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Immunology and Infection

ट्राइकोडर्मा स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया की व्यवहार्यता परख मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर-व्युत्पन्न मैक्रोफेज के अंदर

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65231
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Laboratory of Immunobiology - Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Università Degli Studi di Genova
* These authors contributed equally

Summary

मैक्रोफेज द्वारा फंगल कोनिडिया के फागोसाइटोसिस से जुड़ी तकनीक का व्यापक रूप से कवक के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के मॉड्यूलेशन का मूल्यांकन करने वाले अध्ययनों के लिए उपयोग किया जाता है। इस पांडुलिपि का उद्देश्य ट्राइकोडर्मा स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया के साथ प्रेरित मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर-व्युत्पन्न मैक्रोफेज के फागोसाइटोसिस और निकासी क्षमताओं के मूल्यांकन के लिए एक विधि प्रस्तुत करना है।

Abstract

मैक्रोफेज रक्षा की एक महत्वपूर्ण रेखा का प्रतिनिधित्व करते हैं और विभिन्न ऊतकों में रोगजनकों के विकास और उपनिवेशण को रोकने के लिए जिम्मेदार हैं। कोनिडियल फागोसाइटोसिस एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है जो मैक्रोफेज-रोगज़नक़ इंटरैक्शन में शामिल साइटोप्लाज्मिक और आणविक घटनाओं की जांच के साथ-साथ आंतरिक कोनिडिया की मृत्यु के समय के निर्धारण के लिए अनुमति देती है। मैक्रोफेज द्वारा फंगल कोनिडिया के फागोसाइटोसिस से जुड़ी तकनीक का व्यापक रूप से कवक के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के मॉड्यूलेशन का मूल्यांकन करने वाले अध्ययनों के लिए उपयोग किया जाता है। फागोसाइटोसिस की चोरी और फागोसोम का पलायन फंगल विषाणु के तंत्र हैं। यहां, हम उन तरीकों की रिपोर्ट करते हैं जिनका उपयोग फागोसाइटोसिस, निकासी और टी स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया की व्यवहार्यता के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, एक कवक जो जैव नियंत्रण और जैव उर्वरक एजेंट के रूप में उपयोग किया जाता है और मानव संक्रमण को प्रेरित करने में सक्षम है। प्रोटोकॉल में 1) ट्राइकोडर्मा संस्कृति, 2) कोनिडिया प्राप्त करने के लिए धोना, 3) पॉलीसुक्रोज समाधान विधि का उपयोग करके परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) का अलगाव और मैक्रोफेज में पीबीएमसी का भेदभाव, 4) गोल ग्लास कवरस्लिप और रंगाई का उपयोग करके इन विट्रो फागोसाइटोसिस विधि में, और 5) कोनिडिया फागोसाइटोसिस के बाद कोनिडिया व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए एक निकासी परख । सारांश में, इन तकनीकों मैक्रोफेज की कवक निकासी दक्षता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

ट्राइकोडर्मा जीनस (क्रम: हाइपोक्रेलेस, परिवार: हाइपोक्रेसी) सर्वव्यापी, सैप्रोफाइटिक कवक से बना है जो अन्य कवक प्रजातियों के परजीवी हैं और व्यावसायिक रूप से उपयोगीएंजाइमों की एक श्रृंखला का उत्पादन करने में सक्षम हैं। इन कवक प्रजातियों विषम प्रोटीन2 के उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है, सेलूलोज़3 के उत्पादन, इथेनॉल, बीयर, शराब, और कागज4, कपड़ा उद्योगमें 5, खाद्य उद्योग6, और जैविक नियंत्रण एजेंटों 7,8 के रूप में कृषि में. इन कवक प्रजातियों में औद्योगिक रुचि के अलावा, मनुष्यों में संक्रमण की बढ़ती संख्या ने कुछ ट्राइकोडर्मा प्रजातियों को अवसरवादीरोगजनकों का दर्जा दिया है।

ट्राइकोडर्मा एसपीपी संस्कृति में तेजी से बढ़ता है, शुरू में सफेद और कपास की कॉलोनियों के साथ जो हरे पीले से गहरे हरे रंग में बदल जाते हैं10. वे पीएच और तापमान की स्थिति की एक विस्तृत श्रृंखला में रहने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, और अवसरवादी प्रजातियों शारीरिक पीएच और तापमान पर जीवित रहने में सक्षम हैं और इस प्रकार, विभिन्न मानव ऊतकों 11,12,13 उपनिवेश. महत्वपूर्ण रूप से, ट्राइकोडर्मा एसपीपी की संक्रमण दर में वृद्धि विषाणु कारकों से जुड़ी हो सकती है, और इनका अच्छी तरह से अध्ययन नहीं किया जाता है। इसके अलावा, अवसरवादी ट्राइकोडर्मा प्रजातियों के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को समझने पर ध्यान केंद्रित करने वाले अध्ययन अभी भी दुर्लभ हैं।

