Summary
Här beskriver vi ett optimerat protokoll för retinal venocklusion med hjälp av rose bengal och ett laserstyrt retinalt avbildningsmikroskopsystem med rekommendationer för att maximera dess reproducerbarhet i genetiskt modifierade stammar.
Abstract
Musmodeller av retinal venocklusion (RVO) används ofta i oftalmologi för att studera hypoxisk-ischemisk skada i neural näthinna. I denna rapport ges en detaljerad metod som pekar ut kritiska steg med rekommendationer för optimering för att uppnå konsekvent framgångsrika ocklusionshastigheter över olika genetiskt modifierade musstammar. RVO-musmodellen består huvudsakligen av intravenös administrering av ett fotosensibiliserande färgämne följt av laserfotokoagulering med hjälp av ett retinalt bildmikroskop fäst vid en oftalmisk guidad laser. Tre variabler identifierades som determinanter för ocklusionskonsistens. Genom att justera väntetiden efter administrering av rose bengal och balansera baslinjen och experimentell laserutgång kan variationen mellan experiment begränsas och en högre framgångsgrad för ocklusioner uppnås. Denna metod kan användas för att studera retinala sjukdomar som kännetecknas av retinalt ödem och hypoxisk-ischemisk skada. Dessutom, eftersom denna modell inducerar vaskulär skada, kan den också tillämpas för att studera neurovaskulatur, neuronal död och inflammation.
Introduction
Retinal venocklusion (RVO) är en vanlig retinal kärlsjukdom som drabbade cirka 28 miljoner människor världen över 20151. RVO leder till synnedgång och förlust hos vuxna i arbetsför ålder och äldre, vilket representerar en pågående synhotande sjukdom som beräknas öka under det närmaste decenniet. Några av de distinkta patologierna för RVO inkluderar hypoxisk-ischemisk skada, retinalt ödem, inflammation och neuronal förlust2. För närvarande är den första behandlingslinjen för denna sjukdom genom administrering av vaskulära endoteltillväxtfaktor (VEGF) -hämmare. Medan anti-VEGF-behandling har hjälpt till att förbättra retinalt ödem, står många patienter fortfarande inför synnedgång3. För att ytterligare förstå patofysiologin för denna sjukdom och för att testa potentiella nya behandlingslinjer finns det ett behov av att skapa ett funktionellt och detaljerat RVO-musmodellprotokoll för olika musstammar.
Musmodeller har utvecklats med samma laseranordning som används hos mänskliga patienter, parat med ett bildsystem skalat till rätt storlek för en mus. Denna musmodell av RVO rapporterades först 2007 4 och fastställdes vidare av Ebneter och andra 4,5. Så småningom optimerades modellen av Fuma et al. för att replikera viktiga kliniska manifestationer av RVO såsom retinalt ödem6. Sedan modellen först rapporterades har många studier använt den med administrering av ett fotosensibiliserande färgämne följt av fotokoagulering av stora retinala vener med en laser. Mängden och typen av färgämnet som administreras, lasereffekt och exponeringstid varierar dock avsevärt mellan studier som har använt denna metod. Dessa skillnader kan ofta leda till ökad variabilitet i modellen, vilket gör det svårt att replikera. Hittills finns det inga publicerade studier med specifika detaljer om potentiella vägar för optimering.
Denna rapport presenterar en detaljerad metodik för RVO-musmodellen i C57BL/6J-stammen och en tamoxifeninducerbar endotelial kaspas-9-knockoutstam (iEC Casp9KO) med en C57BL/6J-bakgrund och av relevans för RVO-patologi som referensstam för en genetiskt modifierad mus. En tidigare studie hade visat att icke-apoptotisk aktivering av endotelkaspas-9 initierar retinalt ödem och främjar neuronal död8. Erfarenhet av att använda denna stam hjälpte till att bestämma och ge insikt om potentiella modifieringar för att skräddarsy RVO-musmodellen, som kan vara tillämplig på andra genetiskt modifierade stammar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) uttalande för användning av djur i oftalmisk och synforskning. Gnagare experiment godkändes och övervakades av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Columbia University.
OBS: Alla experiment använde två månader gamla hanmöss som vägde cirka 20 g.
1. Beredning och administrering av tamoxifen för inducerbar genetisk ablation av flakade gener
OBS: Retinal kärldiameter kan påverkas av djurets vikt. Se till att alla djur som används för ett försök har samma vikt.
- Späd tamoxifen i majsolja till en koncentration av 20 mg / ml.
OBS: Tamoxifen är ett giftigt ämne och är ljuskänsligt. Skydda mot ljus, t.ex. med aluminiumfolie. - Vortex lösningen i några sekunder.
- Låt stå i ugnen på 55 °C i 15 min.
OBS: Se till att tamoxifen har löst sig helt. Ytterligare virveling kan vara nödvändig. - Förvara lösningen vid 4 °C i upp till 1 vecka.
