Summary
Lipidbelastede hepatocytter er iboende for leverregenerering, men går normalt tabt ved densitetsgradientcentrifugering. Her præsenterer vi en optimeret celleisoleringsprotokol, der bevarer steatotiske hepatocytter, hvilket giver repræsentative populationer af regenererende hepatocytter efter delvis hepatektomi hos mus.
Abstract
Delvis hepatektomi har været meget udbredt til at undersøge leverregenerering hos mus, men isoleringen af høje udbytter af levedygtige hepatocytter til nedstrøms enkeltcelleapplikationer er udfordrende. En markant ophobning af lipider inden for regenererende hepatocytter observeres i løbet af de første 2 dage af normal leverregenerering hos mus. Denne såkaldte forbigående regenereringsassocierede steatose (TRAS) er midlertidig, men overlapper delvist den store proliferative fase. Densitetsgradientrensning er rygraden i de fleste eksisterende protokoller til isolering af primære hepatocytter. Da gradientrensning er afhængig af cellernes tæthed og størrelse, adskiller den ikke-steatotiske fra steatotiske hepatocytpopulationer. Derfor går fede hepatocytter ofte tabt, hvilket giver ikke-repræsentative hepatocytfraktioner.
Den præsenterede protokol beskriver en nem og pålidelig metode til in vivo-isolering af regenererende hepatocytter uanset deres lipidindhold. Hepatocytter fra mandlige C57BL/6-mus isoleres 24-48 timer efter hepatektomi ved en klassisk to-trins kollaganaseperfusionsmetode. En standard peristaltisk pumpe driver de opvarmede opløsninger via det kateteriserede ringere vena cava ind i resten ved hjælp af en retrograd perfusionsteknik med udstrømning gennem portalvenen. Hepatocytter dissocieres af kollagenase for deres frigivelse fra Glissons kapsel. Efter vask og omhyggelig centrifugering kan hepatocytterne anvendes til eventuelle downstream-analyser. Afslutningsvis beskriver dette papir en ligetil og reproducerbar teknik til isolering af en repræsentativ population af regenererende hepatocytter efter delvis hepatektomi hos mus. Metoden kan også hjælpe undersøgelsen af fedtleversygdom.
Introduction
Leveren kan regenerere sig selv selv efter større vævstab. Denne unikke regenerative kapacitet illustreres eksplicit af den eksperimentelle model af delvis (70%) hepatektomi, først beskrevet hos rotter af Higgins og Anderson i 19311. I denne model fjernes 70% af leveren kirurgisk fra dyr ved at klippe større leverlober af. De resterende lapper vokser derefter gennem kompenserende hypertrofi for at genoprette den oprindelige levermasse inden for ca. 1 uge efter operationen, omend uden restaurering af den oprindelige leverarkitektur 2,3. Yderligere hepatektomier med varierende mængder vævsfjernelse er blevet udviklet, såsom 86% forlænget hepatektomi, hvor leverresten er for lille til at komme sig, hvilket i sidste ende fører til posthepatektomi leversvigt (PHLF) og efterfølgende død hos 30% -50% af dyrene 4,5,6. Disse modeller muliggør undersøgelse af normal og mislykket leverregenerering, afhængigt af mængden af resekteret væv (figur 1).
Selvom musemodeller af hepatektomier er blevet brugt med succes i mange år, har først for nylig mere avancerede analysemetoder givet mulighed for en dybere indsigt på enkeltcelleniveau. For de fleste af disse metoder er tilstedeværelsen af individuelle hepatocytter imidlertid en grundlæggende forudsætning. De fleste protokoller til isolering af primære hepatocytter er baseret på en to-trins kollaganaseperfusionsteknik og efterfølgende densitetsgradientrensning for at adskille levedygtige hepatocytter fra affald og ikke-parenkymale såvel som døde celler 7,8,9. Denne metode blev først beskrevet af Berry and Friend i 196910 og tilpasset af Seglen og kolleger i 197211,12. Da gradientcentrifugering imidlertid er afhængig af cellernes tæthed og størrelse, går lipidbelastede hepatocytter ofte tabt under standardrensning. Mens et sådant tab kan være ubetydeligt for mange forskningsspørgsmål, er det et afgørende aspekt for tidlig leverregenerering. I løbet af de første 2 dage akkumulerer hepatocytter i den regenererende muselever lipider og derved vokser i størrelse og dypper i densitet. Denne forbigående regenereringsassocierede steatose (TRAS) tjener til at tilvejebringe regenerativt brændstof og er midlertidig, men overlapper delvist den store proliferative fase og er ujævnt fordelt i leverlobulerne - leverens funktionelle enheder13,14. Efter udvidet 86%-hepatektomi forekommer TRAS imidlertid også, men vedvarer, fordi regenerering er gået i stå, og lipider ikke oxideres14. Derfor vil gradientoprensning af hepatocytter efter 70% eller 86% -hepatektomier give ikke-repræsentative fraktioner, da de fleste lipidbelastede hepatocytter går tabt på grund af deres lave densitet15.
I denne modificerede isolationsprotokol isoleres hepatocytter fra C57BL/6-mus 24-48 timer efter hepatektomi ved en klassisk to-trins kollaganaseperfusionsmetode. Normalt udføres kanylering og perfusion af resten til celleisolering via portalvenen. Imidlertid er portovaskulær resistens i små rester, der er tilbage efter større resektion, høj16, og perfusion er således delikat. Fordi vena cava forbliver upåvirket af hepatektomier, kan perfusion let udføres i retrograd retning via kanylering af vena cava. En standard peristaltisk pumpe driver de opvarmede opløsninger via det kateteriserede inferior vena cava ind i leverresten ved hjælp af retrograd perfusion med udstrømning gennem portalvenen (supplerende figur S1). Hepatocytter dissocieres af collagenaser og frigives fra Glissons kapsel. Efter vask og omhyggelig behandling af levedygtige hepatocytter ved trinvis isolering ved hjælp af en lavhastighedscentrifugeringsmetode kan hepatocytterne anvendes til eventuelle downstream-analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg var i overensstemmelse med schweiziske føderale dyreforordninger og godkendt af Zürichs veterinærkontor (nr. 007/2017, 156/2019), der sikrer menneskelig pleje. C57BL/6-hanmus i alderen 10-12 uger blev holdt på en 12 timers dag/nat-cyklus med fri adgang til mad og vand. Hver forsøgsgruppe bestod af seks til otte dyr. Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle materialer, udstyr og reagenser, der anvendes i denne protokol.
