איסוף דגימות מזלוף ואיסוף נתונים בזמן אמת של פרמטרים פיזיולוגיים. המערכת המבודדת יכולה לשמש לבדיקת השערות רבות המערבות פונקציות שונות ותופעות ריאות, מפעילות מטבולית ואזיזמטית ועד להיווצרות בצקת ותקופות שימור להשתלות ריאות.

איור 1 מציג תרשים של מערכת זלוף הריאות המבודדת שהורכבה במלואה יחד עם מערכת האוורור ורכישת הנתונים המחושבים. רכיב ההזנקה של המערכת מבטיח כי זלוף זורם כל הזמן דרך הריאות המבודדות. עורק הריאות הוא cannulated כדי לספק זלוף זרימה, בעוד זרימה זלוף מסופק על ידי cannulating את האטריום השמאלי של הלב. החלחול מועבר באמצעות משאבת הרולר כך שזלוף עובר דרך מחליף החום, ואז דרך מלכודת הבועה לתוך עורק הריאות, ולבסוף לתוך מיטת כלי הדם של הריאות. רכיב האוורור של המערכת מאפשר למדיום האוורור לזרום כל הזמן מעבר לקצה הדיסטלי של מד הפנומוטצ'ומטר ישירות דרך צינורית קנה הנשימה לתוך הריאות.

איור 2 מראה את הריכוז של מאו (איור 2A) ו-5-HT (איור 2B) בריאה מבודדת שנשמרה ב-4 °C (5 °F) עד 24 שעות. רמות סרוטונין ומונואמין אוקסידאז נקבעו מדגימות נוזל תוך וסקולרי שהושגו בזמנים שונים ונותחו על ידי ELISA. ריכוז 5-HT הגיע לשיא לאחר 15 דקות של שימור ולאחר מכן ירד במהלך 6 השעות הבאות. לאחר מכן, רמות זלוף הראו עלייה לא משמעותית סטטיסטית עד השעה ה - 24. רמות MAO הראו התנהגות דומה, לשיא לאחר 15 דקות של שימור, ולאחר מכן ירידה במהלך שש השעות הבאות עד השעה 2412. איור 3 מציג שיעורי שחרור של 5-HT ו-MAO, המתבטאים כאחוז מהערך ההתחלתי, הנמדדים עד 24 שעות בהכנת ריאות מבודדת במהירות של 4 °C (5 °F). במהלך השעה הראשונה של שימור, רמות 5-HT עלו גבוה יותר מאשר MAO וירד בתוך 6 שעות לאחר שנלכד מחדש על ידי תאי אנדותל וטסיות דם, כמו גם קטבוליזם מתווך MAO12.

איור 4 מראה NEP (צפיפות אופטית/חלבון מ"ג/דקה), ופעילות אנזימטית של ACE (צפיפות אופטית/חלבון מ"ג/דקה) לאורך זמן בהכנת ריאות מבודדת. פעילות NEP (איור 4A) נקבעה על ידי ניתוח ספקטרופוטומטרי באמצעות N-Dansyl-D-Ala-Gly-pnitro-Phe-Gly כמצע NEP ואחריו תוספת enalapril לעכב ACE. פעילות ACE (איור 4B) נקבעה על ידי ניתוח ספקטרופוטומטרי באמצעות enalapril כמצע ACE, ואחריו תוספת זרחן לעכב NEP. מאז שני הפתרונות הכילו enalapril, פעילות ACE חושב כמו ההבדל פלואורסצנטיות בין דגימות עם ובלי enalapril13.

איור 5 מראה את ההשפעה של שימור ריאתי על חדור נימים (mKfc) לאורך תקופה של 24 שעות במערכת זלוף הריאות המבודדת במודל הארנב. קבוצת ביקורת (n = 6), מוערכת מיד לאחר הקציר, היה mKfc של 2.8 ± 0.8 (mL / min / cmH2O / g) שגיאה סטנדרטית, לעומת זאת, הריאה perfused סבלה עלייה הדרגתית על mKfc ניקוד 7.5 ± 1.4 (n = 6) ב 6 שעות, 10.8 ± 2.3 (n = 6) ב 12 שעות והגיע 16.3 ± 2.5 (n = 6) לאחר 24 שעות של שימור13.