एक संक्रमण के दौरान, न्यूट्रोफिल के साथ, मैक्रोफेज फागोसाइटोसिस के लिए जिम्मेदार रक्षा की रेखा का प्रतिनिधित्व करते हैं, और इस प्रकार, विभिन्न ऊतकों में रोगजनकों के विकास और उपनिवेशण को रोकते हैं। पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स, जैसे टोल-जैसे रिसेप्टर्स और सी-टाइप लेक्टिन रिसेप्टर्स, मैक्रोफेज फागोसाइटोसिस कवक का उपयोग करना और उन्हें फागोलिसोसोम में संसाधित करना, इस प्रकार श्वसन फटने को बढ़ावा देना, प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स की रिहाई, और फागोसाइटोस्ड सूक्ष्मजीवों का विनाश14. फागोसाइटोसिस का तंत्र, हालांकि, विभिन्न माइक्रोबियल रणनीतियों से प्रभावित और विकसित हो सकता है, जैसे कि कवक कोशिकाओं का आकार और आकार; फागोसाइटोसिस में बाधा डालने वाले कैप्सूल की उपस्थिति; फागोसाइटोसिस-उत्प्रेरण रिसेप्टर्स की संख्या में कमी; साइटोप्लाज्म में एक्टिन फाइबर की संरचना का रीमॉडेलिंग; स्यूडोपोडिया के गठन में बाधा; और फागोसाइटोसिस प्रक्रिया14 के बाद फागोसोम या फागोलिसोसोम बच जाते हैं।

क्रिप्टोकोकस neoformans सहित कई रोगजनकों, मेजबान में जीवित रहने के लिए एक जगह के रूप में मैक्रोफेज का उपयोग करें, प्रसार, और संक्रमण15. फागोसाइटोसिस और निकासी परख रोगजनकों के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली 15,16,17से बचने के लिए नियोजित माइक्रोबियल रणनीतियों की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है। तकनीक के इस प्रकार भी फागोसाइटोसिस के अंतर कैनेटीक्स की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, फागोसोम अम्लीकरण में देरी, और ऑक्सीडेटिव फट कि कम फंगल हत्या18 में जिसके परिणामस्वरूप.

फागोसाइटोसिस, फंगल अस्तित्व और फागोसोम परिपक्वता प्रक्रिया की चोरी का मूल्यांकन करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। इनमें प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी शामिल है, जिसका उपयोग फागोसाइटोसिस, सेलुलर स्थान और फागोसाइटोसिस19के दौरान उत्पादित अणुओं का निरीक्षण करने के लिए किया जाता है; फ्लो साइटोमेट्री, जो फागोसाइटोसिस पर मात्रात्मक डेटा प्रदान करता है और प्रक्रिया20,21 में शामिल विभिन्न मार्करों का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है; इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी, जिसका उपयोग माइक्रोबियल कैप्चर और फागोसोम परिपक्वता22 का आकलन करने के लिए किया जाता है; एंटीबॉडी-मध्यस्थता फागोसाइटोसिस, जिसका उपयोग रोगज़नक़23 के लिए फागोसाइटोसिस प्रक्रिया की विशिष्टता का आकलन करने के लिए किया जाता है; और अन्य 24,25,26,27।

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक आम, कम लागत वाली, और एक ऑप्टिकल खुर्दबीन और थाली विकास परख का उपयोग कर प्रत्यक्ष विधि फागोसाइटोसिस और फंगल conidia की हत्या का आकलन करने के लिए रोजगार. यह प्रोटोकॉल पाठकों को टी. स्ट्रोमैटिकम के संपर्क में आने वाले मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर-व्युत्पन्न मैक्रोफेज का उपयोग करके फागोसाइटोसिस और क्लीयरेंस परख करने के लिए चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करेगा। पीबीएमसी का उपयोग इसलिए किया गया क्योंकि ट्राइकोडर्मा कोनिडिया को फाइटोपैथोजेन के खिलाफ जैव नियंत्रण के रूप में लागू किया जाता है और दुनिया भर में पौधों की फसलों के लिए एक जैव उर्वरक और कई मानव संक्रमण हुए हैं, जिन्हें ट्राइकोडर्मोसिस कहा जाता है। इसके अलावा, ट्राइकोडर्मा कोनिडिया और मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच बातचीत पर ध्यान केंद्रित करने वाले केवल दो पिछले कार्य हैं, जिसमें हमने मैक्रोफेज29 में न्यूट्रोफिल28 और ऑटोफैगी की जांच की। यह लेख पहले दिखाता है कि पीबीएमसी व्युत्पन्न मैक्रोफेज द्वारा टी स्ट्रोमैटिकम के कोनिडिया के फागोसाइटोसिस का अध्ययन कैसे किया जा सकता है, और फिर सरल माइक्रोस्कोपी-आधारित तकनीकों का उपयोग करके संलग्न कोनिडिया की व्यवहार्यता का आकलन कैसे किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल आगे मैक्रोफेज से जुड़े प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया या प्रतिरक्षा प्रणाली मॉड्यूलेशन से संबंधित तंत्र पर जांच की सुविधा प्रदान कर सकता है।

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Protocol

नैतिक विचार और मानवीय विषय
इस अध्ययन में वर्णित मनुष्यों के साथ सभी प्रयोग हेलसिंकी और ब्राजील के संघीय कानूनों की घोषणा के अनुसार आयोजित किए गए थे और सांताक्रूज की आचार समिति (परियोजना पहचान कोड: 550.382 / 2014) के स्टेट यूनिवर्सिटी द्वारा अनुमोदित किए गए थे।