1. Delvis hepatektomi hos mus
- For standard hepatektomi (70%), ligere og resektere venstre laterallap, højre del af medianlappen og venstre del af medianlapen (figur 1B). Ved udvidet hepatektomi (86%)4 skal du også fjerne caudatlapperne og den højre forreste lap (figur 1C).
- BEMÆRK: Standard hepatektomi er en procedure, der har været anvendt i leverregenereringsforskning i mange år. Protokoller til denne procedure er tilgængelige3,17, herunder den videoassisterede protokol fra Mitchell og Willenbring 18. Yderligere oplysninger om de teknikker, der anvendes her til hepatektomier, findes i supplerende fil 1.
Figur 1: Standard (70%) og forlænget (86%) hepatektomi hos mus. (A) De fem museleverlapper og deres respektive bidrag til den samlede levervægt. (B) Skematisk illustration af 70%-hepatektomi hos mus. De mørke lapper repræsenterer den fremtidige leverrest. (C) Skematisk illustration af 86%-hepatektomi hos mus. De mørke lapper repræsenterer den fremtidige leverrest. (D) Præcis volumen af resekteret væv efter 70%- og 86%-hepatektomi. E) Musens mave umiddelbart efter 70 % hepatektomi (F) museabdomen straks (venstre) og 48 timer (højre) efter 86%-hepatektomi. Bemærk den blege farve af den steatotiske rest (hvid pil). n = 6-7/gruppe. Forkortelser: sHx = standard hepatektomi; eHx = udvidet hepatektomi; LW = levervægt. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Fremstilling af perfusionsopløsningerne
- Forbered perfusions-, fordøjelses- og konserveringsbufferne (se tabel 1).
- Alle bufferopløsningers pH-værdi justeres ved 37 °C ved tilsætning af natriumhydroxid (NaOH) eller hydrogenchlorid (HCl) efter behov. Den optimale pH for bufferne er 7,4.
- Placer konserveringsbufferen og Williams' Medium E på is.
- Forbered flowcytometribufferen og opbevar den på is.
Tabel 1: Opløsninger og buffere anvendt til fordøjelse og oprensning af hepatocytter. Klik her for at downloade denne tabel.
3. Forberedelse af perfusionsudstyr
- Vandbadet opvarmes til 42 °C og perfusionsbufferen (50 ml) og fordøjelsesbufferen (10-20 ml) anbringes i vandbadet. Tilføj ikke kollagenase til fordøjelsesbufferen endnu.
- Klargør den peristaltiske pumpe, og indsæt slangen. Den komplette perfusionsopsætning er vist i figur 2.
- Tilslut en 26 G IV-kanyle til slangens udløbende ved hjælp af et Luer-låsestik. Indsæt rørets indløbsende i det forvarmede perfusionsbufferrør i vandbadet. Skyl slangen med 70% ethanol, efterfulgt af 50 ml sterilt natriumchlorid (NaCl 0,9%). Prim slangen med varm perfusionsbuffer (pumpehastighed på 3 ml/min).
- Bedøm musen med isofluran inhalationsanæstesi (800 ml/min O 2, 3% -5% isofluran til induktion og2% til vedligeholdelse under proceduren). Isofluran skal håndteres under en emhætte og sørge for tilstrækkelig ventilation.
- Buprenorphin administreres subkutant 30 minutter før operationen i en dosis på 0,1 mg/kg legemsvægt.
- For at forhindre hypotermi skal du placere den bedøvede mus på en varmepude og lægge et rullet kludvæv under den øvre del af maven for at hæve leveren over de andre organer og lette adgangen til den ringere vena cava.
BEMÆRK: Brug ikke væv, der er for tykt, da kinking af kar er muligt, og perfusionseffekten vil blive påvirket. - Tilsæt øjensalve for at forhindre hornhindeskader.
- Før operationen påbegyndes, skal du sikre dig, at dyret er tilstrækkeligt bedøvet ved at teste pedaltilbagetrækningsrefleksen (fodpudeklemme på begge bagfødder). I tilfælde af et svar skal du levere yderligere anæstesi og genteste, inden proceduren påbegyndes.
- Rengør maven med 70% ethanol.
- Åbn midterlinjesnittet igen ved at skære suturen og forsigtigt trække sårkanterne fra hinanden. Hvis hepatektomien er ældre end 24-48 timer, skal du fjerne suturen og skære huden med en saks.
- Fastgør en 5-0 polypropylensutur til brystbenet, træk den kranielt og fastgør den i denne position. Brug en retraktor eller enkle klip til at holde maven åben. Bughulen skal eksponeres så meget som muligt for at optimere adgang og visualisering.
- Flyt tarmene til højre ved hjælp af vatpinde for at afsløre portalvenen og vena cava. Brug en våd klud til at fastholde tarmene.
- En tung genstand med en højde på ca. 2 cm (f.eks. en silikonebelagt vægtring til målekolber) anbringes ved siden af musens bagben (supplerende figur S2A). Placer slangen med den tilsluttede 26 G IV kanyle på genstanden, og placer nålen forsigtigt oven på vena cava. Juster slangens længde.
- Kom den tilberedte kollagasestamopløsning i det forvarmede fordøjelsesbufferrør. Der tilsættes 250 μL stamopløsning til 10 ml fordøjelsesbuffer. Forbered 10-20 ml fordøjelsesbuffer pr. Dyr. For større dyr eller perfusion af hele lever, tilbered op til 30 ml fordøjelsesbuffer.