איור 6 מראה את ההשפעה של תוספים שונים על החדרות הנימית של מערכת זלוף הריאות המבודדת בתנאים מגוונים. תוספת לחץ פתאומית של 10 cmH2O נוצרת על ידי חסימה חלקית של היציאה ורידים כדי למדוד את החלחיבות של המיטה נימית דרך מקדם סינון נימי (Kfc). כדי למדוד את ה- Kfc, הצינורות שיוצאים מהחיק השמאלי למאגר קרבס היו מהודקים חלקית. לאחר מכן, המלחציים החלקיים נשמרו במשך 3 דקות כדי לוודא כי תוספת הלחץ הגיעה 10 cmH2O. המהדק שוחרר, והזרימה הרגילה נמשכה. תמרון זה נרשם כהגדלה של הלחץ העורקי והגדלת משקל הריאות. פרמטר אחרון זה נחשב ל- Kfc.

Figure 1
איור 1: תרשים עבור מערכת זלוף הריאות המבודדת. נתון זה שונה מהוגו זקס אלקטרוניק (HSE), מנגנון הרווארד14. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ריכוז הסרוטונין (5-HT) ומונואמין אוקסידאז (MAO) המעורבים בחילוף החומרים של הריאות ובחדירה לכלי הדם. הריכוז של (A) MAO ו-(B) 5-HT בריאה מבודדת שנשמרה ב-4 מעלות צלזיוס עד 24 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: שיעורי שחרור של סרוטונין (5-HT) ומונואמין אוקסידאז (MAO). שיעורי השחרור של 5-HT ו- MAO, המתבטאים כאחוז מהערך ההתחלתי, נמדדים עד 24 שעות בהכנת ריאות מבודדת ב 4 °C (70 °F).

Figure 4
איור 4: פעילות אנזימטית של אנדופטידאז נייטרלי (NEP) ואנזים הממיר אנגיוטנסין (ACE). פעילות אנזימטית של (A) NEP ו- (B) ACE לאורך זמן בריאה מבודדת שנשמרה ב 4 °C (50 °F) עד 24 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: השפעת שימור הריאות בחרחול נימי (mKfc). הנתונים מראים את ההשפעה של שימור ריאתי על חדור נימים (mKfc) על ידי תקופה של 24 שעות במערכת זלוף הריאות המבודדת במודל הארנב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: השפעת תוספים שונים על חמיקות נימים. ההשפעה של תוספים שונים בחמיצה נימית של מערכת זלוף הריאות המבודדת בתנאים מגוונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עבודה זו מציגה מבט כללי על מערכת זלוף הריאות המבודדת, טכניקה חיונית במחקר פיזיולוגיה ריאתית. מערכת זלוף הריאות המבודדת מציעה מידה רבה של רב-תכליתיות בשימושיה ומאפשרת הערכה של מספר פרמטרים רלוונטיים בבדיקת מגוון רחב של השערות15. מערכת ריאות מבודדת היא כלי בעל נוכחות כלל עולמית, שבעשור האחרון ביססה עוד יותר את הרלוונטיות שלה להערכות ספציפיות לאיברים וגם הרחיבה את התועלת שלה כהרחבה של טכנולוגיות חדשניות טיפולים חדשניים הכוללים תאי גזע מזנכימליים16 ו- CRISPR/Cas9 הנדסת גנום17, בין היתר. אזורי מחקר זלוף ריאות ex vivo הנוכחי לכסות באופן נרחב אסטרטגיות אנטי דלקתיות, ניהול ומניעת פציעות אוורור, טיפול נגד דחייה, וביצועי בצקת נגד ריאות15.

הרכבה נכונה של המנגנון נדרשת כדי להבטיח זיכרון נתונים נכון. כפי שניתן לראות באיור 1 , המערכת כולה מורכבת מתא רטוב בלחץ שלילי המחובר למערכת אוורור וממערכת זלוף המחקה את תפקודי הנשימה ומחזור הדם של הריאות, בהתאמה. שתי המערכות מחוברות למערכת רכישת נתונים המאפשרת הוספת התקני מדידה שניתן להתאים לצרכים של כל פרוטוקול. התהליך הכירורגי של קציר בלוק קרדיו-ריאתי צריך להתבצע במהירות, רצוי על ידי כוח אדם מנוסה, כדי למנוע פגיעה נוספת ברקמות כדי לשמור על הריאה שלמה ככל האפשר, כך הפונקציה הפיזיולוגית יכולה להמשיך ללא הפרעה נוספת במהלך הניסוי. המערכת מאפשרת גם איסוף דגימת זלוף בזמן אמת שניתן להשתמש בו כדי לקבוע את ההשפעה של מולקולות מסוימות בתפקודי ריאות שונים (למשל, אפקט הפרין על שימור הריאות).