मानव परिधीय रक्त इल्हियस शहर, बाहिया, ब्राजील के स्वस्थ स्वयंसेवकों से एकत्र किया गया था, जो अध्ययन किए गए कवक से संबंधित व्यावसायिक गतिविधियों के संपर्क में नहीं थे। रिपोर्ट की गई स्वास्थ्य चिकित्सा स्थितियों या दवा का उपयोग करने वाले व्यक्तियों को बाहर रखा गया था। सभी विषयों ने स्वेच्छा से भाग लेने के लिए सहमति व्यक्त की और इस अध्ययन में शामिल होने से पहले एक सूचित सहमति फॉर्म पर हस्ताक्षर किए।

1. अभिकर्मकों और समाधान की तैयारी

नोट: आगे बढ़ने से पहले निम्नलिखित अभिकर्मकों और समाधान तैयार करें। अभिकर्मक और सामग्री आपूर्तिकर्ता जानकारी के लिए सामग्री की तालिका (TOM) देखें।

  1. एक संतुलित बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा समाधान 1x (पीबीएस) तैयार करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, एंडोटॉक्सिन मुक्त पीबीएस का उपयोग नहीं किया गया था।
  2. आलू डेक्सट्रोज अगर (पीडीए) माध्यम तैयार करें, और टी स्ट्रोमैटिकम संस्कृति के लिए प्रत्येक पेट्री डिश में 20 एमएल डालें। प्रत्येक दाता के लिए पीडीए के साथ छह प्लेटें तैयार करें, और प्रत्येक स्थिति के लिए एक प्लेट का उपयोग करें: 3 एच, 24 एच, 48 एच, 72 एच, 96 एच, और 120 एच। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक नियंत्रण के लिए तीन प्लेटों का उपयोग करें: ट्राइकोडर्मा नियंत्रण के लिए तीन और R10 मध्यम नियंत्रण के लिए तीन। इष्टतम कोनिडिया वसूली के लिए 60 मिमी x 15 मिमी या 100 मिमी x 15 मिमी के पेट्री व्यंजन का प्रयोग करें।
  3. 100% ग्लिसरॉल जीवाणुज।
  4. सेल संस्कृति के लिए एक R10 माध्यम तैयार करें: RPMI माध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% एंटीबायोटिक (पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ पूरक।
  5. सेल lysis के लिए आसुत जल जीवाणुरहित.
  6. रंगाई प्रक्रिया के लिए पीएच 7.0 पर पानी तैयार करें।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो पीएच मीटर और 0.1 एम/एल एनएओएच और 0.1 एम/एल एचसीएल के समाधान का उपयोग करके पीएच समायोजित करें।
  7. गोल ग्लास कवरस्लिप (13 मिमी) और चिमटी जीवजंतु।

2. ट्राइकोडर्मा स्ट्रोमैटिकम संस्कृति और प्रसंस्करण

  1. टी स्ट्रोमैटिकम के मदर स्टॉक (एम 1) की तैयारी:
    नोट: एक मदर स्टॉक (एम 1) यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि सभी प्रयोग एक ही ताजा पीढ़ी (एफ 1) की संस्कृति से किए जाते हैं।
    1. 7-10 दिनों के लिए अंधेरे में 28 डिग्री सेल्सियस पर पीडीए के साथ पेट्री व्यंजन में एक टी स्ट्रोमैटिकम इनोकुलम विकसित करें जब तक कि कोनिडिया मनाया जाता है और संस्कृति हरी हो जाती है।
    2. स्ट्रोमैटिकम की संस्कृति को धोएं। एक विंदुक का उपयोग संस्कृति की सतह के लिए पीबीएस के 3-5 एमएल जोड़ें. प्लेट से पीबीएस ले लीजिए, और फिर से धीरे-धीरे विंदुक का उपयोग कोनिडिया को हटाने के लिए संस्कृति पर इसे बांटना। इस प्रक्रिया को जितना आवश्यक हो उतना दोहराएं जब तक कि निलंबन गहरे हरे रंग का न हो जाए।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, प्लेट में पीबीएस के 3-5 एमएल जोड़कर संस्कृति की कोमल धुलाई के बाद एक परिपत्र आंदोलन करने का सुझाव दिया जाता है जब तक कि निलंबन कोनिडिया को ठीक करने के लिए हरा नहीं हो जाता। बार-बार पाइपिंग के साथ, अधिक कोनिडिया एकत्र किया जा सकता है।
    3. एक विंदुक के साथ एक 15 एमएल बाँझ ट्यूब में थाली से बरामद निलंबन स्थानांतरण. दोहराएँ कदम 2.1.2-2.1.3 के रूप में कई बार के रूप में आवश्यक अधिक conidia प्राप्त करने के लिए.
    4. 12 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 1,160 x ग्राम पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, और पीबीएस के 5 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें। हाइपहे-मुक्त निलंबन प्राप्त करने के लिए इस चरण (2.1.4) को तीन बार दोहराएं।
      नोट: गोली को ठीक से फिर से निलंबित करने के लिए, सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, संक्षिप्त भंवर की सिफारिश की जाती है।
    5. पीबीएस के 2-3 एमएल में अंतिम गोली को फिर से निलंबित करें, और 1:100 या 1:1,000 के कमजोर पड़ने का उपयोग करके न्यूबॉयर कक्ष में कोनिडिया की गणना करें।
      नोट: इष्टतम स्थितियों में, संस्कृति से 2 x 108 कोनिडिया/एमएल की अंतिम एकाग्रता को पुनर्प्राप्त किया जा सकता है। ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण विधि का उपयोग करके कोनिडिया व्यवहार्यता का आकलन करना वैकल्पिक है।
    6. प्रत्येक ट्यूब में कोनिडिया निलंबन (चरण 2.1.5 से) के 0.5 एमएल जोड़कर निलंबन को 1.5 एमएल बाँझ ट्यूबों में विभाज्य करें। फिर, एम 1 स्टॉक प्राप्त करने के लिए बाँझ 100% ग्लिसरॉल के 0.5 एमएल जोड़ें। भंवर संक्षेप में, ट्यूबों की पहचान करें, और -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. स्ट्रोमैटिकम की संस्कृति और प्रयोग के लिए कोनिडिया प्राप्त करना
    1. एम 10 निलंबन (चरण 2.1 में तैयार) की प्लेट 7-10 दिनों के लिए अंधेरे में 28 डिग्री सेल्सियस पर पीडीए में 7-10 दिनों तक कोनिडिया मनाया जाता है और ताजा एफ 1 पीढ़ी प्राप्त करने के लिए संस्कृति हरी हो जाती है।
      नोट: प्रयोग के लिए एक ताजा टी स्ट्रोमैटिकम संस्कृति सुनिश्चित करने के लिए, कवक विकास के लिए आवश्यक समय और मैक्रोफेज भेदभाव के लिए आवश्यक समय का आकलन करें।
    2. कोनिडिया लीजिए, 2.1.2-2.1.4 चरणों को दोहराते हुए।
    3. पीबीएस के 2-3 एमएल में अंतिम गोली को फिर से निलंबित करें। ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण विधि का उपयोग करके कोनिडिया व्यवहार्यता का आकलन करें, या चरण 2.1.5 में उल्लिखित कोनिडिया की गणना करें।

3. परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल (PBMC) अलगाव

नोट: पीबीएमसी घनत्व 1.077 ग्राम/एमएल30 के पॉलीसुक्रोज समाधान का उपयोग करके घनत्व बाधा विधि द्वारा प्राप्त किए जाते हैं।

  1. एकत्र किए जाने वाले प्रत्येक दाता नमूने के लिए एक 50 एमएल ट्यूब के लिए पॉलीसुक्रोज समाधान के विभाज्य 15 एमएल।
  2. तीन से चार EDTA ट्यूबों का उपयोग कर प्रत्येक दाता से रक्त के 20 एमएल लीजिए. प्रति प्रयोग कम से कम चार दाताओं की भर्ती करें। दाताओं के रक्त को पूल न करें; इसके बजाय, प्रत्येक नमूने को जैविक प्रतिकृति के रूप में अलग से उपयोग करें। प्रत्येक दाता के लिए, रक्त को एक 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 35 एमएल की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए पीबीएस जोड़ें।
  3. रक्त निलंबन (चरण 3.2) को धीरे-धीरे पॉलीसुक्रोज समाधान (चरण 3.1) युक्त ट्यूब की दीवार के साथ एक द्विध्रुवीय निलंबन बनाने के लिए स्थानांतरित करें।
    नोट: पॉलीसुक्रोज समाधान के साथ रक्त के मिश्रण को रोकने के लिए, रक्त को धीरे-धीरे जोड़ें। पीबीएमसी अलगाव के लिए प्रत्येक दाता से न्यूनतम 7 एमएल रक्त के उपयोग की सिफारिश की जाती है।
  4. तुरंत 24 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 1,600 x ग्राम पर द्विध्रुवीय निलंबन युक्त ट्यूब अपकेंद्रित्र. PBMC के सेंट्रीफ्यूजेशन को प्रोग्राम करें: सेंट्रीफ्यूजेशन के अचानक स्टॉप से बचने के लिए त्वरण 1 और मंदी 0 का उपयोग करें।
  5. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद पीबीएमसी युक्त एक सफेद रिंग के गठन का निरीक्षण करें। लाल रक्त कोशिकाएं और ग्रैनुलोसाइट्स निचली परत में रहते हैं, अगली परत में पॉलीसुक्रोज समाधान होता है, और पीबीएमसी पॉलीसुक्रोज समाधान और प्लाज्मा (ऊपरी परत) के बीच सफेद अंगूठी में रहते हैं। एक विंदुक या एक बाँझ पाश्चर विंदुक का उपयोग धीरे aspirating द्वारा सफेद अंगूठी ले लीजिए इतनी के रूप में लाल रक्त कोशिकाओं, प्लाज्मा, या polysucrose समाधान को पकड़ने के लिए नहीं, और एक 15 एमएल ट्यूब के लिए हस्तांतरण.
  6. पीबीएस को 10 एमएल की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए पीबीएमसी युक्त 15 एमएल ट्यूब में जोड़ें। निलंबन समरूप करें, और 24 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 1,600 x ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें।
  7. पीबीएस के 10 एमएल के साथ 24 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 1,600 x ग्राम पर कोशिकाओं को तीन बार धोएं। फिर, R10 माध्यम के 2 एमएल में अंतिम गोली को फिर से निलंबित करें।
  8. trypan नीले बहिष्करण विधि का उपयोग सेल व्यवहार्यता का आकलन, और एक Neubauer कक्ष में कोशिकाओं की गिनती.

