Summary
Detta protokoll tillhandahåller en snabb och storleksspecifik isoleringsmetod för små extracellulära vesiklar genom att optimera storleken på luftsprutmunstycket, mantelvätsketrycket, provflödestrycket, spänningen, förstärkningen och utlösande tröskelparametrarna.
Abstract
Små extracellulära vesiklar (sEV) kan frisättas från alla celltyper och bära protein, DNA och RNA. Signalmolekyler tjänar som indikatorer på cellens fysiologiska och patologiska tillstånd. Det finns dock ingen standardmetod för sEV-isolering, vilket förhindrar nedströms biomarköridentifiering och läkemedelsinterventionsstudier. I den här artikeln tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för isolering och rening av 50-200 nm sEV av en flödescellsorterare. För detta valdes ett 50 μm munstycke och 80 psi mantelvätsketryck för att få en bra sorteringshastighet och stabil sidoström. Standardstora polystyrenmikrosfärer användes för att lokalisera populationer av 100, 200 och 300 nm partiklar. Med ytterligare optimering av utlösningströskeln för spänning, förstärkning och framåtspridning (FSC) kan sEV-signalen separeras från bakgrundsbruset. Dessa optimeringar ger en panel med kritiska sorteringsinställningar som gör att man kan få en representativ population av sEV med endast FSC kontra sidospridning (SSC). Den flödescytometribaserade isoleringsmetoden möjliggör inte bara analys med hög genomströmning utan möjliggör också synkron klassificering eller proteomanalys av sEV baserat på biomarköruttrycket, vilket öppnar många forskningsapplikationer nedströms.
Introduction
En cell släpper ut extracellulära vesiklar (EV) av varierande storlek som resulterar i signalmolekyler och membraninneslutningar, vilket är viktigt för intercellulär kommunikation1. EV i olika storlekar spelar också olika biologiska roller, med 50-200 nm sEV som exakt kan distribuera RNA, DNA och proteiner till rätt extracellulär plats. EV hjälper också till att bestämma deras utsöndringsmekanismer, som inte bara involverar reglering av normala fysiologiska processer som immunövervakning, stamcellsunderhåll, blodkoagulation och vävnadsreparation utan också patologin bakom flera sjukdomar som tumörprogression och metastasering 2,3. Effektiv isolering och analys av sEV är avgörande för att identifiera biomarkörer och utforma framtida läkemedelsinterventioner.
Med kontinuerlig forskning om den kliniska tillämpningen av sEV har isoleringsmetoderna för sEV ställt högre krav. På grund av heterogeniteten hos sEV i storlek, källa och innehåll, liksom deras likhet med andra EV i fysikalisk-kemiska och biokemiska egenskaper, finns det ingen standardmetod för sEV-isolering 4,5. För närvarande är ultracentrifugering, storleksuteslutningskromatografi (SEC), polymerutfällning och immunoaffinitetsinfångning de vanligaste sEV-isoleringsmetoderna6. Ultracentrifugering är fortfarande guldstandarden för sEV-isolering inom forskning, trots att den är tidskrävande, vilket resulterar i låg renhet med en bred storleksfördelning på 40-500 nm och betydande mekaniska skador på sEV efter långvarig centrifugering 7,8,9. Polymerutfällning, som vanligtvis använder polyetylenglykol (PEG), lider av oacceptabel renhet för efterföljande funktionell analys med samtidig utfällning av extracellulära proteinaggregat och polymerkontaminering10,11. Immunoaffinitetsinfångningsbaserade metoder kräver högkostnadsantikroppar med varierande specificitet, samt har problem med låg bearbetningsvolym och ger12,13,14. Partikelstorlek är en av huvudindikatorerna för att utvärdera renheten hos isolerad sEV. Även om sEV-renhet fortfarande är ett ouppnåeligt mål, tar SEC bort en betydande mängd medelkomponenter, och sEV-partiklarna extraherade med SEC-metoden ligger huvudsakligen i intervallet 50-200 nm15. De befintliga teknikerna har några nackdelar, inklusive men inte begränsat till att vara tidskrävande, låg renhet, lågt utbyte, dålig reproducerbarhet, låg genomströmning av prover och potentiell skada på sEV, vilket gör den oförenlig med klinisk användning16. Således är en snabb, billig och storleksspecificerad sEV-isoleringsmetod som är tillämplig på olika biofluider ett väsentligt behov i flera forsknings- och kliniska situationer.
I flödescytometri analyseras enskilda partiklar på ett multiparametriskt sätt med hög genomströmning och delmängder sorteras ut17. På grund av EV: s heterogenitet skulle en cytometrisk mätning av partikelflöde vara idealisk, som har använts för att undersöka EV efter paradigmerna för cellanalys, med ljusspridnings- och fluorescensetiketter som används för att identifiera fysiologirelaterade egenskaper och proteinkomponenter18,19,20. Ändå utmanas konventionell flödescytometri av den lilla storleken på sEV och låg överflöd av ytbiomarkörer. Flödescytometrins känslighet kan förbättras genom att optimera detektionsparametrar för att skilja bakgrundsbrus och sEV oavsett om man använder framåtspridning (FSC), sidospridning (SSC) eller fluorescenströskel som utlöser parameter19.
Med det nuvarande protokollet optimerades högupplösta flödescytometriska sorteringsinställningar med fluorescerande pärlor som standard. Genom att välja rätt munstycksstorlek, mantelvätsketryck, tröskelutlösningsparameter och spänningar som styr spridda ljusintensiteter kunde vi isolera en specifik delmängd av sEV från en komplex blandning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellodling
- Förbered ett odlingsmedium av Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS). Odla den humana bukspottkörtelcancercellen, PANC-1, i en 75 cm2 odlingskolv med en densitet av 1 x 106 celler/ml. Inkubera kulturen vid 37 °C med 5 %CO2.
- Subkultur cellerna när celldensiteten når 75% -80% under mikroskopisk observation. Ta bort mediet och skölj 2x med 3-5 ml fosfatbuffertsaltlösning (PBS; 0,01 M, pH 7,2-7,4).
- Kassera lösningen, tillsätt 1-2 ml trypsin-EDTA-lösning och låt cellerna lossna tills de blir rundade och suspenderade i mediet under mikroskopet. Tillsätt färskt medium, aspirera och dispergera i 75 cm2 odlingskolvar med 15 ml odlingsmedium. Använd ett delodlingsförhållande på 1:2 till 1:4 (rekommenderas).
OBS: Alla operationer utförs i ett biosäkerhetsskåp för att undvika cellkontaminering.
2. Insamling av kulturmedium
- Inkubera cellerna i 48 timmar vid 37 °C med 5 %CO2. Samla upp cellsupernatant (90 ml) i två 50 ml centrifugrör och centrifugera vid 300 x g i 10 minuter vid 4 °C.
- Överför supernatanten till nya sterila rör och centrifugera successivt vid 2 000 x g i 20 minuter, 10 000 x g i 30 minuter och 12 000 x g i 70 minuter vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och skölj pelleten med 10 ml PBS genom att pipettera försiktigt. Centrifugera vid 12 000 x g i 70 minuter vid 4 °C igen och suspendera pelleten igen i 10 ml PBS-buffert för att erhålla en blandning av EV.
- Utför nanopartikelspårningsanalys (NTA) för att kvantifiera och dimensionera EV-blandningen. Utför NTA-analysen enligt instrumentets referenshandbok och referens21.
3. Sortering av celler
- Utför standardstartproceduren för flödescellsorteraren. Slå PÅ maskinen genom att trycka på startknappen . Klicka på laserströmknappen på laserkontrollpanelen . Tryck på knappen Byt tankar i undermenyn smart sampler för att trycksätta fluidiken.
OBS: Se till att avfallstanken är tom och att manteltanken är full innan du startar. - Använd ett ultraljudsrengjort 50 μm jet-in-air-munstycke och installera det på munstycksenheten. Justera trycket till 80 psi för mantelvätska och 80,3 psi för provflöde på tryckkonsolen.
- Tryck på knappen Start Sheath Flow för att starta mantelströmmen. Klicka på bubbelknappen i undermenyn för smarta prover för att automatiskt debubbla i 10 minuter och stäng sedan av den.
OBS: För cellsortering kräver olika storlekar av luftsprutmunstycken olika mantelvätsketryck för att upprätthålla vätskeflödesstabiliteten. I denna metod användes ett munstycke på 50 μm, och endast ett mantelvätsketryck större än eller lika med 80 psi kunde generera stabila sidoströmmar. Tryckskillnaden mellan provflödet och mantelvätskan bestämmer sorteringens belastningshastighet. Under metodens inställningsvillkor (tryckskillnaden mellan provflödet och mantelvätskan är 0,3-0,6 psi) var vätskeflödet relativt stabilt och belastningshastigheten gjorde det möjligt för sorteringseffektiviteten att öka till 80% från 50% för tryckskillnad mindre än 0,3-0,6 psi. - Rikta in strömmen och bestäm laserfläcken. Slå PÅ belysningskammarens ljus för att se strömmen över pinhålen. Justera mikrometrarna upp och ner, vänster och höger och fram och bak för att centrera strömmen på nålhålet och fokusera strömmen.
- Välj fliken Laser- och strömskärningspunkt . Tryck kontinuerligt på den gröna pilknappen när du uppmanas att slutföra kalibreringsprocessen för laserskärning och munstycksjustering.
- Gå till den fina laserjusteringsskärmen. Välj 640-722/44 (H)-kanal som X-axelparameter och 405-448/59 (H) -kanal som Y-axelparameter. Tryck på triggerparameterväljaren och välj SSC-parametern för 488 nm-lasern. Öppna alla laserluckor.
OBS: De X-axel- och Y-axelparametrar som väljs beror på systemets laserkonfiguration. Andra parametrar är tillåtna om systemet inte har en 640 nm eller 405 nm laser. För bästa resultat, välj lasrar med den största rumsliga separationen på pinhole-remsan (exklusive 355 nm-lasern). - Späd regnbågens fluorescerande partiklar genom att tillsätta en droppe i 1 ml dubbeldestillerat vatten för en slutlig koncentration av 1 x 106 pärlor per ml. Öppna dörren till provkammaren och ladda ett rör av de beredda fluorescerande regnbågspartiklarna.
- Tryck på knappen Starta exempel . Justera upp och ner mikrometrar för att optimera fluorescensintensiteten, vilket gör varje signal så intensiv som möjligt. Tryck på knappen Starta kvalitetskontroll (QC) på pekskärmens kontrollpanel för att utföra QC automatiskt.
- Utför droppfördröjning. Öppna sorteringsinställningsskärmen och välj knappen för fördröjning. Tryck på knappen IntelliSort Initialization . Instrumentet justerar automatiskt frekvensen och amplituden för dropposcillation för att erhålla droppfördröjningen på 25 ± 5 och kunna visualisera droppens brytpunkt tydligt. Tryck på knappen Underhåll .
- Välj rör som sorteringsutdatatyp. Placera en 15 ml rörhållare i sorteringskammaren. Slå på plattspänningen och ställ in plattspänningen på cirka 4000 V.
- Aktivera testmönstret genom att välja knappen Streamkonfiguration . Justera laddningsfasreglaget och avböjningsreglaget för att säkerställa att bilden av strömmen är i linje med uppsamlingsröret. Välj knappen Bocka .
- Logga in på Summit-arbetsstationen på datorn. Skapa ett nytt protokoll från huvudmenyn Arkiv. Skapa ett punktdiagram genom att välja fliken Histogram i kontrollpanelen för Summit-programvaran.
- Högerklicka på axlarna i det nya punktdiagrammet på arbetsytan och välj FSC som X-axelparameter och SSC som Y-axelparameter. Presentera FSC och SSC i logaritmisk form.
- Välj fliken Anskaffning och leta reda på panelen för anskaffningsparametrar. Aktivera alla signaler i undermenyn för aktiveringsparametrar. Välj FSC som utlösarparameter och ställ in tröskelvärdet på 0,01. Justera spänningen och förstärkningen för FSC och SSC vid 250 och 0,6 för att säkerställa att händelser inom FSC kontra SSC-området och populationerna separeras.
OBS: Tröskelinställning motsvarar inställning av partikelstorleken som kan detekteras med flödescytometri. Ju större tröskeln är, desto större blir de detekterade partiklarna, och de små partiklarna kommer att skäras av tröskeln och kan inte detekteras. I denna metod är tröskeln inställd på 0, 01, så alla partiklar som är större än elektroniskt brus kan detekteras.
4. Isolering av sEV
- Späd de fluorescerande polystyrenmikrosfärerna till suspensioner på 100 nm, 200 nm och 300 nm. Tillsätt 1 μL mikrosfärer till 1 ml dubbeldestillerat vatten.
- Ladda mikrosfärupphängningen successivt. Välj Start under förvärvsmenyn för summit software och spela in 20 000 händelser.
OBS: Antalet händelser är valfritt. Inte mindre än 5 000 händelser rekommenderas för att uppfylla statistisk signifikans. - Högerklicka på punktdiagrammet FSC vs. SSC för att skapa rektanglar och dra för att ändra storlek och flytta regionerna med elektroniskt brus och 100 nm mikrosfärpopulation. Högerklicka på regionerna för att byta namn på dem som R7 respektive R4. Upprepa stegen ovan för att rama in 200 nm och 300 nm mikrosfärerna med rektanglar successivt och byt namn på dem till R5 respektive R6.
- Slutligen bestäm sorteringsområdet 50-200 nm baserat på det elektroniska bruset och positionen för 200 nm partiklar definierade som R8.
OBS: Den nedre detektionsgränsen på 50 nm placeras strax ovanför det elektroniska bruset i flödescellsorteraren. Området mellan bullret och 200 nm mikrosfärpopulationen kan därför definieras till mellan 50-200 nm. - Redigera sorteringsbeslut på sorteringslogik- och statistikpanelen. Dubbelklicka på det tomma fältet i den vänstra (L1) strömmen. Välj området R8 för att skapa sorteringslogiken. Välj renhetsläget Avbryt och välj ett droppkuvert med 1 droppe för L1-strömmen.
- Ladda 500 μL prov av EV-blandning från steg 2.3. Tryck på Start-knappen under förvärvsmenyn i Summit för att hämta data och tryck sedan på Start i sorteringsmenyn för att samla in 50-200 nm sEV i ett 15 ml centrifugrör.
OBS: En steril miljö är nödvändig för att minimera kontaminering under alla procedurer. - Observera närvaron av sEV genom transmissionselektronmikroskopi (TEM) och verifiera partikelstorleken hos sEV med NTA. Utför western blot-analys (WB) för att ytterligare bekräfta uttrycket av CD9-, CD63- och CD81-markörer18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flödesschemadiagrammet för experimentprotokollet visas i figur 1. I denna metod användes standardstora polystyrenmikrosfärer som referensstandarder för partikelstorleksfördelning. Under det specifika instrumentella parametervillkoret kunde partikelsignalen tydligt särskiljas från bakgrundsbruset i FSC vs. SSC-diagrammet med hjälp av den logaritmiska formen. Gating strategier visas i figur 2. R4, R5 och R6 hänvisar till positionerna för 100 nm, 200 nm respektive 300 nm mikrosfärer. R7 är detektionsgränsen för elektroniskt brus under 50 nm och R8 är positionsområdet för 50-200 nm partiklar.
Partikelstorleksfördelningen för EV-blandningen härledd från PANC-1-celler låg i det breda intervallet 40-400 nm efter ultracentrifugering (figur 3). För att isolera och rena 50-200 nm sEV utfördes flödescytometrisk sortering för att erhålla den specifika storleken sEV enligt placeringen av standardmikrosfärer (figur 4). Kvaliteten på isoleringen verifierades av NTA, och det visade sig att partikelstorleksintervallet för sEV efter sortering var mellan 50-200 nm (som visas i figur 5). Förekomsten av sEV observerades ytterligare med TEM, indikerad med röda pilar i figur 6A, och de isolerade sEV bekräftades innehålla markörer för CD9, CD63 och CD81 genom WB-analys (figur 6B).
Figur 1. Flödesschemadiagram för experimentprotokollet. PANC-1-cellodlingsmediet samlades in och ultracentrifugerades för att erhålla EV-blandningen. Sorteringsparametrarna optimerades för isolering och rening av 50-200 nm sEV vilket verifierades av NTA. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Flödescytometrianalys av polystyrenmikrosfärer i standardstorlek för att lokalisera storleksintervallet 50-200 nm i FSC kontra SSC-diagrammet. Utspädda suspensioner av 100 nm, 200 nm och 300 nm mikrosfärer laddades och analyserades av en flödescytometer som visas i FSC vs. SSC dot plot. R4, R5 och R6 avser positionerna för 100 nm, 200 nm respektive 300 nm partiklar. R7 är det elektroniska bruset som detektionsgräns för 50 nm partiklar, och R8 representerar positionsområdet för 50-200 nm partiklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. NTA-analys av partikelstorleksfördelning av EV erhållen genom ultracentrifugering. Frekvensfördelningen för olika partikelstorlekar representeras av data som partikelprocent kontra storlek. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. Flödescytometrianalys av det insamlade EV-provet. Punktdiagrammet FSC vs SSC visar ett prov av den uppsamlade EV-blandningen laddad och analyserad av en flödescytometer. SEV i storleksintervallet 50-200 nm inom R8-regionen sorterades. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5. Verifiering av partikelstorleksfördelning av sEV efter sortering med NTA. Histogrammet representativ partikelprocent kontra storlek visar storleksfördelningen för den sorterade sEV. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6. Karakterisering av sEV isolerad genom sortering. (A) En representativ TEM-bild av sorterad sEV (indikeras med röda pilar). Skalstång = 200 nm. (B) Western blot-analys av CD9-, CD81- och CD63-markörer i den sorterade sEV. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en optimerad metod för att isolera och rena sEV med den angivna partikelstorleken 50-200 nm med hjälp av en flödescellsorterare, som validerades av NTA. Metoden löste flaskhalsproblemet med att erhålla sEV med enhetlig partikelstorlek och hög renhet, vilket undviker störningar från obesläktade biologiska molekyler inslagna i stora EV22. Snabba analyser med hög genomströmning är möjliga med flödescytometri, som kan fånga 100 000 partiklar per sekund och fatta 70 000 sorteringsbeslut per sekund17, vilket kraftigt minskar tiden och återspeglar heterogeniteten hos sEV-partiklar. Dessutom kan detta flödescytometribaserade protokoll anpassas baserat på individuella intressen i subpopulationer av EV av specifika storlekar. Alternativa grindintervall kan användas för att identifiera och isolera populationerna av intresse med samma instrumentparametrar inställda som ovan, såsom luftsprutmunstycke, mantelvätsketryck, provflödestryck och utlösande tröskelparameter.
Den tekniska svårigheten med denna metod ligger i separationen av populationer med olika storleksintervall, vilket särskilt skiljer sig från bakgrundsbrus. Vi identifierade en panel med kritiska sorteringsinställningar. För det första påverkar munstyckets storlek sorteringshastigheten. För att förbättra koncentrationen av sEV erhållen genom sortering används ett 50 μm munstycke i denna metod och 80 psi mantelvätsketryck krävs för att stabilisera sidoströmmen. Med högre mantelvätsketryck ökar fallfrekvenserna, vilket resulterar i högre händelsehastigheter och kortare sorteringstid23. Ökande mantelvätsketryck dämpar emellertid känsligheten hos FSC- och fluorescenssignaler på grund av den minskade tiden det tar att passera genom lasern och antalet fotoner som når detektorn24. Det är särskilt svårt att bibehålla sidoströmmens stabilitet under detta tryck, vilket kräver hög renhet hos munstycket och rörledningen. För det andra rekommenderas ultraljudsrengöring av munstycket och spolning av flödescytometrirör starkt för att öka sannolikheten för experimentell framgång. Slutligen är spänning och förstärkning avgörande för befolkningsseparation, särskilt för små partiklar. Här kan en spänning på 250 V och förstärkning på 0,6 effektivt separera sEV vid 50-200 nm med FSC-utlösning och plotta i logaritmisk form.
En varning för tillvägagångssättet är att koncentrationen av sEV i vissa fall är för hög, eller sEV-aggregatet, under sorteringsprocessen, vilket gör det svårt att uppnå en enpartikelsuspension. Den aggregerade sEV kommer att kasseras på grund av den överförstärkta signalen.
Sammantaget, med fördelarna med analys av flödescytometri med hög genomströmning, optimerade denna metod munstycksstorlek, mantelvätsketryck, provflödestryck och utlösande tröskelparameter som ledde till framgångsrik isolering av 50-200 nm sEV. Dessutom möjliggör denna metod inte bara separation av partiklar av specifik storlek, utan möjliggör också synkron klassificering eller proteomanalys av sEV baserat på antigenuttryck, vilket öppnar många forskningstillämpningar nedströms.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Scientific Research Fund of Zhejiang Chinese Medicine University (2020ZG29), Basic Public Welfare Research Project of Zhejiang Province (LGF19H150006, LTGY23B070001), Project of Zhejiang Provincial Department of Education (Y202147028) och Project of Experimental Technology of Zhejiang University Laboratory Department (SJS201712, SYB202130).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Beckman Coulter | 344058 | |
| Culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | SUER | SUER050QY | |
| Flow cell sorter | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| Human pancreatic cancer cell, PANC-1 | NA | NA | PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University |
| Laser particle size and zeta potential analyzer | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco | C20012500BT | |
| Polystyrene fluorescent microspheres | Beckman Coulter | 6602336 | |
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-1200EX | |
| Trypsin-EDTA solution | Gibco | 1713949 | |
| Ultra rainbow fluorescent particles | Beckman Coulter | B28479 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW32TI |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Smith, Z. J., et al. Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Shao, H., et al. Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma. Nature Communications. 6, 6999 (2015).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- McKinnon, K. M.
- Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry. Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).
- Nolan, J. P., Duggan, E. Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).
- Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system. Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).