BEMÆRK: Det anbefales at tilsætte kollagenasestamopløsningen til den opvarmede nedbrydningsbuffer ca. 30 minutter før fordøjelsesprocessens start.
Figur 2: Oversigt over perfusionsopsætningen. (A) Kirurgisk bord med det nødvendige udstyr til perfusionen. (B) De materialer, der er nødvendige til fremstilling af leveren samt hepatocytekstraktion og isolering. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Kanylering og perfusion
- Indstil pumpehastigheden til 3 ml/min, og tænd pumpen. Lad den forvarmede perfusionsbuffer nå nålen. Kassér de første 2-3 ml perfusionsbuffer.
- Udfør kanylering af den ringere vena cava.
- Mens bufferen løber gennem nålen, indsættes 26 G IV-kanylen i en lav vinkel i vena cava under nyrerne. Sørg for, at kanylefacen peger opad.
- Brug en vatpind til forsigtigt at trække vena cava caudalt under punkteringsstedet, så den tilvejebragte spænding letter indsættelsen af kanylen i venen. Se efter blod i kateterets flashkammer, når nålen kommer ind i lumen.
- Skub nålen yderligere 2-3 mm frem for at sikre, at spidsen af plastkateteret også er kommet ind i venen.
- Skub plastikkateteret over nålen og ind i vena cava yderligere 5 mm. Fjern nålen langsomt og meget forsigtigt.
BEMÆRK: Det anbefales ikke at fastgøre kanylen med en ligatur. Dette trin er tidskrævende, da fartøjet først skal dissekeres til dette formål. Hvis kanylen er løst placeret og understøttet af en genstand, er yderligere fiksering ikke nødvendig (se perfusionsopsætning i supplerende figur S2). For at stabilisere kanyleringsstedet og forhindre tilbageløb kan der tilsættes en enkelt dråbe monomert n-butyl-cyanoacrylat på kanyleringsstedet.
- Når blod falder ud af kanylen, skal du fylde den med varm perfusionsbuffer ved hjælp af en sprøjte.
- Sæt røret på kanylen igen, og kør stadig med en pumpehastighed på 3 ml/min. Lad perfusionsbufferen komme ind i leveren.
- Efter 2-3 s skal du kigge efter hvide pletter, der dannes i leveren og / eller ekspansion / hævelse af portalvenen, hvilket indikerer, at perfusionsbufferen strømmer gennem leveren og kommer ind i leverlobulerne fra den centrale vene (figur 3).
- Vent til portalvenen synligt svulmer inden for 1-2 s efter udseendet af hvide pletter på leveroverfladen. Klip portalvenen med en saks så distalt som muligt fra leverhilusen. Brug en mikrobeholderclips til at mærke (ikke tilstoppe) skærestedet (figur 3B).
BEMÆRK: Dette forenkler vurderingen af strømmen gennem leveren under perfusionsprocessen. Leveren ryddes øjeblikkeligt for blod og bliver gulhvid inden for få sekunder (figur 3C). Et yderligere snit gennem huden på højre side af maveåbningen letter udstrømningen af blodet såvel som perfusionsopløsningen (figur 3B og supplerende figur S2B, C). - Forøg flowet op til 4-7 ml/min afhængigt af dyrets vægt, leverstørrelse og omfanget af den forudgående hepatektomi.
- Klem portalvenen med pincet eller vaskulær klemme i 7-10 s. Sørg for, at der ikke passerer væske igennem.
BEMÆRK: Leveren svulmer synligt under fastspænding og slapper af ved frigivelse. Dette er afgørende for at skylle hele leveren og rydde den for eventuelt resterende blod. - Udfør en anden klemme efter ca. 30 s, og sørg for, at leveren svulmer op og slapper af. Fortsæt med at skylle dyret, indtil bufferen, der strømmer ud af portalvenen, er klar, men i det mindste i 3-4 minutter.
BEMÆRK: Pumpehastigheden afhænger af røret samt leverens størrelse. Det skal vurderes individuelt. - På dette tidspunkt af proceduren burde eutanasi have fundet sted sekundært til ekssanguination. Bekræft, at det systemiske kredsløb er stoppet (ingen hjerterytme eller flimren i hjertet). For at sikre døden udføres bilateral pneumothorax på dette stadium af proceduren som sekundær fysisk metode til eutanasi.
BEMÆRK: Reducer pumpehastigheden lidt, hvis systemisk cirkulation er stoppet (ingen hjerteslag eller flimrende hjerte).
Figur 3: Perfusionsproces fra kanylering til fordøjelse. (A) Museleverens anatomi med den ringere vena cava (hvid pil) og portalvenen (gul pil). (B) Kanylering af den ringere vena cava. Kanylen er sikret med en ligatur (hvid pil), og placeringen af udstrømningen gennem den åbne portalvene er markeret (ikke fastspændt) med en mikrobeholderklemme. (C) Bemærk forekomsten af ujævne strukturer, før perfusionsbufferen har renset leveren fra alt resterende blod (hvid pil). Huden skæres (gul pil), og en vatpind placeres for at sikre dræning af blod og perfusionsvæske. Intermitterende fastspænding kan udføres med en vaskulær klemme eller pincet. (D) Leveren skal renses for alt blod (*). Efter at den kollaganaseholdige fordøjelsesbuffer er kommet ind i leveren, vil den ikke længere slappe af efter fastspænding, og leverlapperne vil stige i størrelse. (E) Efter et stykke tid kan der observeres et boblende udseende på leverens overflade (*). Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Fordøjelse
- Sæt perfusionspumpen på pause, og overfør hurtigt indløbsslangen fra perfusionsbufferen til den forvarmede fordøjelsesbuffer. Genstart pumpen.
- Før fordøjelsesbufferen når leveren, skal du klemme portalvenen endnu en gang i 3-4 s. Sørg for, at leveren slapper af ved frigivelse af klemmen, og at perfusionsvæsken forbliver klar.