- Använd en 1 ml spruta utrustad med en 26 G nål för tamoxifen injektion. Rengör injektionsområdet med 70% etanol. Administrera 2 mg tamoxifen (100 μl 20 mg/ml) intraperitonealt (IP) en gång dagligen under den fastställda tiden enligt den specifika inducerbara Cre-linjen.
- Tillåt två dagars vila för djuren innan försöken påbörjas.
2. Beredning av reagens för laserfotokoagulering
- Rose bengal
OBS: Rosenbengal är ljuskänslig. Förvara i mörker tills användning och förbered dig fräsch för bästa resultat.- Bered rosbengal genom att späda den till 5 mg/ml i steril saltlösning och filtrera den genom ett 0,2 μm sprutfilter.
- Förbered en 1 ml spruta försedd med en 26 G nål med rosenbengal.
- Ketamin / xylazin
- Späd ketamin och xylazin i steril saltlösning i enlighet med detta för följande koncentrationer: ketamin (80-100 mg/kg) och xylazin (5-10 mg/kg).
- Karprofen
- Späd karprofen till 1 mg/ml i steril saltlösning.
- Förbered en 1 ml spruta utrustad med en 26 G nål med karprofen.
- Steril saltlösning
- Bered en 5 ml spruta försedd med en 26 G nål med steril saltlösning.
3. Laserinställning
- Hantera försiktigt den fiberoptiska kabeln och anslut den till laserkontrollboxen och laseradaptern i retinalbildmikroskopet.
- Slå på lampboxen för retinal bildmikroskop.
- Slå på datorn och öppna bildprogrammet.
- Justera vitbalansen genom att använda ett vitt papper och placera det framför musokularet och klicka på Justera i bildprogrammet.
- Slå på laserkontrollboxen genom att vrida på nyckeln och följa instruktionerna på laserkontrollboxens skärm.
OBS: Lasern som används i detta experiment är klass 3B och kan orsaka ögonskador. Använd skyddsglasögon när du använder lasern. - Kontrollera baslinjens lasereffekt.
- Använd en lasereffektmätare.
- Justera skärmen på laserkontrollboxen till följande parametrar: 50 mW och 2 000 ms.
- Slå på lasern och placera effektmätaren framför okularet.
OBS: Se till att mikroskoplampan är släckt när du testar baslinjens lasereffekt. - Tryck på fotbrytarpedalen för att aktivera lasern.
- Sikta på att lasereffektavläsningen ska vara 13-15 mW.
OBS: Lasereffektavläsningen bestämmer framgångsgraden för retinala venocklusioner. Om lasereffektavläsningen är för låg kan justeringar göras av laserexponeringens effekt och tid. Se tabell 1 för rekommendationer.
- Justera den experimentella lasereffekten genom att ställa in skärmen på laserkontrollboxen för följande parametrar: 100 mW, 1 000 ms.
- Stäng av lasern.
OBS: För säkerhet och för att förhindra överhettning är det bäst att hålla lasern avstängd mellan möss.
4. Mussvansveninjektion av rosbengal
- Häll 300 ml vatten i en 500 ml bägare.
- Värm bägaren i mikrovågsugn i 1 min.
- Sätt gasväv i varmt vatten i bägaren.
- Sätt musen i en fasthållare.
- Tryck försiktigt gasbindningen i mussvansen och leta efter de dilaterade venerna. Desinficera injektionsstället med en spritservett efter varmvattenutvidgningen.
- För in nålen på injektionsstället och dra i sprutan för att säkerställa att du är i venen. Injicera sedan mussvansvenen och administrera rätt mängd beroende på djurets vikt (37,5 mg/kg). Tryck på injektionsstället för att undvika hematom eller blödning. Torka av webbplatsen.
- Släpp musen från fasthållaren och sätt tillbaka den i buret.
- Låt 8 minuter för rosbengalen att cirkulera före injektion av bedövningsmedel.
OBS: Detta ger totalt 10 minuter mellan rosbengalinjektionen och laserbestrålningen.
5. Ocklusion av större vener
- Slå på den uppvärmda musplattformen.
- Tillsätt en droppe fenylefrin och tropikamid i varje öga.
- Injicera 150 μL av anestetika, ketamin (80-100 mg/kg) och xylazin (5-10 mg/kg) IP.
Under denna procedur fick musen två IP-injektioner. Därför alternerades sidorna. IP-injektionen för anestesin gavs i den nedre högra bukkvadranten, och saltlösningen injicerades intp den nedre vänstra bukkvadranten. Vi rekommenderar att du drar i sprutan före injektion för att säkerställa att nålen är i buken och inte i några organ. - Tå-nypa djuret för att bestämma djupet av anestesi och vänta tills det inte svarar.
- Tillsätt en droppe proparakainhydroklorid per öga (smärtstillande).
- Tillsätt gelsalva till båda ögonen.
- Injicera 150 μL karprofen subkutant mellan öronen.