4. फागोसाइटोसिस कैनेटीक्स

नोट: मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर-व्युत्पन्न मैक्रोफेज को नियंत्रण के रूप में 1:10 या केवल R10 माध्यम के संक्रमण (MOI) की बहुलता पर T. स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया के साथ इलाज किया जाता है। संक्रमण की बहुलता (एमओआई) संक्रमण लक्ष्यों में जोड़े गए संक्रामक एजेंटों के अनुपात का प्रतिनिधित्व करती है और इसे पूर्ण संख्या के रूप में प्रस्तुत किया जाता है: एमओआई = एजेंट: लक्ष्य31। यहाँ, हम उपयोग 1 टी. स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया (एजेंट) के लिए 10 मैक्रोफेज (लक्ष्य). फिर, कोशिकाओं को अलग-अलग समय (3 एच, 24 एच, 48 एच, 72 एच, 96 एच, और 120 एच) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट किया जाता है। इसके बाद, एक माइक्रोस्कोप के तहत फागोसाइटोसिस प्रक्रिया में शामिल पक्षपाती मैक्रोफेज की कल्पना करने के लिए एक गोल ग्लास कवरस्लिप का उपयोग किया जाता है। एक प्रयोगात्मक डिजाइन आंकड़ा (चित्रा 1) प्रदान की है.

नोट: 24-अच्छी प्लेटों का उपयोग सुझाया गया है।

  1. स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया के साथ मानव-व्युत्पन्न मैक्रोफेज का उपचार
    1. बाँझ चिमटी का उपयोग कर प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एक बाँझ दौर कांच coverslip (13 मिमी) जोड़ें.
    2. R10 माध्यम के साथ 1 एमएल की अंतिम मात्रा के लिए अच्छी तरह से प्लेट 8 x 105 कोशिकाओं के लिए चरण 3.7-3.8 में प्राप्त सेल निलंबन की मात्रा समायोजित करें। कोशिका आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें।
      नोट: कोशिकाओं को माध्यम में निलंबित किया जाना चाहिए और एक गोल आकृति विज्ञान होना चाहिए।
    3. 7 दिनों के लिए 5% सीओ2 वातावरण के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, और मैक्रोफेज32 में मोनोसाइट्स के भेदभाव के लिए हर 2 दिनों में ताजा आर 10 माध्यम के साथ माध्यम को बदलें। एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग सेल आकृति विज्ञान का प्रेक्षण. मैक्रोफेज चपटा और विस्तारित आकार के साथ स्पिंडल आकृति विज्ञान पेश करेंगे; एक बढ़ा हुआ साइटोप्लास्मैटिक अनुपात और स्यूडोपोडिया की उपस्थिति भी देखी जा सकती है। पक्षपाती मोनोन्यूक्लियर-व्युत्पन्न मैक्रोफेज की तलाश करें।
      नोट: अविभाजित मोनोसाइट्स का एक बहुत छोटा अनुपात माध्यम में निलंबित रह सकता है।
    4. एक विंदुक का उपयोग कर प्रत्येक अच्छी तरह से के माध्यम निकालें, और मलबे और गैर पक्षपाती कोशिकाओं को हटाने के लिए पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें.
    5. R2.2 माध्यम में 8 x 104 conidia/mL की अंतिम एकाग्रता पर T. stromaticum conidia का एक नया निलंबन तैयार करने के लिए चरण 10 में तैयार निलंबन का उपयोग करें।
    6. 1:10 का एमओआई प्राप्त करने के लिए प्रत्येक उपचार अच्छी तरह से (3 एच, 24 एच, 48 एच, 72 एच, 96 एच, और 120 एच) में चरण 4.1.5 में तैयार कोनिडिया निलंबन के 1 एमएल जोड़ें। नियंत्रणों के लिए, अच्छी तरह से R10 माध्यम के केवल 1 एमएल जोड़ें।
    7. 5% सीओ2 वातावरण के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर टी स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया के साथ 3 घंटे के लिए मैक्रोफेज को चुनौती दें। 3 घंटे के बाद, माध्यम को हटा दें, और गैर-फागोसाइटोस्ड कोनिडिया को हटाने के लिए कोशिकाओं को धो लें।
    8. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए R10 माध्यम के 1 एमएल जोड़ें, और एक 5% सीओ2 वातावरण के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर अलग अलग समय (3 एच, 24 एच, 48 एच, 72 एच, 96 एच, और 120 घंटे) के लिए थाली सेते हैं.
  2. रंग और विश्लेषण
    1. इसी इनक्यूबेशन (चरण 4.1.8) पूरा होने के बाद प्रत्येक अच्छी तरह से माध्यम निकालें, और उस अच्छी तरह से पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें।
    2. बाँझ चिमटी और एक धुंधला किट के साथ रंग के लिए एक सुई का उपयोग कुओं से दौर कांच coverslips निकालें.
      नोट: वैकल्पिक रूप से, धुंधला हो जाना मई Grünwald-Giemsa दाग33 का उपयोग किया जा सकता है।
    3. प्रत्येक गोल ग्लास कवरस्लिप के लिए, दाग फिक्सेटर (5 एस), डाई 1 (5 एस), डाई 2 (2 एस), और बफर वॉटर पीएच 7.0 (5 एस) जोड़ें, जो धुंधला किट के घटक हैं। प्रतीक्षा करें जब तक वे सूखी हैं, और बढ़ते एजेंट का उपयोग कर एक गिलास स्लाइड पर coverslips ठीक.
    4. परिणाम की मात्रा निर्धारित करें: प्रत्येक समय की स्थिति के लिए कुल 100 मैक्रोफेज (Mø) की गणना करें। एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, 100x उद्देश्य और विसर्जन तेल (समीकरण [1]) का उपयोग करके फागोसाइटोसिस कोनिडिया के साथ मैक्रोफेज की संख्या की गणना करें।
      Equation 1 (1)
    5. मैक्रोफेज प्रति कोनिडिया फागोसाइटोज की संख्या प्राप्त करें: कम से कम एक फागोसाइटोस्ड कोनिडियम (समीकरण [2])34के साथ मैक्रोफेज की संख्या से विभाजित 100 मैक्रोफेज में मौजूद कोनिडिया को सहसंबंधित करें।
      Equation 2 (2)
      नोट: मूल्यांकन और कोनिडिया गिनती करने के लिए, ImageJ सॉफ्टवेयर35 इस्तेमाल किया जा सकता है.
    6. परिणाम प्रस्तुत करने के लिए 40x और 100x उद्देश्यों का उपयोग करके प्रत्येक नमूने और समय की स्थिति से फागोसाइटोसिस की तस्वीर लें।