BEMÆRK: Fordøjelsesbufferen indeholder phenolrød og kan let skelnes fra den klare perfusionsbuffer. Dette giver mulighed for nem sporing i røret. - Så snart fordøjelsesbufferen har nået leveren, skal du klemme portalvenen igen med en mikrokarklemme.
BEMÆRK: Ved fastspænding svulmer leveren op, men slapper ikke af ved frigivelse af klemmen. Dette er normalt. - For at lette fordøjelsesprocessen skal du lukke den overlegne vena cava med en vaskulær klemme direkte under membranen for at lade fordøjelsesbufferen passere fra den ringere vena cava til leveren til udstrømningen gennem den åbne portalvene.
BEMÆRK: Denne fastspænding sikrer, at den systemiske cirkulation omgås, og at unødvendig kontakt med resterende blodkomponenter/hæmmere forhindres. Dette trin er valgfrit, da det er vanskeligt at nærme sig den overlegne vena cava bag det forstørrede levervæv efter skinoperation, men adgangen er meget lettere hos hepatektomiserede mus. - Fordøjes i ca. 4 minutter ved en strømningshastighed på 5 ml/min. Efterhånden som fordøjelsen skrider frem, skal du kigge efter tegn på, at leveren begynder at svulme op og små klare / gennemsigtige sektioner på leverens overflade. Bemærk desuden, at leveren får tekstur af et vådt stykke stof og fremstår næsten sumpet (figur 3E). Undersøg konsistensen ved forsigtigt at røre ved med en fugtig vatpind.
- Fortsæt med perfusionen, indtil der kan observeres en markant forskel i leverens overfladestruktur. Bemærk, at leveren antager en meget lys farve og et boblende udseende (figur 3E), og Glissons kapsel (dvs. leversækken) adskiller sig fra parenchymen. Stop fordøjelsesprocessen, så snart leveren har erhvervet disse egenskaber, da overfordøjelse kan beskadige hepatocytterne. Fjern nålen, før luft kommer ind i leveren.
BEMÆRK: Normalt kræves der 10-20 ml fordøjelsesbuffer for at nå tilstrækkelig fordøjelse. Dette afhænger af dyrets størrelse, omfanget af hepatektomi, slangeopsætning og kvaliteten af kollagenaseopløsningen. Forøg om nødvendigt perfusionstiden i stedet for perfusionshastigheden. For meget tryk i vaskulærsystemet kan få leveren til at briste, og perfusions- / fordøjelsesvæsken kan gå tabt til retroperitonealrummet.
6. Forberedelse af leveren
- Fjern leveren forsigtigt fra bukhulen. Vær meget forsigtig, da det nu er meget spinkelt og skrøbeligt.
- Tag fat i det centrale bindevæv mellem lapperne ved hjælp af tang og løft det let opad ved hjælp af det som et ankerpunkt.
- Skær alle leverforbindelser til andre organer, fjern galdeblæren og placer leveren i den iskolde konserveringsbuffer.
BEMÆRK: Ideelt set bør hepatocytekstraktion og yderligere behandling finde sted straks for at opretholde levedygtigheden af hepatocytter. Om nødvendigt kan leveren dog opbevares i kort tid ved 4 °C (f.eks. til transport). Denne forsinkelse bør ikke overstige 30-40 min.
7. Hepatocytekstraktion
- Overfør leveren til en 10 cm petriskål og tilsæt 10 ml iskold Williams' Medium E.
- Spræng Glissons kapsel med pincet med fine spidser et par steder langs leveroverfladen. Tag fat i en central del (f.eks. bindevæv ved leverhilus) med to par pincetter og træk dem langsomt fra hinanden, så kapslen kan rives uden at beskadige hepatocytterne. Frigør cellerne ved forsigtigt at ryste kapslen (supplerende figur S3).
BEMÆRK: Ideelt set rives leveren let fra hinanden og frigiver cellerne. Anvend ikke magt. En celleskraber kan hjælpe med at fjerne alle celler fuldstændigt og øge celleudbyttet. Skær ikke leveren i stykker med en saks. - Filtrer 5 ml levermasse gennem en 100 μm cellesil i et 50 ml rør. Skyl filteret med 10 ml frisk iskoldt medium. Filtrer de resterende 5 ml papirmasse gennem cellesilen.
BEMÆRK: Brug en 25 ml serologisk pipette til at overføre leverpulpen med de dissocierede hepatocytter (figur 4A). Mindre pipetter med mindre åbninger øger forskydningsspændingen og beskadiger hepatocytterne irreversibelt. - Tilsæt i alt 30 ml koldt medium for at skylle petriskålen, filtrer den, og tilsæt suspensionen til 50 ml røret, indtil den er fuld. Alle isolerede celler er nu suspenderet (figur 4B).
Figur 4: Oprensning ved forsigtig centrifugering . (A) Leverhomogenat tilbage efter ekstraktionstrinnet. B) Mikroskopisk billede (20x forstørrelse) af homogenatet Bemærk den markerede forurening med affald. C) Oprensningscentrifugeringstrin og D) mikroskopiske afbildninger af de supernatanter, der skal kasseres. E) Mikroskopisk billede af den rensede hepatocytfraktion. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
8. Hepatocytisolering
- Spin ved 50 × g i 5 minutter ved 4 °C (lavest mulig acceleration og lavest mulig bremse).
BEMÆRK: Hepatocytter er tættere end ikke-parenkymale leverceller. På grund af den lave centrifugeringskraft pelleteres kun hepatocytter, mens andre celler (f.eks. immunceller, erytrocytter og sinusformede celler) forbliver i supernatanten. - Det meste af supernatanten opsuges, så der efterlades 1 ml til resuspendering af cellerne ved forsigtigt at hvirvle røret rundt.
- Tilsæt 40 ml koldt Williams 'E-medium og drej igen ved 50 × g i 10 minutter ved 4 ° C (lav acceleration, lav bremse) for yderligere at fjerne døde hepatocytter og cellerester og pelletlevedygtige og fede hepatocytter (figur 4C).
