Summary
이 프로토콜은 공기 분무 노즐의 크기, 시스 유체 압력, 샘플 흐름 압력, 전압, 이득 및 트리거링 임계값 매개변수를 최적화하여 작은 세포외 소포에 대한 신속하고 크기별 분리 방법을 제공합니다.
Abstract
작은 세포외 소포(sEV)는 모든 세포 유형에서 방출될 수 있으며 단백질, DNA 및 RNA를 운반할 수 있습니다. 신호 분자는 세포의 생리적 및 병리학적 상태를 나타내는 지표 역할을 합니다. 그러나 다운스트림 바이오마커 식별 및 약물 개입 연구를 방해하는 sEV 분리를 위한 표준 방법은 없습니다. 이 기사에서는 플로우 셀 분류기에 의한 50-200nm sEV의 분리 및 정제를 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이를 위해 50μm 노즐과 80psi 시스 유체 압력을 선택하여 우수한 분류 속도와 안정적인 측류를 얻었습니다. 표준 크기의 폴리스티렌 미소 구체는 100, 200 및 300 nm 입자의 집단을 찾는 데 사용되었습니다. 전압, 이득 및 순방향 산란(FSC) 트리거 임계값을 추가로 최적화하면 sEV 신호를 배경 잡음과 분리할 수 있습니다. 이러한 최적화는 FSC 대 측면 산란(SSC)만 사용하여 sEV의 대표 모집단을 얻을 수 있는 중요한 정렬 설정 패널을 제공합니다. 유세포 분석 기반 분리 방법은 고처리량 분석을 가능하게 할 뿐만 아니라 바이오마커 발현을 기반으로 sEV의 동기식 분류 또는 프로테옴 분석을 가능하게 하여 수많은 다운스트림 연구 응용 분야를 열어줍니다.
Introduction
세포는 다양한 크기의 세포외 소포체(EV)를 방출하여 세포간 통신에 중요한 신호 분자와 막 내포물을 생성합니다1. 다양한 크기의 EV는 또한 50-200nm sEV가 RNA, DNA 및 단백질을 올바른 세포외 위치에 정확하게 분배할 수 있는 다양한 생물학적 역할을 합니다. sEV는 또한 면역 감시, 줄기 세포 유지, 혈액 응고 및 조직 복구와 같은 정상적인 생리적 과정의 조절뿐만 아니라 종양 진행 및 전이와 같은 여러 질병의 기저에 있는 병리를 포함하는 분비 메커니즘을 결정하는 데 도움이 됩니다 2,3. sEV의 효과적인 분리 및 분석은 바이오마커를 식별하고 향후 약물 개입을 설계하는 데 중요합니다.
sEV의 임상 적용에 대한 지속적인 연구로 sEV의 격리 방법은 더 높은 요구 사항을 제시했습니다. 크기, 출처 및 함량이 sEV의 이질성과 물리화학적 및 생화학적 특성에서 다른 EV와의 유사성으로 인해 sEV 분리를 위한 표준 방법이 없습니다 4,5. 현재, 초원심분리, 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 폴리머 침전, 면역친화성 포획이 가장 일반적인 sEV 분리 방법이다6. 초원심분리는 시간이 많이 소요됨에도 불구하고 연구에서 sEV 분리의 황금 표준으로 여전히 40-500nm의 넓은 크기 분포로 순도가 낮고 장기간 원심분리후 sEV에 상당한 기계적 손상을 입힙니다 7,8,9. 일반적으로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 사용하는 고분자 침전은 세포 외 단백질 응집체 및 고분자 오염의 수반되는 침전과 함께 후속 기능 분석에 대해 허용 할 수없는 순도로 어려움을 겪습니다10,11. 면역친화성 포획 기반 방법은 다양한 특이성을 갖는 고가의 항체를 필요로 할 뿐만 아니라 낮은 처리 부피 및 수율12,13,14에 문제가 있습니다. 입자 크기는 분리된 sEV의 순도를 평가하는 주요 지표 중 하나입니다. sEV 순도는 달성할 수 없는 목표로 남아 있지만 SEC는 상당한 양의 중간 성분을 제거하며 SEC 방법으로 추출된 sEV 입자는 주로 50-200nm범위에 있습니다 15. 기존 기술은 시간 소모적이고, 순도가 낮고, 수율이 낮고, 재현성이 낮고, 시료 처리량이 낮고, sEV의 잠재적 손상이 있어 임상적 활용과 양립할 수 없는 몇 가지 단점이 있다16. 따라서 다양한 생체 유체에 적용할 수 있는 빠르고 저렴하며 크기가 지정된 sEV 분리 방법은 여러 연구 및 임상 상황에서 필수적인 요구 사항입니다.
