Summary
Lipidbeladene Hepatozyten sind der Leberregeneration inhärent, gehen aber normalerweise bei der Zentrifugation mit Dichtegradienten verloren. Hier stellen wir ein optimiertes Zellisolationsprotokoll vor, das steatotische Hepatozyten beibehält, was repräsentative Populationen von regenerierenden Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen ergibt.
Abstract
Die partielle Hepatektomie ist weit verbreitet, um die Leberregeneration bei Mäusen zu untersuchen, aber die Isolierung hoher Ausbeuten lebensfähiger Hepatozyten für nachgeschaltete Einzelzellanwendungen ist eine Herausforderung. Eine deutliche Akkumulation von Lipiden in regenerierenden Hepatozyten wird während der ersten 2 Tage der normalen Leberregeneration bei Mäusen beobachtet. Diese sogenannte transiente regenerationsassoziierte Steatose (TRAS) ist temporär, überschneidet sich aber teilweise mit der Hauptproliferationsphase. Die Dichtegradientenreinigung ist das Rückgrat der meisten existierenden Protokolle zur Isolierung von primären Hepatozyten. Da die Gradientenreinigung auf der Dichte und Größe der Zellen beruht, trennt sie nicht-steatotische von steatotischen Hepatozytenpopulationen. Daher gehen Fetthepatozyten häufig verloren, was zu nicht repräsentativen Hepatozytenfraktionen führt.
Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine einfache und zuverlässige Methode zur in vivo Isolierung von regenerierenden Hepatozyten unabhängig von ihrem Lipidgehalt. Hepatozyten von männlichen C57BL/6-Mäusen werden 24-48 h nach der Hepatektomie durch einen klassischen zweistufigen Kollagenase-Perfusionsansatz isoliert. Eine Standard-Peristaltikpumpe treibt die erwärmten Lösungen über die katheterisierte untere Hohlvene in den Rest, wobei eine retrograde Perfusionstechnik mit Abfluss durch die Pfortader verwendet wird. Hepatozyten werden durch Kollagenase dissoziiert, um sie aus der Glisson-Kapsel freizusetzen. Nach dem Waschen und sorgfältigen Zentrifugieren können die Hepatozyten für beliebige nachgeschaltete Analysen verwendet werden. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit eine einfache und reproduzierbare Technik zur Isolierung einer repräsentativen Population regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen. Die Methode kann auch bei der Untersuchung von Fettlebererkrankungen helfen.
Introduction
Die Leber kann sich auch nach einem größeren Gewebeverlust selbst regenerieren. Diese einzigartige Regenerationsfähigkeit wird explizit durch das experimentelle Modell der partiellen (70%) Hepatektomie veranschaulicht, das erstmals 1931 von Higgins und Anderson an Ratten beschrieben wurde1. In diesem Modell werden 70% der Leber operativ von Tieren entfernt, indem größere Leberlappen abgeschnitten werden. Die verbleibenden Lappen wachsen dann durch kompensatorische Hypertrophie, um die ursprüngliche Lebermasse innerhalb von etwa 1 Woche nach der Operation wiederherzustellen, wenn auch ohne Wiederherstellung der ursprünglichen Leberarchitektur 2,3. Es wurden zusätzliche Hepatektomien mit unterschiedlichen Mengen an Gewebeentfernung entwickelt, wie z. B. eine 86% erweiterte Hepatektomie, bei der der Leberrest zu klein ist, um sich zu erholen, was schließlich zu Leberversagen nach Hepatektomie (PHLF) und anschließendem Tod bei 30%-50% der Tiere führt 4,5,6. Diese Modelle ermöglichen die Untersuchung der normalen und fehlgeschlagenen Leberregeneration, abhängig von der Menge des resezierten Gewebes (Abbildung 1).
Obwohl Mausmodelle der Hepatektomie seit vielen Jahren erfolgreich eingesetzt werden, ermöglichen erst in jüngster Zeit fortschrittlichere Analysemethoden einen tieferen Einblick auf Einzelzellebene. Für die meisten dieser Methoden ist jedoch das Vorhandensein einzelner Hepatozyten eine Grundvoraussetzung. Die meisten Protokolle für die Isolierung von primären Hepatozyten basieren auf einer zweistufigen Kollagenase-Perfusionstechnik und einer anschließenden Dichtegradientenreinigung, um lebensfähige Hepatozyten von Trümmern und nicht-parenchymalen sowie toten Zellen zu trennen 7,8,9. Diese Methode wurde erstmals 1969 von Berry und Friend beschrieben10 und 1972 von Seglen und Kollegen angepasst11,12. Da die Gradientenzentrifugation jedoch von der Dichte und Größe der Zellen abhängt, gehen lipidbeladene Hepatozyten während der Standardreinigung häufig verloren. Während ein solcher Verlust für viele Forschungsfragen vernachlässigbar sein kann, ist er ein entscheidender Aspekt für die frühe Leberregeneration. Während der ersten 2 Tage akkumulieren Hepatozyten in der sich regenerierenden Mausleber Lipide, wodurch sie an Größe zunehmen und an Dichte verlieren. Diese transiente regenerationsassoziierte Steatose (TRAS) dient der Bereitstellung von regenerativem Brennstoff und ist vorübergehend, überlappt jedoch teilweise die Hauptproliferationsphase und ist ungleichmäßig in den Leberläppchen - den Funktionseinheiten der Leber- verteilt 13,14. Nach längerer 86%-Hepatektomie tritt jedoch auch eine TRAS auf, die jedoch bestehen bleibt, da die Regeneration ins Stocken geraten ist und die Lipide nicht oxidiert werden14. Daher führt die Gradientenreinigung von Hepatozyten nach 70%- oder 86%-Hepatektomien zu nicht repräsentativen Fraktionen, da die meisten lipidbeladenen Hepatozyten aufgrund ihrer geringen Dichte verloren gehen15.
In diesem modifizierten Isolationsprotokoll werden Hepatozyten von C57BL/6-Mäusen 24-48 h nach der Hepatektomie durch einen klassischen zweistufigen Kollagenase-Perfusionsansatz isoliert. In der Regel erfolgt die Kanülierung und Perfusion des Restes zur Zellisolierung über die Pfortader. Der portovaskuläre Widerstand in kleinen Überresten, die nach einer größeren Resektion zurückbleiben, ist jedoch hoch16, und daher ist die Perfusion empfindlich. Da die Hohlvene von Hepatektomien unberührt bleibt, kann die Perfusion durch Kanülierung der Hohlvene leicht in retrograder Richtung durchgeführt werden. Eine Standard-Peristaltikpumpe treibt die erwärmten Lösungen über die katheterisierte untere Hohlvene in den Leberrest, wobei eine retrograde Perfusion mit Abfluss durch die Pfortader verwendet wird (Ergänzende Abbildung S1). Hepatozyten werden durch Kollagenasen dissoziiert und aus der Glisson-Kapsel freigesetzt. Nach dem Waschen und der sorgfältigen Verarbeitung lebensfähiger Hepatozyten durch schrittweise Isolierung mit einem langsamen Zentrifugationsansatz können die Hepatozyten für beliebige nachgeschaltete Analysen verwendet werden.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Tierschutzverordnung durchgeführt und vom Veterinäramt Zürich (Nr. 007/2017, 156/2019) genehmigt, um die menschliche Versorgung zu gewährleisten. Männliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 10-12 Wochen wurden in einem 12-stündigen Tag/Nacht-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser gehalten. Jede Versuchsgruppe bestand aus sechs bis acht Tieren. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Partielle Hepatektomie bei Mäusen
- Bei der Standard-Hepatektomie (70%) wird der linke Seitenlappen, der rechte Teil des Medianlappens und der linke Teil des Medianlappens ligiert und reseziert (Abbildung 1B). Entfernen Sie bei einer erweiterten Hepatektomie (86 %)4 auch die Caudatlappen und den rechten Vorderlappen (Abbildung 1C).
