Summary
Den nåværende protokollen beskriver isolering av fykobilisomer fra cyanobakterier ved sentrifugering gjennom en diskontinuerlig sukrosetetthetsgradient. Fraksjonene av intakte fykobilisomer bekreftes av 77K fluorescerende utslippsspekter og SDS-PAGE-analyse. De resulterende fykobilisomfraksjonene er egnet for negativ farging av TEM og massespektrometrianalyse.
Abstract
I cyanobakterier er fykobilisom et viktig antenneproteinkompleks som høster lys og overfører energi til fotosystem I og II for fotokjemi. Å studere strukturen og sammensetningen av fykobilisome er av stor interesse for forskere fordi det avslører utviklingen og divergensen av fotosyntese i cyanobakterier. Denne protokollen gir en detaljert og optimalisert metode for å bryte cyanobakterielle celler til lav pris av en perle-beater effektivt. Det intakte fykobilisomet kan deretter isoleres fra celleekstraktet ved sukrose gradient ultracentrifugation. Denne metoden har vist seg å være egnet for både modell og ikke-modell cyanobakterier med forskjellige celletyper. En trinnvis prosedyre er også gitt for å bekrefte integriteten og egenskapen til phycobiliproteins av 77K fluorescensspektroskopi og SDS-PAGE farget av sinksulfat og Coomassie Blue. Det isolerte fykobilisomet kan også utsettes for ytterligere strukturelle og komposisjonsanalyser. Totalt sett gir denne protokollen en nyttig startveiledning som gjør det mulig for forskere som ikke er kjent med cyanobakterier å raskt isolere og karakterisere intakt fykobilisom.
Introduction
Fykobilisom (PBS) er et stort vannløselig pigmentproteinkompleks som festes til den cytoplasmatiske siden av fotosystemene i thylakoidmembranene i cyanobakterier1. PBS består hovedsakelig av fargede fykobiliproteiner og fargeløse linkerproteiner1,2. Phycobiliproteins kan deles inn i fire store grupper: phycoerythrin, phycoerythrocyanin, phycocyanin og allophycocyanin3. De fire store gruppene absorberer forskjellige bølgelengder av lysenergi i området 490-650 nm, som klorofyller absorberte ineffektivt3. PBS kan fungere som en lett høstende antenne for å samle lysenergi og levere den til Photosystem II og I4.
Strukturen og sammensetningen av PBS varierer fra art til art. Samlet har tre former for fykobilisom (hemidiscodial, buntformet og stangformet) blitt identifisert i forskjellige cyanobakterielle arter5. Selv i samme art endres sammensetningen av PBS som respons på miljøet, for eksempel lyskvalitet og næringsnedbrytning6,7,8,9,10,11. Derfor har den eksperimentelle prosedyren for å isolere PBS fra cyanobakterier vært medvirkende til å studere PBS12. I løpet av flere tiår har mange forskjellige protokoller isolert PBS og analysert sin struktur, sammensetning og funksjon6,7,8,12,13,14,15,16,17. Det brede utvalget av metoder for PBS-isolasjon gir faktisk fleksibilitet til å isolere komplekset i forskjellige arter med forskjellige reagenser og instrumenter. Imidlertid gjør det også å velge en passende protokoll vanskeligere for forskere som ikke er kjent med cyanobakterier og PBS. Derfor er en generalisert og grei protokoll utviklet i dette arbeidet for de som er interessert i å starte PBS-isolasjon fra cyanobakterier.
Metodene for å isolere PBS fra tidligere publikasjoner er oppsummert her. Siden PBS er et vannløselig proteinkompleks og lett dissosieres, er det nødvendig med en høy ionisk styrkefosfatbuffer for å stabilisere PBS under ekstraksjon18. Flere forskningsartikler som beskriver metoder for isolering av PBS fra cyanobakterier har tidligere blitt publisert. De fleste metodene krever en høy konsentrasjon av fosfatbuffer8,14,15,18,19. Prosedyrene for mekanisk forstyrrelse av cellene varierer imidlertid, for eksempel glassperler-assistert ekstraksjon, sonikering20 og fransk presse6,8,14. Ulike fykobiliproteiner kan oppnås ved nedbør med ammoniumsulfat20 og renses av HPLC21 eller en kromatografisk kolonne22. På den annen side kan intakt PBS enkelt isoleres ved sukrosetetthetsgradient ultracentrifugation6,8,15.