- Det meste af supernatanten kasseres, og der efterlades 1 ml til resuspendering af cellerne ved at hvirvle røret rundt.
- Tilsæt 40 ml kold Williams 'E medium og drej igen ved 50 × g i 5 minutter ved 4 ° C (lav acceleration, lav bremse).
- Det meste af supernatanten opsuges, så der efterlades 1 ml til resuspendering af cellerne ved forsigtigt at hvirvle røret rundt.
BEMÆRK: Stop ikke denne proces, før cellerne er rettet eller analyseret. Hepatocytter er meget skrøbelige, og enhver forsinkelse i perfusions-, fordøjelses- og rensningsprocessen kan beskadige cellerne. - Bestem den endelige cellekoncentration efter tilsætning af trypanblåt ved hjælp af et Neubauer-forbedret tællekammer.
BEMÆRK: De fleste snavs og ikke-parenkymale celler er nu fjernet, hvilket resulterer i en ren pellet på ca. 10-15 × 106 hepatocytter tilbage efter 70% -hepatektomi. - Afhængigt af den ønskede koncentration tilsættes mere iskoldt medium. Brug hepatocytcellesuspensionen til enhver nedstrømsanalyse eller initiere en primær cellekultur.
BEMÆRK: På dette stadium forbliver kun få immun- og ikke-parenkymale celler (<5%) i suspensionen. Hvis yderligere rensning ønskes, udføres et negativt udvalg af CD31+ og CD45+ celler ved magnetisk eller fluorescensaktiveret cellesortering (MACS/FACS). Til dato er der ingen pålidelig og robust overflademarkør for leverparenkymale celler.
9. Fremstilling af de isolerede hepatocytter til flowcytometri
- Hepatocytterne centrifugeres ved 100 × g i 5 min.
- Supernatanten kasseres, og den ønskede mængde flowcytometribuffer tilsættes afhængigt af koncentrationen af cellesuspensionen.
- Tilsæt 1 ml cellesuspension i et flowcytometrirør. Der centrifugeres i 5 minutter ved 100 × g , og supernatanten kasseres.
- Tilsæt 100-200 μL af det fortyndede Alexa Fluor 488 Zombie grønne levedygtighedsfarvestof (koncentration 1:400) til cellerne og ryst dem forsigtigt. Hepatocytterne resuspenderes forsigtigt ved manuel omrystning eller ved hjælp af en hvirvelblander ved lav hastighed (maks. 2-3) i 2 sekunder.
BEMÆRK: Brug ikke små pipettespidser til at opslæmme cellerne igen. De er meget skrøbelige, og den påførte forskydningsspænding forårsager skade og reducerer cellelevedygtigheden. Hvis pipettering ikke kan undgås, skal du bruge en 1.000 μL pipette efter at have afskåret den mindste del fra spidsen for at forstørre diameteren og pipette cellerne meget langsomt. - Placer rørene på is eller opbevar dem ved stuetemperatur, afhængigt af den ønskede farvning. Inkuber cellerne i 20-30 minutter i mørke.
- Tilsæt 2 ml flowcytometribuffer og vask cellerne 3x. Centrifuger cellerne efter hvert vasketrin ved 100 × g i 5 minutter.
- Tilsæt 2 ml fikseringsbuffer (1:1, 4% PFA og PBS). Hepatocytterne resuspenderes forsigtigt ved manuel omrystning eller ved hjælp af en hvirvelblander ved lav hastighed (maks. 2-3) i 2 sekunder.
- Fastgør cellerne i 30 min.
- Supernatanten centrifugeres ved 100 × g i yderligere 5 minutter, supernatanten kasseres, og der tilsættes flowcytometribuffer.
BEMÆRK: Celler kan opbevares i flowcytometribuffer før analyse op til 72 timer efter isolering.
10. Analyse af hepatocytter med flowcytometri
- Analyser hepatocytterne ved hjælp af en fluorescensaktiveret cellesorterer.
BEMÆRK: Overvej den relativt store størrelse af hepatocytter og juster spændingerne. Start med en lav spænding og gå ikke højere end 350 V for fremadspredning (FSC) og 220 V for sidespredning (SSC).- Juster spændingerne for FSC og SSC til cellernes estimerede store størrelse. Identificer hepatocytpopulationen, og registrer alle hændelser ved hjælp af SSC-A og FSC-A (figur 5A).
- Bemærk, at snavs og ikke-parenkymale celler vises i nederste venstre hjørne af FSC versus SSC-tæthedsplottet og er udelukket (figur 5A).
- Da dubletceller kan påvirke analysen, konstrueres et tæthedsplot for sidespredningshøjde (SSC-H) versus sidespredningsområde (SSC-A) for at udelukke dubletter, som vist i figur 5B.
- Vælg den endelige hepatocytpopulation ved at gating CD31- (endotelmarkør) og CD45- (immunmarkør) celler (figur 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TRAS topper ved 16 timer efter hepatektomi og forsvinder gradvist 32-48 timer efter standard hepatektomi, men fortsætter ud over 48 timer efter forlænget hepatektomi. Makroskopisk er TRAS let synlig som en bleg teint af leverresten (figur 1F) og kan observeres hos hepatektomiserede mus mellem 16 timer og 48 timer efter operationen.
Det estimerede endelige udbytte er 10-15 × 10 6 hepatocytter efter 70% -hepatektomi og 4-9 × 106 efter forlænget 86%-hepatektomi hos mus med en gennemsnitlig endelig levedygtighed på henholdsvis 78% og 65%. Dette svarer til den forventede procentdel sammenlignet med et samlet udbytte på 50-70 × 106 fra en hel muselever (figur 6A,C). Efter partielle hepatektomier viser hepatocytter en øget cellestørrelse sammenlignet med normale lever, svarende til deres øgede lipidindhold (figur 6B). Gating strategien er vist i supplerende figur S4.