- HINWEIS: Die Standard-Hepatektomie ist ein Verfahren, das seit vielen Jahren in der Leberregenerationsforschung eingesetzt wird. Protokolle für dieses Verfahren sind verfügbar3,17, einschließlich des videogestützten Protokolls von Mitchell und Willenbring18. Weitere Details zu den hier verwendeten Techniken für Hepatektomien finden Sie in der Ergänzungsdatei 1.
Abbildung 1: Standard- (70%) und erweiterte (86%) Hepatektomie bei Mäusen. (A) Die fünf Leberlappen der Maus und ihre jeweiligen Beiträge zum Gesamtlebergewicht. (B) Schematische Darstellung der 70%-Hepatektomie bei Mäusen. Die dunklen Lappen stellen den zukünftigen Leberrest dar. (C) Schematische Darstellung der 86%-Hepatektomie bei Mäusen. Die dunklen Lappen stellen den zukünftigen Leberrest dar. (D) Genaues Volumen des resezierten Gewebes nach 70%- und 86%-Hepatektomie. (E) Abdomen der Maus unmittelbar nach 70%-Hepatektomie; (F) Mausabdomen sofort (links) und 48 h (rechts) nach 86%-Hepatektomie. Beachten Sie die blasse Farbe des steatotischen Restes (weißer Pfeil). n = 6-7/Gruppe. Abkürzungen: sHx = Standard-Hepatektomie; eHx = erweiterte Hepatektomie; LW = Lebergewicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
2. Herstellung der Perfusionslösungen
- Bereiten Sie die Perfusions-, Verdauungs- und Konservierungspuffer vor (siehe Tabelle 1).
- Stellen Sie den pH-Wert aller Pufferlösungen auf 37 °C ein, indem Sie je nach Bedarf Natriumhydroxid (NaOH) oder Chlorwasserstoff (HCl) hinzufügen. Der optimale pH-Wert für die Puffer liegt bei 7,4.
- Legen Sie den Konservierungspuffer und Williams' Medium E auf Eis.
- Bereiten Sie den Durchflusszytometrie-Puffer vor und lagern Sie ihn auf Eis.
Tabelle 1: Lösungen und Puffer, die für die Verdauung und Reinigung von Hepatozyten verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
3. Vorbereitung der Perfusionsausrüstung
- Erwärmen Sie das Wasserbad auf 42 °C und geben Sie den Perfusionspuffer (50 ml) und den Aufschlusspuffer (10-20 ml) in das Wasserbad. Fügen Sie dem Verdauungspuffer noch keine Kollagenase hinzu.
- Bereiten Sie die Schlauchpumpe vor und führen Sie den Schlauch ein. Der vollständige Perfusionsaufbau ist in Abbildung 2 dargestellt.
- Schließen Sie eine 26 G IV-Kanüle mit einem Luer-Lock-Anschluss an das Auslassende des Schlauchs an. Führen Sie das Einlassende des Röhrchens in das vorgewärmte Perfusionspufferrohr im Wasserbad ein. Spülen Sie den Schlauch mit 70 % Ethanol, gefolgt von 50 ml sterilem Natriumchlorid (NaCl 0,9 %). Grundieren Sie den Schlauch mit warmem Perfusionspuffer (Pumpendrehzahl von 3 ml/min).
- Beruhigen Sie die Maus mit einer Isofluran-Inhalationsanästhesie (800 ml/min O 2, 3%-5% Isofluran zur Induktion und2% zur Aufrechterhaltung während des Eingriffs). Behandeln Sie Isofluran unter einer Laborhaube und sorgen Sie für ausreichende Belüftung.
- Verabreichen Sie Buprenorphin 30 Minuten vor der Operation subkutan in einer Dosierung von 0,1 mg/kg Körpergewicht.
- Um eine Unterkühlung zu vermeiden, legen Sie die sedierte Maus auf ein Wärmekissen und legen Sie ein gerolltes Stofftuch unter den Oberbauch, um die Leber über die anderen Organe zu heben und den Zugang zur unteren Hohlvene zu erleichtern.
HINWEIS: Verwenden Sie kein zu dickes Gewebe, da ein Abknicken der Gefäße möglich ist und die Wirksamkeit der Perfusion beeinträchtigt wird. - Fügen Sie Augensalbe hinzu, um Hornhautschäden zu vermeiden.
- Stellen Sie vor Beginn der Operation sicher, dass das Tier ausreichend betäubt ist, indem Sie den Pedalrückzugsreflex (Fußpolster an beiden Hinterfüßen) testen. Im Falle einer Reaktion eine zusätzliche Anästhesie durchführen und vor Beginn des Eingriffs erneut testen.
- Reinigen Sie den Bauch mit 70% Ethanol.
- Öffnen Sie den Mittellinienschnitt wieder, indem Sie die Naht durchschneiden und die Wundränder vorsichtig auseinanderziehen. Wenn die Hepatektomie älter als 24-48 h ist, entfernen Sie die Naht und schneiden Sie die Haut mit einer Schere.
- Befestigen Sie eine 5-0-Polypropylennaht am Brustbein, ziehen Sie sie kranial und fixieren Sie sie in dieser Position. Verwenden Sie einen Retraktor oder einfache Clips, um den Bauch offen zu halten. Die Bauchhöhle muss so weit wie möglich freigelegt werden, um den Zugang und die Visualisierung zu optimieren.
- Bewegen Sie den Darm mit Wattestäbchen nach rechts, um die Pfortader und die Hohlvene freizulegen. Verwenden Sie ein feuchtes Tuch, um den Darm zu halten.
- Legen Sie einen schweren Gegenstand von ca. 2 cm Höhe (z. B. einen silikonbeschichteten Gewichtsring für Messkolben) neben die Hinterbeine der Maus (Ergänzende Abbildung S2A). Setzen Sie den Schlauch mit der angeschlossenen Kanüle 26 G IV auf das Objekt und positionieren Sie die Nadel vorsichtig auf der Hohlvene. Passen Sie die Länge des Schlauchs an.
- Geben Sie die vorbereitete Kollagenase-Stammlösung in das vorgewärmte Aufschlusspufferrohr. 250 μl der Stammlösung werden in 10 ml Aufschlusspuffer gegeben. Bereiten Sie 10-20 ml Verdauungspuffer pro Tier vor. Für größere Tiere oder die Perfusion ganzer Lebern bereiten Sie bis zu 30 ml Verdauungspuffer vor.
HINWEIS: Es wird empfohlen, die Kollagenase-Stammlösung ca. 30 Minuten vor Beginn des Aufschlussprozesses in den erwärmten Aufschlusspuffer zu geben.
