Summary
Hepatócitos carregados de lipídios são inerentes à regeneração hepática, mas geralmente são perdidos após a centrifugação do gradiente de densidade. Aqui, apresentamos um protocolo de isolamento celular otimizado que retém hepatócitos esteatóticos, produzindo populações representativas de hepatócitos regeneradores após hepatectomia parcial em camundongos.
Abstract
A hepatectomia parcial tem sido amplamente utilizada para investigar a regeneração hepática em camundongos, mas o isolamento de altos rendimentos de hepatócitos viáveis para aplicações unicelulares a jusante é um desafio. Um acúmulo acentuado de lipídios dentro de hepatócitos em regeneração é observado durante os primeiros 2 dias de regeneração hepática normal em camundongos. Esta chamada esteatose associada à regeneração transitória (TRAS) é temporária, mas se sobrepõe parcialmente à principal fase proliferativa. A purificação do gradiente de densidade é a espinha dorsal da maioria dos protocolos existentes para o isolamento de hepatócitos primários. Como a purificação do gradiente depende da densidade e do tamanho das células, ela separa as populações de hepatócitos não esteatóticos dos esteatóticos. Portanto, hepatócitos gordurosos muitas vezes são perdidos, produzindo frações de hepatócitos não representativas.
O protocolo apresentado descreve um método fácil e confiável para o isolamento in vivo de hepatócitos regeneradores, independentemente de seu conteúdo lipídico. Hepatócitos de camundongos machos C57BL/6 são isolados 24-48 h após a hepatectomia por uma abordagem clássica de perfusão de colagenase em duas etapas. Uma bomba peristáltica padrão conduz as soluções aquecidas através da veia cava inferior cateterizada para o remanescente, usando uma técnica de perfusão retrógrada com saída pela veia porta. Os hepatócitos são dissociados pela colagenase para sua liberação da cápsula de Glisson. Após a lavagem e centrifugação cuidadosa, os hepatócitos podem ser usados para qualquer análise a jusante. Em conclusão, este trabalho descreve uma técnica simples e reprodutível para o isolamento de uma população representativa de hepatócitos regenerados após hepatectomia parcial em camundongos. O método também pode ajudar no estudo da doença hepática gordurosa.
Introduction
O fígado pode regenerar-se mesmo após uma grande perda de tecido. Essa capacidade regenerativa única é explicitamente ilustrada pelo modelo experimental de hepatectomia parcial (70%), descrito pela primeira vez em ratos por Higgins e Anderson em 19311. Neste modelo, 70% do fígado é removido cirurgicamente dos animais, cortando lobos hepáticos maiores. Os lobos restantes crescem então através de hipertrofia compensatória para restaurar a massa hepática original dentro de cerca de 1 semana após a cirurgia, embora sem restauração da arquitetura hepática original 2,3. Hepatectomias adicionais com quantidades variadas de remoção tecidual têm sido desenvolvidas, como a hepatectomia prolongada a 86%, onde o remanescente hepático é muito pequeno para se recuperar, levando eventualmente à insuficiência hepática pós-hepatectomia (PHLF) e subsequente morte em 30%-50% dos animais 4,5,6. Esses modelos possibilitam o estudo da regeneração hepática normal e falha, dependendo da quantidade de tecido ressecado (Figura 1).
Embora os modelos de hepatectomias em camundongos tenham sido usados com sucesso por muitos anos, apenas recentemente métodos analíticos mais avançados permitiram uma visão mais profunda no nível de célula única. Para a maioria desses métodos, no entanto, a presença de hepatócitos individuais é um pré-requisito básico. A maioria dos protocolos para o isolamento de hepatócitos primários baseia-se em uma técnica de perfusão de colagenase em duas etapas e subsequente purificação de gradiente de densidade para separar hepatócitos viáveis de detritos e não parenquimatos, bem como células mortas 7,8,9. Esse método foi descrito pela primeira vez por Berry e Friend em 196910 e adaptado por Seglen e colegas em 197211,12. No entanto, como a centrifugação por gradiente depende da densidade e do tamanho das células, os hepatócitos carregados de lipídios são frequentemente perdidos durante a purificação padrão. Embora essa perda possa ser insignificante para muitas questões de pesquisa, é um aspecto crucial para a regeneração hepática precoce. Durante os primeiros 2 dias, os hepatócitos dentro do fígado de rato em regeneração acumulam lípidos, crescendo assim em tamanho e mergulhando em densidade. Essa esteatose associada à regeneração transitória (TRAS) serve para fornecer combustível regenerativo e é temporária, mas se sobrepõe parcialmente à fase proliferativa principal e é distribuída de forma desigual dentro dos lóbulos hepáticos - as unidades funcionais do fígado13,14. Após a hepatectomia prolongada de 86%, no entanto, a SRAT também ocorre, mas persiste, pois a regeneração é paralisada e os lipídios não estão sendo oxidados14. Portanto, a purificação gradiente de hepatócitos após hepatectomias de 70% ou 86% produzirá frações não representativas, pois a maioria dos hepatócitos carregados de lipídios é perdida devido à sua baixa densidade15.
