Summary
Lipidbelastede hepatocytter er iboende for leverregenerering, men går vanligvis tapt ved sentrifugering av tetthetsgradient. Her presenterer vi en optimalisert celleisolasjonsprotokoll som beholder steatotiske hepatocytter, noe som gir representative populasjoner av regenererende hepatocytter etter delvis hepatektomi hos mus.
Abstract
Delvis hepatektomi har vært mye brukt til å undersøke leverregenerering hos mus, men isolering av høye utbytter av levedyktige hepatocytter for nedstrøms enkeltcelleapplikasjoner er utfordrende. En markert akkumulering av lipider i regenererende hepatocytter observeres i løpet av de første 2 dagene av normal leverregenerering hos mus. Denne såkalte transiente regenereringsassosierte steatosen (TRAS) er midlertidig, men overlapper delvis den store proliferative fasen. Density-gradient rensing er ryggraden i de fleste eksisterende protokoller for isolering av primære hepatocytter. Siden gradientrensing er avhengig av tettheten og størrelsen på cellene, skiller den ikke-steatotisk fra steatotiske hepatocyttpopulasjoner. Derfor går fete hepatocytter ofte tapt, noe som gir ikke-representative hepatocytfraksjoner.
Den presenterte protokollen beskriver en enkel og pålitelig metode for in vivo-isolering av regenererende hepatocytter uavhengig av lipidinnholdet. Hepatocytter fra mannlige C57BL/6-mus isoleres 24-48 timer etter hepatektomi ved en klassisk to-trinns kollagenaseperfusjonstilnærming. En standard peristaltisk pumpe driver de oppvarmede løsningene via den kateteriserte dårligere vena cava inn i resten, ved hjelp av en retrograd perfusjonsteknikk med utstrømning gjennom portalvenen. Hepatocytter dissocieres av kollagenase for frigjøring fra Glissons kapsel. Etter vask og forsiktig sentrifugering kan hepatocytter brukes til eventuelle nedstrømsanalyser. Avslutningsvis beskriver dette papiret en enkel og reproduserbar teknikk for isolering av en representativ populasjon av regenererende hepatocytter etter delvis hepatektomi hos mus. Metoden kan også hjelpe studiet av fettleversykdom.
Introduction
Leveren kan regenerere seg selv selv etter stort vevstap. Denne unike regenerative kapasiteten er eksplisitt illustrert av den eksperimentelle modellen for delvis (70%) hepatektomi, først beskrevet hos rotter av Higgins og Anderson i 19311. I denne modellen fjernes 70% av leveren kirurgisk fra dyr ved å klippe av større leverlapper. De resterende vokser deretter gjennom kompenserende hypertrofi for å gjenopprette den opprinnelige levermassen innen ca. 1 uke etter operasjonen, om enn uten restaurering av den opprinnelige leverarkitekturen 2,3. Ytterligere hepatektomier med varierende mengder vevsfjerning har blitt utviklet, for eksempel 86% utvidet hepatektomi hvor leverresten er for liten til å gjenopprette, noe som til slutt fører til posthepatektomi leversvikt (PHLF) og etterfølgende død hos 30% -50% av dyrene 4,5,6. Disse modellene muliggjør studier av normal og mislykket leverregenerering, avhengig av mengden resektert vev (figur 1).
Selv om musemodeller av hepatektomier har blitt brukt med suksess i mange år, har bare nylig mer avanserte analysemetoder tillatt en dypere innsikt på enkeltcellenivå. For de fleste av disse metodene er imidlertid tilstedeværelsen av individuelle hepatocytter en grunnleggende forutsetning. De fleste protokoller for isolering av primære hepatocytter er basert på en to-trinns kollagenaseperfusjonsteknikk og påfølgende tetthetsgradientrensing for å skille levedyktige hepatocytter fra rusk og ikke-parenkymal, samt døde celler 7,8,9. Denne metoden ble først beskrevet av Berry og Friend i 196910 og tilpasset av Seglen og kolleger i 197211,12. Imidlertid, da gradientsentrifugering er avhengig av tettheten og størrelsen på cellene, går lipidbelastede hepatocytter ofte tapt under standard rensing. Selv om et slikt tap kan være ubetydelig for mange forskningsspørsmål, er det et avgjørende aspekt for tidlig leverregenerering. I løpet av de første 2 dagene akkumulerer hepatocytter i den regenererende museleveren lipider, og vokser dermed i størrelse og dypper i tetthet. Denne forbigående regenereringsassosierte steatosen (TRAS) tjener til å gi regenerativt drivstoff og er midlertidig, men overlapper delvis den viktigste proliferative fasen og er ujevnt fordelt i leverlobulene - de funksjonelle enhetene i leveren13,14. Etter utvidet 86% -hepatektomi oppstår imidlertid TRAS også, men vedvarer, fordi regenerering er stoppet og lipider ikke blir oksidert14. Derfor vil gradientrensing av hepatocytter etter 70%- eller 86%-hepatektomier gi ikke-representative fraksjoner, da de fleste lipidbelastede hepatocytter går tapt på grunn av deres lave tetthet15.
I denne modifiserte isolasjonsprotokollen isoleres hepatocytter fra C57BL/6-mus 24-48 timer etter hepatektomi ved en klassisk to-trinns kollagenaseperfusjonstilnærming. Vanligvis gjøres kanylering og perfusjon av resten for celleisolasjon via portalvenen. Portovaskulær resistens i små rester etter større reseksjon er imidlertid høy16, og perfusjonen er derfor ømfintlig. Fordi vena cava forblir upåvirket av hepatektomier, kan perfusjon lett utføres i retrograd retning via kanylering av vena cava. En standard peristaltisk pumpe driver de oppvarmede løsningene via den kateteriserte vena cava inferior inn i leverresten, ved bruk av retrograd perfusjon med utstrømning gjennom portvenen (tilleggsfigur S1). Hepatocytter dissocieres av kollagenaser og frigjøres fra Glissons kapsel. Etter vask og forsiktig behandling av levedyktige hepatocytter ved trinnvis isolasjon ved hjelp av en lavhastighets sentrifugeringsmetode, kan hepatocytter brukes til alle nedstrømsanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk var i samsvar med sveitsiske føderale dyreforskrifter og godkjent av veterinærkontoret i Zürich (nr. 007/2017, 156/2019) som sikrer menneskelig omsorg. Mannlige C57BL/6 mus i alderen 10-12 uker ble holdt på en 12 timers dag / natt syklus med fri tilgang til mat og vann. Hver forsøksgruppe besto av seks til åtte dyr. Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, utstyr og reagenser som brukes i denne protokollen.