- Rymma musen på plattformen.
- Justera plattformen tills vyn av retinal fundus är tydlig och fokuserad.
- Räkna näthinnans vener och ta en bild av fundus.
OBS: Retinala vener är mörkare och bredare än artärer. Vener och artärer alternerar; Men ibland kan det finnas en grenad artär nära synnerven, och därför två intilliggande artärer. - Slå på lasern och sikta mot en näthinneven cirka 375 μm från optisk skiva.
- Bestråla kärlet genom att trycka på fotbrytaren och lätt flytta laserstrålen upp till 100 μm. Upprepa detta steg tre gånger och flytta laserstrålen efter varje puls så att bestrålningen inte fokuseras på ett ställe.
- Upprepa bestrålning på andra större fartyg för att uppnå 2-3 ocklusioner.
6. Fastställa antalet vener som är ockluderade vid dag 0
- Stäng av lampan efter bestrålning av kärlen och vänta i 10 minuter.
OBS: Ljusexponering kan orsaka näthinneskador och inflammation; Stäng av lampan under väntetiden för att minimera exponeringen7. - Slå på lampan igen och räkna antalet ockluderade vener.
- Ta en bild av fundus.
7. Eftervård
- Injicera 1 ml steril saltlösning IP.
OBS: Se information om IP-injektion i avsnitt 5, steg 3. - Tillsätt smörjmedel ögondroppar till båda ögonen.
- Tillsätt gelsalva till båda ögonen.
- Titta på musen när den återhämtar sig från anestesi och återför den inte till buren med de andra djuren förrän den är helt återställd. Karprofen (5 mg/kg) kan ges dagligen upp till 2 dagar efter ingreppet. Om det appliceras på människor är smärta inte ett symptom på RVO.
OBS: Lämna inte djuren utan uppsikt förrän de har återhämtat sig helt från anestesi.
8. Bedömning av retinalt ödem med optisk koherenstomografi (OCT)
OBS: Detta steg kan göras vid utredarens intressanta tidpunkt. Toppen av retinalt ödem för en C57BL / 6J-mus är 1 dag efter RVO-proceduren. Den här tidpunkten kan variera beroende på musens bakgrund.
- Slå på retinal imaging mikroskop ljuslåda, OCT-maskinen och den uppvärmda musplattformen.
- Dagen efter ocklusionen, följ steg 5.2 till 5.7 för att förbereda djuret.
- Öppna bildhanterings- och OCT-programmen.
- I OCT-programmet justerar du knuffen till 5.
- Ta OCT vid 75 μm distal från bränningen eller 4 klick.
- Ta OCT-bilder vid fyra kvadranter av näthinnan.
- Analysera OCT-bilderna med hjälp av spårningsprogramvara.
- Jämför näthinnans tjocklek på förbestrålade mått med 1 dag efter RVO eller vid tidpunkten för intresse.
OBS: När du analyserar data, ta hänsyn till antalet vener som bestrålas eftersom detta kan påverka utvecklingen av retinalt ödem. Djur avlivas sedan genom administrering av bedövningsmedel följt av perfusionskirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RVO-musmodellen syftar till att framgångsrikt uppnå ocklusioner i näthinnans vener, vilket leder till hypoxisk-ischemisk skada, nedbrytning av blodnäthinnebarriären, neuronal död och retinalt ödem8. Figur 1 visar en tidslinje med steg för att säkerställa reproducerbarhet, en schematisk bild av den experimentella designen och skisserar steg som kan optimeras ytterligare beroende på experimentella frågor. De tre huvudstegen som kan modifieras är väntetiden efter rose bengal-administration, baslinjelasereffekten och den experimentella laserutgången. I denna rapport användes C57BL/6J-möss, liksom WT- och KO-kullkamrater från en inducerbar endotelcell caspase-9 knockout-muslinje (iEC Casp9), för att bestämma de optimala inställningarna över olika stammar.
Väntetiden från ros bengal injektion till laserbestrålning kan förändra framgången för fotokoagulering i venerna. För kort väntetid kan resultera i låg rosbengalkoncentration i venerna, medan för lång väntetid kan leda till att rosbengal rensas från näthinnans cirkulation. Båda situationerna kan leda till dålig fotokoagulering och misslyckade ocklusioner. Vid testning av antalet ocklusioner som erhållits omedelbart efter laserbestrålning visade jämförelse av djur som laserades 10 och 20 minuter efter administrering av rosbengal att det inte fanns några skillnader i antalet ocklusioner som uppnåddes (figur 2B). Antalet ocklusioner som kvarstod upp till 1 dag efter RVO minskade dock signifikant hos djur som laserades 20 minuter efter administrering av rosbengal oberoende av genotyp. Detta resultat tyder på att när man studerar akut RVO-inducerad skada kan väntetiden efter administrering av rosbengal påverka ocklusionsstabiliteten. Tidig reperfusion av vener (före 24 timmar efter skada) kan påverka utvecklingen av retinalt ödem och bör därför kontrolleras genom att bestämma rätt väntetid från administrering av Rose Bengal till laserbestrålning.