Neste protocolo de isolamento modificado, hepatócitos de camundongos C57BL/6 são isolados 24-48 h após a hepatectomia por uma abordagem clássica de perfusão de colagenase em duas etapas. Normalmente, a canulação e a perfusão do remanescente para isolamento celular são feitas através da veia porta. No entanto, a resistência portovascular em pequenos remanescentes deixados após ressecção maior é alta16 e, portanto, a perfusão é delicada. Como a veia cava permanece não afetada pelas hepatectomias, a perfusão pode ser facilmente realizada na direção retrógrada através da canulação da veia cava. Uma bomba peristáltica padrão conduz as soluções aquecidas através da veia cava inferior cateterizada para o remanescente hepático, utilizando perfusão retrógrada com saída pela veia porta (Figura Suplementar S1). Os hepatócitos são dissociados pelas colagenases e liberados da cápsula de Glisson. Após a lavagem e o processamento cuidadoso de hepatócitos viáveis por isolamento gradual usando uma abordagem de centrifugação de baixa velocidade, os hepatócitos podem ser usados para qualquer análise a jusante.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram de acordo com o Regulamento Federal Suíço de Animais e aprovados pelo Escritório Veterinário de Zurique (n° 007/2017, 156/2019), garantindo cuidados humanos. Camundongos machos C57BL/6 com idade entre 10-12 semanas foram mantidos em um ciclo de 12 h dia/noite com livre acesso a alimentos e água. Cada grupo experimental foi composto por seis a oito animais. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, equipamentos e reagentes usados neste protocolo.
1. Hepatectomia parcial em camundongos
- Para hepatectomia padrão (70%), ligai e ressecaram o lobo lateral esquerdo, a porção direita do lobo mediano e a porção esquerda do lobo mediano (Figura 1B). Para hepatectomia prolongada (86%)4, remova também os lobos caudados e o lobo anterior direito (Figura 1C).
- NOTA: A hepatectomia padrão é um procedimento que tem sido usado na pesquisa de regeneração hepática por muitos anos. Protocolos para esse procedimento estão disponíveis3,17, incluindo o protocolo videoassistido de Mitchell e Willenbring 18. Mais detalhes sobre as técnicas utilizadas aqui para hepatectomias podem ser encontrados no Arquivo Suplementar 1.
Figura 1: Hepatectomia padrão (70%) e estendida (86%) em camundongos. (A) Os cinco lobos hepáticos de camundongos e suas respectivas contribuições para o peso total do fígado. (B) Ilustração esquemática da hepatectomia a 70% em camundongos. Os lobos escuros representam o futuro remanescente hepático. (C) Ilustração esquemática da hepatectomia a 86% em camundongos. Os lobos escuros representam o futuro remanescente hepático. (D) Volume preciso de tecido ressecado pós-hepatectomia de 70% e 86%. (E) Abdome de camundongo imediatamente após hepatectomia a 70%; (F) abdome de camundongo imediatamente (esquerda) e 48 h (direita) após hepatectomia a 86%. Observe a cor pálida do remanescente esteatótico (seta branca). n = 6-7/grupo. Abreviaturas: sHx = hepatectomia padrão; eHx = hepatectomia prolongada; LW = peso do fígado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Preparação das soluções de perfusão
- Prepare os tampões de perfusão, digestão e preservação (ver Tabela 1).
- Ajustar o pH de todas as soluções-tampão a 37 °C adicionando hidróxido de sódio (NaOH) ou cloreto de hidrogénio (HCl), conforme necessário. O pH ideal para os tampões é 7,4.
- Coloque o tampão de preservação e o E Médio de Williams no gelo.
- Prepare o tampão de citometria de fluxo e armazene-o no gelo.
Tabela 1: Soluções e tampões utilizados para a digestão e purificação de hepatócitos. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
3. Preparação do equipamento de perfusão
- Aqueça o banho-maria a 42 °C e coloque o tampão de perfusão (50 mL) e o tampão de digestão (10-20 mL) no banho-maria. Não adicione colagenase ao tampão de digestão ainda.
- Prepare a bomba peristáltica e insira a tubulação. A configuração completa da perfusão é mostrada na Figura 2.
- Conecte uma cânula IV de 26 G à extremidade de saída da tubulação usando um conector de bloqueio Luer. Insira a extremidade de entrada do tubo no tubo tampão de perfusão pré-aquecido no banho de água. Lavar a tubulação com etanol a 70%, seguido de 50 mL de cloreto de sódio estéril (NaCl 0,9%). Prima a tubulação com tampão de perfusão quente (velocidade da bomba de 3 mL/min).
- Sedar o camundongo usando anestesia inalatória com isoflurano (800 mL/min O 2, 3%-5% de isoflurano para indução e2% para manutenção durante o procedimento). Manuseie o isoflurano sob um exaustor de laboratório e forneça ventilação adequada.
- Administrar buprenorfina por via subcutânea 30 min antes da cirurgia na dose de 0,1 mg/kg de peso corporal.
- Para evitar a hipotermia, coloque o rato sedado em uma almofada de aquecimento e coloque um tecido de pano enrolado sob o abdômen superior para elevar o fígado acima dos outros órgãos e facilitar o acesso à veia cava inferior.
NOTA: Não use tecido muito espesso, pois a torção dos vasos é possível e a eficácia da perfusão seria afetada. - Adicione pomada ocular para evitar danos na córnea.
- Antes de iniciar a cirurgia, certifique-se de que o animal está adequadamente anestesiado, testando o reflexo de retirada do pedal (pinça da almofada do pé em ambas as patas traseiras). Em caso de resposta, forneça anestesia adicional e reteste antes de iniciar o procedimento.
- Limpe o abdômen com etanol a 70%.
- Reabra a incisão da linha média cortando a sutura e afastando suavemente as bordas da ferida. Se a hepatectomia for mais antiga que 24-48 h, remova a sutura e corte a pele com uma tesoura.
- Fixe uma sutura de polipropileno 5-0 no esterno, puxe-a cranialmente e fixe-a nesta posição. Use um afastador ou clipes simples para manter o abdômen aberto. A cavidade abdominal deve ser exposta o máximo possível para otimizar o acesso e a visualização.
- Mova os intestinos para a direita usando cotonetes para revelar a veia porta e a veia cava. Use um pano molhado para reter os intestinos.