I denne protokollen ble en modell cyanobakterie og en ikke-modell cyanobakterier brukt som materialer for PBS-isolasjon. De er modell unicellular glukose-tolerante Synechocystis sp. PCC 6803 (heretter Syn6803) og ikke-modell filamentous Leptolyngbya sp. JSC-1 (heretter JSC-1), henholdsvis7,23,24. Protokollen begynner med forstyrrelser av den unicellulære og filamentøse cyanobakterien i en høyionisk styrkefosfatbuffer. Etter lysis samles supernatantene ved sentrifugering og behandles deretter med et ikke-ionisk vaskemiddel (Triton X-100) for å løse de vannløselige proteinene fra thylakoidmembranene. De totale vannløselige proteinene påføres en diskontinuerlig sukrosetetthetsgradient for å fraksjonere PBS. Den diskontinuerlige sukrosegradienten i denne protokollen består av fire sukroseløsninger og partisjonerer den intakte PBS i de laveste fraksjonene av sukroselag25. Integriteten til PBS kan analyseres av SDS-PAGE, sinkfarging og 77K fluorescensspektroskopi6,7,8,26. Denne metoden er egnet for forskere som tar sikte på å isolere intakt PBS fra cyanobakterier og studere dens spektrale, strukturelle og komposisjonelle egenskaper.
Det er flere fordeler med denne protokollen. (1) Denne metoden er standardisert og kan brukes til å isolere intakt PBS fra både encellet og filamentøs cyanobakterier. De fleste artiklene beskriver metoden som gjaldt i enten en type cyanobakterier4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Denne metoden utføres ved romtemperatur, da PBS dissosierer ved lav temperatur19,27. (3) Denne metoden beskriver bruk av en perle-beater for å forstyrre cellene; Derfor er det billigere og tryggere enn høytrykks fransk presse og mulig hørselsskade fra soniker i andre metoder8,13,14,20. (4) Denne metoden isolerer intakt PBS ved sukrose gradient ultra-sentrifugering. På denne måten kan intakt PBS med forskjellige størrelser og delvis dissosiert PBS skilles basert på sukrosekonsentrasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Synechocystis sp. PCC 6803, den modellglukosetolerante stammen, ble hentet fra Dr. Chu, Hsiu-An ved Academia Sinica, Taiwan. Leptolyngbya sp. JSC-1, den ikke-modell filamentøse, ble hentet fra Dr. Donald A. Bryant ved Pennsylvania State University, USA.
1. Cellekultur og høsting
- Inokuler Syn6803- eller JSC-1-celler ved hjelp av en metallisk inokulasjonssløyfe i en 100 ml konisk kolbe som inneholder 50 ml B-HEPES medium28. Kultur cellene ved 30 °C under 50 μmol fotoner m-2 s-1 (hvitt lys LED) i 1% (v/v) CO2 med konstant omrøring av en magnetisk rører (120 rpm) til kulturen når midt eksponentiell vekstfase (OD750 = 0,6-0,8).
MERK: Høst cellekulturen når kulturens optiske tetthet på 750 nm (OD750) når 0,6-0,8 ved å overføre til en ny kolbe. Optisk tetthet ble rutinemessig brukt til å estimere mikrobiell celletetthet i flytende kulturer29. Bølgelengdene fra 720-750 nm ble brukt i ulike studier for måling av cyanobakteriell vekst30,31,32. I denne protokollen brukes OD750 fordi JSC-1 kan produsere pigmenter som absorberer fjernrødt lys7. Alternativt ble klorofyllkonsentrasjon også brukt til å måle veksten av cyanobakterier33. - Overfør cellekulturen (OD750 ~ 0,8) til en 1L konisk kolbe og fortynn den til OD750 = 0,2 i 500 ml B-HEPES-medium. Øk kulturen til sen eksponentiell vekstfase (OD750 = 0,8-1,0) i samme tilstand som nevnt ovenfor (trinn 1.1) og høst deretter kulturen ved sentrifugering.
- Sentrifuger kulturen på 10.000 x g i 20 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten helt.
MERK: Cellenes pellets kan oppbevares ved -80 °C i opptil 6 måneder.
2. Celler lysis
- Suspender cellepellets og vask to ganger med 0,75 M K-fosfatbuffer, pH 7.
MERK: For å lage 0,75 M K-fosfatbuffer ved pH 7, klargjør du 1,5 M K2HPO4 og 1,5 M KH2PO4 separat. Bland 615 ml 1,5 M K2HPO4 og 385 ml 1,5 M KH2PO4 for å få 1,5 M K-fosfatbuffer ved pH 7. Bare fortynn den med samme mengde ddH2O for å lage 0,75 M K-fosfatbuffer ved pH 7. - Pellet cellene i 50 ml sentrifugerør ved sentrifugering ved 10.000 x g i 20 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten og resuspend cellene med 0,75 M K-fosfatbuffer. Mål pellets våte vekt med en elektronisk balanse og resuspend 1 g våtvekt av pellet i 5 ml buffer.
MERK: Våtvekten til en pellets ble målt ved å trekke vekten av et tomt sentrifugerør fra vekten av sentrifugerøret som inneholder cellepelleten. - Tilsett 1 ml celleoppheng og 0,4-0,6 g 0,1 mm glassperler (se Materialbord) i et 2 ml hetteglass med skruehett.
- Bryt cellene i 30 s med en perle-beater (se Tabell over materialer). La rørene avkjøles i et vannbad med romtemperatur i 2 minutter og gjenta bruddsyklusen 5 ganger.
- Etter lysis, sentrifuger hetteglassene ved 500 x g i 10 s ved romtemperatur. Samle supernatanten med en pipette i et 15 ml sentrifugerør. Vask perlene med 0,5 ml 0,75 M K-fosfatbuffer en gang, og overfør deretter til samme sentrifugerør.
- Tilsett Triton X-100 (2% m/v, endelig konsentrasjon) til den lysede cellefjæringen og inkuber på en gynge shaker (40 rpm) ved romtemperatur til løsningen blir homogen (~ 20 min).
- Sentrifuger rørene på 17,210 g i 20 min for å fjerne intakte celler og store cellerester. Oppbevar supernatanten uten det øvre Triton-micellelaget ved romtemperatur i opptil 1 time.
MERK: Supernatanten inneholder to separerte lag. Det øvre hydrofobe Triton X-laget inneholder klorofyllbindende proteiner og hydrofobe stangformede fykobilisomer6. Det nedre vandige laget inneholder vannløselig PBS.
3. Klargjøring av sukrose gradientbuffere og PBS-isolasjon
- Lag fire konsentrasjoner av sukrose (2,0 M, 1,0 M, 0,75 M og 0,5 M) i 0,75 M K-fosfatbuffer ved pH 7.
MERK: Det anbefales å bruke 1,5 M K-fosfatbuffer ved pH 7 for å forberede sukrosegradienten fordi tilsetning av sukrose fortynner konsentrasjonen av K-fosfatbuffer. Etter at sukrose er fullstendig oppløst, tilsett ddH2O for å justere konsentrasjonen til 0,75 M, pH 7. - Plasser 2,8 ml 2,0 M sukrosebuffer på bunnen av det 40 ml sentrifugerrøret og overlegget med tre lag sukroseløsninger (8 ml 1,0 M; 12 ml 0,75 M og 11 ml 0,5 M for 40 ml sentrifugerør), og til slutt PBS som inneholder den supernatante fraksjonen (3,0 ml) (figur 1A).
MERK: Tilsett sukroseløsningen forsiktig og la sukrose falle veldig sakte inne i røret. Hold pipettespissen rett over overflaten av oppløsningen i røret mens du laster inn løsningen. Sukrose lag kan observeres når de er lagdelt sakte. - Sentrifuger de resulterende gradientene ved 125 800 x g i ~ 16h-20 h ved 25 °C.MERK: En ultracentrifuge (se Materialtabell) er nødvendig for dette trinnet.
- Ved ultra-sentrifugering kondenserer du de fraksjonerte PBS- og fykobiliproteinene mellom lagene. Blå bånd i Syn6803 (lilla bånd vist i JSC-1) ble observert i grensesnittene (figur 1D).
- Samle sakte fraksjonene med en pipette fra toppen av sukrosegradientene. Fjern sukrose ved gjentatte ganger å konsentrere seg (3500 x g i 20 min) og fortynn fraksjonene med 0,75 M K-fosfatbuffer i membran sentrifugalfilterenheter (10 K molekylvektavskjæring, se Materialtabell).
4. Måling av PBS fluorescens ved 77K
MERK: Et fluormåler utstyrt med en flytende nitrogenbeholder (se Materialtabellen) brukes til å måle fluorescensspektra ved 77K.
- Fortynn den konsentrerte PBS-prøven med 0,75 M K-fosfatbuffer for å få minst 500 μL.
MERK: Konsentrasjonene av fycocyanin av prøver var ~4,2 μg ml-1 basert på formelen: (OD615 0,474 x OD652)/5,34 [mg/ml]34. - Tilsett 500 μL av PBS-prøven til et gjennomsiktig glassrør og frys røret i flytende nitrogen til det er helt frosset. Flytt det frosne røret til en gjennomsiktig Dewar-beholder (se Materialbord) ferdigfylt med flytende nitrogen.
MERK: Glassrørets indre diameter er 3 mm i denne protokollen. Tynne glassrør ble brukt til å minimere reabsorpsjon av kortbølgelengdeutslipp i prøven. - Velg eksitasjonsbølgelengdene for henholdsvis fycoerythrin og phycocyanin til henholdsvis 550 nm og 580 nm.
MERK: Fluorescensutslipp ble registrert fra 560-800 nm (for 550 nm eksitasjon) eller 600-800 nm (for 580 nm eksitasjon).
5. SDS-PAGE analyse av PBS
- Bufferbytte de konsentrerte PBS-prøvene i 0,75 M K-fosfat med 50 mM Tris-buffer (pH 8,0) i membransentrifugalfilterenheter (3K molekylvektkutt, se Materialtabell).
- Bland 50 μL PBS-oppløsning med 10 μL 6x SDS-lastebuffer [300 mM Tris pH 6,8, 12% (m/v) Natriumdodecylsulfat, 0,06% (w/v) Bromphenol blå, 50% (v/v) Glyserol, 6% (v/v) β-Mercaptoethanol] (se Materialtabellen) i et mikrosenterrør og inkubere ved 95 °C i 10 minutter i en varmeblokk.
- Skill proteinprøvene med SDS-PAGE (8%-20% (w/ v) polyakrylamidgel) og fortsett med sink- og Coomassie-farging. Den detaljerte prosedyren er beskrevet i Referanse8.
- For sinkfarging, inkuber gelen i 50 mM ZnSO4-oppløsning i 10 min ved romtemperatur, vask gelen med destillert vann og visualiser sinkindusert fluorescens under UV-bestråling (312 nm).
- For Coomassie blå farging, inkuber gelen i Coomassie Blue farging buffer [0,25% (w / v) av Coomassie R-250, 10% (v / v) eddiksyre, 50% (v / v) av Methanol, se Tabell over materialer] i 1 time ved romtemperatur. Vask gelen med destillert vann to ganger for å fjerne restflekkebufferen og inkuber gelen med destaining buffer [10% (v / v) eddiksyre, 30% (v / v) Metanol] på en gynge shaker (40 rpm) ved romtemperatur over natten. Visualiser den fullstendig avsatte gelen med et digitalt kamera eller en skanner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syn6803- og JSC-1-cellene ble dyrket i koniske kolber med konstant omrøring i B-HEPES medium ved 30 °C, under et LED-hvitt lys (50 μmol fotoner m-2s-1) i et vekstkammer fylt med 1% (v/v) CO2. I den eksponentielle vekstfasen (OD750 = ~ 0,5) ble cellene subkulturert i friskt medium med en endelig optisk tetthet OD750 = ~ 0,2. Etter å ha nådd den sene eksponentielle vekstfasen (OD750 = 0,6-0,8), ble kulturene samlet inn og sentrifugert (10.000 x g ved romtemperatur i 20 min). Supernatanten ble kassert, og cellepellets ble lagret ved -80 °C til neste trinn var tilgjengelig.
For å bryte cellene ble cellene først tint ved romtemperatur. Cellene ble forstyrret av perleslag med 0,1 mm glassperler innenfor 0,75 M K-fosfatbufferen. Komplett cellelys viser supernatanten i mørkeblågrønn farge før sentrifugering (figur 1B). Etter oppløselighet av Triton X-100 og sentrifugering for å fjerne de uoppløselige membranene og celleavfallet, ble supernatanten lastet på toppen av sukrose gradientløsning i et 40 ml sentrifugerør (figur 1C). Etter 18 timers sentrifugering flyttet den intakte PBS til gradientens senter som et klart blått bånd for Syn6803 og et lilla bånd for JSC-1. Forskjellen i deres farge er resultatet av de forskjellige sammensetningene av PBS i Syn6803 og JSC-1. PBS fra Syn6803 bærer phycocyanin35, mens PBS av JSC-1 bærer phycocyanin og phycoerythrin7. Resultatet av sukrosetetthet-gradient separasjon av isolert PBS viser flere brøkdeler av dissosierte fykobiliproteiner, og den laveste brøkdelen representerer intakt PBS (figur 1D).
Absorpsjonsspektraet til de forskjellige fraksjonene av PBS isolert fra JSC-1 og Syn6803 sammenlignes i figur 2A. Den detaljerte prosedyren for absorpsjonsspektra er beskrevet i artiklene7,8. Absorpsjonsspektra fra dissosiert PBS og intakt PBS av JSC-1 og Syn6803 har samme topp på 622 nm, tilsvarende fycocyanin. Og fycoerythrin absorpsjonstoppen på 571 nm finnes i både dissosiert PBS og intakt PBS av JSC-1. Allophycocyanin viser en mindre topp med en skulder på 670 nm i de intakte PBS-fraksjonene JSC-1 og Syn6803. Spektralforskjellene indikerer at stangforholdet (phycocyanin) til kjernen (allophycocyanin) er høyere i den dissosierte PBS enn i den intakte PBS-fraksjonen, da spektralegenskapene til fykobiliproteiner har blitt bestemt tidligere5. Siden de dissosierte PBS og de intakte PBS-fraksjonene viser lignende absorpsjonsspektra og fluorescerende utslippsfunksjoner ved romtemperatur, ble 77K fluorescensspektroskopi deretter brukt til å analysere de forskjellige fraksjonene isolert fra sukrosegradienten. 77K fluorescerende utslipp spektra av dissosierte PBS og intakte PBS fraksjoner var begeistret med 580 nm. Utslippsspektraet til den dissosierte PBS har en sterk topp på ~ 650 nm i Syn6803 og JSC-1, som representerer utslippet fra phycocyanin (figur 2B). Den fluorescerende utslippsspektra av den intakte PBS viser to fluorescerende utslipp maksimal topper: den svake på 651 nm og den sterke på 684 nm, avslører energien høstet av phycocyanin ble overført effektivt til allophycocyanin og terminal emittere (ApcD og ApcE) i kjernen9 (Figur 2C). Disse funksjonene viser at de laveste brøkene i sukrosegradienten inneholder intakt PBS.
Den dissosierte PBS og intakt PBS ble skilt av SDS-PAGE på en 8%-20% (w / v) SDS polyakrylamid lineær gradient gel. De α og β underenheter av fycocyanin og allophycocyanin var synlige på gelen uten farging (figur 3A). Gelen ble deretter farget med 10 mM ZnSO4 i 10 min. Kromoforholdige fykobiliproteiner ble observert av sinkfarging under UV-bestråling8. Phycobiliprotein-underenheter (14-21 kDa) er sterkt fluorescerende, og ApcE (pilen) viste svak fluorescens (figur 3B). Videre viser Coomassie Blue farging de forskjellige proteinsammensetningen mellom de dissosierte PBS-fraksjonene og de intakte PBS-fraksjonene (figur 3C). De øvre fraksjonene inneholder andre ikke-PBS vannløselige proteiner ettersom flere proteiner er farget enn i intakte PBS-fraksjoner. Den intakte PBS i Syn6803 viser et fremtredende ApcE-bånd (pil) som mangler i de dissosierte PBS-fraksjonene (figur 3C).
Volumforholdet mellom PBS-ekstraktet og sukrosegradienten er avgjørende for å oppnå skarpe bånd i sukrosegradienten etter ultracentrifugation. Det foreslåtte forholdet mellom solubiliserte PBS-ekstrakter og sukrose gradientløsning er 1:10. Basert på tidligere erfaring, gjør sukrose gradient i 40 ml sentrifuge rør viser en høyere oppløsning enn sukrose gradient laget i 13 ml rør. Den diskontinuerlige sukrosegradienten sprer seg over tid på grunn av vibrasjoner på benken. Derfor kan 13 ml sentrifugerøret være et godt valg for håndtering av mange prøver samtidig. For å demonstrere det, har sukrosegradientene i 13 ml sentrifugerør i forholdet 1:3 og 1:10 blitt fremstilt mellom råekstraktene til Syn6803 eller JSC-1 til sukrosegradientløsningen (figur 4A). Etter ultracentrifugation viser sukrosegradienten som er klargjort med forholdet 1:3, bredere bånd enn graderingen som er laget med forholdet 1:10 (figur 4B). De laveste fraksjonene av hver gradient inneholder intakt PBS, bekreftet av 77K fluorescerende utslippsspektroskopi.
Figur 1: Forstyrrelse av Syn6803- og JSC-1-celler og sukrosegradient ultracentrifugation. (A) Skjematisk illustrasjon av klargjøring av den utgåtte sukrosegradienten i et 40 ml sentrifugerør. (B) Hetteglassene med skruehett ble fylt med 0,4 g glassperler og 1 ml celleoppheng av Syn6803 eller JSC-1, og deretter ble cellene lysnet av en perle-beater. (C) Supernatanten til Triton X-100 solubilisert ekstrakt ble lagdelt på toppen av en sukrosetetthetsgradient. (D) Etter sentrifugering i 18 timer ble PBS-fraksjonene visualisert som klare blå bånd i gradienten i Syn6803 og som lilla bånd i JSC-1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Spektroskopisk karakterisering av ulike brøkdeler av sukrosegradienter. (A) Absorpsjonsspektra av dissosiert PBS og intakte PBS-fraksjoner fra JSC-1 og Syn6803. Fluorescensutslippsspektra ble målt til 77 K ved hjelp av eksitasjonsbølgelengden ved 580 nm for (B) de dissosierte PBS-fraksjonene og (C) de intakte PBS-fraksjonene syn6803 og JSC-1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: SDS-PAGE-analyse av PBS isolert fra sukrosegradienter. De dissosierte og intakte PBS-fraksjonene ble kvantifisert (20 μg protein per bane) og lastet på en 8% -20% (w / v) gradient polyakrylamidgel. Etter gelelektroforese ble gelen visualisert ved sinkfarging og Coomassie Blue farging, senere. (A) Fargen på fykobiliproteiner er synlig på gelen uten farging. (B) Sinkfarget gel viser fluorescens av fykobiliproteiner. (C) Gelen farget med Coomassie Blue viser fykobiliproteiner og andre proteiner. Pilene angir posisjonene til ApcE. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sukrosegradienten laget i 13 ml sentrifugerør. Forholdet mellom råekstraktet og sukrosegradientløsningen er merket på toppen av bildene. (A) Supernatanten til Triton X-100 solubiliserte ekstrakter av Syn6803 og JSC-1 ble lagdelt over sukrosetetthetsgradienter med forskjellige forhold mellom de solubiliserte ekstraktene til sukrose gradientløsningen. (B) Etter sentrifugering i 18 timer ble PBS-fraksjonene i Syn6803 og JSC-1 observert i sukrosegradientene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en enkel og standard metode for å isolere intakt PBS i to typer cyanobakterier, encellet modell Syn6803 og filamentøs ikke-modell JSC-1. De kritiske trinnene i protokollen er cellehomogenisering og ultracentrifugation på en diskontinuerlig tetthet gradient av sukrose. Generelt er forstyrrelsen av filamentøse celler mer komplisert enn encellede. Å øke mengden av startmaterialet (den våte vekten av cellepelleten) og gjentakelsen av perleslag var nyttig for å øke utbyttet av PBS fra filamentøse cyanobakterielle celler. For den filamentøse cyanobakterien ble JSC-1, tre ganger flere celler brukt enn encellet, Syn6803. I tillegg, for å fullstendig bryte den filamentøse cyanobakterien, krever det perle-slående flere ganger enn den unicellulære cyanobakterien for å observere den mørke blåaktig-lilla fargen i ekstraksjonsbufferen.
Varigheten av bead-beating er ikke foreslått å overstige 30 s siden prøvene oppvarmes under hver perle-bankende syklus. Rørene anbefales å avkjøles ved romtemperatur på en benk (eller i et vannbad) mellom hver syklus, da den intakte PBS lett dissosieres ved lav temperatur25. Derfor foreslås hver prosedyre i denne protokollen å bli utført ved romtemperatur. Mange forskningsartikler har beskrevet forskjellige celleavbruddsmetoder, inkludert en høytrykkshomogenisator (Fransk-Press) eller en soniker6,8,20. En perlemølle homogenisator foreslås fordi den er billigere, tryggere, enklere å håndtere, raskere, mer tilgjengelig og mer effektiv i behandling av flere prøver samtidig.
Fykobilisomer viser tre forskjellige former, hemidiscoidal, buntformet og stangformet5. De intakte fykobilisomene isolert i figur 2 tilhører den hemidiscoidale formen som omtalt i tidligere publikasjoner7,13,36. Den øvre brøkdelen som representerer dissosiert PBS, kan imidlertid også inneholde stangformet PBS. Syn6803 og JSC-1 koder en spesifikk stangkjernekobling CpcL, som antyder tilstedeværelsen av stangformet PBS i tillegg til den hemidiscoidale PBS6,37. Stangformet PBS er direkte identifisert i Syn6803, men ikke i JSC-17,13,37. På den annen side omdanner JSC-1 sin PBS ved å utføre type III kromatisk akklimatisering i grønt / rødt lys og fjernrødt lys fotoacclimation i rødt / fjernrødt lys6,7. Alle disse diversitetene indikerer at det kan være andre typer PBS i sukrosegradientene, i tillegg til den laveste intakte hemidiscoidale PBS-fraksjonen. For eksempel er to typer PBS til stede samtidig som Synechococcus sp. PCC 7335 og JSC-1 akklimatiserer seg til fjernrødt lys8,13. Det foreslås at personen som isolerer PBS fra en ukarakterisert cyanobakteriell stamme, bør være mer forsiktig med å analysere hver brøkdel i sukrosegradienten for å identifisere mulige typer PBS.
Totalt sett gir denne protokollen en billig, enkel og rask metode for celleavbrudd. Det har også blitt demonstrert at denne metoden er pålitelig for å isolere PBS fra forskjellige cyanobakterier med forskjellige celletyper og PBS-komposisjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesse.
Acknowledgments
Forfatterne takker Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University for praktisk bruk av ultracentrifuge. De cyanobakterielle stammene Synechocystis sp. PCC 6803 og Leptolyngbya sp. JSC-1 ble begavet fra henholdsvis Dr. Chu, Hsiu-An ved Academia Sinica, Taiwan og Dr. Donald A. Bryant ved Pennsylvania State University, USA. Dette arbeidet ble finansiert av Vitenskaps- og teknologidepartementet (Taiwan) (109-2636-B-002-013- og 110-2628-B-002-065-) og Utdanningsdepartementet (Taiwan) Yushan Young Scholar Program (109V1102 og 110V1102).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectroscopy. |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
References
- Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model. Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).
- Glazer, A. N.
- Glazer, A. N.
- Liu, H., et al. Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria. Science. 342 (6162), 1104 (2013).
- Bryant, D. A., Canniffe, D. P. How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).
- Hirose, Y., et al. Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria. Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).
- Gan, F., et al. Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light. Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).
- Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light. Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).
- Ho, M. Y., et al. Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).
- Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. M. Chromatic Acclimation in Cyanobacteria: A diverse and widespread process for optimizing photosynthesis. Annual Review of Microbiology. 73, 407-433 (2019).
- Grossman, A. R., Schaefer, M. R., Chiang, G. G., Collier, J. L. The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions. Microbiological Reviews. 57 (3), 725-749 (1993).
- Bryant, D. A., Glazer, A. N., Eiserling, F. A. Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp. Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).
- Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light. Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).
- Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes. Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).
- Zhang, J., et al. Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica. Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).
- Li, Y., et al. Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris. Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).
- Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. E., Rios-Castro, E., Gomez-Lojero, C. Complementary chromatic and far-red photoacclimations in Synechococcus ATCC 29403 (PCC 7335). I: The phycobilisomes, a proteomic approach. Photosynthesis Research. 138 (1), 39-56 (2018).
- Yamanaka, G., Glazer, A. N., Williams, R. C. Cyanobacterial phycobilisomes. Characterization of the phycobilisomes of Synechococcus sp. 6301. Journal of Biological Chemistry. 253 (22), 8303-8310 (1978).
- Gantt, E., Lipschultz, C. A., Grabowski, J., Zimmerman, B. K. Phycobilisomes from blue-green and red algae: Isolation criteria and dissociation characteristics. Plant Physiology. 63 (4), 615-620 (1979).
- Patel, A., Mishra, S., Pawar, R., Ghosh, P. K. Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat. Protein Expression and Purification. 40 (2), 248-255 (2005).
- Zolla, L., Bianchetti, M. High-performance liquid chromatography coupled on-line with electrospray ionization mass spectrometry for the simultaneous separation and identification of the Synechocystis PCC 6803 phycobilisome proteins. Journal of Chromatography A. 912 (2), 269-279 (2001).
- Soni, B., Kalavadia, B., Trivedi, U., Madamwar, D. Extraction, purification and characterization of phycocyanin from Oscillatoria quadripunctulata-Isolated from the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, India. Process Biochemistry. 41 (9), 2017-2023 (2006).
- Williams, J. G. K. Methods in Enzymology. , Academic Press. 766-778 (1988).
- Brown Igor, I., et al. Polyphasic characterization of a thermotolerant siderophilic filamentous cyanobacterium that produces intracellular iron deposits. Applied and Environmental Microbiology. 76 (19), 6664-6672 (2010).
- Wang, L., et al. Isolation, purification and properties of an R-phycocyanin from the phycobilisomes of a marine red macroalga Polysiphonia urceolata. PLoS One. 9 (2), 87833 (2014).
- Berkelman, T. R., Lagarias, J. C. Visualization of bilin-linked peptides and proteins in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 156 (1), 194-201 (1986).
- Rigbi, M., Rosinski, J., Siegelman, H. W., Sutherland, J. C. Cyanobacterial phycobilisomes: Selective dissociation monitored by fluorescence and circular dichroism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (4), 1961-1965 (1980).
- Dubbs, J. M., Bryant, D. A. Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409. Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).
- Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).
- Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002. Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).
- Zhang, S., Bryant, D. A. Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212. Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).
- Huang, J. Y., et al. Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Biochemistry. 55 (15), 2214-2226 (2016).
- Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris - A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f. Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga. Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).
- Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).
- Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).
- Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna. Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).