I princip drivs framgångsrik fotokoagulering som leder till ocklusion av laserkraft. Även om detta är en så viktig del av processen är det också en av de största källorna till variabilitet i modellen och bör optimeras för konsekvens. För att uppnå detta rekommenderas att mäta laserutgången under installationen innan mössen injiceras med rosbengal. Den rekommenderade effekten för baslinjelasereffekten är mellan 13,0 och 15,0 mW. Låg baslinjelasereffekt, såsom 11,5 mW, utan modifiering av experimentell effekt (100 mW), resulterade i inga ocklusioner, som visas i figur 3. Däremot resulterade en baslinjelaserutgång på 13,5 mW med en experimentell effekt på 100 mW i framgångsrika ocklusioner. I de fall där laserutgången var under 13,0 mW ökades experimenteffekten till 110 mW för att uppnå samma framgångsrika ocklusioner som med högre baslinjelaserutgång. Vanligtvis är 100 mW den vanliga experimentella kraften; Om laserutgången är under 13,0 mW kan den dock kompenseras genom att modifiera experimenteffekten med de rekommenderade intervallen i tabell 1.
Fyra huvudtyper av ocklusioner har noterats inträffa efter laser fotokoagulering av venerna. Dessa typer av ocklusioner sammanfattas i figur 4A och har klassificerats enligt mängden blodflöde; helt ockluderade kärl (inget blodflöde), delvis ockluderade kärl (mestadels blockerade med tillfälligt flöde), delvis reperfunderade (oavbrutet stadigt blodflöde med hinder) och helt reperfuserade kärl (ingen uppenbar obstruktion alls). För att undersöka om typerna av ocklusioner förändras beroende på genotypen och bestämma tiden per ocklusionstillstånd utvärderades 10 min videor efter laserbestrålning. Denna bedömning hjälpte till att bestämma att den bestrålade vaskulaturen hos iEC Casp9-möss tillbringar mer tid i delvis reperfunderade och delvis ockluderade tillstånd än C57BL6 / J, som tillbringar mer tid i helt ockluderade tillstånd (figur 4B).
Figur 5 visar hur ocklusionstillståndet hos kärlen förändras snabbt inom de första 10 minuterna efter laserfotokoagulering. När dessa första 10 minuter har passerat stabiliseras ocklusionerna och bibehålls upp till en 24 timmars tidpunkt. För att bedöma det exakta initiala antalet ocklusioner per öga rekommenderas det att vänta i 10 minuter efter bestrålning. En tidigare bedömning av denna modell fastställde att de flesta ocklusioner reperfuserar 8 dagar efter bestrålning8; Emellertid kan frekvensen av ocklusioner som reperfuserar per dag variera beroende på stam och måste bestämmas i varje experimentell modell. Modellen som presenteras här är av akut skada och avsedd att användas för att förstå vägar som leder till ödem, som utvecklas inom 24 timmar efter ocklusioner. En annan egenskap hos RVO är flamformade blödningar, som kan observeras vid 24 timmar efter skada, som visas i figur 5.
Uppföljning vid 24 timmar efter RVO kan avslöja andra oftalmiska patologier som kan uppstå som ett resultat av RVO-metoden. Vissa inkluderar men är inte begränsade till subretinal blödning (kännetecknas av kontinuerlig blodplåster), näthinneavlossning, helt ischemisk näthinna (inget blodflöde i vener och artärer) och grå starr. Figur 6 visar ögonbottenbilder med motsvarande OCT som exempel på dessa utom i ögon där grå starr bildas (figur 6F), eftersom OCT inte kan utföras i närvaro av grå starr. Figur 6A visar exempel på hur en ögonbottenbild och OCT av ett oskadat öga ser ut som referens.
Den huvudsakliga morfologiska patologin för RVO i denna modell är retinalt ödem. För att bedöma nivån av retinalt ödem rekommenderas att du tar OCT-bilder före dagen för RVO-proceduren för en baslinjeavläsning och vid den intressanta tidpunkten. Figur 7 visar OCT-kvantifiering av retinalt ödem i skadade ögon. En annan åtgärd som används för att bestämma tillståndet hos neuronala lager är att bedöma disorganiseringen av retinala inre lager (DRIL). Detta är ett mått som används i den kliniska miljön som representerar kapillär icke-perfusion, ett annat kännetecken för RVO 5,9,10. Ett exempel på denna bedömning finns i figur 7B. Figur 7C visar ett exempel på en OCT-bild med motsvarande etiketter för varje näthinnelager.