유세포 분석에서, 단일 입자는 높은 처리량, 다중모수 방식으로 분석되고, 부분집합은 분류된다17. EV의 이질성으로 인해, 단일 입자 유세포 측정이 이상적일 것이며, 이는 세포 분석의 패러다임에 따라 EV를 조사하는 데 사용되어 왔으며, 광 산란 및 형광 표지는 생리학 관련 특징 및 단백질 성분을 식별하는 데 사용됩니다18,19,20. 그럼에도 불구하고 기존의 유세포 분석은 sEV의 크기가 작고 표면 바이오마커가 적기 때문에 어려움을 겪고 있습니다. 유세포 분석의 감도는 전방 산란(FSC), 측면 산란(SSC) 또는 형광 임계값 트리거 파라미터19를 사용하는 것과 관계없이 배경 잡음과 sEV를 구별하기 위해 검출 파라미터를 최적화함으로써 향상될 수 있습니다.
현재 프로토콜에서는 형광 비드를 표준으로 사용하여 고분해능 유세포 분석 정렬 설정을 최적화했습니다. 적절한 노즐 크기, 피복액 압력, 임계값 트리거링 매개변수 및 산란광 강도를 제어하는 전압을 선택하여 복잡한 혼합물에서 sEV의 특정 하위 집합을 분리할 수 있었습니다.
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Protocol
1. 세포 배양
- 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)의 배양 배지를 준비합니다. 인간 췌장암 세포인 PANC-1을 75cm2 배양 플라스크에서 1 x 106 cells/mL의 밀도로 배양합니다. 배양물을 5%CO2와 함께 37°C에서 배양한다.
- 세포 밀도가 현미경 관찰에서 75%-80%에 도달할 때 세포를 계대 배양합니다. 배지를 제거하고, 3-5 mL의 인산염 완충 식염수(PBS; 0.01 M, pH 7.2-7.4)로 2x 헹굽니다.
- 용액을 버리고 1-2mL의 트립신-EDTA 용액을 추가하고 현미경으로 배지에 둥글게 될 때까지 세포가 분리되도록 합니다. 신선한 배지를 추가하고, 흡인하고, 15 mL 배양 배지와 함께 75cm2 배양 플라스크에 분산시킨다. 1:2에서 1:4의 하위 재배 비율을 사용합니다(권장).
알림: 모든 작업은 세포 오염을 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다.
2. 배양 배지 수집
- 세포를 5%CO2와 함께 37°C에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 세포 상층액(90mL)을 2개의 50mL 원심분리기 튜브에 수집하고 4°C에서 10분 동안 300x g 로 원심분리합니다.
- 상청액을 새로운 멸균 튜브로 옮기고 4°C에서 2,000 x g에서 20분, 10 x g에서 30분, 12,000 x g에서 70분 동안 연속적으로 원심분리합니다.
- 상층액을 제거하고 부드럽게 피펫팅하여 10mL의 PBS로 펠릿을 헹굽니다. 다시 4°C에서 70분 동안 12,000 x g 에서 원심분리하고, 펠렛을 10 mL의 PBS 완충액에 재현탁하여 EVs의 혼합물을 얻었다.
- 나노 입자 추적 분석(NTA)을 수행하여 EV 혼합물을 정량화하고 크기를 측정합니다. 기기 작동 참조 매뉴얼 및 참조21에 따라 NTA 분석을 수행합니다.