Figur 6: Hepatocytudbytte, cellestørrelse og levedygtighed. (A) Celletal for en hel muselever og af rester 24 timer efter 70%- og 86%-hepatektomi. (B) Beregnet cellevolumen af isolerede hepatocytter. Bemærk den markante stigning i cellestørrelse 24 timer efter hepatektomi, for både 70% og 86%. C) isolerede hepatocytters cellelevedygtighed efter hvert trin i rensningsprocessen. Levedygtighed blev målt ved flowcytometri ved hjælp af Alexa Fluor 488 Zombie grøn levedygtighedsfarvestof. Procentdele er taget fra alle hepatocyt singlets. For gating-strategien, se supplerende figur S6 og supplerende figur S4. Fejlbjælker henviser til standardafvigelser med n = 6-8/gruppe. Forkortelser: sHx = standard hepatektomi; eHx = udvidet hepatektomi; uden resektion = fingeroperation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Et øget lipidindhold i murine hepatocytter 24 timer efter delvis hepatektomi kan observeres ved en stigning i granularitet (figur 7; for gatingstrategi, se supplerende figur S5) eller direkte observeret ved tilstedeværelsen af lipidvesikler inde i forstørrede hepatocytter (figur 8 og supplerende fil 1).
Figur 7: Øget granularitet og cellestørrelse målt ved flowcytometri. (A) Øget granularitet blandt isolerede hepatocytter 24 timer efter hepatektomi som en indirekte markør for tilstedeværelsen af lipidvesikler. B) Histogram, der viser SSC. C) Procentdelene repræsenterer den fraktion af celler med høj cytoplasmatisk granulær intensitet målt ved SSC-signalet. Fejlbjælker henviser til standardafvigelser med n = 6-8/gruppe. Forkortelser: sHx = standard hepatektomi; eHx = udvidet hepatektomi; uden resektion = fingeroperation; FSC = fremadrettet spredningssignal; SSC = sidespredning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Sudan IV-farvning som markør for fedtindholdet i isolerede friske hepatocytter. A) Hepatocytter fra frisk lever af mus uden forudgående operation. Øget størrelse og fedtindhold af hepatocytter 24 timer (B) efter 70% -hepatektomi og (C) 86% -hepatektomi. Bemærk den samtidige tilstedeværelse af både større, steatotiske hepatocytter og mindre, ikke-steatotiske hepatocytter. Skalastænger = 30 μm (B-D). Fejlbjælker henviser til standardafvigelser med n = 6-8/gruppe. Forkortelser: sHx = standard hepatektomi; eHx = udvidet hepatektomi; uden resektion = fingeroperation. Klik her for at se en større version af denne figur.
En meget lav procentdel af immun- og ikke-parenkymale celler forbliver i den endelige suspension. Yderligere rensning opnås ved FACS eller MACS, hvis det ønskes. Negativ selektion af CD31+ og CD45+ celler ved flowcytometri anvendes til at demonstrere og kvantificere de ikke-parenkymale celler (figur 5).
Figur 5: Flowcytometrigatingstrategi og udvælgelse af CD31- og CD45- parenkymale celler. (A) Gating diagram med alle registrerede begivenheder; Overvej den relativt store størrelse af hepatocytter og brug justerede spændinger. Gå ikke højere end 350 V for FSC og 220 V for SSC. (B) Singlet gating. (C) Hepatocytter vælges ved at gating CD31- (endotelmarkør) og CD45- (immunmarkør) celler. Denne udvælgelse kan udføres i en fluorescensaktiveret cellesorterer for at vælge parenkymale celler til yderligere downstream-analyser, hvis det er nødvendigt; n = 4-5/gruppe. Forkortelser: FSC = fremadrettet spredning; SSC = sidespredning. Klik her for at se en større version af denne figur.
For at demonstrere effektiviteten af den modificerede protokol til tilbageholdelse af steatotiske celler blev hepatocytter isoleret ved anvendelse af den klassiske densitetsgradienttilgang7 (figur 9A). I modsætning til den modificerede procedure (figur 9B) var et fedtcellelag tydeligt synligt oven på densitetsgradienten. Analyse af celler bekræftede et groft fravær af lipidbelastede hepatocytter i pellet efter densitetsgradientcentrifugering. I modsætning hertil blev celler fra fedtlaget beriget med steatotiske hepatocytter og en betydelig brøkdel af ikke-parenkymale og døde celler (figur 9A). Således fratager klassisk isolation høsten af steatotiske celler, mens denne modificerede protokol, der udelader densitetsgradienten, bevarer lipidbelastede subpopulationer, hvilket muliggør upartisk udforskning af leverregenerering uden at skæve mod magre hepatocytter.