Abbildung 2: Überblick über den Perfusionsaufbau. (A) Operationstisch mit der für die Perfusion erforderlichen Ausrüstung. (B) Die Materialien, die für die Vorbereitung der Leber sowie für die Extraktion und Isolierung von Hepatozyten benötigt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
4. Kanülierung und Perfusion
- Stellen Sie die Pumpendrehzahl auf 3 ml/min ein und schalten Sie die Pumpe ein. Lassen Sie den vorgewärmten Perfusionspuffer die Nadel erreichen. Verwerfen Sie die ersten 2-3 ml Perfusionspuffer.
- Führen Sie eine Kanülierung der unteren Hohlvene durch.
- Während der Puffer durch die Nadel läuft, führen Sie die 26 G IV-Kanüle in einem flachen Winkel in die Hohlvene unterhalb der Niere ein. Stellen Sie sicher, dass die Nadelfase nach oben zeigt.
- Ziehen Sie die Hohlvene mit einem Wattestäbchen sanft kaudal unter die Einstichstelle, so dass die bereitgestellte Spannung das Einführen der Kanüle in die Vene erleichtert. Suchen Sie in der Blitzkammer des Katheters nach Blut, wenn die Nadel in das Lumen eindringt.
- Schieben Sie die Nadel weitere 2-3 mm vor, um sicherzustellen, dass die Spitze des Kunststoffkatheters ebenfalls in die Vene eingedrungen ist.
- Schieben Sie den Kunststoffkatheter über die Nadel und weitere 5 mm in die Hohlvene. Entfernen Sie die Nadel langsam und sehr vorsichtig.
HINWEIS: Es wird nicht empfohlen, die Kanüle mit einer Ligatur zu fixieren. Dieser Schritt ist zeitaufwändig, da das Gefäß zu diesem Zweck zunächst präpariert werden muss. Wenn die Kanüle locker positioniert und mit einem Gegenstand gestützt wird, ist keine weitere Fixierung notwendig (siehe Perfusionsaufbau in Ergänzende Abbildung S2). Um die Kanülierungsstelle zu stabilisieren und einen Rückfluss zu verhindern, kann ein einzelner Tropfen monomeres n-Butylcyanacrylat auf die Kanülierungsstelle gegeben werden.
- Wenn Blut aus der Kanüle tropft, füllen Sie sie mit einer Spritze mit warmem Perfusionspuffer.
- Befestigen Sie den Schlauch wieder an der Kanüle, die immer noch mit einer Pumpgeschwindigkeit von 3 ml/min läuft. Lassen Sie den Perfusionspuffer in die Leber gelangen.
- Suchen Sie nach 2-3 s nach weißen Flecken, die sich in der Leber bilden und/oder sich ausdehnen/schwellen der Pfortader aus, die darauf hindeuten, dass der Perfusionspuffer durch die Leber fließt und von der Zentralvene in die Leberläppchen gelangt (Abbildung 3).
- Warten Sie, bis die Pfortader innerhalb von 1-2 s nach dem Auftreten weißer Flecken auf der Leberoberfläche sichtbar anschwillt. Schneiden Sie die Pfortader mit einer Schere so distal wie möglich vom Leberhilus ab. Verwenden Sie einen Mikrogefäßclip, um die Schnittstelle zu beschriften (nicht zu verschließen) (Abbildung 3B).
HINWEIS: Dies vereinfacht die Beurteilung des Flusses durch die Leber während des Perfusionsprozesses. Die Leber wird sofort von Blut befreit und färbt sich innerhalb weniger Sekunden gelb-weiß (Abbildung 3C). Ein zusätzlicher Schnitt durch die Haut auf der rechten Seite der Bauchöffnung erleichtert den Abfluss des Blutes sowie der Perfusionslösung (Abbildung 3B und ergänzende Abbildung S2B,C). - Erhöhen Sie den Durchfluss auf bis zu 4-7 ml/min, abhängig vom Gewicht des Tieres, der Lebergröße und dem Ausmaß der vorherigen Hepatektomie.
- Klemmen Sie die Pfortader mit einer Pinzette oder einer Gefäßklemme für 7-10 s fest. Stellen Sie sicher, dass keine Flüssigkeit durchläuft.
HINWEIS: Die Leber schwillt beim Klemmen sichtbar an und entspannt sich beim Loslassen. Dies ist entscheidend, um die gesamte Leber zu spülen und sie von verbleibendem Blut zu befreien. - Führen Sie nach ca. 30 s eine zweite Klemme durch und stellen Sie sicher, dass die Leber anschwillt und sich entspannt. Fahren Sie mit dem Spülen des Tieres fort, bis der aus der Pfortader fließende Puffer klar ist, mindestens jedoch für 3-4 Minuten.
HINWEIS: Die Pumpendrehzahl hängt sowohl vom Schlauch als auch von der Größe der Leber ab. Es muss individuell bewertet werden. - Zu diesem Zeitpunkt des Verfahrens hätte die Euthanasie sekundär zur Ausblutung erfolgen müssen. Bestätigen Sie, dass der systemische Kreislauf gestoppt wurde (kein Herzschlag oder Flackern des Herzens). Um den Tod sicherzustellen, wird in diesem Stadium des Verfahrens ein bilateraler Pneumothorax als sekundäre physikalische Methode der Euthanasie durchgeführt.
HINWEIS: Reduzieren Sie die Pumpendrehzahl leicht, wenn die systemische Zirkulation aufgehört hat (kein Herzschlag oder Flackern des Herzens).
Abbildung 3: Perfusionsprozess von der Kanülierung bis zur Verdauung. (A) Anatomie der Mausleber mit der Vena cava inferior (weißer Pfeil) und der Pfortader (gelber Pfeil). (B) Kanülierung der Vena cava inferior. Die Kanüle ist mit einer Ligatur (weißer Pfeil) gesichert und die Stelle des Abflusses durch die geöffnete Pfortader mit einer Mikrogefäßklemme markiert (nicht geklemmt). (C) Beachten Sie das Auftreten fleckiger Strukturen, bevor der Perfusionspuffer die Leber von allem verbleibenden Blut befreit hat (weißer Pfeil). Die Haut wird eingeschnitten (gelber Pfeil) und ein Wattestäbchen wird platziert, um den Abfluss von Blut und Durchblutungsflüssigkeit zu gewährleisten. Die intermittierende Klemmung kann mit einer Gefäßklemme oder einer Pinzette durchgeführt werden. (D) Die Leber sollte von jeglichem Blut befreit werden (*). Nachdem der kollagenasehaltige Verdauungspuffer in die Leber gelangt ist, entspannt er sich nach dem Einklemmen nicht mehr und die Leberlappen nehmen an Größe zu. (E) Nach einer Weile kann ein sprudelndes Aussehen auf der Oberfläche der Leber beobachtet werden (*). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
5. Verdauung
- Halten Sie die Perfusionspumpe an und übertragen Sie den Einlassschlauch schnell vom Perfusionspuffer in den vorgewärmten Aufschlusspuffer. Starten Sie die Pumpe neu.
- Bevor der Verdauungspuffer die Leber erreicht, klemmen Sie die Pfortader noch einmal für 3-4 s fest. Stellen Sie sicher, dass sich die Leber beim Lösen der Klemme entspannt und die Perfusionsflüssigkeit klar bleibt.