1. Delvis hepatektomi hos mus
- Ved standard hepatektomi (70 %) ligerer og resekterer venstre sidelapp, høyre del av medianlappen og venstre del av medianlappen (figur 1B). Ved utvidet hepatektomi (86 %)4 fjernes også caudatlappene og høyre fremre (figur 1C).
- MERK: Standard hepatektomi er en prosedyre som har blitt brukt i leverregenereringsforskning i mange år. Protokoller for denne prosedyren er tilgjengelige3,17, inkludert den videoassisterte protokollen til Mitchell og Willenbring 18. Ytterligere detaljer om teknikkene som brukes her for hepatektomier finnes i tilleggsfil 1.
Figur 1: Standard (70 %) og utvidet (86 %) hepatektomi hos mus. (A) De fem museleverlappene og deres respektive bidrag til den totale levervekten. (B) Skjematisk illustrasjon av 70%-hepatektomi hos mus. De mørke lobene representerer fremtidens leverrest. (C) Skjematisk illustrasjon av 86%-hepatektomi hos mus. De mørke lobene representerer fremtidens leverrest. (D) Nøyaktig volum av resektert vev post 70%- og 86%-hepatektomi. (E) Mus abdomen umiddelbart etter 70%-hepatektomi; (F) mus abdomen umiddelbart (venstre) og 48 timer (høyre) etter 86%-hepatektomi. Legg merke til den bleke fargen på den steatotiske resten (hvit pil). n = 6-7/gruppe. Forkortelser: sHx = standard hepatektomi; eHx = utvidet hepatektomi; LW = levervekt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Tilberedning av perfusjonsoppløsningene
- Forbered perfusjons-, fordøyelses- og konserveringsbufferne (se tabell 1).
- Juster pH i alle bufferløsninger ved 37 °C ved å tilsette natriumhydroksid (NaOH) eller hydrogenklorid (HCl) etter behov. Den optimale pH for bufferne er 7,4.
- Plasser bevaringsbufferen og Williams' Medium E på is.
- Forbered flowcytometribufferen og oppbevar den på is.
Tabell 1: Løsninger og buffere som brukes til fordøyelse og rensing av hepatocytter. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
3. Klargjøring av perfusjonsutstyr
- Varm vannbadet til 42 °C og plasser perfusjonsbufferen (50 ml) og fordøyelsesbufferen (10-20 ml) i vannbadet. Ikke legg kollagenase til fordøyelsesbufferen ennå.
- Forbered den peristaltiske pumpen og sett inn slangen. Det komplette perfusjonsoppsettet er vist i figur 2.
- Koble en 26 G IV kanyle til utløpsenden av slangen ved hjelp av en Luer-låsekobling. Sett innløpsenden av røret inn i det forvarmede perfusjonsbufferrøret i vannbadet. Skyll slangen med 70 % etanol, etterfulgt av 50 ml sterilt natriumklorid (NaCl 0,9 %). Fyll slangen med varm perfusjonsbuffer (pumpehastighet på 3 ml/min).
- Bedøv musen ved hjelp av isofluran inhalasjonsanestesi (800 ml/minO2, 3-5 % isofluran til induksjon og 2 % til vedlikehold under prosedyren). Håndter isofluran under en laboratoriehette og sørg for tilstrekkelig ventilasjon.
- Gi buprenorfin subkutant 30 minutter før kirurgi med en dose på 0,1 mg/kg kroppsvekt.
- For å forhindre hypotermi, plasser den bedøvede musen på en varmepute og legg et rullet klutvev under overlivet for å heve leveren over de andre organene og lette tilgangen til den dårligere vena cava.
MERK: Ikke bruk vev som er for tykt, da kinking av kar er mulig og perfusjonseffekten vil bli påvirket. - Legg til øyesalve for å forhindre hornhinneskader.
- Før du starter operasjonen, må du sørge for at dyret er tilstrekkelig bedøvet ved å teste pedaluttaksrefleksen (fotputeklemme på begge bakføttene). Ved svar, gi ytterligere anestesi og test på nytt før du starter prosedyren.
- Rengjør magen med 70% etanol.
- Åpne midtlinjesnittet på nytt ved å kutte suturen og forsiktig trekke sårkantene fra hverandre. Hvis hepatektomi er eldre enn 24-48 timer, fjern suturen og kutt huden med saks.
- Fest en 5-0 polypropylen sutur til brystbenet, trekk den kranialt og fest den i denne posisjonen. Bruk en retractor eller enkle klips for å holde magen åpen. Bukhulen må eksponeres så mye som mulig for å optimalisere tilgang og visualisering.
- Flytt tarmene til høyre ved hjelp av bomullspinner for å avsløre portalvenen og vena cava. Bruk en våt klut for å beholde tarmene.
- Plasser en tung gjenstand på ca. 2 cm høyde (f.eks. en silikonbelagt vektring for volumetriske kolber) ved siden av musebakbena (tilleggsfigur S2A). Plasser slangen med den tilkoblede 26 G IV kanylen på gjenstanden og plasser nålen forsiktig på toppen av vena cava. Juster lengden på slangen.
- Sett den tilberedte kollagenaseoppløsningen inn i det forvarmede fordøyelsesbufferrøret. Tilsett 250 μL av stamløsningen til 10 ml fordøyelsesbuffer. Forbered 10-20 ml fordøyelsesbuffer per dyr. For større dyr eller perfusjon av hele leveren, lag opptil 30 ml fordøyelsesbuffer.