- Coloque um objeto pesado de aproximadamente 2 cm de altura (por exemplo, um anel de peso revestido de silicone para frascos volumétricos) adjacente às patas traseiras do rato (Figura suplementar S2A). Coloque a tubulação com a cânula 26 G IV conectada no objeto e posicione a agulha cuidadosamente em cima da veia cava. Ajuste o comprimento da tubulação.
- Coloque a solução de estoque de colagenase preparada no tubo tampão de digestão pré-aquecido. Adicionar 250 μL da solução-mãe a 10 ml de tampão de digestão. Prepare 10-20 mL de tampão de digestão por animal. Para animais maiores ou perfusão de fígados inteiros, prepare até 30 mL de tampão de digestão.
NOTA: Recomenda-se adicionar a solução de estoque de colagenase ao tampão de digestão aquecido aproximadamente 30 minutos antes do início do processo de digestão.
Figura 2: Visão geral da configuração de perfusão. (A) Mesa cirúrgica com o equipamento necessário para a perfusão. (B) Os materiais necessários para a preparação do fígado, bem como a extração e isolamento de hepatócitos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Canulação e perfusão
- Ajuste a velocidade da bomba para 3 mL/min e ligue a bomba. Deixe o tampão de perfusão pré-aquecido alcançar a agulha. Descarte os primeiros 2-3 mL de tampão de perfusão.
- Realizar a canulação da veia cava inferior.
- Enquanto o tampão está correndo através da agulha, insira a cânula 26 G IV em um ângulo raso na veia cava abaixo do rim. Certifique-se de que o bisel da agulha aponte para cima.
- Use um cotonete para puxar suavemente a veia cava caudalmente abaixo do local da punção para que a tensão fornecida facilite a inserção da cânula na veia. Procure sangue na câmara de flash do cateter quando a agulha entrar no lúmen.
- Avance a agulha um adicional de 2-3 mm para garantir que a ponta do cateter de plástico também tenha entrado na veia.
- Deslize o cateter de plástico sobre a agulha e para a veia cava mais 5 mm. Retire a agulha lentamente e com muito cuidado.
NOTA: Não é recomendável fixar a cânula com uma ligadura. Esta etapa é demorada, pois o recipiente deve primeiro ser dissecado para esse fim. Se a cânula estiver vagamente posicionada e apoiada com um objeto, nenhuma fixação adicional será necessária (consulte a configuração de perfusão na Figura S2 Suplementar). Para estabilizar o local de canulação e evitar o refluxo, uma única gota de n-butil-cianoacrilato monomérico pode ser adicionada ao local de canulação.
- Quando o sangue cair da cânula, preencha-a com tampão de perfusão quente usando uma seringa.
- Recoloque o tubo à cânula, ainda funcionando a uma velocidade de bomba de 3 mL/min. Deixe o tampão de perfusão entrar no fígado.
- Após 2-3 s, procure manchas brancas que se formam no fígado e/ou expansão/inchaço da veia porta, que indicam que o tampão de perfusão está fluindo pelo fígado e entrando nos lóbulos hepáticos a partir da veia central (Figura 3).
- Espere que a veia porta inche visivelmente dentro de 1-2 s após o aparecimento de manchas brancas na superfície do fígado. Corte a veia porta com uma tesoura o mais distalmente possível do hilo hepático. Use um clipe de microvaso para rotular (não ocluir) o local de corte (Figura 3B).
NOTA: Isso simplifica a avaliação do fluxo através do fígado durante o processo de perfusão. O fígado limpa o sangue instantaneamente e fica amarelo-branco em poucos segundos (Figura 3C). Um corte adicional através da pele no lado direito da abertura abdominal facilita a saída do sangue, bem como a solução de perfusão (Figura 3B e Figura Suplementar S2B,C). - Aumente o fluxo até 4-7 mL/min, dependendo do peso do animal, do tamanho do fígado e da extensão da hepatectomia prévia.
- Campe a veia porta com pinça ou pinça vascular por 7-10 s. Certifique-se de que nenhum fluido esteja passando.
NOTA: O fígado incha visivelmente durante o aperto e relaxa após a liberação. Isso é crucial para lavar todo o fígado e limpá-lo de qualquer sangue restante. - Realize um segundo grampo após aproximadamente 30 s e certifique-se de que o fígado incha e relaxa. Continue com a lavagem do animal até que o tampão que flui para fora da veia porta esteja claro, mas pelo menos por 3-4 min.
NOTA: A velocidade da bomba depende do tubo, bem como do tamanho do fígado. Deve ser avaliado individualmente. - Neste ponto do procedimento, a eutanásia deveria ter ocorrido secundária à exsanguinação. Confirme que a circulação sistêmica parou (sem batimentos cardíacos ou cintilação do coração). Para garantir a morte, o pneumotórax bilateral é realizado nesta fase do procedimento como método físico secundário de eutanásia.
NOTA: Reduza ligeiramente a velocidade da bomba se a circulação sistémica tiver parado (sem batimentos cardíacos ou cintilação do coração).
Figura 3: Processo de perfusão desde a canulação até a digestão. (A) Anatomia do fígado de camundongo com a veia cava inferior (seta branca) e a veia porta (seta amarela). (B) Canulação da veia cava inferior. A cânula é fixada com uma ligadura (seta branca), e a localização do fluxo de saída através da veia porta aberta é marcada (não presa) com uma braçadeira de microvaso. (C) Observe o aparecimento de estruturas irregulares antes que o tampão de perfusão tenha eliminado o fígado de todo o sangue restante (seta branca). A pele é incisada (seta amarela) e um cotonete é colocado para garantir a drenagem do sangue e do fluido de perfusão. O pinçamento intermitente pode ser realizado com um grampo vascular ou pinça. (D) O fígado deve ser limpo de todo o sangue (*). Depois que o tampão de digestão contendo colagenase tiver entrado no fígado, ele não relaxará mais após o clampeamento e os lobos do fígado aumentarão de tamanho. (E) Depois de um tempo, uma aparência borbulhante na superfície do fígado pode ser observada (*). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Digestão
- Pause a bomba de perfusão e transfira rapidamente o tubo de entrada do tampão de perfusão para o tampão de digestão pré-aquecido. Reinicie a bomba.