HINWEIS: Der Aufschlusspuffer enthält Phenolrot und ist leicht vom klaren Perfusionspuffer zu unterscheiden. Dies ermöglicht eine einfache Nachführung innerhalb der Röhre. - Sobald der Verdauungspuffer die Leber erreicht hat, klemmen Sie die Pfortader erneut mit einem Mikrogefäßclip fest.
HINWEIS: Beim Klemmen schwillt die Leber an, entspannt sich aber nicht beim Lösen der Klemme. Das ist normal. - Um den Verdauungsprozess zu erleichtern, verschließen Sie die obere Hohlvene mit einer Gefäßklemme direkt unter dem Zwerchfell, damit der Verdauungspuffer von der unteren Hohlvene zur Leber zum Abfluss durch die geöffnete Pfortader gelangen kann.
HINWEIS: Diese Klemmung stellt sicher, dass der systemische Kreislauf umgangen wird und unnötiger Kontakt mit verbleibenden Blutbestandteilen/Inhibitoren verhindert wird. Dieser Schritt ist optional, da es nach einer Scheinoperation schwierig ist, sich der oberen Hohlvene hinter dem vergrößerten Lebergewebe zu nähern, aber bei hepatektomierten Mäusen ist der Zugang viel einfacher. - Aufschluss für ca. 4 min bei einer Flussrate von 5 ml/min. Wenn die Verdauung fortschreitet, suchen Sie nach Anzeichen dafür, dass die Leber anschwillt, und nach kleinen klaren / transparenten Abschnitten auf der Oberfläche der Leber. Beachten Sie außerdem, dass die Leber die Textur eines nassen Stoffes annimmt und fast matschig erscheint (Abbildung 3E). Untersuchen Sie die Konsistenz durch vorsichtiges Berühren mit einem feuchten Wattestäbchen.
- Fahren Sie mit der Perfusion fort, bis ein deutlicher Unterschied in der Oberflächenstruktur der Leber beobachtet werden kann. Beachten Sie, dass die Leber eine sehr helle Farbe und ein sprudelndes Aussehen annimmt (Abbildung 3E) und sich die Glisson-Kapsel (d. h. der Lebersack) vom Parenchym trennt. Stoppen Sie den Verdauungsprozess, sobald die Leber diese Eigenschaften erworben hat, da eine Überverdauung die Hepatozyten schädigen kann. Entfernen Sie die Nadel, bevor Luft in die Leber gelangt.
HINWEIS: Normalerweise werden 10-20 ml Aufschlusspuffer benötigt, um eine ausreichende Verdauung zu erreichen. Dies hängt von der Größe des Tieres, dem Ausmaß der Hepatektomie, dem Aufbau der Schläuche und der Qualität der Kollagenaselösung ab. Erhöhen Sie bei Bedarf die Perfusionszeit und nicht die Perfusionsgeschwindigkeit. Zu viel Druck im Gefäßsystem kann dazu führen, dass die Leber platzt und die Perfusions-/Verdauungsflüssigkeit in den retroperitonealen Raum verloren geht.
6. Vorbereitung der Leber
- Entfernen Sie die Leber vorsichtig aus der Bauchhöhle. Seien Sie sehr vorsichtig, da es jetzt sehr dünn und zerbrechlich ist.
- Fassen Sie das zentrale Bindegewebe zwischen den Lappen mit einer Pinzette und heben Sie es leicht nach oben, wobei Sie es als Ankerpunkt verwenden.
- Schneiden Sie alle Verbindungen der Leber zu anderen Organen ab, entfernen Sie die Gallenblase und legen Sie die Leber in den eiskalten Konservierungspuffer.
HINWEIS: Idealerweise sollte die Extraktion und Weiterverarbeitung von Hepatozyten sofort erfolgen, um die Lebensfähigkeit der Hepatozyten zu erhalten. Bei Bedarf kann die Leber jedoch kurzzeitig bei 4 °C gelagert werden (z.B. für den Transport). Diese Verzögerung sollte 30-40 Minuten nicht überschreiten.
7. Hepatozyten-Extraktion
- Übertragen Sie die Leber in eine 10 cm Petrischale und fügen Sie 10 ml eiskaltes Williams' Medium E hinzu.
- Zerreißen Sie die Glisson-Kapsel mit einer Pinzette mit feiner Spitze an einigen Stellen entlang der Leberoberfläche. Fassen Sie einen zentralen Teil (z. B. Bindegewebe am Leberhilus) mit zwei Pinzetten und ziehen Sie sie langsam auseinander, damit die Kapsel reißen kann, ohne die Hepatozyten zu beschädigen. Geben Sie die Zellen frei, indem Sie die Kapsel leicht schütteln (Ergänzende Abbildung S3).
HINWEIS: Im Idealfall reißt die Leber leicht auseinander und setzt die Zellen frei. Wenden Sie keine Gewalt an. Ein Zellabstreifer kann helfen, alle Zellen vollständig zu entfernen und die Zellausbeute zu erhöhen. Schneiden Sie die Leber nicht mit einer Schere in Stücke. - Filtrieren Sie 5 ml Leberpulpe durch ein 100-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Röhrchen. Spülen Sie den Filter mit 10 ml frischem, eiskaltem Medium. Die restlichen 5 ml Zellstoff werden durch das Zellsieb filtriert.
HINWEIS: Verwenden Sie eine serologische 25-ml-Pipette, um die Leberpulpa mit den dissoziierten Hepatozyten zu übertragen (Abbildung 4A). Kleinere Pipetten mit kleineren Öffnungen erhöhen die Scherspannung und schädigen die Hepatozyten irreversibel. - Fügen Sie insgesamt 30 ml kaltes Medium hinzu, um die Petrischale zu spülen, filtern Sie sie und geben Sie die Suspension in das 50-ml-Röhrchen, bis es voll ist. Alle isolierten Zellen befinden sich nun in der Schwebe (Abbildung 4B).
Abbildung 4: Reinigung durch schonende Zentrifugation . (A) Leberhomogenat, das nach dem Extraktionsschritt übrig bleibt. (B) Mikroskopische Ansicht (20-fache Vergrößerung) des Homogenisats; Beachten Sie die ausgeprägte Kontamination mit Schmutz. (C) Reinigungszentrifugationsschritte und (D) mikroskopische Ansichten der zu verwerfenden Überstände. (E) Mikroskopische Ansicht der gereinigten Hepatozytenfraktion. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
8. Hepatozyten-Isolierung
- Schleudern Sie bei 50 × g für 5 min bei 4 °C (geringste Beschleunigung und niedrigstmögliche Bremse).
HINWEIS: Hepatozyten sind dichter als nicht-parenchymale Leberzellen. Aufgrund der geringen Zentrifugationskraft werden nur Hepatozyten pelletiert, während andere Zellen (z. B. Immunzellen, Erythrozyten und sinusförmige Zellen) im Überstand verbleiben. - Saugen Sie den größten Teil des Überstands ab und lassen Sie 1 ml übrig, um die Zellen durch vorsichtiges Schwenken des Röhrchens zu resuspendieren.