Figur 9: Udbytter af steatotiske hepatocytter efter den klassiske tæthedsgradientisolationsprotokol sammenlignet med den forbedrede protokol . (A) Med den klassiske densitetsgradientrensningsmetode (endelig koncentration af 90% densitetsgradientopløsning i fosfatbufret saltvand) opsamles døde hepatocytter i et cellelag oven på densitetsgradientopløsningen. (B) Dette lag består ikke kun af ikke-parenkymale celler og ikke-levedygtige hepatocytter, men også af levedygtige, store, fede hepatocytter. (C) Den pellet, der opnås efter densitetsgradientcentrifugering, indeholder magre hepatocytter af mindre størrelse og er for det meste blottet for steatotiske celler. Dette er den "rene" fraktion, der er isoleret med den klassiske protokol. (D) Med den forbedrede protokol går de lipidfyldte hepatocytter ikke tabt, og alle hepatocytter pelleteres. Supernatanten (E) består hovedsagelig af døde og fragmenterede hepatocytter og ikke-parenkymale celler, mens pellet (F) er en blanding af hepatocytter af variabel størrelse og lipidindhold. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1: Supplerende protokoller. (A) Lipidfarvning med Sudan IV; (B) standard og udvidet hepatektomi hos mus. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S1: Oversigt over perfusionsopsætningen. (1) Cannulate den ringere vena cava. (2) Perfus leveren med varm perfusionsbuffer for at chelere calcium. (3) Opvarm fordøjelsesbufferen med kollaganaser og Ca2+ for at dissociere celler in vivo. Fjern leveren og (4) opbevar den i iskold konserveringsbuffer (maks. 30 min). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Perfusionsopsætning. A) Perfusionsbord med isoflurandyse, rødlysvarmelampe og perfusionsrør. En tung genstand kan placeres under røret for at stabilisere det og reducere risikoen for forskydning. (B) I løbet af de første par minutter af perfusionen vil noget blod strømme ud gennem portalvenen og poolen i det åbne bughule. (C) Abdominalvæggen er skåret på den ene side for at dræne blodet. En vatpind letter dræningen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S3: Glissons kapsel. (A) Glissons kapsel bristes med pincet med fine spidser nogle få steder langs leveroverfladen, og levercellerne frigives ved forsigtigt at ryste kapslen. (B) Leveren skal let rives fra hinanden. (C) Den tomme leversæk (Glissons kapsel) med frigivne hepatocytter i suspension. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S4: Flowcytometrigatingstrategi til levedygtighedsscreening. (A) Alle begivenheder blev registreret. (B) Singlet gating. (C) Levende / død farvning med Alexa Fluor 488 Zombie grøn levedygtighed farvestof. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S5: Flowcytometrigatingstrategi til granularitetsmåling. (A) Alle begivenheder blev registreret. (B) Singlet gating. C) Prikplot af sidespredning (SSC; x-aksen ) versus fremadrettet spredning (FSC; y-aksen ) for at analysere granularitetsniveauerne. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S6: Hepatocytrensning. A) cellepellet efter første centrifugeringstrin Bemærk fedtlaget oven på mediet. B) Hepatocytpellet efter anden centrifugeringsrunde. C) Oprensede hepatocytter ved afslutningen af rensningsprocessen. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den offentliggjorte protokol giver en pålidelig og ligetil metode til at isolere et højt udbytte af normale og steatotiske murinhepatocytter til enkeltcelle downstream-analyser eller bulkanalyse af celler efter FACS-sortering. Den klare fordel i forhold til densitetsgradientrensning er, at det cellulære lipidindhold i det væsentlige ikke har nogen indflydelse på det effektive udbytte af hepatocytter. Således vil fraktionen af steatotiske hepatocytter blive bevaret og inkluderet i downstream-analyser. Dette er ikke kun afgørende for undersøgelsen af steatogene leversygdomme, men også afgørende for enhver analyse af processer efter større hepatektomier, hvor hepatocytter viser en tidsmæssigt og rumligt dynamisk steatose inden for de første 2-3 dage efter regenerering. Selvom (enkeltcelle) analyser af isolerede hepatocytter allerede er blevet udført efter hepatektomier 19,20,21, må det antages, at den analyserede cellepopulation i det mindste delvist var berøvet lipidbelastede hepatocytter, og resultaterne var derfor ikke fuldt repræsentative og skæve mod magre hepatocytter.
I øjeblikket er funktionen af TRAS ikke fuldt afklaret. For eksempel forbliver de rumlige forskelle i lipidindhold i leverlobuler dårligt forstået. Derfor er der behov for en metode, der tillader kvantitativ og kvalitativ detektion uden præcist at udelukke disse celler fra analyser (f.eks. til enkeltcelletranskriptomik, flowcytometri og metabolomics).
Samlet set er hepatocytudbyttet med denne forbedrede protokol markant overlegen i forhold til andre metoder til isolering af fedtholdige hepatocytter (f.eks. fra mus med ikke-alkoholisk steatohepatitis, NASH) ved anvendelse af densitetsgradientrensning15. Imidlertid kan celleudbytte, levedygtighed og fedtindhold variere mellem præparater. Flere faktorer synes at være ansvarlige.
For det første vil forskellige partier af collagenase eller collagenase blandinger variere i deres enzymatiske aktivitet; Imidlertid er forskellene fra parti til parti ikke så kritiske som med traditionelle collagenaser. Ikke desto mindre kan det være nødvendigt at justere arbejdskoncentrationen. Forskellene kan minimeres yderligere ved korrekt opbevaring indtil brug (tørre lyofililater og rehydrerede stamopløsninger ved -15 til -25 °C) og ved at undgå gentagne fryse-optøningscyklusser, men kan ikke elimineres fuldstændigt. Derfor anbefales det kun at bruge collagenaser af en bestemt batch til en given eksperimentel serie. Desuden afhænger den enzymatiske aktivitet af den temperatur, ved hvilken fordøjelsesbufferen når leveren, med en optimal temperatur mellem 35 °C og 37 °C for en blanding af collagenaserne I og II22. Lavere temperaturer vil reducere den enzymatiske aktivitet, mens temperaturer over 50 °C kan føre til irreversibel denaturering af proteinet. Test dette på forhånd, og optimer forsøgsbetingelserne ved at justere fordøjelsesbufferens starttemperatur, plastrørets længde og diameter og strømningshastigheden. For eksempel kan der forventes et fald i buffertemperaturen på op til 10 °C inden for en rørlængde på 60 cm. Korriger temperaturen ved hjælp af varmepuder og infrarøde lamper, hvis det er nødvendigt. Collagenaser viser deres optimale fordøjelseskapacitet ved en pH-værdi på 7,4; Det anbefales derfor at justere bufferopløsningernes pH-værdi allerede ved en driftstemperatur på ca. 37 °C før brug.
For det andet er det altafgørende at skylle leveren (eller hele musen) tilstrækkeligt med perfusionsbuffer, inden fordøjelsesprocessen påbegyndes for at eliminere potentielle hæmmere såsom serum eller albumin. Ideelt set startes perfusion først, efter at den systemiske cirkulation er stoppet, for at sikre, at fordøjelsesbufferen kun bevæger sig fra vena cava gennem leveren til udstrømningen via den åbne portalvene. Den overlegne vena cava kan lukkes med en lille vaskulær klemme. Dette forhindrer kontakt med resterende blodkomponenter/hæmmere. En anden metode til optimal skylning af leveren er intermitterende fastspænding af portalvenen. Dette skal gøres omhyggeligt og - når fordøjelsesbufferen har nået leveren - udføres kun én gang for at undgå at beskadige de allerede fordøjede celler.