Figure 1
चित्रा 1: मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर-व्युत्पन्न मैक्रोफेज का उपयोग करके फागोसाइटोसिस और शंकुधारी व्यवहार्यता परख का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (1-10) फागोसाइटोसिस परख: टी स्ट्रोमैटिकम पीडीए में उगाया जाना चाहिए, और पीबीएस के साथ प्लेट धोने से कोनिडिया को बरामद किया जाता है। PBMCs मैक्रोफेज में भेदभाव के लिए 7 दिनों के लिए बाँझ दौर ग्लास coverslips के साथ 24 अच्छी तरह से प्लेटों में सुसंस्कृत, वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर घनत्व बाधा विधि द्वारा अलग किया जाना चाहिए, और फिर अलग समय अंतराल के साथ 1:10 के एक MOI के साथ इलाज. गोल ग्लास coverslips हटा रहे हैं और धुंधला किट के साथ दाग रहे हैं, और परिणाम प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं. (1-8,11-13) कोनिडिया व्यवहार्यता परख: अलगाव के बाद, पीबीएमसी को मैक्रोफेज में भेदभाव के लिए 7 दिनों के लिए गोल ग्लास कवरस्लिप के बिना 24-अच्छी प्लेटों में सुसंस्कृत किया जाता है और फिर अलग-अलग समय अंतराल के लिए 1:10 के एमओआई के साथ इलाज किया जाता है। कोशिकाओं आसुत जल के साथ इनक्यूबेशन द्वारा lysed किया जाना चाहिए; निलंबन को तब अपकेंद्रित्र किया जाता है, और फिर ट्राइकोडर्मा के विकास कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए पीडीए में पुन: निलंबित गोली चढ़ाया जाता है। यह आंकड़ा छवियों के डेटाबेस का उपयोग करके डिजाइन किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. फागोसाइटोसिस के बाद शंकुधारी व्यवहार्यता परख