- Antes que o tampão de digestão atinja o fígado, prenda a veia porta mais uma vez por 3-4 s. Certifique-se de que o fígado relaxa após a liberação do grampo e o fluido de perfusão permanece claro.
NOTA: O tampão de digestão contém vermelho de fenol e é facilmente distinguível do tampão de perfusão claro. Isso permite um rastreamento fácil dentro do tubo. - Assim que o tampão de digestão tiver atingido o fígado, prenda a veia porta mais uma vez com um clipe de microvaso.
NOTA: Ao apertar, o fígado incha, mas não relaxa após a liberação da braçadeira. Isso é normal. - Para facilitar o processo de digestão, feche a veia cava superior com um grampo vascular diretamente abaixo do diafragma para permitir que o tampão de digestão passe da veia cava inferior para o fígado para o fluxo através da veia porta aberta.
NOTA: Este aperto garante que a circulação sistémica é contornada e que o contacto desnecessário com componentes/inibidores residuais do sangue é evitado. Esta etapa é opcional, pois é difícil abordar a veia cava superior atrás do tecido hepático aumentado após a cirurgia simulada, mas o acesso é muito mais fácil em camundongos hepatectomizados. - Digerir por aproximadamente 4 min a uma taxa de fluxo de 5 mL/min. À medida que a digestão progride, procure sinais de que o fígado começa a inchar e pequenas seções claras / transparentes na superfície do fígado. Além disso, observe que o fígado assume a textura de um pedaço de pano molhado e parece quase encharcado (Figura 3E). Sonde a consistência tocando cuidadosamente com um cotonete úmido.
- Continue com a perfusão até que uma diferença marcante na textura da superfície do fígado possa ser observada. Observe que o fígado assume uma cor muito clara e uma aparência borbulhante (Figura 3E), e a cápsula de Glison (ou seja, o saco hepático) se separa do parênquima. Pare o processo de digestão assim que o fígado adquirir essas propriedades, pois a digestão excessiva pode danificar os hepatócitos. Remova a agulha antes que o ar entre no fígado.
NOTA: Normalmente, 10-20 mL de tampão de digestão são necessários para alcançar a digestão suficiente. Isso depende do tamanho do animal, da extensão da hepatectomia, da configuração da tubulação e da qualidade da solução de colagenase. Se necessário, aumente o tempo de perfusão em vez da velocidade de perfusão. Muita pressão no sistema vascular pode fazer com que o fígado exploda e o fluido de perfusão/digestão pode ser perdido para o espaço retroperitoneal.
6. Preparação do fígado
- Remova o fígado suavemente da cavidade abdominal. Tenha muito cuidado, pois agora é muito frágil e frágil.
- Segure o tecido conjuntivo central entre os lóbulos usando fórceps e levemente levante-o para cima, usando-o como ponto de ancoragem.
- Corte todas as conexões do fígado com outros órgãos, remova a vesícula biliar e coloque o fígado no tampão de preservação gelado.
NOTA: Idealmente, a extração de hepatócitos e o processamento adicional devem ocorrer imediatamente para manter a viabilidade dos hepatócitos. No entanto, se necessário, o fígado pode ser armazenado por um curto período de tempo a 4 °C (por exemplo, para transporte). Este atraso não deve exceder 30-40 min.
7. Extração de hepatócitos
- Transfira o fígado para uma placa de Petri de 10 cm e adicione 10 mL de E médio de Williams gelado.
- Rompa a cápsula de Glisson com pinças de ponta fina em alguns locais ao longo da superfície do fígado. Segure uma parte central (por exemplo, tecido conjuntivo no hilo do fígado) com dois pares de pinças e separe-os lentamente, permitindo que a cápsula se rasgue sem danificar os hepatócitos. Solte as células agitando suavemente a cápsula (Figura S3 Suplementar).
NOTA: Idealmente, o fígado rasga facilmente e libera as células. Não aplique força. Um raspador de células pode ajudar a remover completamente todas as células e aumentar o rendimento celular. Não corte o fígado em pedaços com uma tesoura. - Filtrar 5 ml de polpa hepática através de um filtro celular de 100 μm para um tubo de 50 ml. Lave o filtro com 10 mL de meio gelado fresco. Filtrar os restantes 5 ml de polpa através do filtro celular.
NOTA: Utilizar pipeta sorológica de 25 mL para transferir a polpa hepática com os hepatócitos dissociados (Figura 4A). Pipetas menores com aberturas menores aumentam a tensão de cisalhamento e danificam irreversivelmente os hepatócitos. - Adicione um total de 30 mL de meio frio para enxaguar a placa de Petri, filtrá-la e adicione a suspensão ao tubo de 50 mL até que esteja cheia. Todas as células isoladas estão agora em suspensão (Figura 4B).
Figura 4: Purificação por centrifugação suave . (A) Homogeneizado hepático deixado após a etapa de extração. (B) Visão microscópica (ampliação de 20x) do homogeneizado; observe a contaminação marcada com detritos. (C) Etapas de centrifugação de purificação e (D) vistas microscópicas dos sobrenadantes a serem descartados. (E) Visão microscópica da fração purificada de hepatócitos. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
8. Isolamento de hepatócitos
- Gire a 50 × g durante 5 min a 4 °C (menor aceleração e menor freio possível).
NOTA: Os hepatócitos são mais densos do que as células hepáticas não parenquimatosas. Devido à baixa força de centrifugação, apenas os hepatócitos são peletizados, enquanto outras células (por exemplo, células imunes, eritrócitos e células sinusoidais) permanecem no sobrenadante. - Aspirar a maior parte do sobrenadante, deixando 1 mL para ressuspender as células, girando suavemente o tubo.