Figur 1: Tidslinje och schematisk bild av RVO-musmodellen . (A) Tidslinje för händelser från administrering av rosbengal till avbildning av ockluderade vener. (B) Sammanfattad representation av metoden för att uppnå framgångsrik retinal venfotokoagulation. Röda rutor representerar viktiga steg i processen som är mycket varierande och som kan optimeras per musmodell och fråga av intresse. (C) Retinala större vener (V) är bredare och mörkare jämfört med artärer (A). Varje större ven kommer att bestrålas med en guidad laser på 532 nm, spotstorlek 50 μm, effekt 100 mW, varaktighet 1 s, total energi 0,3 J och strålningsexponering 15278,87 J / cm2, vid ett genomsnittligt avstånd på 375 μm från synnerven. (D) Laserapplicering orsakar en förångningsbubbla synlig vid fundusavbildning på cirka 150 μm och täcker <4% av den totala näthinneytan. Siffror representerar den föreslagna platsen och rörelseriktningen (pilar) för laserstrålen vid bestrålning av kärl. Förkortningar: A = artär; V = ven; ON = synnerv. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Tiden för fotoocklusion i förhållande till administrering av ros bengal är avgörande för framgångsrik fotokoagulation. (A) Fundus retinala bilder av iEC Casp9 WT och iEC Casp9 KO fotoockluderade 10 och 20 minuter efter administrering av Rose Bengal. Vita cirklar representerar vener som hade framgångsrika ocklusioner. (B) Antal ocklusioner omedelbart efter bestrålning (0 timmar) och 1 dag efter bestrålning i 10 min och 20 min efter rosenbengalisk injektion av kombinerade genotyper. Welchs t-test, felstaplar indikerar SEM. (C) Antal ocklusioner åtskilda av genotyp. Tvåvägs ANOVA och Fishers LSD-test; felstaplar indikerar SEM. Förkortningar: WT = vildtyp; KO = knockout; SEM = medelmåttets standardfel; ANOVA = variansanalys; LSD = minst signifikant skillnad; ns = inte signifikant; P-RVO = postretinal venocklusion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Mätning av baslinje och experimentell laserutgång är kritiska steg för framgångsrik fotokoagulering. Fundus retinala bilder av iEC Casp9 WT och iEC Casp9 KO 10 min efter fotokoagulering; Fotoockluderad med olika baslinje- och experimentella laserutgångsnivåer. Laserutgång med låg baslinje kan kompenseras med experimentell laserutgång (12,8 mW, 110 mW). Vita cirklar representerar vener som hade framgångsrika ocklusioner. Förkortningar: WT = wild-type; KO = knockout. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: RVO-metoden resulterar i olika typer av ocklusioner. (A) Ögonbottens retinala bilder av C57BL / 6J, iEC Casp9 WT och iEC Casp9 KO 10 minuter efter fotokoagulering med olika typer av ocklusioner: helt ockluderad, delvis ockluderad, delvis reperfunderad och helt reperfunderad. Infällningar visar en fokuserad bild av en ven som resulterade i en specifik typ av ocklusion efter fotokoagulation. (B) Kvantifiering av procentandelen vener ockluderade i de olika ocklusionstillstånden för varje genotyp under de första 10 minuterna efter bestrålning. Tio minuters videor utvärderades av två utredare, blindade för genotyper, som tilldelade nummer till de olika ocklusionstillstånden (helt ockluderad (-2), delvis ockluderad (-1), helt reperfunderad (2) och delvis reperfunderad (1)) per varaktighet. Förkortningar: RVO = retinal venocklusion; WT = vildtyp; KO = knockout. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Tidslinje för ocklusioner efter RVO. Fundus retinala bilder av C57BL / 6J, iEC Casp9 WT och iEC Casp9 KO 0, 5 min, 10 min och 24 h efter laserbestrålning. De första 10 minuterna är kritiska för ocklusionernas tillstånd och kan förändras snabbt. Efter de första 10 minuterna är ocklusionerna stabila upp till minst 24 timmar. Vita cirklar representerar vener som hade framgångsrika ocklusioner, och gula pilspetsar visar flamformade blödningar. Förkortningar: RVO = retinal venocklusion; WT = vildtyp; KO = knockout. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Olika oftalmiska patologier kan inträffa efter RVO. (A-E) visa ögonbottens näthinnebilder och motsvarande OCT. (A) Ett exempel på ett oskadat öga som inte genomgick RVO-processen. (B) Subretinal blödning som visar blod som läcker ut ur kärlen i fundusbilden. (C) Näthinneavlossning som ses av suddiga veck i fundus och lyft av näthinnan i ULT. (D) Överdriven ödem som visas av en stor mängd svullnad i OCT. (E) Ett helt ischemiskt öga med helt nedsatt blodflöde som resulterar i en vit näthinna. F) Två olika exempel på ett kataraktöga där en tydlig bottenbild och ULT inte kunde erhållas. OCT-skalstänger: 100 μm. Förkortningar: RVO = retinal venocklusion; OCT = optisk koherenstomografi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Kvantifiering av OCT-bilder. (A) Undersökning av skikttjockleken och DRIL i olaserade kontrollögon och ögon som genomgick RVO-proceduren. GCL-, IPL-, INL-, OPL-, ONL-, Outer segment- och Whole Retina-mätningar. Statistik, Mann-Whitney-test p-värden: GCL: 0,0070, IPL: 0,0205, INL: <0,0001, OPL: 0,0014, ONL: 0,5582, yttre segment: 0,44852, hela näthinnan: 0,0019. Felstaplar visar SEM. (B) DRIL-kvantifiering mätt från OCT-bilderna från olaserade kontroller och RVO WT- och KO iEC Casp9-möss samt c57/BL6J-möss som hade RVO. Felstaplar visar SEM. (C) Exempel OCT med etiketterna för varje näthinnelager. Förkortningar: DRIL = Disorganisering av de inre retinala skikten; RVO = retinal venocklusion; WT = vildtyp; KO = knockout; GCL = ganglioncellskikt; IPL = inre plexiformskikt; INL = inre kärnskikt; OPL = yttre plexiformskikt; ONL = yttre kärnskiktet; SEM = medelmåttets standardfel; OCT = optisk koherenstomografi; ns = inte signifikant. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Baslinje laserutgång (mW) | Rekommenderad experimentell laserutgång (mW) | Rekommenderad tidsexponering (ms) |
| <11.0 eller >15.0 | Stäng av lasern och justera fibern i slutet som är ansluten till laserkontrollboxen. Skruva loss den och flytta den något åt höger eller vänster. Mät resultatet igen tills det når ett högre eller lägre värde. | |
| 11.0-12.0 | 120 | 1,000 |
| 12.0-13.0 | 110 | 1,000 |
| 13.0-14.0 | 100 | 1,000 |
| 14.0-15.0 | 100 | 1,000 |
Tabell 1: Låg baslinjelaserutgång kan kompenseras med högre experimentell laserutgång. Variationer i baslinjelaserutgång och rekommenderad experimentell laserutgång och exponeringstid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RVO-modellen på möss ger en väg att ytterligare förstå RVO-patologi och att testa potentiella terapier. Medan musens RVO-modell används i stor utsträckning inom området, finns det ett behov av ett aktuellt detaljerat protokoll för modellen som behandlar dess variabilitet och beskriver optimeringen av modellen. Här ger vi en guide med exempel från erfarenhet på vad som kan ändras för att få de mest konsekventa resultaten över en kohort av försöksdjur och ge tillförlitliga data.
De två viktigaste elementen i RVO-musmodellen är laserutgången och framgångsrik intravenös injektion av fotosensibiliseringsfärgämnet. För att producera den kraft som krävs för att inducera koagulering när lasern är riktad mot en viss ven måste laserutgången justeras korrekt. Även om detta kan uppnås med hjälp av de tekniker som föreslås i metoden är det viktigt att överväga skillnaderna i varje laboratoriums systeminställning. Variationer av den fiberoptiska kabeln och hur den ryms i förhållande till utrustning och rumstemperatur är några av de variabler som kan förklara låg lasereffekt. Oberoende inställningar av systeminställningarna rekommenderas för att öka laserutgången.
Denna ansträngning är dock oanvändbar utan en lämplig svansvensteknik för att leverera fotosensibiliseringsfärgämnet. Svansveninjektioner kan vara svåra att uppnå, och det är en färdighet som tar tid att utveckla. Dåliga injektioner kan resultera i inga ocklusioner; i detta fall kan rose bengal administreras via IP. Administrering av rosbengal via IP har använts för att modellera RVO men med en längre laserbestrålningstid (3 s) och högre rosbengalkoncentration (40 mg/ml)11. För att begränsa långvarig laserbestrålning och specifikt rikta in sig på vaskulaturen är svansvenering det föredragna administreringssättet.
Denna modell kan också åstadkommas med andra fotoaktiverbara färgämnen såsom Y-eosin och natriumfluorescein12,13,14, även om rosbengal är det mest använda fotoaktiverbara färgämnet 4,5,6,8. Alla färgämnen har visat sig ge tidiga tecken på klinisk sjukdom såsom retinalblödning och retinalt ödem15. Fotoaktiverbara färgämnen har visat sig inte ha några skadliga effekter på djuren och uppvisar därmed obetydlig systemtoxicitet15,16. Det bör också noteras att det valda färgämnet bör ha ett absorptionsmaximum som är kompatibelt med våglängden för lasern som används. Rose Bengal har en excitation vid 525 nm17, natriumfluorescein vid 475-490 nm 18 och Y-eosin vid 490 nm19.