3. 세포 분류
- 플로우 셀 분류기의 표준 시작 절차를 수행합니다. 시작 버튼을 눌러 기기를 켭니다. 레이저 제어판에서 Laser Power 버튼을 클릭합니다. Smart sampler 하위 메뉴의 Change Tanks 버튼을 눌러 유체 장치에 압력을 가합니다.
알림: 시작하기 전에 폐기물 탱크가 비어 있고 피복 탱크가 가득 찼는지 확인하십시오. - 초음파로 세척된 50μm 제트 인 에어 노즐을 사용하여 노즐 어셈블리에 설치합니다. 압력을 시스 유체의 경우 80psi로, s의 경우 80.3psi로 조정합니다.amp압력 콘솔의 흐름.
- 피복 흐름 시작(Start Sheath Flow) 버튼을 눌러 피복 스트림 흐름을 시작합니다. 스마트 샘플러 하위 메뉴에서 버블 버튼을 클릭하여 10분 동안 자동으로 버블을 제거한 다음 끕니다.
알림: 세포 분류의 경우 다양한 크기의 공기 분무 노즐은 액체 흐름 안정성을 유지하기 위해 서로 다른 피복 유체 압력이 필요합니다. 이 방법에서는 50μm의 노즐을 사용했으며 80psi 이상의 시스 유체 압력에서만 안정적인 측류를 생성할 수 있었습니다. 시료 흐름과 시스 유체 사이의 압력 차이는 분류의 로딩 속도를 결정합니다. 방법의 설정 조건(샘플 흐름과 시스 유체 사이의 압력 차이는 0.3-0.6psi)에서 액체 흐름은 비교적 안정적이었고 로딩 속도로 분류 효율이 0.3-0.6psi 미만의 압력 차이에 대해 50%에서 80%로 증가했습니다. - 스트림을 정렬하고 레이저 스폿을 결정합니다. 조명 챔버 조명을 켜서 view 핀홀 위의 스트림. 위아래, 왼쪽, 오른쪽, 앞뒤 마이크로미터를 조정하여 스트림을 핀홀의 중앙에 배치하고 스트림의 초점을 맞춥니다.
- Laser and Stream Intercept(레이저 및 스트림 인터셉트) 탭을 선택합니다. 프롬프트에 따라 녹색 화살표 버튼을 계속 눌러 레이저 인터셉트 및 노즐 정렬 보정 프로세스를 완료합니다.
- 미세 레이저 정렬 화면에 액세스합니다. X축 매개변수로 640-722/44( H) 채널을 선택하고 Y축 매개변수로 405-448/59(H) 채널을 선택합니다. 트리거 매개변수 선택기 를 누르고 488nm 레이저의 SSC 매개변수를 선택합니다. 모든 레이저 셔터를 엽니다.
알림: 선택한 X축 및 Y축 매개변수는 시스템의 레이저 구성에 따라 다릅니다. 시스템에 640nm 또는 405nm 레이저가 없는 경우 다른 매개변수가 허용됩니다. 최상의 결과를 얻으려면 핀홀 스트립에서 공간 분리가 가장 큰 레이저를 선택하십시오(355nm 레이저 제외). - 이중 증류수 1mL에 1방울을 넣어 최종 농도가 1 x 10mL당 6 비드가 되도록 무지개 형광 입자를 희석합니다. 샘플 챔버의 도어를 열고 준비된 무지개 형광 입자의 튜브를 로드합니다.
- 샘플 시작 버튼을 누릅니다. 상하 마이크로미터를 조정하여 형광 강도를 최적화하여 각 신호를 최대한 강렬하게 만듭니다. 터치스크린 제어판의 품질 관리(QC) 시작 버튼을 누르면 자동으로 QC가 수행됩니다.
- 드롭 지연을 수행합니다. 정렬 설정 화면에 액세스하여 드롭 지연 버튼을 선택합니다. IntelliSort 초기화 단추를 누릅니다. 계기는 자동적으로 25 ± 5의 하락 지연을 얻고 하락의 끊는 점을 명확하게 가시화할 수 있기 위하여 진동의 빈도 그리고 진폭을 조정합니다. 유지 관리 버튼을 누릅니다.