- Adicionar 40 mL de meio E de Williams frio e girar novamente a 50 × g por 10 min a 4 °C (baixa aceleração, freio baixo) para remover ainda mais hepatócitos mortos e detritos celulares e hepatócitos viáveis e gordurosos de pellets (Figura 4C).
- Descarte a maior parte do sobrenadante, deixando 1 mL para ressuspender as células girando o tubo.
- Adicione 40 mL de meio E de Williams frio e gire novamente a 50 × g por 5 min a 4 °C (baixa aceleração, freio baixo).
- Aspirar a maior parte do sobrenadante, deixando 1 mL para ressuspender as células, girando suavemente o tubo.
Observação : não pare esse processo até que as células são corrigidas ou analisadas. Os hepatócitos são muito frágeis e qualquer atraso no processo de perfusão, digestão e purificação pode danificar as células. - Determine a concentração celular final após a adição de azul de tripano, usando uma câmara de contagem melhorada de Neubauer.
NOTA: A maioria dos detritos e células não parenquimatosas já foram removidos, resultando em uma pelota limpa de aproximadamente 10-15 × 106 hepatócitos deixados após 70%-hepatectomia. - Dependendo da concentração desejada, adicione mais meio gelado. Use a suspensão de células de hepatócitos para qualquer análise a jusante ou inicie uma cultura de células primárias.
NOTA: Nesta fase, apenas algumas células imunes e não parenquimatosas (<5%) permanecem na suspensão. Se uma purificação adicional for desejada, execute uma seleção negativa de células CD31 + e CD45 + por classificação de células ativadas por magnetismo ou fluorescência (MACS / FACS). Até o momento, não há um marcador de superfície confiável e robusto para as células do parênquima hepático.
9. Preparação dos hepatócitos isolados para citometria de fluxo
- Centrifugar os hepatócitos a 100 × g durante 5 min.
- Descarte o sobrenadante e adicione a quantidade desejada de tampão de citometria de fluxo, dependendo da concentração da suspensão celular.
- Adicionar 1 mL de suspensão celular em um tubo de citometria de fluxo. Centrifugar durante 5 min a 100 × g e eliminar o sobrenadante.
- Adicione 100-200 μL do corante de viabilidade verde Alexa Fluor 488 Zombie diluído (concentração 1:400) às células e agite-as suavemente. Ressuscite cuidadosamente os hepatócitos agitando manualmente ou usando um misturador de vórtice em baixa velocidade (máximo 2-3) por 2 s.
Observação : não use pequenas pontas de pipeta para ressuspender as células. Eles são muito frágeis e a tensão de cisalhamento aplicada causa danos e reduz a viabilidade celular. Se a pipetagem não for evitável, use uma pipeta de 1.000 μL depois de cortar a menor parte da ponta para aumentar o diâmetro e pipetar as células muito lentamente. - Coloque os tubos no gelo ou guarde-os à temperatura ambiente, dependendo da coloração desejada. Incube as células por 20-30 min no escuro.
- Adicione 2 mL de tampão de citometria de fluxo e lave as células 3x. Centrifugar as células após cada etapa de lavagem a 100 × g durante 5 min.
- Adicionar 2 mL de tampão de fixação (1:1 4% PFA e PBS). Ressuscite cuidadosamente os hepatócitos agitando manualmente ou usando um misturador de vórtice em baixa velocidade (máximo 2-3) por 2 s.
- Fixe as células por 30 min.
- Centrifugar a 100 × g por mais 5 min, descartar o sobrenadante e adicionar tampão de citometria de fluxo.
NOTA: As células podem ser armazenadas em tampão de citometria de fluxo antes da análise até 72 h após o isolamento.
10. Análise de hepatócitos com citometria de fluxo
- Analise os hepatócitos usando um classificador de células ativado por fluorescência.
NOTA: Considere o tamanho relativamente grande dos hepatócitos e ajuste as tensões. Comece com uma baixa tensão e não vá além de 350 V para dispersão frontal (FSC) e 220 V para dispersão lateral (SSC).- Ajuste as tensões para FSC e SSC para o tamanho grande estimado das células. Identificar a população de hepatócitos e registrar todos os eventos usando SSC-A e FSC-A (Figura 5A).
- Observe que os detritos e as células não parenquimatosas são exibidos no canto inferior esquerdo do gráfico de densidade FSC versus SSC e são excluídos (Figura 5A).
- Como as células duplas podem afetar a análise, construa um gráfico de densidade de altura de dispersão lateral (SSC-H) versus área de dispersão lateral (SSC-A) para excluir duplicatas, como mostra a Figura 5B.
- Selecione a população final de hepatócitos por meio da determinação de células CD31- (marcador endotelial) e CD45- (marcador imunológico) (Figura 5C).
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Representative Results
O TRAS atinge o pico às 16 h após a hepatectomia e desaparece gradualmente 32-48 h após a hepatectomia padrão, mas persiste além de 48 h após a hepatectomia prolongada. Macroscopicamente, o TRAS é facilmente visível como uma tez pálida do remanescente hepático (Figura 1F) e pode ser observado em camundongos hepatectomizados entre 16 h e 48 h após a cirurgia.
O rendimento final estimado é de 10-15 × 10 6 hepatócitos após hepatectomia a 70% e 4-9 × 106 após hepatectomia prolongada a 86% em camundongos, com viabilidade final média de 78% e 65%, respectivamente. Isso corresponde à porcentagem esperada em comparação com um rendimento total de 50-70 × 106 de um fígado de rato inteiro (Figura 6A,C). Após hepatectomias parciais, os hepatócitos apresentam um tamanho celular aumentado em relação aos fígados normais, correspondendo ao seu aumento do conteúdo lipídico (Figura 6B). A estratégia de bloqueio é mostrada na Figura Suplementar S4.