नोट: एक प्रयोगात्मक डिजाइन आंकड़ा प्रदान की जाती है (चित्रा 1)।

नोट: 24-अच्छी प्लेटों का प्रयोग करें।

  1. के साथ मानव व्युत्पन्न मैक्रोफेज को चुनौती दें टी. स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया.
    1. मोनोसाइट्स को अलग करने के लिए चरण 4.1.2-4.1.8 दोहराएं, और टी स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया के साथ मैक्रोफेज का इलाज करें।
      नोट: कुओं में गोल ग्लास कवरस्लिप का उपयोग न करें। फागोसाइटोसिस कैनेटीक्स को परखने के लिए उपयोग किए जाने वाले समान समय अंतराल का उपयोग करें ताकि फागोसाइटोसिस को शंकुधारी व्यवहार्यता के साथ सहसंबद्ध किया जा सके।
    2. नियंत्रण के रूप में चरण 4.1.5 (R10 मध्यम + कोनिडिया) में तैयार निलंबन के साथ कुओं का उपयोग करके टी स्ट्रोमैटिकम विकास पर R10 माध्यम के प्रभाव का मूल्यांकन करें।
  2. शंकुधारी व्यवहार्यता परख
    1. प्रत्येक इनक्यूबेशन अवधि (3 एच, 24 एच, 48 एच, 72 एच, 96 एच, और 120 एच) के बाद माध्यम निकालें, और कोनिडिया को हटाने के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें जिन्हें फागोसाइटोसिस नहीं किया गया है।
      नोट: R10 मध्यम + कोनिडिया वाले नियंत्रण को धोया नहीं जाना चाहिए।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से बाँझ आसुत जल के 0.5 एमएल जोड़ें, और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर थाली सेते हैं. इस समय के बाद, कोशिकाओं lysed किया गया है सुनिश्चित करने के लिए एक उल्टे खुर्दबीन के तहत सेल आकृति विज्ञान का निरीक्षण.
    3. निलंबन लीजिए, और इसे 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 6,000 x ग्राम पर एक मिनी अपकेंद्रित्र का उपयोग कर निलंबन अपकेंद्रित्र.
    4. सतह पर तैरनेवाला सावधानी से त्यागें, बाँझ आसुत जल के 10 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें, और अंधेरे में 28 डिग्री सेल्सियस पर पीडीए युक्त प्लेट में निलंबन के 10 माइक्रोन को टीका लगाएं।
    5. स्ट्रोमैटिकम विकास के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण तैयार करें: 8 x 106 कोनिडिया/एमएल की अंतिम एकाग्रता के साथ एक नया निलंबन तैयार करने के लिए टी. स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया (चरण 2.2) के निलंबन का उपयोग करें। अंधेरे में 28 डिग्री सेल्सियस पर पीडीए में इस निलंबन के प्लेट 10 माइक्रोन।
      नोट: इस निलंबन के 10 माइक्रोन में कोनिडिया (8 x 104) की समान संख्या होगी जिसका उपयोग रक्त मोनोन्यूक्लियर-व्युत्पन्न मैक्रोफेज को संक्रमित करने के लिए किया गया था। इस सकारात्मक नियंत्रण और चरण 5.1.2 में उल्लिखित एक के बीच का अंतर यह है कि चरण 5.1.2 में ऊपर वर्णित नियंत्रण का उपयोग फागोसाइटोसिस के समय ट्राइकोडर्मा विकास पर आर 10 माध्यम के संभावित प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। टी. स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया पीबीएस में एकत्र के निलंबन का उपयोग कर चरण 5.2.5 में यह सकारात्मक नियंत्रण R10 माध्यम के प्रभाव के बिना ट्राइकोडर्मा विकास के लिए एक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है कि कैसे कवक स्वाभाविक रूप से बढ़ता है. इस नियंत्रण का उपयोग करके, यह मूल्यांकन करना संभव है कि क्या R10 माध्यम ट्राइकोडर्मा विकास को प्रभावित करता है।
    6. हर दिन पीडीए में टी स्ट्रोमैटिकम के विकास कैनेटीक्स का निरीक्षण करें, और संस्कृति की तस्वीर लें।
    7. विश्लेषण: परिणामों का मूल्यांकन करने के लिए दो बिंदुओं का उपयोग किया जा सकता है: 1) संस्कृति के लिए संपूर्ण संस्कृति प्लेट पर कब्जा करने के लिए आवश्यक समय (दिनों में), और 2) समय (दिनों में) टी की विशेषता हरी रंजकता की उपस्थिति तक।

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. 8 समूहों / उपचारों के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर निर्धारित करने के लिए क्रुस्कल-वालिस परीक्षण का उपयोग करें। पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण मानें। सभी डेटा को मानक विचलन (एसडी) ± साधन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। आंकड़ों में, # पी < 0.05 पर सांख्यिकीय महत्व को इंगित करता है।

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Representative Results

मैक्रोफेज द्वारा फंगल कोनिडिया के फागोसाइटोसिस से जुड़ी तकनीक का व्यापक रूप से कवक के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के मॉड्यूलेशन का मूल्यांकन करने वाले अध्ययनों के लिए उपयोग किया जाता है। हमने फागोसाइटोसिस के बाद कोनिडिया की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए टी. स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया के फागोसाइटोसिस का उपयोग किया, क्योंकि फागोसाइटोसिस की चोरी और फागोसोम का पलायन फंगल विषाणु के तंत्र हैं। शोधकर्ताओं को नैदानिक रुचि की प्रजातियों की जांच करते समय इन तकनीकों को पहले परख में से एक के रूप में करना चाहिए।

Figure 2
चित्रा 2: मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर-व्युत्पन्न मैक्रोफेज द्वारा स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया का फागोसाइटोसिस "। फागोसाइटोसिस कैनेटीक्स (ए) के प्रतिनिधि परिणाम 40x और (बी) 100x उद्देश्यों के तहत पीबीएमसी व्युत्पन्न मैक्रोफेज दिखा रहे हैं जिसमें टी. स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया शामिल हैं। (सी) टी स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया मुक्त और बाहरी झिल्ली से जुड़ा हुआ; (डी) टी स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया पूरी तरह से मैक्रोफेज द्वारा आंतरिक; (ई) एक ऊपरी विमान में टी स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया; (एफ) एकाधिक फागोसाइटोसिस; और (जी) कोनिडिया अंकुरण अंदर (एच) और मैक्रोफेज के बाहर। तीर: पीला, मुक्त कोनिडिया; सफेद, बाहरी झिल्ली से जुड़ा कोनिडिया; काला, पूरी तरह से आंतरिक कोनिडिया; मैक्रोफेज के अंदर लाल, कोनिडिया अंकुरण। धराशायी तीर: काला, एकाधिक फागोसाइटोसिस; लाल, मैक्रोफेज के बाहर R10 माध्यम में अंकुरित होने वाला कोनिडिया; ऊपरी तल में सफेद, कोनिडिया। स्केल बार 20 माइक्रोन इंगित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 2 फागोसाइटोसिस कैनेटीक्स के प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है। फागोसाइटोसिस प्रक्रिया की शुरुआत में, मुक्त टी. स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया देखा जा सकता है, साथ ही मैक्रोफेज की बाहरी झिल्ली से जुड़ी कोनिडिया या उनके द्वारा पूरी तरह से आंतरिक(चित्रा 2ए-सी)। कम कोनिडिया को मुक्त देखा जा सकता है या फागोसाइटोसिस समय बढ़ने के साथ मैक्रोफेज की बाहरी झिल्ली से जुड़ा हुआ है।