MERK: Det anbefales å tilsette kollagenaseløsningen til den oppvarmede fordøyelsesbufferen ca. 30 minutter før fordøyelsesprosessen starter.
Figur 2: Oversikt over perfusjonsoppsettet. (A) Kirurgisk bord med nødvendig utstyr for perfusjon. (B) Materialene som trengs for fremstilling av leveren, samt hepatocyttekstraksjon og isolering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Canylering og perfusjon
- Juster pumpehastigheten til 3 ml/min og slå på pumpen. La den forvarmede perfusjonsbufferen nå nålen. Kast de første 2-3 ml perfusjonsbufferen.
- Utfør kanylering av den dårligere vena cava.
- Mens bufferen løper gjennom nålen, stikk 26 G IV-kanylen i grunn vinkel inn i vena cava under nyrene. Pass på at nålens skråning peker oppover.
- Bruk en bomullspinne til å trekke vena cava forsiktig under stikkstedet slik at den tilførte spenningen letter innføringen av kanylen i venen. Se etter blod i kateterets blitskammer når nålen kommer inn i lumen.
- Før nålen ytterligere 2-3 mm for å sikre at tuppen av plastkateteret også har kommet inn i venen.
- Skyv plastkateteret over nålen og inn i vena cava ytterligere 5 mm. Fjern nålen sakte og veldig forsiktig.
MERK: Det anbefales ikke å feste kanylen med en ligatur. Dette trinnet er tidkrevende da fartøyet først må dissekeres for dette formålet. Hvis kanylen er løst plassert og støttet med en gjenstand, er det ikke nødvendig med ytterligere fiksering (se perfusjonsoppsett i tilleggsfigur S2). For å stabilisere kanyleringsstedet og forhindre tilbakestrømning, kan en enkelt dråpe monomert n-butyl-cyanoakrylat tilsettes på kanyleringsstedet.
- Når blodet faller ut av kanylen, fyll det med varm perfusjonsbuffer ved hjelp av en sprøyte.
- Fest røret til kanylen, som fortsatt kjører med en pumpehastighet på 3 ml / min. La perfusjonsbufferen komme inn i leveren.
- Etter 2-3 s, se etter hvite flekker som dannes i leveren og/eller ekspansjon/hevelse i portvenen, som indikerer at perfusjonsbufferen strømmer gjennom leveren og kommer inn i leverlobulene fra sentralvenen (figur 3).
- Vent til portalvenen synlig svulmer innen 1-2 s etter utseendet av hvite flekker på leveroverflaten. Klipp portalvenen med saks så distalt som mulig fra leverhilus. Bruk en mikrobeholderklips til å merke (ikke okkludere) skjærestedet (figur 3B).
MERK: Dette forenkler vurderingen av strømmen gjennom leveren under perfusjonsprosessen. Leveren rydder av blod umiddelbart og blir gulhvit i løpet av få sekunder (figur 3C). Et ekstra kutt gjennom huden på høyre side av bukåpningen letter utstrømningen av blodet så vel som perfusjonsløsningen (figur 3B og tilleggsfigur S2B,C). - Øk gjennomstrømningen opp til 4-7 ml/min, avhengig av dyrets vekt, leverstørrelse og omfanget av tidligere hepatektomi.
- Klem portalvenen med pinsett eller vaskulær klemme i 7-10 s. Pass på at ingen væske passerer gjennom.
MERK: Leveren svulmer synlig under klemming og slapper av ved frigjøring. Dette er avgjørende for å skylle hele leveren og rense den for gjenværende blod. - Utfør en ny klemme etter ca. 30 s og sørg for at leveren svulmer og slapper av. Fortsett med å skylle dyret til bufferen som strømmer ut av portalvenen er klar, men minst i 3-4 minutter.
MERK: Pumpehastigheten avhenger av røret så vel som størrelsen på leveren. Det må vurderes individuelt. - På dette tidspunktet av prosedyren skal eutanasi ha skjedd sekundært til ekssanguinering. Bekreft at systemisk sirkulasjon har stoppet (ingen hjerteslag eller flimring i hjertet). For å sikre døden utføres bilateral pneumothorax på dette stadiet av prosedyren som sekundær fysisk metode for eutanasi.
MERK: Reduser pumpehastigheten litt hvis systemisk sirkulasjon har stoppet (ingen hjerteslag eller flimring i hjertet).
Figur 3: Perfusjonsprosess fra kanylering til fordøyelse. (A) Anatomi av museleveren med den nedre vena cava (hvit pil) og portvenen (gul pil). (B) Kanylering av den dårligere vena cava. Kanylen er sikret med en ligatur (hvit pil), og plasseringen av utstrømningen gjennom den åpnede portalvenen er merket (ikke klemmet) med en mikrobeholderklemme. (C) Legg merke til forekomsten av flekkvise strukturer før perfusjonsbufferen har fjernet leveren fra alt gjenværende blod (hvit pil). Huden snittes (gul pil) og en bomullspinne plasseres for å sikre drenering av blod og perfusjonsvæske. Intermitterende klemming kan utføres med en vaskulær klemme eller pinsett. (D) Leveren skal renses for alt blod (*). Etter at kollagenaseholdig fordøyelsesbuffer har kommet inn i leveren, vil den ikke lenger slappe av etter klemming og leverlappene vil øke i størrelse. (E) Etter en stund kan et boblende utseende på overflaten av leveren observeres (*). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. Fordøyelse
- Sett perfusjonspumpen på pause og overfør raskt innløpsslangen fra perfusjonsbufferen til den forvarmede fordøyelsesbufferen. Start pumpen på nytt.
- Før fordøyelsesbufferen når leveren, klemme portalvenen en gang til i 3-4 s. Sørg for at leveren slapper av ved frigjøring av klemmen og perfusjonsvæsken forblir klar.