- 정렬 출력 유형으로 튜브를 선택합니다. 분류 챔버에 15mL 튜브 홀더를 놓습니다. 플레이트 볼륨을 켭니다tage ON하고 플레이트 voltage를 약 4000V로 설정합니다.
- 스트림 설정 단추를 선택하여 테스트 패턴을 켭니다. 충전 위상 슬라이더와 편향 슬라이더를 조정하여 스트림의 이미지가 수집 튜브와 정렬되도록 합니다. 확인 표시 단추를 선택합니다.
- 컴퓨터에서 Summit 워크스테이션에 로그인합니다. 파일 주 메뉴에서 새 프로토콜을 만듭니다. Summit 소프트웨어 제어판에서 히스토그램 탭을 선택하여 점도표를 만듭니다.
- 작업 공간에서 새 도트 플롯의 좌표축을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 X축 매개변수로 FSC 를 선택하고 Y축 매개변수로 SSC 를 선택합니다. FSC와 SSC를 로그 형식으로 표시합니다.
- 획득 탭을 선택하고 획득 매개변수 패널을 찾습니다. 활성화 매개변수의 하위 메뉴에서 모든 신호를 활성화합니다. 트리거 매개변수로 FSC를 선택하고 임계값을 0.01로 설정합니다. FSC 및 SSC의 전압과 이득을 250 및 0.6으로 조정하여 FSC 대 SSC 플롯 내의 이벤트와 모집단이 분리되도록 합니다.
참고: 임계값 설정은 유세포 분석으로 감지할 수 있는 입자 크기를 설정하는 것과 동일합니다. 임계값이 클수록 감지된 입자가 커지고 작은 입자는 임계값에 의해 차단되어 감지할 수 없습니다. 이 방법에서는 임계값이 0.01로 설정되므로 전자 노이즈보다 큰 모든 입자를 감지할 수 있습니다.
4. sEV의 격리
- 형광 폴리스티렌 마이크로스피어를 100nm, 200nm 및 300nm의 현탁액으로 희석합니다. 1 μL의 마이크로스피어를 1 mL의 이중 증류수에 넣는다.
- 마이크로스피어 서스펜션을 연속적으로 로드합니다. summit 소프트웨어의 획득 메뉴에서 시작을 선택하고 20,000개의 이벤트를 기록합니다.
참고: 이벤트 수는 선택 사항입니다. 통계적 유의성을 충족하기 위해 5,000개 이상의 이벤트가 권장됩니다. - FSC 대 SSC 도트 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 직사각형을 만들고 드래그하여 전자 노이즈 영역과 100nm 마이크로스피어 모집단의 크기와 위치를 변경합니다. 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 각각 R7 및 R4로 이름을 바꿉니다. 위의 단계를 반복하여 200nm 및 300nm 마이크로스피어를 직사각형으로 연속적으로 구성하고 각각 R5 및 R6으로 이름을 바꿉니다.
- 마지막으로, 전자 노이즈와 R8로 정의된 200nm 입자의 위치를 기반으로 50-200nm 분류 영역을 결정합니다.
알림: 50nm의 검출 하한은 플로우 셀 분류기의 전자 노이즈 바로 위에 있습니다. 따라서 노이즈와 200nm 마이크로스피어 집단 사이의 영역은 50-200nm 사이로 정의할 수 있습니다. - 정렬 논리 및 통계 패널에서 정렬 결정을 편집합니다. 왼쪽 스트림(L1)의 빈 필드를 두 번 클릭합니다. R8 이라는 영역을 선택하여 정렬 논리를 만듭니다. 순도의 중단 모드를 선택하고 L1 스트림에 대해 1방울의 드롭릿 엔벨로프를 선택합니다.
- 500μL 로드 samp2.3단계의 EV 혼합물. Summit의 수집 메뉴 아래에 있는 시작 버튼을 눌러 데이터를 수집한 다음 정렬 메뉴에서 시작을 눌러 50-200nm sEV를 15mL 원심분리기 튜브에 수집합니다.