Figura 6: Rendimento de hepatócitos, tamanho celular e viabilidade. (A) Contagem de células de um fígado inteiro de camundongo e de remanescentes 24 h após hepatectomia de 70% e 86%. (B) Volume celular calculado de hepatócitos isolados. Observe o aumento acentuado no tamanho das células 24 h após a hepatectomia, para 70% e 86%. (C) Viabilidade celular de hepatócitos isolados após cada etapa do processo de purificação. A viabilidade foi medida por citometria de fluxo utilizando o corante de viabilidade verde Alexa Fluor 488 Zombie. As porcentagens são retiradas de todos os singletos de hepatócitos. Para a estratégia de bloqueio, consulte a Figura Suplementar S6 e a Figura Suplementar S4. As barras de erro referem-se a desvios padrão com n = 6-8/grupo. Abreviaturas: sHx = hepatectomia padrão; eHx = hepatectomia prolongada; sem ressecção = cirurgia simulada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Um aumento do conteúdo lipídico em hepatócitos murinos 24 h após a hepatectomia parcial pode ser observado por um aumento na granularidade (Figura 7; para estratégia de bloqueio, ver Figura Suplementar S5) ou diretamente observado pela presença de vesículas lipídicas dentro de hepatócitos aumentados (Figura 8 e Arquivo Suplementar 1).
Figura 7: Aumento da granularidade e do tamanho celular medido pela citometria de fluxo. (A) Aumento da granularidade entre hepatócitos isolados 24 h após a hepatectomia como marcador indireto para a presença de vesículas lipídicas. (B) Histograma mostrando CSC. (C) As porcentagens representam a fração de células com alta intensidade granular citoplasmática, medida pelo sinal SSC. As barras de erro referem-se a desvios padrão com n = 6-8/grupo. Abreviaturas: sHx = hepatectomia padrão; eHx = hepatectomia prolongada; sem ressecção = cirurgia simulada; FSC = sinal de dispersão para a frente; SSC = dispersão lateral. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Coloração de Sudão IV como marcador do teor de gordura de hepatócitos frescos isolados. (A) Hepatócitos de um fígado de rato inteiro fresco sem cirurgia prévia. Aumento do tamanho e teor de gordura dos hepatócitos 24 h (B) pós-hepatectomia a 70% e (C) hepatectomia a 86%. Observe a presença concomitante de hepatócitos esteatóticos maiores e hepatócitos menores e não esteatóticos. Barras de escala = 30 μm (B-D). As barras de erro referem-se a desvios padrão com n = 6-8/grupo. Abreviaturas: sHx = hepatectomia padrão; eHx = hepatectomia prolongada; sem ressecção = cirurgia simulada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Uma porcentagem muito baixa de células imunes e não parenquimatosas permanece na suspensão final. A purificação adicional é alcançada por FACS ou MACS, se desejado. A seleção negativa de células CD31+ e CD45+ por citometria de fluxo é utilizada para demonstrar e quantificar as células não parenquimatosas (Figura 5).
Figura 5: Estratégia de bloqueio por citometria de fluxo e seleção de células parenquimatosas CD31 e CD45-. (A) Gráfico de bloqueio com todos os eventos registrados; considerar o tamanho relativamente grande dos hepatócitos e usar tensões ajustadas. Não vá acima de 350 V para FSC e 220 V para SSC. (B) Singlet gating. (C) Os hepatócitos são selecionados por meio da eliminação de células CD31- (marcador endotelial) e CD45- (marcador imunológico). Esta seleção pode ser realizada em um classificador de células ativado por fluorescência para selecionar células parenquimatosas para análises posteriores a jusante, se necessário; n = 4-5/grupo. Abreviaturas: FSC = dispersão para a frente; SSC = dispersão lateral. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para demonstrar a eficácia do protocolo modificado na retenção de células esteatóticas, os hepatócitos foram isolados utilizando a abordagem clássica de gradiente dedensidade7 (Figura 9A). Ao contrário do procedimento modificado (Figura 9B), uma camada de células gordurosas foi claramente visível no topo do gradiente de densidade. A análise das células confirmou uma ausência macroscópica de hepatócitos carregados de lipídios no pellet após centrifugação de gradiente de densidade. Em contraste, as células da camada gordurosa foram enriquecidas com hepatócitos esteatóticos e uma fração substancial de células não parenquimatosas e mortas (Figura 9A). Assim, o isolamento clássico priva a colheita de células esteatóticas, enquanto este protocolo modificado omitindo o gradiente de densidade retém subpopulações carregadas de lipídios, permitindo a exploração imparcial da regeneração hepática sem se inclinar para hepatócitos magros.