MERK: Fordøyelsesbufferen inneholder fenolrødt og kan lett skilles fra den klare perfusjonsbufferen. Dette muliggjør enkel sporing i røret. - Så snart fordøyelsesbufferen har nådd leveren, klemmer du portalvenen igjen med en mikrobeholderklemme.
MERK: Ved klemming svulmer leveren, men slapper ikke av ved frigjøring av klemmen. Dette er normalt. - For å lette fordøyelsesprosessen, lukk den overlegne vena cava med en vaskulær klemme rett under membranen for å la fordøyelsesbufferen passere fra den dårligere vena cava til leveren til utstrømningen gjennom den åpnede portalvenen.
MERK: Denne klemmingen sikrer at systemisk sirkulasjon omgås og unødvendig kontakt med gjenværende blodkomponenter/inhibitorer forhindres. Dette trinnet er valgfritt, da det er vanskelig å nærme seg den overlegne vena cava bak det forstørrede levervevet etter sham kirurgi, men tilgangen er mye lettere i hepatektomiserte mus. - Fordøyes i ca. 4 minutter ved en strømningshastighet på 5 ml/min. Etter hvert som fordøyelsen utvikler seg, se etter tegn på at leveren begynner å hovne opp og små klare / gjennomsiktige seksjoner på overflaten av leveren. Videre må du observere at leveren får tekstur av et vått tøystykke og virker nesten fuktig (figur 3E). Undersøk konsistensen ved å berøre forsiktig med en fuktig bomullspinne.
- Fortsett med perfusjonen til en markert forskjell i leverens overflatetekstur kan observeres. Vær oppmerksom på at leveren antar en veldig lys farge og et boblende utseende (figur 3E), og Glissons kapsel (dvs. leversekken) skiller seg fra parenkymet. Stopp fordøyelsesprosessen så snart leveren har oppnådd disse egenskapene, da overfordøyelse kan skade hepatocytter. Fjern nålen før luft kommer inn i leveren.
MERK: Vanligvis er det nødvendig med 10-20 ml fordøyelsesbuffer for å oppnå tilstrekkelig fordøyelse. Dette avhenger av dyrets størrelse, omfanget av hepatektomi, slangeoppsett og kvaliteten på kollagenaseoppløsningen. Hvis nødvendig, øk perfusjonstiden i stedet for perfusjonshastigheten. For mye trykk i det vaskulære systemet kan føre til at leveren sprekker og perfusjons- / fordøyelsesvæsken kan gå tapt til retroperitonealrommet.
6. Forberedelse av leveren
- Fjern leveren forsiktig fra bukhulen. Vær veldig forsiktig, for den er nå veldig spinkel og skjør.
- Ta tak i det sentrale bindevevet mellom lobene ved hjelp av tang og løft det litt oppover, bruk det som et ankerpunkt.
- Kutt alle tilkoblingene til leveren til andre organer, fjern galleblæren og legg leveren i den iskalde bevaringsbufferen.
MERK: Ideelt sett bør hepatocyttekstraksjon og videre behandling skje umiddelbart for å opprettholde levedyktigheten av hepatocytter. Om nødvendig kan imidlertid leveren oppbevares i kort tid ved 4 °C (f.eks. for transport). Denne forsinkelsen bør ikke overstige 30-40 min.
7. Hepatocytt ekstraksjon
- Overfør leveren til en 10 cm petriskål og tilsett 10 ml iskald Williams' Medium E.
- Ruptur Glissons kapsel med pinsett med finspiss på noen få steder langs leveroverflaten. Ta tak i en sentral del (f.eks. bindevev ved leverhilus) med to par pinsett og trekk dem sakte fra hverandre, slik at kapselen kan rive uten å skade hepatocytter. Slipp cellene ved å riste kapselen forsiktig (tilleggsfigur S3).
MERK: Ideelt sett rives leveren lett fra hverandre og frigjør cellene. Ikke bruk makt. En celleskraper kan bidra til å fjerne alle celler helt og øke celleutbyttet. Ikke kutt leveren i stykker med saks. - Filter 5 ml levermasse gjennom en 100 μm cellesil i et 50 ml rør. Skyll filteret med 10 ml friskt iskaldt medium. Filtrer de resterende 5 ml massen gjennom cellesilen.
MERK: Bruk en 25 ml serologisk pipette til å overføre levermassen med de dissosierte hepatocytter (figur 4A). Mindre pipetter med mindre åpninger øker skjærspenningen og skader hepatocytter irreversibelt. - Tilsett totalt 30 ml kaldt medium for å skylle petriskålen, filtrer den og tilsett suspensjonen til 50 ml røret til den er full. Alle isolerte celler er nå i suspensjon (figur 4B).
Figur 4: Rensing ved forsiktig sentrifugering . (A) Leverhomogenat igjen etter ekstraksjonstrinnet. (B) Mikroskopisk visning (20x forstørrelse) av homogenatet; Legg merke til den merkede forurensningen med rusk. (C) Sentrifugeringstrinn for rensing og (D) mikroskopiske bilder av supernatantene som skal forkastes. (E) Mikroskopisk visning av den rensede hepatocyttfraksjonen. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
8. Hepatocytt isolasjon
- Spinn ved 50 × g i 5 minutter ved 4 °C (laveste akselerasjon og laveste brems mulig).
MERK: Hepatocytter er tettere enn ikke-parenkymale leverceller. På grunn av den lave sentrifugeringskraften blir bare hepatocytter pelletert, mens andre celler (f.eks. immunceller, erytrocytter og sinusformede celler) forblir i supernatanten. - Aspirer det meste av supernatanten, og la 1 ml resuspendere cellene ved å virvle røret forsiktig.
- Tilsett 40 ml kald Williams' E-medium og spinn igjen ved 50 × g i 10 minutter ved 4 °C (lav akselerasjon, lav brems) for ytterligere å fjerne døde hepatocytter og cellerester og pelletslevedyktige og fete hepatocytter (figur 4C).