- Fügen Sie 40 ml kaltes Williams-E-Medium hinzu und schleudern Sie erneut bei 50 × g für 10 Minuten bei 4 °C (geringe Beschleunigung, geringe Bremse), um tote Hepatozyten und Zelltrümmer sowie lebensfähige und fetthaltige Hepatozyten von Pellets weiter zu entfernen (Abbildung 4C).
- Verwerfen Sie den größten Teil des Überstands und lassen Sie 1 ml übrig, um die Zellen durch Schwenken des Röhrchens zu resuspendieren.
- Fügen Sie 40 ml kaltes Williams' E medium hinzu und schleudern Sie erneut bei 50 × g für 5 min bei 4 °C (geringe Beschleunigung, niedrige Bremse).
- Saugen Sie den größten Teil des Überstands ab und lassen Sie 1 ml übrig, um die Zellen durch vorsichtiges Schwenken des Röhrchens zu resuspendieren.
HINWEIS: Stoppen Sie diesen Vorgang erst, wenn die Zellen fixiert oder analysiert sind. Hepatozyten sind sehr zerbrechlich und jede Verzögerung des Perfusions-, Verdauungs- und Reinigungsprozesses kann die Zellen schädigen. - Bestimmen Sie die endgültige Zellkonzentration nach der Zugabe von Trypanblau mit einer Neubauer-verbesserten Zählkammer.
HINWEIS: Die meisten Trümmer und nicht-parenchymalen Zellen wurden jetzt entfernt, was zu einem sauberen Pellet von etwa 10-15 × 106 Hepatozyten führt, die nach einer 70%igen Hepatektomie übrig bleiben. - Je nach gewünschter Konzentration mehr eiskaltes Medium hinzufügen. Verwenden Sie die Hepatozyten-Zellsuspension für jede nachgeschaltete Analyse oder initiieren Sie eine primäre Zellkultur.
HINWEIS: In diesem Stadium verbleiben nur wenige Immun- und Nicht-Parenchymzellen (<5%) in der Suspension. Wenn eine weitere Aufreinigung gewünscht wird, führen Sie eine negative Selektion von CD31+- und CD45+-Zellen durch magnetische oder fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (MACS/FACS) durch. Bis heute gibt es keinen zuverlässigen und robusten Oberflächenmarker für Leberparenchymzellen.
9. Präparation der isolierten Hepatozyten für die Durchflusszytometrie
- Zentrifugieren Sie die Hepatozyten bei 100 × g für 5 min.
- Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie die gewünschte Menge Durchflusszytometriepuffer hinzu, abhängig von der Konzentration der Zellsuspension.
- 1 ml Zellsuspension in ein Durchflusszytometrieröhrchen geben. 5 min bei 100 × g zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
- Geben Sie 100-200 μl des verdünnten Alexa Fluor 488 Zombie Green Viability Dye (Konzentration 1:400) in die Zellen und schütteln Sie sie vorsichtig. Resuspendieren Sie die Hepatozyten vorsichtig durch manuelles Schütteln oder mit einem Wirbelmischer bei niedriger Geschwindigkeit (maximal 2-3) für 2 s.
HINWEIS: Verwenden Sie keine kleinen Pipettenspitzen, um die Zellen zu resuspendieren. Sie sind sehr zerbrechlich und die aufgebrachte Scherspannung verursacht Schäden und verringert die Lebensfähigkeit der Zellen. Wenn das Pipettieren nicht vermeidbar ist, verwenden Sie eine 1.000-μl-Pipette, nachdem Sie den kleinsten Teil von der Spitze abgeschnitten haben, um den Durchmesser zu vergrößern, und pipettieren Sie die Zellen sehr langsam. - Legen Sie die Röhrchen auf Eis oder lagern Sie sie bei Raumtemperatur, je nach gewünschter Färbung. Inkubieren Sie die Zellen 20-30 Minuten im Dunkeln.
- Fügen Sie 2 ml Durchflusszytometriepuffer hinzu und waschen Sie die Zellen 3x. Zentrifugieren Sie die Zellen nach jedem Waschschritt bei 100 × g für 5 Minuten.
- Fügen Sie 2 ml Fixierungspuffer hinzu (1:1 4% PFA und PBS). Resuspendieren Sie die Hepatozyten vorsichtig durch manuelles Schütteln oder mit einem Wirbelmischer bei niedriger Geschwindigkeit (maximal 2-3) für 2 s.
- Fixieren Sie die Zellen für 30 min.
- Bei 100 × g weitere 5 Minuten zentrifugieren, den Überstand verwerfen und Durchflusszytometriepuffer hinzufügen.
HINWEIS: Die Zellen können vor der Analyse bis zu 72 Stunden nach der Isolierung im Durchflusszytometrie-Puffer gelagert werden.
10. Analyse von Hepatozyten mit Durchflusszytometrie
- Analysieren Sie die Hepatozyten mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer.
HINWEIS: Berücksichtigen Sie die relativ große Größe der Hepatozyten und passen Sie die Spannungen an. Beginnen Sie mit einer niedrigen Spannung und gehen Sie nicht höher als 350 V für die Vorwärtsstreuung (FSC) und 220 V für die Seitenstreuung (SSC).- Passen Sie die Spannungen für FSC und SSC an die geschätzte Größe der Zellen an. Identifizieren Sie die Hepatozytenpopulation und zeichnen Sie alle Ereignisse mit SSC-A und FSC-A auf (Abbildung 5A).
- Beachten Sie, dass Trümmer und nicht-parenchymale Zellen in der unteren linken Ecke des FSC- und SSC-Dichtediagramms angezeigt werden und ausgeschlossen sind (Abbildung 5A).
- Da Dublettzellen die Analyse beeinflussen können, erstellen Sie ein Dichtediagramm der Seitenstreuhöhe (SSC-H) im Vergleich zur Seitenstreufläche (SSC-A), um Dubletten auszuschließen, wie in Abbildung 5B gezeigt.
- Wählen Sie die endgültige Hepatozytenpopulation aus, indem Sie CD31- (Endothelmarker) und CD45- (Immunmarker) Zellen ansteuern (Abbildung 5C).
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Representative Results
TRAS erreicht 16 Stunden nach der Hepatektomie seinen Höhepunkt und verschwindet allmählich 32-48 Stunden nach der Standardhepatektomie, bleibt aber nach der verlängerten Hepatektomie über 48 Stunden hinaus bestehen. Makroskopisch ist TRAS als blasser Teint des Leberrestes gut sichtbar (Abbildung 1F) und kann bei hepatektomierten Mäusen zwischen 16 h und 48 h nach der Operation beobachtet werden.
Die geschätzte Endausbeute beträgt 10-15 × 10 6 Hepatozyten nach 70%-Hepatektomie und 4-9 × 106 nach verlängerter 86%-Hepatektomie bei Mäusen, mit einer mittleren endgültigen Lebensfähigkeit von 78% bzw. 65%. Dies entspricht dem erwarteten Prozentsatz im Vergleich zu einer Gesamtausbeute von 50-70 × 106 aus einer ganzen Mausleber (Abbildung 6A,C). Nach partiellen Hepatektomien zeigen Hepatozyten im Vergleich zu normalen Lebern eine erhöhte Zellgröße, die ihrem erhöhten Lipidgehalt entspricht (Abbildung 6B). Die Gating-Strategie ist in der ergänzenden Abbildung S4 dargestellt.