알림: 모든 절차 중 오염을 최소화하려면 무균 환경이 필요합니다. - 투과전자현미경(TEM)으로 sEV의 존재를 관찰하고 NTA를 이용하여 sEV의 입자 크기를 검증합니다. CD9, CD63 및 CD81 마커18의 발현을 추가로 확인하기 위해 웨스턴 블롯 (WB) 분석을 수행한다.
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Representative Results
실험 프로토콜의 순서도는 그림 1에 나와 있습니다. 이 방법에서는 표준 크기의 폴리스티렌 미소 구체가 입자 크기 분포에 대한 참조 표준으로 사용되었습니다. 특정 기기 매개변수 조건에서 입자 신호는 로그 형식을 사용하여 FSC 대 SSC 플롯의 배경 잡음과 명확하게 구별될 수 있습니다. 게이팅 전략은 그림 2에 나와 있습니다. R4, R5 및 R6은 각각 100nm, 200nm 및 300nm 미소 구체의 위치를 나타냅니다. R7은 50nm 미만의 전자 노이즈 감지 한계이고 R8은 50-200nm 입자의 위치 범위입니다.
PANC-1 세포로부터 유래된 EVs 혼합물의 입자 크기 분포는 초원심분리 후 40-400 nm의 넓은 범위로 나타났다(도 3). 50-200 nm sEV를 분리하고 정제하기 위해, 표준 마이크로스피어의 위치에 따라 특정 크기의 sEV를 얻기 위해 유세포 분석 분류를 수행하였다(도 4). NTA에 의해 분리 품질이 검증되었으며, 선별 후 sEV의 입자 크기 범위는 50-200nm 사이인 것으로 나타났습니다( 그림 5 참조). sEV의 존재는 도 6A에서 적색 화살표로 표시된 TEM에 의해 추가로 관찰되었고, 분리된 sEV는 WB 분석에 의해 CD9, CD63 및 CD81의 마커를 함유하는 것으로 확인되었다(도 6B).
그림 1. 실험 프로토콜에 대한 순서도 다이어그램입니다. PANC-1 세포 배양액을 수거하고 초원심분리하여 EVs 혼합물을 얻었다. 분류 파라미터는 NTA에 의해 검증된 50-200nm sEV의 분리 및 정제를 위해 최적화되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. FSC 대 SSC 플롯에서 50-200nm 크기 범위를 찾기 위한 표준 크기의 폴리스티렌 마이크로스피어의 유세포 분석. 100 nm, 200 nm 및 300 nm 미소 구체의 희석된 현탁액을 로딩하고, FSC 대 SSC 도트 플롯에 나타낸 바와 같이 유세포 분석기에 의해 분석하였다. R4, R5 및 R6은 각각 100nm, 200nm 및 300nm 입자의 위치를 나타냅니다. R7은 50nm 입자에 대한 검출 한계로서의 전자 노이즈이고 R8은 50-200nm 입자의 위치 범위를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 초원심분리로 얻은 EV의 입자 크기 분포에 대한 NTA 분석. 다양한 입자 크기의 빈도 분포는 데이터에 의해 입자 백분율 대 크기로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 수집된 EV 샘플의 유세포 분석. FSC 대 SSC 도트 플롯은 수집된 EV 혼합물의 샘플을 유세포 분석기로 로드하고 분석한 것을 보여줍니다. R8 영역 내에서 50-200 nm의 크기 범위에서 sEV를 분류하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. NTA를 이용한 선별 후 sEV의 입도분포 검증. 대표적인 입자 백분율 대 크기 히스토그램은 정렬된 sEV의 크기 분포를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 분류에 의한 sEV의 특성 분석. (A) 정렬된 sEV의 대표적인 TEM 이미지(빨간색 화살표로 표시). 스케일 바 = 200nm. (B) 분류된 sEV에서 CD9, CD81 및 CD63 마커의 웨스턴 블롯 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 NTA에서 검증한 플로우 셀 분류기를 사용하여 지정된 입자 크기 50-200nm로 sEV를 분리하고 정제하는 최적화된 방법을 설명합니다. 이 방법은 균일한 입자 크기와 고순도의 sEV를 얻는 병목 문제를 해결하여 대형 EV에 싸인 관련 없는 생물학적 분자의 간섭을 피했습니다(22). 초당 100,000개의 입자를 포획하고 초당 70,000개의 분류 결정을 내릴 수 있는 유세포 분석을 통해 빠르고 높은 처리량의 분석이 가능하여17 시간을 크게 단축하고 sEV 입자의 이질성을 반영할 수 있습니다. 또한, 이 유세포 분석 기반 프로토콜은 특정 크기의 EV 하위 집단에 대한 개별 관심사에 따라 맞춤화할 수 있습니다. 대체 게이트 범위를 사용하여 공기 분무 노즐, 시스 유체 압력, 시료 흐름 압력 및 트리거 임계값 매개변수와 같이 위와 동일한 기기 파라미터를 설정하여 관심 모집단을 식별하고 분리할 수 있습니다.
이 방법의 기술적 어려움은 특히 배경 소음과 구별되는 다양한 크기 범위를 가진 모집단을 분리하는 데 있습니다. 중요한 정렬 설정 패널을 식별했습니다. 첫째, 노즐의 크기는 분류 속도에 영향을 미칩니다. 분류에 의해 얻어진 sEV의 농도를 향상시키기 위해, 이 방법에는 50μm 노즐이 사용되며, 측류를 안정화시키기 위해 80psi의 시스 유체 압력이 요구된다. 피복 유체 압력이 높을수록 낙하 빈도가 증가하여 이벤트 발생률이 높아지고 분류 시간이 단축됩니다23. 그러나, 증가된 시스 유체 압력은 레이저를 통과하는 데 걸리는 시간 및 검출기(24)에 도달하는 광자의 수의 감소로 인해 FSC 및 형광 신호의 감도를 감쇠시킨다. 특히, 이러한 압력 하에서 측류의 안정성을 유지하기가 어려우며, 이는 노즐 및 파이프라인의 높은 청결도를 요구한다. 둘째, 실험 성공 가능성을 높이기 위해 노즐의 초음파 세척과 유세포 분석 파이프의 세척을 강력히 권장합니다. 마지막으로, 전압과 이득은 집단 분리, 특히 작은 크기의 입자에 매우 중요합니다. 여기서 250V의 전압과 0.6의 이득은 FSC 트리거링 및 로그 형식으로 플롯을 사용하여 50-200nm에서 sEV를 효과적으로 분리할 수 있습니다.
이 접근법의 한 가지주의 사항은 경우에 따라 분류 과정에서 sEV의 농도가 너무 높거나 sEV 응집체가 너무 높아서 단일 입자 현탁액을 달성하기가 어렵다는 것입니다. 집계된 sEV는 과증폭된 신호로 인해 폐기됩니다.
종합적으로, 유세포 분석의 고처리량 분석의 장점과 함께 이 방법은 노즐 크기, 피복 유체 압력, 샘플 흐름 압력 및 트리거 임계값 매개변수를 최적화하여 50-200nm sEV의 성공적인 분리를 가능하게 합니다. 또한 이 방법은 특정 크기의 입자를 분리할 수 있을 뿐만 아니라 항원 발현을 기반으로 sEV의 동기식 분류 또는 프로테옴 분석을 가능하게 하여 수많은 다운스트림 연구 응용 분야를 열어줍니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작업은 절강 중의과 대학 과학 연구 기금 (2020ZG29), 절강 성 기본 공공 복지 연구 프로젝트 (LGF19H150006, LTGY23B070001), 절강 성 교육부 프로젝트 (Y202147028) 및 절강 대학 실험실 부서의 실험 기술 프로젝트 (SJS201712, SYB202130).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Beckman Coulter | 344058 | |
| Culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | SUER | SUER050QY | |
| Flow cell sorter | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| Human pancreatic cancer cell, PANC-1 | NA | NA | PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University |
| Laser particle size and zeta potential analyzer | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco | C20012500BT | |
| Polystyrene fluorescent microspheres | Beckman Coulter | 6602336 | |
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-1200EX | |
| Trypsin-EDTA solution | Gibco | 1713949 | |
| Ultra rainbow fluorescent particles | Beckman Coulter | B28479 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW32TI |
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