- Kast det meste av supernatanten, og la 1 ml resuspendere cellene ved å virvle røret.
- Tilsett 40 ml kald Williams' E-medium og spinn igjen ved 50 × g i 5 minutter ved 4 °C (lav akselerasjon, lav brems).
- Aspirer det meste av supernatanten, og la 1 ml resuspendere cellene ved å virvle røret forsiktig.
MERK: Ikke stopp denne prosessen før cellene er løst eller analysert. Hepatocytter er svært skjøre, og enhver forsinkelse i perfusjons-, fordøyelses- og renseprosessen kan skade cellene. - Bestem den endelige cellekonsentrasjonen etter tilsetning av trypanblått, ved hjelp av et Neubauer-forbedret tellekammer.
MERK: De fleste rusk og ikke-parenkymale celler er nå fjernet, noe som resulterer i en ren pellet på ca. 10-15 × 106 hepatocytter igjen etter 70%-hepatektomi. - Avhengig av ønsket konsentrasjon, tilsett mer iskaldt medium. Bruk hepatocyttcellesuspensjonen til enhver nedstrømsanalyse eller initier en primær cellekultur.
MERK: På dette stadiet forblir bare få immun- og ikke-parenkymale celler (<5%) i suspensjonen. Hvis ytterligere rensing ønskes, utfør et negativt utvalg av CD31+- og CD45+-celler ved magnetisk eller fluorescensaktivert cellesortering (MACS/FACS). Til dags dato er det ingen pålitelig og robust overflatemarkør for leverparenkymale celler.
9. Fremstilling av de isolerte hepatocytter for flowcytometri
- Sentrifuge hepatocytter ved 100 × g i 5 minutter.
- Kast supernatanten og legg til ønsket mengde flowcytometribuffer, avhengig av konsentrasjonen av cellesuspensjonen.
- Tilsett 1 ml cellesuspensjon i et flowcytometrirør. Sentrifuge i 5 minutter ved 100 × g og kast supernatanten.
- Tilsett 100-200 μL av det fortynnede Alexa Fluor 488 Zombie green viability dye (konsentrasjon 1:400) til cellene og rist dem forsiktig. Resuspender hepatocytter forsiktig ved manuell risting eller bruk av en hvirvelblander ved lav hastighet (maksimalt 2-3) i 2 s.
MERK: Ikke bruk små pipettespisser til å resuspendere cellene. De er svært skjøre og den påførte skjærspenningen forårsaker skade og reduserer cellens levedyktighet. Hvis pipettering ikke kan unngås, bruk en 1000 μL pipette etter å ha kuttet av den minste delen fra spissen for å forstørre diameteren og pipette cellene veldig sakte. - Legg rørene på is eller oppbevar dem ved romtemperatur, avhengig av ønsket farging. Inkuber cellene i 20-30 minutter i mørket.
- Tilsett 2 ml flowcytometribuffer og vask cellene 3x. Sentrifuger cellene etter hvert vasketrinn ved 100 × g i 5 minutter.
- Tilsett 2 ml fikseringsbuffer (1:1, 4% PFA og PBS). Resuspender hepatocytter forsiktig ved manuell risting eller bruk av en hvirvelblander ved lav hastighet (maksimalt 2-3) i 2 s.
- Fest cellene i 30 minutter.
- Sentrifuge ved 100 × g i ytterligere 5 minutter, kast supernatanten og tilsett flowcytometribuffer.
MERK: Celler kan lagres i flowcytometribuffer før analyse opptil 72 timer etter isolering.
10. Analysere hepatocytter med flowcytometri
- Analyser hepatocytter ved hjelp av en fluorescensaktivert cellesortering.
MERK: Vurder den relativt store størrelsen på hepatocytter og juster spenningene. Start med lav spenning og ikke gå høyere enn 350 V for fremoverspredning (FSC) og 220 V for sidespredning (SSC).- Juster spenningene for FSC og SSC til den estimerte store størrelsen på cellene. Identifiser hepatocyttpopulasjonen og registrer alle hendelser ved hjelp av SSC-A og FSC-A (figur 5A).
- Vær oppmerksom på at rusk og ikke-parenkymale celler vises nederst i venstre hjørne av FSC versus SSC-tetthetsplottet og er ekskludert (figur 5A).
- Siden dublettceller kan påvirke analysen, konstruerer du et tetthetsplott for sidespredningshøyde (SSC-H) versus sidespredningsareal (SSC-A) for å utelukke dubletter, som vist i figur 5B.
- Velg den endelige hepatocyttpopulasjonen ved å samle CD31- (endotelmarkør) og CD45- (immunmarkør) celler (figur 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TRAS topper ved 16 timer etter hepatektomi og forsvinner gradvis 32-48 timer etter standard hepatektomi, men vedvarer utover 48 timer etter utvidet hepatektomi. Makroskopisk er TRAS lett synlig som en blek hudfarge i leverresten (figur 1F) og kan observeres hos hepatektomiserte mus mellom 16 timer og 48 timer etter operasjonen.
Det estimerte endelige utbyttet er 10-15 × 10 6 hepatocytter etter 70% -hepatektomi og 4-9 × 106 etter utvidet 86% -hepatektomi hos mus, med en gjennomsnittlig endelig levedyktighet på henholdsvis 78% og 65%. Dette tilsvarer forventet prosentandel sammenlignet med et totalt utbytte på 50-70 × 106 fra en hel muselever (figur 6A,C). Etter partielle hepatektomier viser hepatocytter økt cellestørrelse sammenlignet med normal lever, tilsvarende økt lipidinnhold (figur 6B). Gatingstrategien er vist i tilleggsfigur S4.