על מנת להשיג התפלגות נאותה של זרימת זלוף בין כלי ריאות, כלומר נימים, תנאי אזור 3 יש להשיג. תנאי אזור 1 מוגדרים כאזור שבו הלחץ העורקי יורד מתחת ללחץ המכתמי, בדרך כלל מתקרב ללחץ אטמוספרי. כאשר זה קורה, נימים לשטח, מה שהופך את זרימת הדם או זלוף בלתי אפשרי. בנסיבות רגילות אזור 1 לא יכול להתקיים מאז לחץ עורקי מספיק כדי להבטיח התפלגות זרימה. עם זאת, תנאי אזור 1 יכולים להופיע אם לחץ העורקים יורד, או לחץ מכתם עולה (כפי שהוא עושה במהלך אוורור לחץ חיובי). תנאי אזור 1 מובילים לריאה מאווררת לא מאווררת שלא מסוגלת לבצע החלפת גז. באזור 2 תנאים, לחץ עורקים גבוה יותר מאשר לחץ מכות. עם זאת, הלחץ הוורי נשאר מתחת ללחץ המכתשי וכתוצאה מכך זרימת זלוף נקבע על ידי ההבדל בין לחצים עורקיים ומכתשיים. התנהגות זו יכולה להיות מודל באמצעות נגד סטרלינג. תנאי אזור 3 נקבעים על ידי ההבדל בין לחצים עורקיים ורידיים. העלייה בזרימת זלוף באזור 3 מתרחשת כי נימים נפיץ, מיזוג הפתיחה של מספר מרבי של כלי ריאות.

יחידת המערכת מורכבת משבעה מודולים: שני מודולי מגבר מתמרים אנלוגיים (TAM-A) המצוידים באות גרף מוט LED אנלוגי לניטור אותות דינמיים (לחץ דם, זרימת אוויר נשימתית, כוח התכווצות וכו '), מודול מגבר מתמר דיגיטלי אחד (TAM-D) עם תצוגה מספרית דיגיטלית המיועדת לנטר אותות פועמים המשתנים באיטיות; בקר סרוו עבור מודול זלוף (SCP) שעובד יחד עם מגפי TAM-A ו- TAM-D לשליטה זלוף של זלוף איברים מבודדים באמצעות המשאבה הפרייסטלטית, מהירות המשאבה יכולה להיות מוגדרת במצב לחץ קבוע או נשלטת באופן ידני באמצעות SCP; מודול איזון בצקת (EBM) המודד משקל ריאות; מודול בקרת אוורור (VCM) לשליטה באוורור לחץ חיובי ושלילי, ומודול מונה טיימר (TCM) שניתן להגדיר כדי להפעיל את ה- VCM לביצוע מחזורי השראה עמוקים.

השכיחות העולמית הגבוהה של חיבה ריאתית ונשימה והמגבלות של האפשרויות הטיפוליות הנוכחיות מאלצות ביקוש גדול יותר להשתלות ריאות, שכן הוא נשאר הטיפול הסטנדרטי בזהב לחולים עם מחלת ריאות סופנית18. מערכת זלוף הריאות ex-vivo מייצגת פלטפורמה מצוינת לבדיקת טיפולים ממוקדים במחקר בסיסי וקליני כאחד. ברמה הקלינית, מערכת זלוף ex-vivo יכול לשמש כדי להעריך רקמת השתל מחוץ לגוף, המאפשר לבדוק את האיבר המבודד לפני ההשתלה, עוזר לאסוף נתונים קליניים עבור פרוגנוסטי מדויק יותר על האפקטיביות של ההשתלה. שימוש רציונלי במערכת זלוף הריאות המבודדת יכול לעזור לייעל את ניתוח השתלת הריאות, ולהפוך אותם להליך בטוח ואלקטיבי יותר. מודל הריאות המבודד שימושי גם במחקר הבסיסי של טכניקות אבחון וטיפול מתקדמות כגון הטמעת תאי גזע מזנכימליים וטיפולים אחרים בתיווך מערכת החיסון; דיווחים רבים הראו את הפוטנציאל של טכניקת זלוף ex-vivo כפלטפורמה לעשות מחקר נוסף על שימור ריאות בפיתוח טכניקות כדי למנוע פגיעה איסכמיה-reperfusion ובצקת ריאות, הארכת הכדאיות איברים15. כמה שלבים לפתרון בעיות ומגבלות הקשורות למודל הריאות המבודד הם בעיקר הזמן הזמין הקצר של טכניקה זו עבור דור בצקת אפשרי המושרה על ידי הגבלת ניקוז לימפתית, כמו גם את ההשפעה המערכתית של הטכניקה. קביעת מקדם סינון נימי (Kfc) היא קריטריון אמין למדידת הפונקציונליות של רקמת ריאות שהשתמרה ולקבוע את היקף בצקת לאורך זמן. לא נמצא הבדל בין הקביעות הידניות והאוטומטיות של Kfc19.