De huvudsakliga källorna till variabilitet i denna modell är tiden för fotoocklusion i förhållande till administrering av rosbengal och baslinjen och experimentell laserutgång. Medan figur 2 visar 10- och 20-minuters tidpunkter för fotoocklusion, utfördes också ett litet antal 5- och 15-min-experiment (data visas inte), vilket gav ocklusioner som inte var lika konsekventa som 10-minuterstidpunkten. Därför valdes 10 min som den optimala väntetiden mellan administrering av rosbengal och fotoocklusion för denna metod. Studier har dock rapporterat att RVO också kan induceras så tidigt som 3 minuter efter administrering av rose bengal5. Ett annat sätt att bestämma den musstamspecifika optimala väntetiden från rosbengal till fotoocklusion är att övervaka den relativa rosbengalkoncentrationen med hjälp av fluorescensavbildningsläget med ett tetrametylrhodaminfilter (TRITC). Protokollet som beskrivs här kan emellertid utföras med hjälp av retinala avbildningsmikroskop som inte har ett TRITC-filter.
Den andra källan till hög variabilitet i denna modell är baslinjelaserutgången. Eftersom dagliga nivåer av baslinjelaserutgång kan vara väldigt olika är det viktigt att bedöma nivåerna före varje experiment. Standardisering av baslinjelaserutdata över studier kan hjälpa till att förstärka och utöka användningen av RVO-musmodellen. Justering av fiberkabeln kan räcka för att ändra baslinjenivåerna; Om en mätning på 13,0 mW inte kan uppnås ger tabell 1 en vägledning för kompensation med hjälp av experimentell effekt. Det är viktigt att notera att eftersom näthinnan är ett slutet system är det viktigt att bestämma fraktionen av ockluderade vener (antalet ockluderade vener dividerat med antalet bestrålade vener) för att förstå, kontrollera och förutsäga skadans allvar i RVO-modellen. Tidigare analys av skadade avläsningar (DRIL och retinal tjocklek) korrelerade med andelen ockluderade vener och förväntad retinalatrofi 8 dagar efter RVO8. Således bör fraktionen av vener ockluderade övervägas och utvärderas. Det är fortfarande oklart hur andra mellanliggande ocklusionstillstånd, såsom delvis reperfunderade, delvis ockluderade eller vener som en gång var ockluderade och reperfunderade med 10 minuter, bidrar till utvecklingen av retinalt ödem och atrofi.
Ytterligare studier av ögonen med dessa typer av ocklusioner kan hjälpa till att undersöka om en långvarig ocklusion är nödvändig för väsentlig skada eller om även övergående ocklusioner är viktiga i denna modell. Beroende på den experimentella frågan som ställs kommer olika ocklusionshastigheter att vara optimala. En ocklusionshastighet på 40-50% är idealisk i de flesta fall, vilket betyder två eller tre ocklusioner i ett öga med sex vener. Detta säkerställer betydande skada, men näthinnan är intakt och kan dissekeras för immunhistokemiska och biokemiska analyser.
För att bestämma detta är det relevant att skilja den patologiska uppfattningen om en framgångsrik och representativ ocklusion av RVO-signaturen. Den naturliga ocklusionen som presenteras av RVO inkluderar flamformade blödningar 20 (inte att förväxla med subretinal blödning), som kan observeras i denna modell24 h efter skada. RVO-modellen kan också leda till oönskade näthinneskador (som inte är utmärkande för RVO-patologi) som de som visas i figur 6B-F, om dess parametrar inte kontrolleras försiktigt. Ett tillvägagångssätt som kan vidtas för att undvika dessa, förutom att reglera koncentrationen av rosbengal och den experimentella laserkraften, är att sluta bestråla kärlen som har en tydlig bildning av en trombos efter den första eller andra bestrålningen.
Andra faktorer att tänka på när man använder denna modell och bestämmer vilka vener som ska täppas till är musstammen och kärldiametern. Vissa musstammar, såsom BALB / c, mest känd som albino, är mottagliga för ljusskador21. Dessutom har de retinala utvecklingsunderskott som leder till defekter i decussationen vid optisk chiasm och synskärpa22,23. Det rekommenderas att fullständigt utvärdera basal retinal och vaskulär integritet hos oskadade kontroller för den musstam som valts för RVO-studier. Studier har visat att venbredd kan störa utvecklingen av retinalt ödem och sjukdomspatologi24. Således bör djur med liknande vikt användas för att undvika ytterligare variationer. Exkluderingsfaktorerna för vilka ögon som ska användas i en studie beror också på den experimentella frågan. Det kan vara klokt att inkludera alla ögon som en gång var tillslutna, även om det repermeras vid uppföljningstidpunkten för signalering. Men om stabila ocklusioner önskas skulle dessa ögon uteslutas. Figur 6 visar exempel på möjliga uteslutningskriterier eller ögon som kan användas för patologisk analys.
För att visa att dessa laserinställningar inte orsakade skada och att effekterna som sågs verkligen drevs av ocklusionerna själva, gjordes skenkontroller i tidigare studier8. Skenmössen fick fortfarande en stjärtvensinjektion av rosenbengal men bestrålades i parenkymutrymmet mellan de stora kärlen istället för att bestrålas på venen. Detta var ett viktigt steg för att säkerställa att modellen replikerade RVO-skador som ses hos patienter istället för att bara skada vävnad med en laser. Dessa shams visar ingen aktivering av kaspas-9 eller -7 eller något av ödemet som ses hos mössen som fick normal laserbestrålning till kärlen, vilket indikerar att lasern inte hade några negativa effekter. Att ha dessa kontroller är viktigt, särskilt om högre laserinställningar kommer att användas för att säkerställa att skadan som modelleras är en korrekt representation av den önskade skadan8.
RVO-musmodellen kan tillämpas för att studera andra sjukdomar som härrör från hypoxisk-ischemiska skador i näthinnan och hjärnan, såsom diabetisk retinopati, prematuritetsretinopati och stroke. Dessutom kan det fungera som en modell för att studera signalvägar som är relevanta för vaskulär skadeutveckling och testa potentiella behandlingar som förbättrar neurodegeneration i centrala nervsystemet. Optimeringen som skräddarsys i denna rapport kan begränsa variabiliteten i musens RVO-modell och belysa patofysiologin för RVO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Fiber Patch Cable | Thor Labs | M14L02 | |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Lasercheck | Coherent | 1098293 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoneix Micron IV with Meridian, StreamPix, and OCT modules | Phoenix Technology Group | ||
| Proparacaine Hydrochloride | Akorn | NDC: 17478-263-12 | keep at 4 °C |
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-5G | light-sensitive |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).
- Ehlers, J. P., Fekrat, S. Retinal vein occlusion: beyond the acute event. Survey of Ophthalmology. 56 (4), 281-299 (2011).
- Iftikhar, M., et al. Loss of peak vision in retinal vein occlusion patients treated for macular edema. American Journal of Ophthalmology. 205, 17-26 (2019).
- Zhang, H., et al. Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization. Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).
- Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion. PLoS One. 10 (3), 0119046 (2015).
- Fuma, S., et al. A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model. Scientific Reports. 7, 43509 (2017).
- Zhang, C., et al. Activation of microglia and chemokines in light-induced retinal degeneration. Molecular Vision. 11, 887-895 (2005).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Nicholson, L., et al. Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy. Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).
- Moein, H. R., et al. Optical coherence tomography angiography to detect macular capillary ischemia in patients with inner retinal changes after resolved diabetic macular edema. Retina. 38 (12), 2277-2284 (2018).
- Hirabayashi, K., et al. Development of a novel model of central retinal vascular occlusion and the therapeutic potential of the adrenomedullin-receptor activity-modifying protein 2 system. American Journal of Pathology. 189 (2), 449-466 (2019).
- Martin, G., Conrad, D., Cakir, B., Schlunck, G., Agostini, H. T. Gene expression profiling in a mouse model of retinal vein occlusion induced by laser treatment reveals a predominant inflammatory and tissue damage response. PLoS One. 13 (3), 0191338 (2018).
- Drechsler, F., et al. Effect of intravitreal anti-vascular endothelial growth factor treatment on the retinal gene expression in acute experimental central retinal vein occlusion. Ophthalmic Research. 47 (3), 157-162 (2012).
- Genevois, O., et al. Microvascular remodeling after occlusion-recanalization of a branch retinal vein in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (2), 594-600 (2004).
- Khayat, M., Lois, N., Williams, M., Stitt, A. W.
- Nguyen, V. P., Li, Y., Zhang, W., Wang, X., Paulus, Y. M. High-resolution multimodal photoacoustic microscopy and optical coherence tomography image-guided laser induced branch retinal vein occlusion in living rabbits. Scientific Reports. 9 (1), 10560 (2019).
- Sayyed, S. A. A. R., Beedri, N. I., Kadam, V. S., Pathan, H. M. Rose Bengal sensitized bilayered photoanode of nano-crystalline TiO2-CeO2 for dye-sensitized solar cell application. Applied Nanoscience. 6 (6), 875-881 (2015).
- Emmart, E. W. Observations on the absorption spectra of fluorescein, fluorescein derivatives and conjugates. Archives of Biochemistry and Biophysics. 73 (1), 1-8 (1958).
- Yu, L., Liu, Z., Liu, S., Hu, X., Liu, L. Fading spectrophotometric method for the determination of polyvinylpyrrolidone with eosin Y. Chinese Journal of Chemistry. 27 (8), 1505-1509 (2009).
- MacDonald, D. The ABCs of RVO: a review of retinal venous occlusion. Clinical & Experimental Optometry. 97 (4), 311-323 (2014).
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
- LaVail, M. M., Gorrin, G. M., Repaci, M. A. Strain differences in sensitivity to light-induced photoreceptor degeneration in albino mice. Current Eye Research. 6 (6), 825-834 (1987).
- Jeffery, G. The albino retina: an abnormality that provides insight into normal retinal development. Trends in Neurosciences. 20 (4), 165-169 (1997).
- Kinnear, P. E., Jay, B., Witkop, C. J.
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