Figur 6: Hepatocyttutbytte, cellestørrelse og levedyktighet . (A) Celletall av en hel muselever og rester 24 timer etter 70% og 86%-hepatektomi. (B) Beregnet cellevolum av isolerte hepatocytter. Legg merke til den markerte økningen i cellestørrelse 24 timer etter hepatektomi, for både 70% og 86%. (C) Cellens levedyktighet av isolerte hepatocytter etter hvert trinn i renseprosessen. Levedyktigheten ble målt ved flowcytometri ved bruk av Alexa Fluor 488 Zombie green viability dye. Prosentandeler hentes fra alle hepatocyttsingleter. For gatingstrategien, se tilleggsfigur S6 og tilleggsfigur S4. Feilfelt refererer til standardavvik med n = 6-8/gruppe. Forkortelser: sHx = standard hepatektomi; eHx = utvidet hepatektomi; w/o reseksjon = narrekirurgi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Et økt lipidinnhold i murine hepatocytter 24 timer etter delvis hepatektomi kan observeres ved en økning i granularitet (figur 7; for gatingstrategi, se tilleggsfigur S5) eller direkte observert ved tilstedeværelse av lipidvesikler inne i forstørrede hepatocytter (figur 8 og tilleggsfil 1).
Figur 7 Økt granularitet og cellestørrelse målt ved flowcytometri. (A) Økt granularitet blant isolerte hepatocytter 24 timer etter hepatektomi som en indirekte markør for tilstedeværelse av lipidvesikler. (B) Histogram som viser SSC. (C) Prosentandelene representerer fraksjonen av celler med høy cytoplasmatisk granulær intensitet, målt ved SSC-signalet. Feilfelt refererer til standardavvik med n = 6-8/gruppe. Forkortelser: sHx = standard hepatektomi; eHx = utvidet hepatektomi; w / o reseksjon = sham kirurgi; FSC = fremover scatter signal; SSC = sidespredning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Sudan IV-farging som markør for fettinnhold i isolerte friske hepatocytter. (A) Hepatocytter fra en fersk hel muselever uten forutgående kirurgi. Økt størrelse og fettinnhold av hepatocytter 24 timer (B) etter 70%-hepatektomi og (C) 86%-hepatektomi. Legg merke til samtidig tilstedeværelse av både større, steatotiske hepatocytter og mindre, ikke-steatotiske hepatocytter. Skalastenger = 30 μm (B-D). Feilfelt refererer til standardavvik med n = 6-8/gruppe. Forkortelser: sHx = standard hepatektomi; eHx = utvidet hepatektomi; w/o reseksjon = narrekirurgi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
En svært lav prosentandel av immun- og ikke-parenkymale celler forblir i den endelige suspensjonen. Ytterligere rensing oppnås ved FACS eller MACS, om ønskelig. Negativt utvalg av CD31+- og CD45+-celler ved flowcytometri brukes for å demonstrere og kvantifisere de ikke-parenkymale cellene (figur 5).
Figur 5: Flowcytometri gating strategi og seleksjon av CD31- og CD45- parenkymale celler. (A) Gating diagram med alle hendelser registrert; Tenk på den relativt store størrelsen på hepatocytter og bruk justerte spenninger. Ikke gå høyere enn 350 V for FSC og 220 V for SSC. (B) Singlet gating. (C) Hepatocytter velges ved å gating CD31- (endotelmarkør) og CD45- (immunmarkør) celler. Denne seleksjonen kan utføres i en fluorescensaktivert cellesortering for å velge parenkymale celler for videre nedstrømsanalyser, om nødvendig; n = 4-5/gruppe. Forkortelser: FSC = fremoverspredning; SSC = sidespredning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For å demonstrere effekten av den modifiserte protokollen ved å beholde steatotiske celler, ble hepatocytter isolert ved hjelp av den klassiske tetthetsgradienttilnærmingen7 (figur 9A). I motsetning til den modifiserte prosedyren (figur 9B) var et fettcellelag tydelig synlig på toppen av tetthetsgradienten. Analyse av celler bekreftet et grovt fravær av lipidbelastede hepatocytter i pelleten etter sentrifugering av tetthetsgradient. I motsetning til dette ble celler fra fettlaget beriket med steatotiske hepatocytter og en betydelig fraksjon av ikke-parenkymale og døde celler (figur 9A). Dermed frarøver klassisk isolasjon høstingen av steatotiske celler, mens denne modifiserte protokollen som utelater tetthetsgradienten beholder lipidbelastede subpopulasjoner, noe som muliggjør objektiv utforskning av leverregenerering uten å skjeve mot magre hepatocytter.