ככל שהשימוש במערכת זלוף הריאות המבודדת הופך לפופולרי וטיפולים חדשים משנים את הנוף הקליני, טכניקת ההשפלה ex-vivo הופכת לבחירה אלקטיבית כדי לשפר את תוצאות המטופלים בפתולוגיות ריאות שונות, כמו גם להגדיל את מאגר תורמי הריאות הפוטנציאליים מבלי להתפשר על בטיחות המטופלים, ומבטיח עידן חדש בשימור ריאתי והשתלת ריאות. הופעתה של מגפת Covid-19 והעלייה בשכיחותו של COPD18,20 באוכלוסייה העולמית מדגישים את הצורך במחקר בסיסי נוסף על פיזיולוגיה ריאתית, שימור ריאתי והשתלת ריאות, כמו גם מחקר פרה-אקליני של טיפולים חדשניים עם השקפות לרפואה תרגומית. יתר על כן, מודל ארנבת vivo לשעבר הוא מודל נגיש ומעשי להכשרת תושבים וסטודנטים בתחום הריאות, במיוחד אלה המעורבים בניתוחי חזה ואקמו. כל מעבדה המעורבת בפרוטוקולי מחקר נשימתיים או בית החזה מעודדת לשקול את מערכת זלוף הריאות המבודדת כחלק מהכלים היומיומיים שלהם לניסויים שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לדוקטורט בטינה זומר סרוונטס על תמיכתה בכתיבת כתב היד הזה, וקיציה אלנה לארה ספונט על תמיכתה באיורים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-1864
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4312
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4312
Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4309
Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4138
Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder sigma 3912 500 g
Calcium chloride, CaCl2·2H2O. JT Baker 10035-04-8
Cryogenic vials Corning 430659 2 mL
D-glucosa, C6H12O6. sigma G5767
Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-3882
Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-0064
Eppendorf tubes
Ethanol absolute HPLC grade Caledon
Falcon tubes 14 mL
Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) Hugo Sachs Elektronik (HSE) 70-7001
Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range Hugo Sachs Elektronik (HSE) 59-9349
Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz Hugo Sachs Elektronik (HSE) 59-9703
Heparin PISA 5000 UI
HPLC Column (C18 100A 5U) Alltech 98121213 150 mm x 4.6 mm
Hydrophilic Syringe Filter Millex SLLGR04NL 4 mm
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4296
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4296
Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-0322
Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-0125
Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4162
Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-0020
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O JT Baker 10034-99-8
Microcentrifuge Tube Corning 430909
Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4298
New Zeland rabbits
PISABENTAL (Pentobarbital sodium) PISA Q-7833-215
PLUGSYS Case, Type 603* 7 Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-0045
PLUGSYS TCM Time Counter Module Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-1750
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-0065
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-1793
PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-1755
Potassium chloride, KCl. JT Baker 3040-01
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 JT Baker 7778-77-0
PROCIN (Xylacine clorhydrate) PISA Q-7833-099
Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4161
Scalpel knife
Serotonin 5-HT
Servo Controller for Perfusion (SCP Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-2806
Snap Cap Microcentrifuge Tube Costar 3620 1.7 mL
Sodium bicarbonate, NaHCO3 sigma S6014
Sodium chloride, NaCl. sigma S9888
Surgical gloves No. 7 1/2
Surgical gloves No. 8
Taygon tubes Masterflex
Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4163