Figura 9: Rendimentos de hepatócitos esteatóticos seguindo o protocolo clássico de isolamento de gradiente de densidade em comparação com o protocolo melhorado. (A) Com o método clássico de purificação de gradiente de densidade (concentração final de solução de gradiente de densidade a 90% em solução salina tamponada com fosfato), hepatócitos mortos são coletados em uma camada celular em cima da solução de gradiente de densidade. (B) Esta camada não consiste apenas de células não parenquimatosas e hepatócitos inviáveis, mas também de hepatócitos gordurosos grandes e viáveis. (C) O pellet obtido após centrifugação de gradiente de densidade contém hepatócitos magros de menor tamanho e é principalmente desprovido de células esteatóticas. Esta é a fração "pura" que é isolada com o protocolo clássico. (D) Com o protocolo melhorado, os hepatócitos cheios de lipídios não são perdidos e todos os hepatócitos são peletizados. O sobrenadante (E) consiste principalmente de hepatócitos mortos e fragmentados e células não parenquimatosas, enquanto o pellet (F) é uma mistura de hepatócitos de tamanho variável e conteúdo lipídico. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo Suplementar 1: Protocolos suplementares. (A) Coloração lipídica com Sudão IV; (B) hepatectomia padrão e prolongada em camundongos. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura S1 suplementar: Visão geral sobre a configuração de perfusão. (1) Canular a veia cava inferior. (2) Perfundir o fígado com tampão de perfusão quente para cálcio quelato. (3) Aqueça o tampão de digestão com colagenases e Ca2+ para dissociar as células in vivo. Remova o fígado e (4) armazene em tampão de preservação gelado (máximo de 30 min). Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura S2 suplementar: Configuração de perfusão. (A) Mesa de perfusão com bico de isoflurano, lâmpada de aquecimento de luz vermelha e tubo de perfusão. Um objeto pesado pode ser colocado sob o tubo para estabilizá-lo e reduzir o risco de deslocamento. (B) Durante os primeiros minutos da perfusão, algum sangue fluirá através da veia porta e se acumulará na cavidade abdominal aberta. (C) A parede abdominal é incisada de um lado para drenar o sangue. Um cotonete facilita a drenagem. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar S3: Cápsula de Glisson. (A) A cápsula de Glison é rompida com pinças de ponta fina em alguns locais ao longo da superfície do fígado, e as células do fígado são liberadas agitando suavemente a cápsula. (B) O fígado deve rasgar facilmente. (C) O saco hepático vazio (cápsula de Glisson) com hepatócitos liberados em suspensão. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar S4: Estratégia de bloqueio por citometria de fluxo para triagem de viabilidade. (A) Todos os eventos foram registrados. (B) Singlet gating. (C) Coloração viva/morta com o corante de viabilidade verde Alexa Fluor 488 Zombie. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar S5: Estratégia de bloqueio por citometria de fluxo para medição de granularidade. (A) Todos os eventos foram registrados. (B) Singlet gating. (C) Gráfico de pontos de dispersão lateral (SSC; eixo x ) versus dispersão para a frente (FSC; eixo y ) para analisar os níveis de granularidade. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar S6: Purificação de hepatócitos. (A) Pellet celular após a primeira etapa de centrifugação; observe a camada gordurosa em cima do meio. (B) Pellet de hepatócitos após a segunda rodada de centrifugação. (C) Hepatócitos purificados no final do processo de purificação. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O protocolo publicado fornece um método confiável e direto para isolar um alto rendimento de hepatócitos murinos normais e esteatóticos para análises a jusante de célula única ou análise em massa de células após a classificação FACS. A vantagem distinta sobre a purificação do gradiente de densidade é que o conteúdo lipídico celular não tem essencialmente impacto no rendimento efetivo dos hepatócitos. Assim, a fração de hepatócitos esteatóticos será retida e incluída nas análises a jusante. Isso não é apenas crucial para o estudo de doenças hepáticas esteatogênicas, mas também fundamental para qualquer análise de processos após as principais hepatectomias, onde os hepatócitos exibem uma esteatose temporal e espacialmente dinâmica nos primeiros 2-3 dias de regeneração. Embora análises (unicelulares) de hepatócitos isolados já tenham sido realizadas após hepatectomias19,20,21, deve-se supor que a população celular analisada foi, pelo menos parcialmente, privada de hepatócitos carregados de lipídios e os resultados, portanto, não foram totalmente representativos e inclinados para hepatócitos magros.
Atualmente, a função do TRAS não está totalmente esclarecida. Por exemplo, as diferenças espaciais no conteúdo lipídico dentro dos lóbulos hepáticos permanecem incompreendidas. Portanto, é necessário um método que permita a detecção quantitativa e qualitativa sem excluir precisamente essas células das análises (por exemplo, para transcriptômica de célula única, citometria de fluxo e metabolômica).
No geral, o rendimento de hepatócitos com esse protocolo aprimorado é marcadamente superior a outros métodos para o isolamento de hepatócitos contendo gordura (por exemplo, de camundongos com esteato-hepatite não alcoólica, NASH) usando purificação de gradiente de densidade15. No entanto, o rendimento celular, a viabilidade e o teor de gordura podem variar entre as preparações. Vários fatores parecem ser responsáveis.
Primeiro, diferentes lotes de colagenase ou misturas de colagenase variam em sua atividade enzimática; no entanto, as diferenças de lote a lote não são tão críticas quanto as colagenases tradicionais. No entanto, pode ser necessário ajustar a concentração de trabalho. As diferenças podem ser ainda minimizadas pelo armazenamento adequado até o uso (liofilizados secos e soluções-estoque reidratadas a -15 a -25 °C) e evitando ciclos repetitivos de congelamento-descongelamento, mas não podem ser totalmente eliminadas. Portanto, recomenda-se usar apenas colagenases de um lote específico para uma determinada série experimental. Além disso, a atividade enzimática depende da temperatura em que o tampão de digestão atinge o fígado, com uma temperatura ideal entre 35 °C e 37 °C para uma mistura de colagenases I e II22. Temperaturas mais baixas reduzirão a atividade enzimática, enquanto temperaturas acima de 50 °C podem levar à desnaturação irreversível da proteína. Teste isso com antecedência e otimize as condições experimentais ajustando a temperatura inicial do tampão de digestão, o comprimento e o diâmetro do tubo de plástico e a velocidade do fluxo. Por exemplo, é de esperar uma queda na temperatura do tampão de até 10 °C dentro de um comprimento de tubo de 60 cm. Corrija a temperatura usando almofadas de aquecimento e lâmpadas infravermelhas, se necessário. As colagenases apresentam a sua capacidade de digestão óptima a um pH de 7,4; por conseguinte, recomenda-se ajustar o pH das soluções-tampão já a uma temperatura de trabalho de aproximadamente 37 °C antes da utilização.