Figur 9: Utbytter av steatotiske hepatocytter som følger den klassiske tetthetsgradientisolasjonsprotokollen sammenlignet med den forbedrede protokollen . (A) Med den klassiske tetthetsgradientrensingsmetoden (endelig konsentrasjon av 90% tetthetsgradientløsning i fosfatbufret saltvann) samles døde hepatocytter i et cellelag på toppen av tetthetsgradientløsningen. (B) Dette laget består ikke bare av ikke-parenkymale celler og ikke-levedyktige hepatocytter, men også av levedyktige, store, fete hepatocytter. (C) Pelleten oppnådd etter sentrifugering av tetthetsgradient inneholder magre hepatocytter av mindre størrelse og er for det meste blottet for steatotiske celler. Dette er den "rene" fraksjonen som er isolert med den klassiske protokollen. (D) Med den forbedrede protokollen går ikke de lipidfylte hepatocytter tapt, og alle hepatocytter pelleteres. Supernatanten (E) består hovedsakelig av døde og fragmenterte hepatocytter og ikke-parenkymale celler, mens pelleten (F) er en blanding av hepatocytter av variabel størrelse og lipidinnhold. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Tilleggsprotokoller. (A) Lipidfarging med Sudan IV; (B) standard og utvidet hepatektomi hos mus. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S1: Oversikt over perfusjonsoppsettet. (1) Kanylere den dårligere vena cava. (2) Perfus leveren med varm perfusjonsbuffer for å chelate kalsium. (3) Varm fordøyelsesbufferen med kollagenaser og Ca2+ for å dissosiere celler in vivo. Fjern leveren og (4) oppbevares i iskald konserveringsbuffer (maksimalt 30 min). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S2: Perfusjonsoppsett. (A) Perfusjonsbord med isofluran dyse, rødt lys varmelampe og perfusjonsslange. En tung gjenstand kan plasseres under røret for å stabilisere det og redusere risikoen for forskyvning. (B) I løpet av de første minuttene av perfusjonen vil noe blod strømme ut gjennom portvenen og bassenget i den åpne bukhulen. (C) Bukveggen er snittet på den ene siden for å tømme blodet. En bomullspinne letter dreneringen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S3: Glissons kapsel. (A) Glissons kapsel brytes med pinsett med fintipp på noen få steder langs leveroverflaten, og levercellene frigjøres ved å riste kapselen forsiktig. (B) Leveren skal rive fra hverandre lett. (C) Den tomme leversekken (Glissons kapsel) med frigjorte hepatocytter i suspensjon. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S4: Flowcytometri gating strategi for levedyktig screening. (A) Alle hendelser ble registrert. (B) Singlet gating. (C) Levende / død farging med Alexa Fluor 488 Zombie grønn levedyktighet fargestoff. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S5: Strømningscytometri gating strategi for granularitetsmåling. (A) Alle hendelser ble registrert. (B) Singlet gating. (C) Prikkplott av sidespredning (SSC; x-akse ) versus foroverspredning (FSC; y-akse ) for å analysere granularitetsnivåene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S6: Hepatocyttrensing. (A) Cellepellet etter det første sentrifugeringstrinnet; Legg merke til fettlaget på toppen av mediet. (B) Hepatocyttpellet etter andre sentrifugeringsrunde. (C) Rensede hepatocytter ved slutten av renseprosessen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den publiserte protokollen gir en pålitelig og enkel metode for å isolere et høyt utbytte av normale og steatotiske murine hepatocytter for enkeltcelle nedstrømsanalyser eller bulkanalyse av celler etter FACS-sortering. Den klare fordelen over tetthetsgradientrensing er at det cellulære lipidinnholdet i hovedsak ikke har noen innvirkning på det effektive utbyttet av hepatocytter. Dermed vil fraksjonen av steatotiske hepatocytter beholdes og inkluderes i nedstrømsanalyser. Dette er ikke bare avgjørende for studiet av steatogene leversykdommer, men også avgjørende for enhver analyse av prosesser etter store hepatektomier, hvor hepatocytter viser en tidsmessig og romlig dynamisk steatose innen de første 2-3 dagene av regenerering. Selv om (encellede) analyser av isolerte hepatocytter allerede er utført etter hepatektomi 19,20,21, må det antas at den analyserte cellepopulasjonen i det minste delvis var fratatt lipidladede hepatocytter, og resultatene var derfor ikke fullt representative og skjeve mot magre hepatocytter.
For tiden er funksjonen til TRAS ikke fullstendig avklart. For eksempel forblir de romlige forskjellene i lipidinnhold i leverlobuler dårlig forstått. Derfor er det nødvendig med en metode som tillater kvantitativ og kvalitativ deteksjon uten nøyaktig å utelukke disse cellene fra analyser (f.eks. for encellet transkriptomikk, flowcytometri og metabolomikk).
Samlet sett er hepatocytutbyttet med denne forbedrede protokollen markant overlegen i forhold til andre metoder for isolering av fettholdige hepatocytter (f.eks. fra mus med ikke-alkoholisk steatohepatitt, NASH) ved bruk av tetthetsgradientrensing15. Imidlertid kan celleutbytte, levedyktighet og fettinnhold variere mellom preparatene. Flere faktorer ser ut til å være ansvarlige.
For det første vil forskjellige batcher av kollagenase- eller kollagenaseblandinger variere i deres enzymatiske aktivitet; Lot-to-lot-forskjellene er imidlertid ikke like kritiske som med tradisjonelle kollagenaser. Likevel kan det være nødvendig å justere arbeidskonsentrasjonen. Forskjellene kan minimeres ytterligere ved riktig oppbevaring ved bruk (tørre lyofilisater og rehydrerte stamløsninger ved -15 til -25 °C) og ved å unngå repeterende fryse-tine-sykluser, men kan ikke elimineres helt. Derfor anbefales det å bruke bare kollagenaser av en bestemt batch for en gitt eksperimentell serie. I tillegg avhenger den enzymatiske aktiviteten av temperaturen der fordøyelsesbufferen når leveren, med en optimal temperatur mellom 35 ° C og 37 ° C for en blanding av kollagenaser I og II22. Lavere temperaturer vil redusere den enzymatiske aktiviteten, mens temperaturer over 50 °C kan føre til irreversibel denaturering av proteinet. Test dette på forhånd og optimaliser de eksperimentelle forholdene ved å justere den opprinnelige temperaturen på fordøyelsesbufferen, lengden og diameteren på plastrøret og strømningshastigheten. For eksempel kan man forvente et fall i buffertemperatur på opptil 10 °C innenfor en rørlengde på 60 cm. Korriger temperaturen ved å bruke varmeputer og infrarøde lamper, om nødvendig. Kollagenaser viser sin optimale fordøyelseskapasitet ved en pH på 7,4; Det anbefales derfor å justere pH i bufferløsningene allerede ved en arbeidstemperatur på ca. 37 °C før bruk.
For det andre er det viktig å skylle leveren (eller hele musen) tilstrekkelig med perfusjonsbuffer før fordøyelsesprosessen starter for å eliminere potensielle hemmere som serum eller albumin. Ideelt sett startes perfusjonen først etter at den systemiske sirkulasjonen har stoppet, for å sikre at fordøyelsesbufferen bare beveger seg fra vena cava gjennom leveren til utstrømningen via den åpnede portalvenen. Den overlegne vena cava kan lukkes med en liten vaskulær klemme. Dette forhindrer kontakt med gjenværende blodkomponenter/hemmere. En annen metode for optimal spyling av leveren er intermitterende klemming av portalvenen. Dette bør gjøres nøye og - når fordøyelsesbufferen har nådd leveren - utføres bare en gang for å unngå å skade de allerede fordøyede cellene.