For det tredje er regenererende hepatocytter følsomme, og erfaringen har vist, at de kræver kortere fordøjelsestider og mere omhyggelig håndtering for at undgå overfordøjelse og skade på cellerne. For at høste leveren så forsigtigt som muligt anbefales det at gribe fat i hepatisk hilus med en klemme og derefter først skære den overlegne vena cava og frigøre leveren fra forbindelserne til venen og membranen. Derefter kan den ringere vena cava og portalvenen skæres, hvilket muliggør mobilisering af leveren og let frigør den fra gastrointestinale ledbånd, spiserøret på den ene side og højre nyre på den anden side. I hepatektomiserede mus er det muligt omhyggeligt at gribe en af ligaturerne fra medianloberne for at fjerne leveren. Hvis der gøres et forsøg på at trække leveren ud med magt, kan Glissons kapsel briste, og de isolerede celler kan gå tabt.
Endelig er det vigtigt, at perfusionsproceduren og den videre behandling af hepatocytterne ikke afbrydes eller forsinkes, da dette straks og uundgåeligt vil påvirke levedygtigheden. Ideelt set udføres perfusionen i et hold på mindst to personer og på et dyr ad gangen. Disse krav til tid og arbejdskraft er imidlertid en af begrænsningerne ved denne metode, selvom dette også gælder for alternative metoder.
En anden begrænsning er den endelige renhed af den resulterende cellesuspension, da fordelen ved ikke at miste steatotiske hepatocytter til en densitetsgradient resulterer i en lille andel af resterende ikke-parenkymale og / eller immunceller. I den viste prøve er fraktionen af CD45+ (immunceller) og CD31+ (endotelceller) under 5%, og når der vælges cellestørrelse først under flowcytometri, er procentdelene af CD45+ og CD31+ henholdsvis 1,2% og 2,2% (figur 5). For de fleste anvendelser er dette renhedsniveau tilstrækkeligt, men meget følsomme metoder eller den videre anvendelse i primære cellekulturer kræver sandsynligvis en højere grad. Talrige undersøgelser har brugt CD31 og CD45 som systemiske markører til at sortere levercellepopulationer efter MACS 23,24 eller FACS25.
Denne forbedrede isolationsmetode er ideel til undersøgelse af leverregenerering, især den tidlige periode, der præsenterer betydelige mængder steatotiske hepatocytter. PHLF, med vedvarende steatose, er et særligt relevant emne, der kræver forskning. Efter langvarige hepatektomier, der efterlader marginale rester, kan PHLF udvikle sig og repræsenterer faktisk den mest almindelige dødsårsag på grund af leverkirurgi. Dens patobiologi er kun delvist forstået, og i øjeblikket er der ingen behandling tilgængelig26. I betragtning af at PHLF signifikant begrænser anvendelsen af leverkirurgi (såsom til helbredelse af levermaligniteter), er det et klart medicinsk behov at undersøge årsagerne og identificere potentielle foranstaltninger.
Der er også behov for undersøgelse af sygdomme, der deler hepatisk steatose som udgangspunkt. Et fremtrædende eksempel er ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD), som kan udvikle sig til NASH og til sidst til hepatocellulært carcinom (HCC)27. Spredningen af stillesiddende livsstil i forbindelse med den vestlige kost har ført til en verdensomspændende epidemi af NAFLD, og derfor forventes HCC-forekomsten at stige28,29. Steatosis er igen tæt forbundet med fedme, metabolisk syndrom og type 2-diabetes, alle sygdomme med stigende forekomst30. Derfor udgør steatose en stigende byrde for det nuværende sundhedssystem, der kræver effektive midler til dets forvaltning. Denne forbedrede to-trins kollagenaseperfusionsmetode muliggør undersøgelse af steatotiske hepatocytter på enkeltcelleniveau og bør derfor hjælpe med at udforske årsagerne til og konsekvenserne af hepatocellulær lipidakkumulering.
Denne protokol præsenterer en nem, hurtig og pålidelig teknik til in vivo-isolering af regenererende hepatocytter fra mus efter delvis (70%) og forlænget (86%) hepatektomi. Denne tilgang er ikke afhængig af gradientrensning og kan bruges til at undersøge leverregenereringsprocesser med inklusion af lipidbelastede hepatocytter, der normalt går tabt under traditionelle isolationsprotokoller. Desuden kan denne metode også anvendes til forskning af forskellige leversygdomme forbundet med steatotiske ændringer og er ikke begrænset til musearterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Swiss National Fond (projekttilskud 310030_189262).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | - |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | - |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | - |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | - |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | - |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | - |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | - |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | - |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | - |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | - |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | - | - |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | - |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | - |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | - |
| Fenestrated sterile surgical drape | - | - | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | - |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | - |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | - | - |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | - |
| Isofluran station | Provet | - | - |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | - | - |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | - | - |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | - |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | - |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | - | - |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | - | - |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | - |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | - | Adjust to 42 °C |
References
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C.
- Lehmann, K., et al. Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration. Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).
- Makino, H., et al. A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice. Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).
- Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N. Liver Pathology. Gayam, V., Engin, O. , IntechOpen. (2019).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers. Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver. Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Trotter, N. L. A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy. Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).
- Kachaylo, E., et al. PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice. Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
- Dold, S., et al. Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation. PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).
- Boyce, S., Harrison, D. A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse. Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration. JCI Insight. 5 (22), (2020).
- Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver. Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).
- Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation. Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).
- Roche, Liberase TM Research Grade. , (2020).
- Giugliano, S., et al. Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication. Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).
- Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).
- Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes. Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).
- Helling, T. S. Liver failure following partial hepatectomy. HPB. 8 (3), 165-174 (2006).
- Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F.
- Park, W. Y., et al. Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study. Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).
- Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude. Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
- Roeb, E. Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD). Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).