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dixon, W. E. Contributions to the physiology of the lungs: Part I. The bronchial muscles, their innervation, and the action of drugs upon them. The Journal of Physiology. 29 (2), 97-173 (1903).
  2. Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
  3. Roman, M. A., Nair, S., Tsui, S., Dunning, J., Parmar, J. S. Ex vivo lung perfusion: a comprehensive review of the development and exploration of future trends. Transplantation. 96 (6), 509-518 (2013).
  4. Delaunois, A., Gustin, P., Ansay, M. Multiple muscarinic receptor subtypes mediating pulmonary oedema in the rabbit. Pulmonary Pharmacology. 7 (3), 185-193 (1994).
  5. Delaunois, A., Gustin, P., Vargas, M., Ansay, M. Protective effect of various antagonists of inflammatory mediators against paraoxon-induced pulmonary edema in the rabbit. Toxicology and Applied Pharmacology. 132 (2), 343-345 (1995).
  6. Barr, H. A., Nicholas, T. E., Power, J. H. Control of alveolar surfactant in rats at rest and during prolonged hyperpnoea: pharmacological evidence for two tissue pools of surfactant. British Journal of Pharmacology. 93 (3), 473-482 (1988).
  7. Machuca, T. N., Cypel, M. Ex vivo lung perfusion. Journal of Thoracic Disease. 6 (8), 1054-1062 (2014).
  8. Steen, S., et al. First human transplantation of a nonacceptable donor lung after reconditioning ex vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (6), 2191-2194 (2007).
  9. Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
  10. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. New England Journal of Medicine. 364 (15), 1431-1440 (2011).
  11. Kao, C. C., Parulekar, A. D. Is perfusate exchange during. Annals of Translational Medicine. 8 (3), 43 (2020).
  12. Alquicira-Mireles, J. Participación de la serotonina en los cambios de permeabilidad vascular en la preservación pulmonar en conejo. , Universidad Nacional Autónoma de México. Biología thesis (2013).
  13. Arreola-Ramírez, J. L. Papel de la liberación de acetilcolina y sustancia P en el deterioro de la función pulmonar en un modelo experimental de preservación pulmonar en conejo. , Universidad Nacional Autónoma de México. Doctorado en Ciencias Biomédicas thesis (2009).
  14. Isolated lung perfusion systems for small to large animal models. Harvard Apparatus. Hugo Sachs Elektronik (HSE). , Available from: https://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Isolated%20Lung%20Perfusion%20Systems%20Brochure.pdf (2021).
  15. Jiao, G. Evolving trend of EVLP: Advancements and emerging pathways. SN Comprehensive Clinical Medicine. 1 (4), 287-303 (2019).
  16. Mordant, P., et al. Mesenchymal stem cell treatment is associated with decreased perfusate concentration of interleukin-8 during ex vivo perfusion of donor lungs after 18-hour preservation. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1245-1254 (2016).
  17. Cowan, P. J., Hawthorne, W. J., Nottle, M. B. Xenogeneic transplantation and tolerance in the era of CRISPR-Cas9. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (1), 5-11 (2019).
  18. Collaborators, G. C. R. D. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
  19. Bravo-Reyna, C. C., Torres-Villalobos, G., Aguilar-Blas, N., Frías-Guillén, J., Guerra-Mora, J. R. Comparative study of capillary filtration coefficient (Kfc) determination by a manual and automatic perfusion system. Step by step technique review. Physiological Research. 68 (6), 901-908 (2019).
  20. Pereira, M. R., et al. COVID-19 in solid organ transplant recipients: Initial report from the US epicenter. American Journal of Transplantation. 20 (7), 1800-1808 (2020).

Tags

רפואה גיליון 173 מערכת זלוף מודל ארנב ניתוח ריאתי טכניקה פיזיולוגיה שימור ריאות בצקת
מערכת זלוף ריאות מבודדת במודל הארנב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pacheco-Baltazar, A.,… More

Pacheco-Baltazar, A., Arreola-Ramírez, J. L., Alquicira-Mireles, J., Segura-Medina, P. Isolated Lung Perfusion System in the Rabbit Model. J. Vis. Exp. (173), e62734, doi:10.3791/62734 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter