Summary
Det nuvarande protokollet beskriver isoleringen av fycobilisomer från cyanobakterier genom centrifugering genom en diskontinuerlig sackarostäthetsgradient. Fraktionerna av intakta fycobilisomer bekräftas av 77K fluorescerande emissionsspektrum och SDS-PAGE analys. De resulterande fycobilisome fraktionerna är lämpliga för negativ färgning av TEM och masspektrometri analys.
Abstract
I cyanobakterier är phycobilisome ett vitalt antennproteinkomplex som skördar ljus och överför energi till fotosystem I och II för fotokemi. Att studera strukturen och sammansättningen av phycobilisome är av stort intresse för forskare eftersom det avslöjar utvecklingen och divergensen av fotosyntes i cyanobakterier. Detta protokoll ger en detaljerad och optimerad metod för att bryta cyanobakterieceller till låg kostnad med en pärlslagare effektivt. Den intakta fycobilisomen kan sedan isoleras från cellextraktet genom sackarogradient ultracentrifugation. Denna metod har visat sig vara lämplig för både modell och icke-modell cyanobakterier med olika celltyper. Ett steg-för-steg-förfarande tillhandahålls också för att bekräfta integriteten och egenskapen hos fycobiliproteiner genom 77K fluorescensspektroskopi och SDS-PAGE färgade av zinksulfat och Coomassie Blue. Den isolerade fycobilisome kan också utsättas för ytterligare strukturella och sammansättning analyser. Sammantaget ger detta protokoll en användbar startguide som gör det möjligt för forskare som inte känner till cyanobakterier att snabbt isolera och karakterisera intakt fycobilisome.
Introduction
Phycobilisome (PBS) är ett stort vattenlösligt pigmentproteinkomplex som fäster vid fotosystemens cytoplasmiska sida i de thylakoida membranen i cyanobakterier1. PBS består främst av färgade fykobiliproteiner och färglösa länkproteiner1,2. Fycobiliproteinerna kan delas in i fyra stora grupper: fycoerythrin, phycoerythrocyanin, phycocyanin och allophycocyanin3. De fyra stora grupperna absorberar olika våglängder av ljusenergi i intervallet 490-650 nm, som klorofyller absorberade ineffektivt3. PBS kan fungera som en ljusskördande antenn för att samla in ljusenergi och leverera den till Photosystem II och I4.
PBS struktur och sammansättning varierar från art till art. Tillsammans har tre former av fycobilisome (hemidiscodial, buntformad och stavformad) identifierats i olika cyanobakteriearter5. Även i samma art förändras sammansättningen av PBS som svar på miljön, såsom ljuskvalitet och näringsbrist6,7,8,9,10,11. Därför har det experimentella förfarandet för att isolera PBS från cyanobakterier varit avgörande för att studera PBS12. Under flera årtionden har många olika protokoll isolerat PBS och analyserat dess struktur, sammansättning och funktion6,7,8,12,13,14,15,16,17. Det stora utbudet av metoder för PBS-isolering ger verkligen flexibilitet när det gäller att isolera komplexet hos olika arter med olika reagenser och instrument. Men det gör det också svårare att välja ett lämpligt protokoll för forskare som inte känner till cyanobakterier och PBS. Därför utvecklas ett generaliserat och enkelt protokoll i detta arbete för dem som är intresserade av att starta PBS isolering från cyanobakterier.
Metoderna för att isolera PBS från tidigare publikationer sammanfattas här. Eftersom PBS är ett vattenlösligt proteinkomplex och lätt är dissocierat krävs en hög jonstyrka fosfatbuffert för att stabilisera PBS under extraktion18. Flera forskningsartiklar som beskriver metoder för isolering av PBS från cyanobakterier har publicerats tidigare. De flesta av metoderna kräver en hög koncentration av fosfatbuffert8,14,15,18,19. Förfarandena för mekanisk störning av cellerna varierar dock, såsom glas pärlor-assisterad extraktion, ultraljudsbehandling20 och franska press6,8,14. Olika fycobiliproteiner kan erhållas genom utfällning med ammoniumsulfat20 och renas av HPLC21 eller en kromatografisk kolumn22. Å andra sidan kan intakt PBS enkelt isoleras genom sackarosdensitetsgradient ultracentrifugation6,8,15.
I detta protokoll användes en modell cyanobacterium och en icke-modell cyanobacterium som material för PBS isolering. De är modell encelliga glukostoleranta Synechocystis sp. PCC 6803 (nedan syn6803) och icke-modell filamentösa Leptolyngbya sp. JSC-1 (nedan kallad JSC-1), respektive7,23,24. Protokollet börjar med störningar av den encelliga och filamentösa cyanobakterierna i en hög jonstyrka fosfatbuffert. Efter lys samlas supernatanterna upp genom centrifugering och behandlas sedan med ett icke-joniskt tvättmedel (Triton X-100) för att solubilisera de vattenlösliga proteinerna från thylakoidmembranen. De totala vattenlösliga proteinerna appliceras på en diskontinuerlig sackarostäthetsgradient för att fraktionera PBS. Den diskontinuerade sackaros gradienten i detta protokoll består av fyra sackaroslösningar och skiljeväggar den intakta PBS i de lägsta fraktionerna av sackarosskikt25. Integriteten hos PBS kan analyseras av SDS-PAGE, zinkfärgning och 77K fluorescensspektroskopi6,7,8,26. Denna metod är lämplig för forskare som syftar till att isolera intakt PBS från cyanobakterier och studera dess spektral-, struktur- och kompositionsegenskaper.
Det finns flera fördelar med detta protokoll. (1) Denna metod är standardiserad och kan användas för att isolera intakt PBS från både encelliga och filamentösa cyanobakterier. De flesta av artiklarna beskriver den metod som tillämpades i endera en typ av cyanobakterier4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Denna metod utförs vid rumstemperatur, eftersom PBS separerar vid låg temperatur19,27. (3) Denna metod beskriver användning av en pärlvissla för att störa cellerna. Därför är det billigare och säkrare än högtrycks fransk press och eventuella hörselskador från sonicator i andra metoder8,13,14,20. (4) Denna metod isolerar intakt PBS genom sackarogradient ultracentrifugering. På detta sätt kan intakt PBS med olika storlekar och delvis dissocierad PBS separeras baserat på sackaroskoncentration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Synechocystis sp. PCC 6803, modellen glukostoleranta stam, erhölls från Dr. Chu, Hsiu-An vid Academia Sinica, Taiwan. Leptolyngbya sp. JSC-1, den icke-modell filamentösa, erhölls från Dr. Donald A. Bryant vid Pennsylvania State University, USA.
1. Cellodling och skörd
- Inokulera Syn6803- eller JSC-1-celler med hjälp av en metallisk inokuleringsslinga i en konisk kolv på 100 ml som innehåller 50 ml B-HEPES medium28. Odla cellerna vid 30 °C under 50 μmol fotoner m-2 s-1 (vitljus LED) i 1% (v/v) CO2 med konstant omrörning av en magnetisk omrörare (120 rpm) tills kulturen når mitten av exponentiell tillväxtfas (OD750 = 0,6-0,8).
OBS: Skörda cellkulturen när kulturens optiska densitet vid 750 nm (OD750) når 0,6-0,8 genom att överföra till en ny kolv. Optisk densitet användes rutinmässigt för att uppskatta mikrobiell celldensitet i flytande kulturer29. Våglängderna från 720-750 nm användes i olika studier för att mäta cyanobakterietillväxt30,31,32. I detta protokoll används OD750 eftersom JSC-1 kan producera pigment som absorberar långt rött ljus7. Alternativt användes klorofyllkoncentrationen också för att mäta tillväxten av cyanobakterier33. - Överför cellkulturen (OD750 ~0,8) till en 1L konisk kolv och späd den till OD750 = 0,2 i 500 ml B-HEPES-medium. Odla kulturen fram till den sena exponentiella tillväxtfasen (OD750 = 0,8-1,0) i samma tillstånd som nämns ovan (steg 1.1) och skörda sedan kulturen genom centrifugering.
- Centrifugera kulturen vid 10 000 x g i 20 minuter vid rumstemperatur och kassera supernatanten helt.
OBS: Cellernas pellets kan lagras vid -80 °C i upp till 6 månader.
2. Cellslys
- Suspendera cellpelletsen och tvätta två gånger med 0,75 M K-fosfatbuffert, pH 7.
OBS: För att göra 0,75 M K-fosfatbuffert vid pH 7, förbered 1,5 M K2HPO4 och 1,5 M KH2PO4 separat. Blanda 615 ml 1,5 M K2HPO4 och 385 ml 1,5 M KH2PO4 för att få 1,5 M K-fosfatbuffert vid pH 7. Späd den helt enkelt med samma mängd ddH2O för att göra 0,75 M K-fosfatbuffert vid pH 7. - Pellet cellerna i 50 ml centrifugrör genom centrifugering vid 10 000 x g i 20 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och återanvänd cellerna med 0,75 M K-fosfatbuffert. Mät pelletens våtvikt med en elektronisk balans och återanvänd 1 g våtvikt på pelleten i 5 ml av bufferten.
OBS: Våtvikten för en pellet mättes genom att subtrahera vikten på ett tomt centrifugrör från vikten på centrifugröret som innehåller cellpelleten. - Tillsätt 1 ml cellfjädring och 0,4-0,6 g 0,1 mm glaspärlor (se Materialtabell) i en 2 ml skruvlocksflaska.
- Bryt cellerna i 30 s med en pärlslagare (se Materialtabell). Låt rören svalna i ett vattenbad i rumstemperatur i 2 minuter och upprepa brytcykeln 5 gånger.
- Efter lys, centrifugera injektionsflaskan vid 500 x g i 10 s vid rumstemperatur. Samla supernatanten med en pipett i ett 15 ml centrifugrör. Tvätta pärlorna med 0,5 ml 0,75 M K-fosfatbuffert en gång och överför sedan till samma centrifugrör.
- Tillsätt Triton X-100 (2% w/v, slutlig koncentration) till den lysade cellfjädringen och inkubera på en gungande shaker (40 rpm) vid rumstemperatur tills lösningen blir homogen (~ 20 min).
- Centrifugera rören på 17 210 g i 20 minuter för att avlägsna intakta celler och stora cellrester. Förvara supernatanten utan det övre Triton micelleskiktet vid rumstemperatur i upp till 1 h.
OBS: Supernatanten innehåller två separerade lager. Det övre hydrofoba Triton X-skiktet innehåller klorofyllbindande proteiner och hydrofoba stavformade fycobilisomer6. Det nedre vattenskiktet innehåller vattenlöslig PBS.
3. Beredning av sackarosgradientbuffertar och PBS-isolering
- Gör fyra koncentrationer av sackaros (2,0 M, 1,0 M, 0,75 M och 0,5 M) i 0,75 M K-fosfatbuffert vid pH 7.
OBS: Det föreslås att använda 1,5 M K-fosfatbuffert vid pH 7 för att förbereda sackarosgradienten eftersom tillsats av sackaros späder koncentrationen av K-fosfatbuffert. När sackaros är helt upplöst, tillsätt ddH2O för att justera koncentrationen till 0,75 M, pH 7. - Placera 2,8 ml sackarosbuffert på 2,0 M i botten av 40 ml centrifugrör och överlägg med tre lager sackaroslösningar (8 ml 1,0 M; 12 ml 0,75 M och 11 ml 0,5 M för 40 m L centrifugrör) och slutligen PBS-innehållande supernatantfraktionen (3,5 m) och slutligen PBS-innehållande supernatantfraktionen (3,0 mL).
OBS: Tillsätt försiktigt sackaroslösningen och låt sackaros falla mycket långsamt inuti röret. Håll pipettens spets precis ovanför lösningens yta i röret medan du laddar lösningen. Sackarosskikt kan observeras när de läggs långsamt i lager. - Centrifugera de resulterande lutningarna vid 125 800 x g i ~16h-20 h vid 25 °C.OBS: En ultracentrifuge (se Materialtabell) krävs för detta steg.
- Vid ultracentrifugering kondenserar du de fraktionerade PBS- och fykobiliproteinerna mellan lagren. Blå band i Syn6803 (lila band visade i JSC-1) observerades i gränssnitten (figur 1D).
- Samla långsamt fraktionerna med en pipett från toppen av sackarosgradienterna. Ta bort sackarosen genom att upprepade gånger koncentrera dig (3 500 x g i 20 min) och späda ut fraktionerna med 0,75 M K-fosfatbuffert i membrancentrifugerfilterenheter (10 K molekylviktsskärning, se Materialförteckning).
4. Mätning av PBS fluorescens vid 77K
OBS: En fluorimeter utrustad med en flytande kvävebehållare (se Materialregistret) används för att mäta fluorescensspektra vid 77K.
- Späd ut det koncentrerade PBS-provet med 0,75 M K-fosfatbuffert för att få minst 500 μL.
OBS: Koncentrationerna av phycocyanin av prover var ~4,2 μg mL-1 baserat på formeln: (OD615 0,474 x OD652)/5,34 [mg/mL]34. - Tillsätt 500 μL av PBS-provet till ett genomskinligt glasrör och frys röret i flytande kväve tills det är helt fruset. Flytta det frusna röret till en genomskinlig Dewar-behållare (se Materialtabellen) förfylld med flytande kväve.
OBS: Glasrörets innerdiameter är 3 mm i detta protokoll. Tunna glasrör användes för att minimera återabsorption av kortvåglängdsutsläpp i provet. - Välj excitation våglängder för fycoerythrin och phycocyanin att vara 550 nm respektive 580 nm.
OBS: Fluorescensutsläpp registrerades från 560-800 nm (för 550 nm excitation) eller 600-800 nm (för 580 nm excitation).
5. SDS-PAGE-analys av PBS
- Buffertutbyte av de koncentrerade PBS-proverna i 0,75 M K-fosfat med 50 mM Tris-buffert (pH 8.0) i membrancentrifugerfilterenheter (3K molekylviktsskärning, se Materialförteckning).
- Blanda 50 μL PBS-lösning med 10 μL 6x SDS lastbuffert [300 mM Tris pH 6,8, 12% (w/v) Natriumdodecylsulfat, 0,06% (w/v) Bromfenolblå, 50% (v/v) Glycerol, 6% (v/v) β-Mercaptoethanol] (se Tabell av material)
- Separera proteinproverna med SDS-PAGE (8%-20% (w/v) polyakrylamidgel) och fortsätt med zink- och Coomassiefärgning. Det detaljerade förfarandet har beskrivits i Reference8.
- För zinkfärgning, inkubera gelén i 50 mM ZnSO4-lösning i 10 min vid rumstemperatur, tvätta gelén med destillerat vatten och visualisera zinkinducerad fluorescens under UV-bestrålning (312 nm).
- För Coomassie blå färgning, inkubera gelén i Coomassie Blå färgningsbuffert [0,25% (v/v) coomassie R-250, 10% (v/v) ättiksyra, 50% (v/v) metanol, se Tabell över material] i 1 h vid rumstemperatur. Tvätta gelén med destillerat vatten två gånger för att avlägsna den återstående färgbufferten och inkubera gelén med avtainerbuffert [10% (v/v) ättiksyra, 30% (v/v) Metanol] på en gungande shaker (40 rpm) vid rumstemperatur över natten. Visualisera den helt destained gelen med en digitalkamera eller en skanner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syn6803- och JSC-1-cellerna odlades i koniska flaskor med konstant omrörning i B-HEPES-medium vid 30 °C, under ett LED-vitt ljus (50 μmol fotoner m-2s-1) i en tillväxtkammare fylld med 1% (v/v) CO2. Vid den exponentiella tillväxtfasen (OD750 = ~0,5) subkulturerades cellerna till nytt medium med en slutlig optisk densitet OD750 = ~0,2. Efter att ha nått den sena exponentiella tillväxtfasen (OD750 = 0,6-0,8) samlades kulturerna in och centrifugerades (10 000 x g vid rumstemperatur i 20 minuter). Supernatanten kasserades, och cellpellets lagrades vid -80 °C tills nästa steg var tillgängligt.
För att bryta cellerna tinades cellerna först vid rumstemperatur. Cellerna stördes av pärlslagning med 0,1 mm glaspärlor inom bufferten 0,75 M K-fosfat. Fullständig celllys visar supernatanten i mörkblågrön färg före centrifugering (figur 1B). Efter solubilisering av Triton X-100 och centrifugering för att avlägsna olösliga membran och cellskräp laddades supernatanten på toppen av sackaros gradientlösningen i ett 40 ml centrifugrör (figur 1C). Efter 18 h centrifugering flyttade den intakta PBS till gradientens centrum som ett klarblått band för Syn6803 och ett lila band för JSC-1. Skillnaden i deras färg resulterar från de olika kompositionerna av PBS i Syn6803 och JSC-1. PBS från Syn6803 bär fycocyanin35, medan PBS av JSC-1 bär fycocyanin och fycoerythrin7. Resultatet av sackarosdenstäthets-gradientseparation av isolerade PBS visar flera fraktioner av dissocierade fykobiliproteiner, och den lägsta fraktionen representerar intakt PBS (figur 1D).
Absorptionsspektrat för de olika fraktionerna av PBS som isolerats från JSC-1 och Syn6803 jämförs i figur 2A. Det detaljerade förfarandet för absorptionsspektra har beskrivits i artiklarna7,8. Absorptionsspektrat från den dissocierade PBS och intakta PBS av JSC-1 och Syn6803 har samma topp vid 622 nm, vilket motsvarar fycocyanin. Och fycoerythrin absorption topp vid 571 nm finns i både dissociated PBS och intakt PBS av JSC-1. Allophycocyanin visar en mindre topp med en axel på 670 nm i intakta PBS-fraktioner av JSC-1 och Syn6803. De spektralskillnaderna indikerar att stången (phycocyanin) till kärnan (allophycocyanin) förhållandet är högre i den dissocierade PBS än i den intakta PBS-fraktionen, eftersom de spektralegenskaperna hos phycobiliproteiner har fastställts tidigare5. Eftersom den dissocierade PBS och intakta PBS-fraktionerna visar liknande absorptionsspektra och fluorescerande emissionsfunktioner vid rumstemperatur, användes 77K fluorescensspektroskopi sedan för att analysera de olika fraktionerna isolerade från sackarogradienten. 77K fluorescerande emissionsspektra av dissociated PBS och intakta PBS fraktioner var upphetsade med 580 nm. Utsläppsspektrat för den dissocierade PBS har en stark topp på ~650 nm i Syn6803 och JSC-1, vilket representerar utsläppet från fycocyanin (figur 2B). Det fluorescerande utsläppsspektrat för intakt PBS visar två fluorescerande utsläpp maximala toppar: den svaga vid 651 nm och den starka vid 684 nm, avslöjar den energi som skördas av phycocyanin överfördes effektivt till allophycocyanin och terminal emitters (ApcD och ApcE) i kärnan9 (figur 2C). Dessa funktioner visar att de lägsta fraktionerna i sackarogradienten innehåller intakt PBS.
Dissociated PBS och intakt PBS separerades av SDS-PAGE på en 8%-20% (w/v) SDS polyakrylamide linjär gradient gel. de α och β underenheterna av fycocyanin och allophycocyanin var synliga på gelén utan färgning (figur 3A). Gelen färgades därefter med 10 mM ZnSO4 i 10 min. Chromophore-innehållande phycobiliproteiner observerades av zink färgning under UV bestrålning8. Phycobiliprotein underenheter (14-21 kDa) är starkt fluorescerande, och ApcE (pil) visade svag fluorescens (figur 3B). Vidare visar Coomassie Blue färgning den olika proteinsammansättningen mellan de dissocierade PBS-fraktionerna och de intakta PBS-fraktionerna (figur 3C). De övre fraktionerna innehåller andra icke-PBS-vattenlösliga proteiner eftersom fler proteiner färgas än i intakta PBS-fraktioner. Den intakta PBS i Syn6803 visar ett framträdande ApcE-band (pil) som saknar de dissocierade PBS-fraktionerna (figur 3C).
Volymförhållandet mellan PBS-extraktet och sackarogradienten är avgörande för att erhålla vassa band i sackarogradienten efter ultracentrifugation. Det föreslagna förhållandet mellan lösliga PBS-extrakt och sackaros gradient lösning är 1:10. Baserat på tidigare erfarenhet visar sackarogradienten i 40 ml centrifugrör en högre upplösning än sackarogradienten som görs i 13 ml-rören. Den diskontinuerade sackarosgradienten sprider sig över tid på grund av vibrationer på bänken. Därför kan 13 mL centrifugrör vara ett bra val för hantering av massor av prover samtidigt. För att visa detta har sackarosgradienterna i 13 ml centrifugrör vid förhållandet 1:3 och 1:10 beretts mellan råextrakten från Syn6803 eller JSC-1 och sackaros gradientlösningen (figur 4A). Efter ultracentrifugation visar sackarogradienten som bereds i förhållande 1:3 bredare band än den gradient som gjorts i förhållandet 1:10 (bild 4B). De lägsta fraktionerna av varje gradient innehåller intakt PBS, bekräftad av 77K fluorescerande emissionsspektroskopi.
Figur 1: Störning av syn6803- och JSC-1-celler och sackarogradient ultracentrifugation. (A) Schematisk illustration av att förbereda den avvecklade sackaros gradienten i ett 40 mL centrifugrör. B) Skruvlocksflaskorna fylldes med 0,4 g glaspärlor och 1 ml cellfjädring av Syn6803 eller JSC-1, och sedan lysades cellerna av en pärlvisp. (C) Supernatanten av Triton X-100 solubiliserat extrakt var skiktat på toppen av en sackarostäthetsgradient. (D) Efter centrifugering i 18 h visualiserades PBS-fraktionerna som klarblå band i gradienten i Syn6803 och som lila band i JSC-1. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Spektroskopisk karakterisering av olika fraktioner av sackarogradienter. (A) Absorptionsspektra av dissocierad PBS och intakta PBS-fraktioner från JSC-1 och Syn6803. Fluorescensutsläppsspektra mättes vid 77 K med hjälp av excitationsvåglängden vid 580 nm för (B) de dissocierade PBS-fraktionerna och (C) de intakta PBS-fraktionerna av Syn6803 och JSC-1. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: SDS-PAGE-analys av PBS isolerad från sackarosgradienter. De dissociated och intakt PBS fraktioner kvantifierades (20 μg protein per lane) och lastades på en 8%-20% (w/v) gradient polyacrylamide gel. Efter gel elektrofores, gelen visualiserades av zink färgning och Coomassie Blå färgning, därefter. A) Färgen på fykobiliproteiner är synlig på gelén utan färgning. B) Zinkfläckad gel visar fluorescensen hos fykobiliproteiner. (C) Gelen som färgas med Coomassie Blue visar fykobiliproteiner och andra proteiner. Pilarna anger ApcE:s positioner. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Sackarosgradienten tillverkad i 13 ml centrifugrör. Förhållandet mellan råextraktet och sackarosgradientlösningen är markerade ovanpå bilderna. (A) Supernatanten av Triton X-100 solubiliserade extrakt av Syn6803 och JSC-1 var skiktad över sackarosdensitetsgradienter med olika förhållanden mellan de lösliga extrakten till sackaros gradientlösningen. B) Efter centrifugering i 18 timmar observerades PBS-fraktionerna i Syn6803 och JSC-1 i sackarosgradienterna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en enkel och standard metod för att isolera intakt PBS i två typer av cyanobakterier, encellig modell Syn6803 och filamentös icke-modell JSC-1. De kritiska stegen i protokollet är cell homogenisering och ultracentrifugation på en diskontinuerlig densitet gradient av sackaros. I allmänhet är störningen av filamentösa celler mer komplicerad än encelliga. Öka mängden av utgångsmaterialet (cellpelletens våtvikt) och upprepningen av pärlslagning var till hjälp för att öka utbytet av PBS från filamentösa cyanobakterieceller. För den filamentösa cyanobakterie, JSC-1, användes tre gånger fler celler än encellig, Syn6803. Dessutom, för att helt bryta den filamentösa cyanobakterie, kräver det pärlslagning fler gånger än den encelliga cyanobakterierna för att observera den mörka blålila färgen i extraktionsbufferten.
Varaktigheten av pärlslagning föreslås inte överstiga 30 s eftersom proverna värms upp under varje pärlslagningscykel. Rören rekommenderas att svalna vid rumstemperatur på en bänk (eller i ett vattenbad) mellan varje cykel, eftersom den intakta PBS lätt separeras vid låg temperatur25. Därför föreslås varje procedur i detta protokoll att utföras vid rumstemperatur. Många forskningsartiklar har beskrivit olika cellstörningsmetoder, inklusive en högtryckshomogenisator (french-press) eller en sonicator6,8,20. En pärlkvarn homogenisator föreslås eftersom den är billigare, säkrare, lättare att hantera, snabbare, mer tillgänglig och effektivare vid bearbetning av flera prover samtidigt.
Phycobilisomes visar tre olika former, hemidiscoidal, buntformad och stavformad5. De intakta fycobilisomer som isoleras i figur 2 tillhör den hemidiscoidala formen som diskuterats i tidigare publikationer7,13,36. Den övre fraktionen som representerar dissocierad PBS kan dock också innehålla stavformad PBS. Syn6803 och JSC-1 kodar en specifik stångkärna linker CpcL, som föreslår förekomsten av stavformad PBS utöver hemidiscoidal PBS6,37. Stavformad PBS har identifierats direkt i Syn6803 men inte i JSC-17,13,37. Å andra sidan bygger JSC-1 om sin PBS genom att utföra kromatisk acklimatisk acklimatisering av typ III i grönt/rött ljus och långt rött ljusfotoacclimation i rött/långt rött ljus6,7. Alla dessa skillnader tyder på att det kan finnas andra typer av PBS i sackarosgradienterna, utöver den lägsta intakta hemidiscoidala PBS-fraktionen. Till exempel finns två typer av PBS samtidigt när Synechococcus sp. PCC 7335 och JSC-1 acklimatiserar sig till långt rött ljus8,13. det föreslås att personen som isolerar PBS från en okarakteriserad cyanobakterie stam bör vara mer försiktig vid analys av varje fraktion i sackaros gradienten för att identifiera eventuella typer av PBS.
Sammantaget ger detta protokoll en billig, enkel och snabb metod för cellstörning. Det har också visats att denna metod är tillförlitlig för att isolera PBS från olika cyanobakterier med olika celltyper och PBS-kompositioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande intresse.
Acknowledgments
Författarna tackar Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University för bekväm användning av ultracentrifuge. De cyanobakterie stammar synechocystis sp. PCC 6803 och Leptolyngbya sp. JSC-1 var begåvade från Dr. Chu, Hsiu-An vid Academia Sinica, Taiwan, och Dr. Donald A. Bryant vid Pennsylvania State University, USA, respektive. Detta arbete finansierades av ministeriet för vetenskap och teknik (Taiwan) (109-2636-B-002-013- och 110-2628-B-002-065-) och utbildningsministeriet (Taiwan) Yushan Young Scholar Program (109V1102 och 110V1102).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectroscopy. |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
References
- Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model. Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).
- Glazer, A. N.
- Glazer, A. N.
- Liu, H., et al. Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria. Science. 342 (6162), 1104 (2013).
- Bryant, D. A., Canniffe, D. P. How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).
- Hirose, Y., et al. Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria. Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).
- Gan, F., et al. Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light. Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).
- Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light. Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).
- Ho, M. Y., et al. Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).
- Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. M. Chromatic Acclimation in Cyanobacteria: A diverse and widespread process for optimizing photosynthesis. Annual Review of Microbiology. 73, 407-433 (2019).
- Grossman, A. R., Schaefer, M. R., Chiang, G. G., Collier, J. L. The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions. Microbiological Reviews. 57 (3), 725-749 (1993).
- Bryant, D. A., Glazer, A. N., Eiserling, F. A. Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp. Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).
- Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light. Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).
- Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes. Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).
- Zhang, J., et al. Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica. Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).
- Li, Y., et al. Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris. Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).
- Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. E., Rios-Castro, E., Gomez-Lojero, C. Complementary chromatic and far-red photoacclimations in Synechococcus ATCC 29403 (PCC 7335). I: The phycobilisomes, a proteomic approach. Photosynthesis Research. 138 (1), 39-56 (2018).
- Yamanaka, G., Glazer, A. N., Williams, R. C. Cyanobacterial phycobilisomes. Characterization of the phycobilisomes of Synechococcus sp. 6301. Journal of Biological Chemistry. 253 (22), 8303-8310 (1978).
- Gantt, E., Lipschultz, C. A., Grabowski, J., Zimmerman, B. K. Phycobilisomes from blue-green and red algae: Isolation criteria and dissociation characteristics. Plant Physiology. 63 (4), 615-620 (1979).
- Patel, A., Mishra, S., Pawar, R., Ghosh, P. K. Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat. Protein Expression and Purification. 40 (2), 248-255 (2005).
- Zolla, L., Bianchetti, M. High-performance liquid chromatography coupled on-line with electrospray ionization mass spectrometry for the simultaneous separation and identification of the Synechocystis PCC 6803 phycobilisome proteins. Journal of Chromatography A. 912 (2), 269-279 (2001).
- Soni, B., Kalavadia, B., Trivedi, U., Madamwar, D. Extraction, purification and characterization of phycocyanin from Oscillatoria quadripunctulata-Isolated from the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, India. Process Biochemistry. 41 (9), 2017-2023 (2006).
- Williams, J. G. K. Methods in Enzymology. , Academic Press. 766-778 (1988).
- Brown Igor, I., et al. Polyphasic characterization of a thermotolerant siderophilic filamentous cyanobacterium that produces intracellular iron deposits. Applied and Environmental Microbiology. 76 (19), 6664-6672 (2010).
- Wang, L., et al. Isolation, purification and properties of an R-phycocyanin from the phycobilisomes of a marine red macroalga Polysiphonia urceolata. PLoS One. 9 (2), 87833 (2014).
- Berkelman, T. R., Lagarias, J. C. Visualization of bilin-linked peptides and proteins in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 156 (1), 194-201 (1986).
- Rigbi, M., Rosinski, J., Siegelman, H. W., Sutherland, J. C. Cyanobacterial phycobilisomes: Selective dissociation monitored by fluorescence and circular dichroism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (4), 1961-1965 (1980).
- Dubbs, J. M., Bryant, D. A. Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409. Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).
- Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).
- Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002. Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).
- Zhang, S., Bryant, D. A. Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212. Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).
- Huang, J. Y., et al. Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Biochemistry. 55 (15), 2214-2226 (2016).
- Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris - A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f. Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga. Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).
- Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).
- Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).
- Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna. Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).