Em segundo lugar, é fundamental lavar o fígado (ou todo o rato) suficientemente com tampão de perfusão antes de iniciar o processo de digestão para eliminar potenciais inibidores, como o soro ou a albumina. Idealmente, a perfusão é iniciada somente após a circulação sistêmica ter parado, para garantir que o tampão de digestão se mova apenas da veia cava através do fígado para a saída através da veia porta aberta. A veia cava superior pode ser fechada com uma pequena braçadeira vascular. Isso evita o contato com componentes/inibidores residuais do sangue. Outro método de lavar o fígado de forma ideal é o pinçamento intermitente da veia porta. Isso deve ser feito com cuidado e - uma vez que o tampão de digestão tenha atingido o fígado - realizado apenas uma vez para evitar danificar as células já digeridas.
Em terceiro lugar, os hepatócitos em regeneração são sensíveis, e a experiência mostrou que eles exigem tempos de digestão mais curtos e manuseio mais cuidadoso para evitar a superdigestão e danos às células. Para colher o fígado o mais suavemente possível, recomenda-se agarrar o hilo hepático com um grampo e, em seguida, primeiro cortar a veia cava superior e libertar o fígado das conexões com a veia e o diafragma. Posteriormente, a veia cava inferior e a veia porta podem ser cortadas, o que permite a mobilização do fígado e o liberta facilmente dos ligamentos gastrointestinais, do esôfago de um lado e do rim direito do outro lado. Em camundongos hepatectomizados, é possível agarrar cuidadosamente uma das ligaduras dos lobos medianos para remover o fígado. Se for feita uma tentativa de puxar o fígado para fora à força, a cápsula de Glisson pode se romper e as células isoladas podem se perder.
Finalmente, é essencial que o procedimento de perfusão e o processamento posterior dos hepatócitos não sejam interrompidos ou atrasados, pois isso afetará imediata e inevitavelmente a viabilidade. O ideal é que a perfusão seja realizada em uma equipe de pelo menos duas pessoas e em um animal de cada vez. Esses requisitos de tempo e mão de obra, no entanto, são uma das limitações desse método, embora isso também se aplique a métodos alternativos.
Outra limitação é a pureza final da suspensão celular resultante, pois a vantagem de não perder hepatócitos esteatóticos para um gradiente de densidade resulta em uma pequena proporção de células não parenquimatosas e/ou imunes remanescentes. Na amostra mostrada, a fração de CD45+ (células imunes) e CD31+ (células endoteliais) está abaixo de 5% e, ao selecionar o tamanho da célula primeiro durante a citometria de fluxo, as porcentagens de CD45+ e CD31+ são de 1,2% e 2,2%, respectivamente (Figura 5). Para a maioria das aplicações, esse nível de pureza é suficiente, mas métodos altamente sensíveis ou o uso posterior em culturas de células primárias provavelmente exigem um grau mais alto. Numerosos estudos têm utilizado CD31 e CD45 como marcadores sistêmicos para classificar populações de células hepáticas por MACS 23,24 ou FACS25.
Este método de isolamento melhorado é ideal para o estudo da regeneração hepática, particularmente o período inicial que se apresenta com quantidades significativas de hepatócitos esteatóticos. PHLF, caracterizando esteatose persistente, é um assunto particularmente relevante que requer pesquisa. Após hepatectomias prolongadas deixando para trás restos marginais, a PHLF pode se desenvolver e, de fato, representa a causa mais comum de morte devido à cirurgia hepática. Sua patobiologia é apenas parcialmente compreendida, e atualmente não há tratamento disponível26. Dado que a PHLF limita significativamente a aplicação da cirurgia hepática (como para a cura de malignidades hepáticas), explorar suas causas e identificar medidas potenciais é uma clara necessidade médica.
Também existe necessidade para o estudo de doenças que compartilham a esteatose hepática como ponto de partida. Um exemplo proeminente é a doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA), que pode evoluir para EHNA e, eventualmente, para carcinoma hepatocelular (CHC)27. A disseminação do sedentarismo em conjunto com a dieta ocidental levou a uma epidemia mundial de DHGNA e, consequentemente, projeta-se que a incidência de CHC aumente28,29. A esteatose, por sua vez, também está intimamente ligada à obesidade, à síndrome metabólica e ao diabetes tipo 2, todas doenças com incidência crescente30. Portanto, a esteatose representa uma carga crescente para o atual sistema de saúde, exigindo meios efetivos para sua gestão. Este método melhorado de perfusão de colagenase em duas etapas permite o estudo de hepatócitos esteatóticos no nível de célula única e, portanto, deve ajudar a explorar as causas e consequências do acúmulo de lipídios hepatocelulares.
Este protocolo apresenta uma técnica fácil, rápida e confiável para o isolamento in vivo de hepatócitos regeneradores de camundongos após hepatectomia parcial (70%) e prolongada (86%). Esta abordagem não depende da purificação gradiente e pode ser usada para investigar processos de regeneração hepática com a inclusão de hepatócitos carregados de lipídios que geralmente são perdidos durante os protocolos tradicionais de isolamento. Além disso, este método também pode ser aplicado para a pesquisa de várias doenças hepáticas associadas a alterações esteatóticas e não se limita às espécies de camundongos.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Swiss National Fond (bolsa de projeto 310030_189262).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | - |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | - |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | - |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | - |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | - |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | - |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | - |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | - |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | - |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | - |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | - | - |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | - |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | - |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | - |
| Fenestrated sterile surgical drape | - | - | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | - |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | - |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | - | - |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | - |
| Isofluran station | Provet | - | - |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | - | - |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | - | - |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | - |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | - |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | - | - |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | - | - |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | - |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | - | Adjust to 42 °C |
References
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