Abbildung 6: Hepatozytenausbeute, Zellgröße und Viabilität . (A) Zellzahl einer ganzen Mausleber und von Resten 24 h nach 70%- und 86%-Hepatektomie. (B) Berechnetes Zellvolumen isolierter Hepatozyten. Beachten Sie den deutlichen Anstieg der Zellgröße 24 Stunden nach der Hepatektomie, sowohl für 70% als auch für 86%. (C) Zelllebensfähigkeit isolierter Hepatozyten nach jedem Schritt des Reinigungsprozesses. Die Lebensfähigkeit wurde mittels Durchflusszytometrie mit dem grünen Lebensfähigkeitsfarbstoff Alexa Fluor 488 Zombie gemessen. Prozentsätze werden von allen Hepatozyten-Singuletts entnommen. Informationen zur Gating-Strategie finden Sie in der ergänzenden Abbildung S6 und der ergänzenden Abbildung S4. Fehlerbalken beziehen sich auf Standardabweichungen mit n = 6-8/Gruppe. Abkürzungen: sHx = Standard-Hepatektomie; eHx = erweiterte Hepatektomie; Ohne Resektion = Scheinoperation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ein erhöhter Lipidgehalt in murinen Hepatozyten 24 h nach partieller Hepatektomie kann durch eine Erhöhung der Granularität beobachtet werden (Abbildung 7; zur Gating-Strategie siehe ergänzende Abbildung S5) oder direkt durch das Vorhandensein von Lipidvesikeln in vergrößerten Hepatozyten beobachtet werden (Abbildung 8 und ergänzende Datei 1).
Abbildung 7: Erhöhte Granularität und Zellgröße, gemessen durch Durchflusszytometrie. (A) Erhöhte Granularität zwischen isolierten Hepatozyten 24 h nach Hepatektomie als indirekter Marker für das Vorhandensein von Lipidvesikeln. (B) Histogramm mit SSC. (C) Die Prozentsätze repräsentieren den Anteil der Zellen mit hoher zytoplasmatischer granularer Intensität, gemessen durch das SSC-Signal. Fehlerbalken beziehen sich auf Standardabweichungen mit n = 6-8/Gruppe. Abkürzungen: sHx = Standard-Hepatektomie; eHx = erweiterte Hepatektomie; ohne Resektion = Scheinoperation; FSC = Vorwärtsstreusignal; SSC = Seitenstreuung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Sudan IV-Färbung als Marker für den Fettgehalt isolierter frischer Hepatozyten. (A) Hepatozyten aus einer frischen ganzen Mausleber ohne vorherige Operation. Erhöhte Größe und Fettgehalt der Hepatozyten 24 h (B) nach 70%-Hepatektomie und (C) 86%-Hepatektomie. Beachten Sie das gleichzeitige Vorhandensein sowohl größerer, steatotischer Hepatozyten als auch kleinerer, nicht-steatotischer Hepatozyten. Maßstabsbalken = 30 μm (B-D). Fehlerbalken beziehen sich auf Standardabweichungen mit n = 6-8/Gruppe. Abkürzungen: sHx = Standard-Hepatektomie; eHx = erweiterte Hepatektomie; Ohne Resektion = Scheinoperation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ein sehr geringer Prozentsatz an Immun- und Nicht-Parenchymzellen verbleibt in der endgültigen Suspension. Eine weitere Reinigung wird auf Wunsch durch FACS oder MACS erreicht. Die negative Selektion von CD31+- und CD45+-Zellen mittels Durchflusszytometrie wird verwendet, um die nicht-parenchymalen Zellen zu demonstrieren und zu quantifizieren (Abbildung 5).
Abbildung 5: Durchflusszytometrie-Gating-Strategie und Auswahl von CD31- und CD45-Parenchymzellen. (A) Gating-Diagramm mit allen aufgezeichneten Ereignissen; Berücksichtigen Sie die relativ große Größe der Hepatozyten und verwenden Sie angepasste Spannungen. Gehen Sie nicht höher als 350 V für FSC und 220 V für SSC. (B) Singulett-Gating. (C) Hepatozyten werden durch Gating von CD31- (Endothelmarker) und CD45- (Immunmarker) Zellen ausgewählt. Diese Selektion kann in einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer durchgeführt werden, um bei Bedarf Parenchymzellen für weitere nachgeschaltete Analysen auszuwählen. n = 4-5/Gruppe. Abkürzungen: FSC = Vorwärtsstreuung; SSC = Seitenstreuung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Um die Wirksamkeit des modifizierten Protokolls bei der Retention von steatotischen Zellen zu demonstrieren, wurden Hepatozyten mit dem klassischen Dichtegradientenansatz7 isoliert (Abbildung 9A). Anders als beim modifizierten Verfahren (Abbildung 9B) war auf dem Dichtegradienten eine Fettzellschicht deutlich sichtbar. Die Analyse der Zellen bestätigte ein grobes Fehlen von lipidbeladenen Hepatozyten im Pellet nach Dichtegradientenzentrifugation. Im Gegensatz dazu waren Zellen aus der Fettschicht mit steatotischen Hepatozyten und einem erheblichen Anteil an nicht-parenchymalen und toten Zellen angereichert (Abbildung 9A). So beraubt die klassische Isolierung die Ernte von steatotischen Zellen, während dieses modifizierte Protokoll, das den Dichtegradienten weglässt, lipidbeladene Subpopulationen beibehält, was die unvoreingenommene Erforschung der Leberregeneration ermöglicht, ohne sich in Richtung magerer Hepatozyten zu verlagern.
Abbildung 9: Ausbeute an steatotischen Hepatozyten nach dem klassischen Dichtegradienten-Isolationsprotokoll im Vergleich zum verbesserten Protokoll . (A) Bei der klassischen Dichtegradientenreinigungsmethode (Endkonzentration von 90% Dichtegradientenlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung) werden tote Hepatozyten in einer Zellschicht auf der Dichtegradientenlösung gesammelt. (B) Diese Schicht besteht nicht nur aus nicht-parenchymalen Zellen und nicht lebensfähigen Hepatozyten, sondern auch aus lebensfähigen, großen, fettigen Hepatozyten. (C) Das Pellet, das nach Dichtegradientenzentrifugation erhalten wird, enthält magere Hepatozyten kleinerer Größe und ist größtenteils frei von steatotischen Zellen. Dies ist die "reine" Fraktion, die mit dem klassischen Protokoll isoliert wird. (D) Mit dem verbesserten Protokoll gehen die mit Lipiden gefüllten Hepatozyten nicht verloren und alle Hepatozyten werden pelletiert. Der Überstand (E) besteht hauptsächlich aus toten und fragmentierten Hepatozyten und nicht-parenchymalen Zellen, während das Pellet (F) eine Mischung aus Hepatozyten unterschiedlicher Größe und Lipidgehalt ist. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzungsdossier 1: Ergänzende Protokolle. (A) Lipidfärbung mit Sudan IV; (B) Standard- und erweiterte Hepatektomie bei Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S1: Übersicht über den Perfusionsaufbau. (1) Kanülieren Sie die untere Hohlvene. (2) Perfusionieren Sie die Leber mit warmem Perfusionspuffer, um Kalzium zu chelatisieren. (3) Erwärmen Sie den Verdauungspuffer mit Kollagenasen und Ca2+ , um Zellen in vivo zu dissoziieren. Entfernen Sie die Leber und (4) lagern Sie sie in einem eiskalten Konservierungspuffer (maximal 30 Minuten). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S2: Perfusions-Setup. (A) Perfusionstisch mit Isoflurandüse, Rotlicht-Heizlampe und Perfusionsrohr. Ein schwerer Gegenstand kann unter das Rohr gelegt werden, um es zu stabilisieren und das Risiko einer Verschiebung zu verringern. (B) In den ersten Minuten der Perfusion fließt etwas Blut durch die Pfortader ab und sammelt sich in der offenen Bauchhöhle. (C) Die Bauchdecke ist auf einer Seite eingeschnitten, um das Blut abzulassen. Ein Wattestäbchen erleichtert die Drainage. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S3: Glissons Kapsel. (A) Die Glisson-Kapsel wird mit einer Pinzette mit feiner Spitze an einigen Stellen entlang der Leberoberfläche aufgebrochen, und die Leberzellen werden durch leichtes Schütteln der Kapsel freigesetzt. (B) Die Leber sollte leicht auseinanderreißen. (C) Der leere Lebersack (Glisson-Kapsel) mit freigesetzten Hepatozyten in Suspension. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S4: Durchflusszytometrie-Gating-Strategie für das Viabilitätsscreening. (A) Alle Ereignisse wurden aufgezeichnet. (B) Singulett-Gating. (C) Lebend-/Totfärbung mit Alexa Fluor 488 Zombie Green Viability Dye. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S5: Durchflusszytometrie-Gating-Strategie zur Granularitätsmessung. (A) Alle Ereignisse wurden aufgezeichnet. (B) Singulett-Gating. (C) Punktdiagramm der Seitenstreuung (SSC; x-Achse ) versus Vorwärtsstreuung (FSC; y-Achse ), um die Granularitätsebenen zu analysieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S6: Hepatozyten-Reinigung. (A) Zellpellet nach dem ersten Zentrifugationsschritt; Beachten Sie die Fettschicht auf dem Medium. (B) Hepatozyten-Pellet nach der zweiten Zentrifugationsrunde. (C) Gereinigte Hepatozyten am Ende des Reinigungsprozesses. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Das veröffentlichte Protokoll bietet eine zuverlässige und unkomplizierte Methode zur Isolierung einer hohen Ausbeute an normalen und steatotischen murinen Hepatozyten für Einzelzell-Downstream-Analysen oder Massenanalysen von Zellen nach FACS-Sortierung. Der entscheidende Vorteil gegenüber der Dichtegradientenreinigung besteht darin, dass der zelluläre Lipidgehalt im Wesentlichen keinen Einfluss auf die effektive Ausbeute an Hepatozyten hat. So bleibt der Anteil der steatotischen Hepatozyten erhalten und wird in nachgelagerte Analysen einbezogen. Dies ist nicht nur für die Untersuchung von steatogenen Lebererkrankungen von entscheidender Bedeutung, sondern auch für die Analyse von Prozessen nach großen Hepatektomien, bei denen Hepatozyten innerhalb der ersten 2-3 Tage der Regeneration eine zeitlich und räumlich dynamische Steatose aufweisen. Auch wenn bereits nach Hepatektomien 19,20,21 (Einzelzell-)Analysen von isolierten Hepatozyten durchgeführt wurden, muss davon ausgegangen werden, dass der analysierten Zellpopulation zumindest teilweise lipidbeladene Hepatozyten entzogen wurden und die Ergebnisse daher nicht vollständig repräsentativ und in Richtung magerer Hepatozyten verzerrt waren.
Derzeit ist die Funktion von TRAS nicht vollständig geklärt. Zum Beispiel sind die räumlichen Unterschiede im Lipidgehalt innerhalb der Leberläppchen nach wie vor unverstanden. Daher wird eine Methode benötigt, die einen quantitativen und qualitativen Nachweis ermöglicht, ohne diese Zellen präzise von Analysen auszuschließen (z. B. für Einzelzell-Transkriptomik, Durchflusszytometrie und Metabolomik).
Insgesamt ist die Hepatozytenausbeute mit diesem verbesserten Protokoll deutlich besser als bei anderen Methoden zur Isolierung fetthaltiger Hepatozyten (z. B. von Mäusen mit nichtalkoholischer Steatohepatitis, NASH) unter Verwendung der Dichtegradientenreinigung15. Die Zellausbeute, die Lebensfähigkeit und der Fettgehalt können jedoch zwischen den Präparaten variieren. Mehrere Faktoren scheinen dafür verantwortlich zu sein.
Erstens variieren verschiedene Chargen von Kollagenase oder Kollagenase-Mischungen in ihrer enzymatischen Aktivität; Die Unterschiede zwischen den Chargen sind jedoch nicht so kritisch wie bei herkömmlichen Kollagenasen. Dennoch kann eine Anpassung der Arbeitskonzentration erforderlich sein. Die Unterschiede können durch sachgemäße Lagerung bis zur Verwendung (trockene Lyophilisate und rehydrierte Stammlösungen bei -15 bis -25 °C) und durch Vermeidung sich wiederholender Gefrier-Tau-Zyklen weiter minimiert werden, können aber nicht vollständig eliminiert werden. Daher wird empfohlen, nur Kollagenasen einer bestimmten Charge für eine bestimmte Versuchsreihe zu verwenden. Darüber hinaus hängt die enzymatische Aktivität von der Temperatur ab, bei der der Verdauungspuffer die Leber erreicht, mit einer optimalen Temperatur zwischen 35 °C und 37 °C für eine Mischung aus Kollagenasen I und II22. Niedrigere Temperaturen verringern die enzymatische Aktivität, während Temperaturen über 50 °C zu einer irreversiblen Denaturierung des Proteins führen können. Testen Sie dies im Voraus und optimieren Sie die Versuchsbedingungen, indem Sie die Anfangstemperatur des Aufschlusspuffers, die Länge und den Durchmesser des Kunststoffrohrs sowie die Strömungsgeschwindigkeit anpassen. So ist beispielsweise mit einem Abfall der Puffertemperatur um bis zu 10 °C innerhalb einer Rohrlänge von 60 cm zu rechnen. Korrigieren Sie die Temperatur bei Bedarf mit Wärmepads und Infrarotlampen. Kollagenasen zeigen ihre optimale Verdauungskapazität bei einem pH-Wert von 7,4; Daher wird empfohlen, den pH-Wert der Pufferlösungen bereits vor der Verwendung auf eine Arbeitstemperatur von ca. 37 °C einzustellen.
Zweitens ist es von größter Bedeutung, die Leber (oder die ganze Maus) vor Beginn des Verdauungsprozesses ausreichend mit Perfusionspuffer zu spülen, um potenzielle Inhibitoren wie Serum oder Albumin zu eliminieren. Idealerweise wird die Perfusion erst nach dem Stoppen des systemischen Kreislaufs begonnen, um sicherzustellen, dass sich der Verdauungspuffer nur von der Hohlvene durch die Leber zum Abfluss über die geöffnete Pfortader bewegt. Die obere Hohlvene kann mit einer kleinen Gefäßklemme verschlossen werden. Dies verhindert den Kontakt mit verbliebenen Blutbestandteilen/Inhibitoren. Eine weitere Methode, um die Leber optimal zu spülen, ist die intermittierende Klemmung der Pfortader. Dies sollte sorgfältig geschehen und - sobald der Verdauungspuffer die Leber erreicht hat - nur einmal durchgeführt werden, um eine Schädigung der bereits verdauten Zellen zu vermeiden.
Drittens sind regenerierende Hepatozyten empfindlich, und die Erfahrung hat gezeigt, dass sie kürzere Verdauungszeiten und eine sorgfältigere Handhabung erfordern, um eine Überverdauung und Schädigung der Zellen zu vermeiden. Um die Leber so schonend wie möglich zu entnehmen, wird empfohlen, den Leberhilus mit einer Klammer zu fassen und dann zuerst die obere Hohlvene zu durchtrennen und die Leber von den Verbindungen zur Vene und zum Zwerchfell zu befreien. Anschließend können die untere Hohlvene und die Pfortader durchtrennt werden, was eine Mobilisierung der Leber ermöglicht und sie leicht von den Magen-Darm-Bändern, der Speiseröhre auf der einen Seite und der rechten Niere auf der anderen Seite befreit. Bei hepatektomierten Mäusen ist es möglich, eine der Ligaturen vorsichtig aus den Mittellappen zu greifen, um die Leber zu entfernen. Wenn versucht wird, die Leber mit Gewalt herauszuziehen, kann die Glisson-Kapsel reißen und die isolierten Zellen könnten verloren gehen.
Schließlich ist es wichtig, dass der Perfusionsprozess und die Weiterverarbeitung der Hepatozyten nicht unterbrochen oder verzögert werden, da dies die Lebensfähigkeit sofort und unweigerlich beeinträchtigt. Idealerweise wird die Perfusion in einem Team von mindestens zwei Personen und jeweils an einem Tier durchgeführt. Diese zeitlichen und personellen Anforderungen sind jedoch eine der Einschränkungen dieser Methode, obwohl dies auch für alternative Methoden gilt.
Eine weitere Einschränkung ist die endgültige Reinheit der resultierenden Zellsuspension, da der Vorteil, dass steatotische Hepatozyten nicht an einen Dichtegradienten verloren gehen, zu einem geringen Anteil an verbleibenden nicht-parenchymalen und/oder Immunzellen führt. In der gezeigten Probe liegt der Anteil von CD45+ (Immunzellen) und CD31+ (Endothelzellen) unter 5 %, und bei der ersten Auswahl der Zellgröße während der Durchflusszytometrie betragen die Prozentsätze von CD45+ und CD31+ 1,2 % bzw. 2,2 % (Abbildung 5). Für die meisten Anwendungen ist dieser Reinheitsgrad ausreichend, aber hochempfindliche Methoden oder die weitere Verwendung in primären Zellkulturen erfordern wahrscheinlich einen höheren Grad. Zahlreiche Studien haben CD31 und CD45 als systemische Marker verwendet, um Leberzellpopulationen nach MACS 23,24 oder FACS25 zu sortieren.
Diese verbesserte Isolationsmethode eignet sich ideal für die Untersuchung der Leberregeneration, insbesondere in der Frühphase, in der erhebliche Mengen an steatotischen Hepatozyten vorhanden sind. PHLF, mit persistierender Steatose, ist ein besonders relevantes Thema, das Forschung erfordert. Nach ausgedehnten Hepatektomien, die marginale Reste hinterlassen, kann sich eine PHLF entwickeln und stellt in der Tat die häufigste Todesursache aufgrund einer Leberoperation dar. Seine Pathobiologie ist nur teilweise verstanden, und derzeit ist keine Behandlung verfügbar26. Angesichts der Tatsache, dass PHLF die Anwendung von Leberoperationen (z. B. zur Heilung von Lebermalignomen) erheblich einschränkt, ist die Erforschung ihrer Ursachen und die Identifizierung möglicher Maßnahmen ein klarer medizinischer Bedarf.
Es besteht auch Bedarf an der Untersuchung von Krankheiten, die die Lebersteatose als Ausgangspunkt haben. Ein prominentes Beispiel ist die nichtalkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD), die zu NASH und schließlich zu einem hepatozellulären Karzinom (HCC) führen kann27. Die Verbreitung einer sitzenden Lebensweise in Verbindung mit der westlichen Ernährung hat zu einer weltweiten NAFLD-Epidemie geführt, und dementsprechend wird die HCC-Inzidenz voraussichtlichum 28,29 steigen. Die Steatose wiederum ist auch eng mit Fettleibigkeit, dem metabolischen Syndrom und Typ-2-Diabetes verbunden, alles Krankheiten mit steigender Inzidenz30. Daher stellt die Steatose eine zunehmende Belastung für das derzeitige Gesundheitssystem dar und erfordert wirksame Mittel für ihr Management. Diese verbesserte zweistufige Kollagenase-Perfusionsmethode ermöglicht die Untersuchung von steatotischen Hepatozyten auf Einzelzellebene und sollte daher bei der Erforschung der Ursachen und Folgen der hepatozellulären Lipidakkumulation helfen.
Dieses Protokoll stellt eine einfache, schnelle und zuverlässige Technik für die In-vivo-Isolierung von regenerierenden Hepatozyten von Mäusen nach partieller (70%) und erweiterter (86%) Hepatektomie dar. Dieser Ansatz beruht nicht auf einer Gradientenreinigung und kann verwendet werden, um Leberregenerationsprozesse unter Einbeziehung von lipidbeladenen Hepatozyten zu untersuchen, die normalerweise während herkömmlicher Isolationsprotokolle verloren gehen. Darüber hinaus kann diese Methode auch für die Erforschung verschiedener Lebererkrankungen angewendet werden, die mit steatotischen Veränderungen einhergehen und ist nicht auf die Mausspezies beschränkt.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom Schweizerischen Nationalfonds unterstützt (Projektbeitrag 310030_189262).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | - |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | - |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | - |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | - |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | - |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | - |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | - |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | - |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | - |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | - |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | - | - |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | - |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | - |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | - |
| Fenestrated sterile surgical drape | - | - | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | - |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | - |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | - | - |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | - |
| Isofluran station | Provet | - | - |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | - | - |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | - | - |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | - |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | - |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | - | - |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | - | - |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | - |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | - | Adjust to 42 °C |
References
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C.
- Lehmann, K., et al. Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration. Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).
- Makino, H., et al. A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice. Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).
- Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N. Liver Pathology. Gayam, V., Engin, O. , IntechOpen. (2019).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers. Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver. Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Trotter, N. L. A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy. Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).
- Kachaylo, E., et al. PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice. Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
- Dold, S., et al. Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation. PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).
- Boyce, S., Harrison, D. A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse. Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration. JCI Insight. 5 (22), (2020).
- Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver. Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).
- Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation. Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).
- Roche, Liberase TM Research Grade. , (2020).
- Giugliano, S., et al. Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication. Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).
- Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).
- Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes. Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).
- Helling, T. S. Liver failure following partial hepatectomy. HPB. 8 (3), 165-174 (2006).
- Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F.
- Park, W. Y., et al. Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study. Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).
- Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude. Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
- Roeb, E. Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD). Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).