For det tredje er regenererende hepatocytter følsomme, og erfaring har vist at de krever kortere fordøyelsestider og mer forsiktig håndtering for å unngå overfordøyelse og skade på cellene. For å høste leveren så forsiktig som mulig, anbefales det å ta tak i leverhilus med en klemme og deretter først kutte den overlegne vena cava og frigjøre leveren fra forbindelsene til venen og membranen. Deretter kan den dårligere vena cava og portalvenen kuttes, noe som muliggjør mobilisering av leveren og frigjør den lett fra gastrointestinale leddbånd, spiserøret på den ene siden og høyre nyre på den andre siden. I hepatektomiserte mus er det mulig å forsiktig ta tak i en av ligaturene fra medianlobene for å fjerne leveren. Hvis det gjøres et forsøk på å trekke leveren ut med makt, kan Glissons kapsel briste, og de isolerte cellene kan gå seg vill.
Endelig er det viktig at perfusjonsprosedyren og videre behandling av hepatocytter ikke avbrytes eller forsinkes, da dette umiddelbart og uunngåelig vil påvirke levedyktigheten. Ideelt sett utføres perfusjonen i et team på minst to personer og på ett dyr om gangen. Disse kravene i tid og arbeidskraft er imidlertid en av begrensningene ved denne metoden, selv om dette også gjelder alternative metoder.
En annen begrensning er den endelige renheten av den resulterende cellesuspensjonen, da fordelen ved ikke å miste steatotiske hepatocytter til en tetthetsgradient resulterer i en liten andel gjenværende ikke-parenkymale og / eller immunceller. I det viste utvalget er fraksjonen av CD45+ (immunceller) og CD31+ (endotelceller) under 5 %, og ved seleksjon for cellestørrelse først under flowcytometri er prosentandelene av CD45+ og CD31+ henholdsvis 1,2 % og 2,2 % (figur 5). For de fleste anvendelser er dette renhetsnivået tilstrekkelig, men svært følsomme metoder eller videre bruk i primære cellekulturer krever sannsynligvis en høyere grad. Tallrike studier har brukt CD31 og CD45 som systemiske markører for å sortere levercellepopulasjoner etter MACS 23,24 eller FACS25.
Denne forbedrede isolasjonsmetoden er ideell for studier av leverregenerering, spesielt den tidlige perioden som presenterer betydelige mengder steatotiske hepatocytter. PHLF, med vedvarende steatose, er et spesielt relevant tema som krever forskning. Etter utvidede hepatektomier som etterlater marginale rester, kan PHLF utvikle seg og representerer faktisk den vanligste dødsårsaken på grunn av leverkirurgi. Patobiologien er bare delvis forstått, og det foreligger foreløpig ingen behandling26. Gitt at PHLF betydelig begrenser anvendelsen av leverkirurgi (for eksempel for kur av levermaligniteter), er det et klart medisinsk behov å utforske årsakene og identifisere potensielle tiltak.
Det er også behov for studier av sykdommer som deler hepatisk steatose som utgangspunkt. Et fremtredende eksempel er ikke-alkoholholdig fettleversykdom (NAFLD), som kan utvikle seg til NASH og til slutt til hepatocellulært karsinom (HCC)27. Spredningen av stillesittende livsstil i forbindelse med det vestlige kostholdet har ført til en verdensomspennende epidemi av NAFLD, og følgelig forventes HCC-forekomsten å stige28,29. Steatose er i sin tur også tett knyttet til fedme, metabolsk syndrom og type-2-diabetes, alle sykdommer med økende forekomst30. Derfor representerer steatose en økende byrde for dagens helsevesen, og krever effektive midler for ledelsen. Denne forbedrede to-trinns kollagenaseperfusjonsmetoden muliggjør studier av steatotiske hepatocytter på enkeltcellenivå, og bør derfor hjelpe til med å utforske årsakene og konsekvensene av hepatocellulær lipidakkumulering.
Denne protokollen presenterer en enkel, rask og pålitelig teknikk for in vivo-isolering av regenererende hepatocytter fra mus etter delvis (70%) og utvidet (86%) hepatektomi. Denne tilnærmingen er ikke avhengig av gradientrensing og kan brukes til å undersøke leverregenereringsprosesser med inkludering av lipidbelastede hepatocytter som vanligvis går tapt under tradisjonelle isolasjonsprotokoller. Videre kan denne metoden også brukes til forskning av ulike leversykdommer forbundet med steatotiske forandringer og er ikke begrenset til musearten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Swiss National Fond (prosjektstipend 310030_189262).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | - |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | - |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | - |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | - |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | - |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | - |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | - |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | - |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | - |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | - |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | - | - |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | - |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | - |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | - |
| Fenestrated sterile surgical drape | - | - | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | - |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | - |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | - | - |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | - |
| Isofluran station | Provet | - | - |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | - | - |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | - | - |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | - |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | - |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | - | - |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | - | - |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | - |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | - | Adjust to 42 °C |
References
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C.
- Lehmann, K., et al. Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration. Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).
- Makino, H., et al. A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice. Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).
- Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N. Liver Pathology. Gayam, V., Engin, O. , IntechOpen. (2019).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers. Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver. Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Trotter, N. L. A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy. Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).
- Kachaylo, E., et al. PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice. Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
- Dold, S., et al. Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation. PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).
- Boyce, S., Harrison, D. A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse. Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration. JCI Insight. 5 (22), (2020).
- Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver. Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).
- Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation. Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).
- Roche, Liberase TM Research Grade. , (2020).
- Giugliano, S., et al. Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication. Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).
- Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).
- Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes. Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).
- Helling, T. S. Liver failure following partial hepatectomy. HPB. 8 (3), 165-174 (2006).
- Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F.
- Park, W. Y., et al. Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study. Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).
- Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude. Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
- Roeb, E. Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD). Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).