विशेष रूप से, इस काम में, कोनिडिया को मुक्त पाया जा सकता है और फागोसाइटोसिस प्रक्रिया की शुरुआत में बाहरी झिल्ली (चित्रा 2सी) से जुड़ा हुआ है, मैक्रोफेज (चित्रा 2 डी) द्वारा पूरी तरह से आंतरिक, या मैक्रोफेज की तुलना में ऊपरी विमान में (चित्रा 2ई) लेकिन फागोसाइटेड नहीं, और एक से अधिक कोनिडियम एक ही मैक्रोफेज(चित्रा 2एफ)में पाया जा सकता है। लंबे समय (96 एच) के बाद, फागोसाइटोस्ड कोनिडिया मैक्रोफेज (चित्रा 2जी) के अंदर अंकुरित हो सकता है, और मुक्त कोनिडिया 37 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 2एच)पर हाइपहे बनाने के लिए आर 10 माध्यम में अंकुरित हो सकता है।

फागोसाइटोसिस के बाद, यह निरीक्षण करना संभव था कि टी. स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया मानव पीबीएमसी व्युत्पन्न मैक्रोफेज के साथ बातचीत के 120 घंटे के बाद भी व्यवहार्य रहा। प्रतिनिधि परिणाम बरामद कोनिडिया (चित्रा 3ए) की संस्कृति को दिखाते हैं और संस्कृति के लिए संपूर्ण संस्कृति प्लेट(चित्रा 3बी)पर कब्जा करने और रंगीन हरे कोनिडिया(चित्रा 3सी)बनाने के लिए आवश्यक समय (दिनों में) का प्रतिनिधित्व करते हैं। केवल असतत टी. स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया फागोसोम से बचने में सक्षम थे और मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर-व्युत्पन्न मैक्रोफेज29 के साइटोप्लाज्म में मुक्त पाए गए। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन और नाइट्रोजन प्रजातियों के उत्पादन को कम करने के लिए ट्राइकोडर्मा की क्षमता भी फागोसोम के अंदर कोनिडिया के अस्तित्व में योगदान कर सकती है और फागोसाइटोसिस 28,29,36 के बाद व्यवहार्यता की व्याख्या कर सकती है। अब तक, हमने दिखाया है कि फागोसाइटोस्ड कोनिडिया व्यवहार्य रहता है और 120h के बाद भी पीडीए माध्यम में बढ़ने में सक्षम है। अन्य सूक्ष्मजीवों को भी मैक्रोफेज द्वारा निगलने के बाद जीवित रहने की सूचना दी गई है, जैसे एस्परगिलस 27,37 और क्रिप्टोकोकस38।

Figure 3
चित्रा 3: मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर-व्युत्पन्न मैक्रोफेज की निकासी क्षमता टी स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया से संक्रमित। स्ट्रोमैटिकम कोनिडिया (3 एच, 24 एच, 48 एच, 72 एच, 96 एच, या 120 एच) के साथ एक चुनौती के बाद पीबीएमसी व्युत्पन्न मैक्रोफेज को lysed किया गया था, और फागोसाइटोस्ड कोनिडिया की व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए निलंबन को पीडीए में चढ़ाया गया था। (ए) पीबीएमसी व्युत्पन्न मैक्रोफेज द्वारा फागोसाइटोसिस के बाद टी स्ट्रोमैटिकम विकास के प्रतिनिधि परिणाम दिखाए जाते हैं। निगरानी (बी) टी. स्ट्रोमैटिकम विकास और (सी) पीबीएस में टी स्ट्रोमैटिकम के साथ सकारात्मक नियंत्रण के लिए अलग-अलग दिनों में शंकु (चरण 5.2.5 देखें), आर 10 माध्यम के लिए नियंत्रण (चरण 5.1.2 देखें), और अलग-अलग समय अवधि (3 एच, 24 एच, 48 एच, 72 एच, 96 एच, 120 एच) के लिए मैक्रोफेज द्वारा कोनिडिया फागोसाइटोज)। चार स्वस्थ दाताओं से प्रतिनिधि परिणाम। मानक विचलन (एसडी) ± माध्य। क्रुस्कल-वालिस परीक्षण। प्रतीक # p < 0.05, n = 4 पर महत्व को इंगित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एस्परगिलस फ्यूमिगेटस, क्रिप्टोकोकस, कैंडिडा अल्बिकन्स और अन्य सहित कई कवक रोगजनकों के लिए, शंकुधारी या खमीर फागोसाइटोसिस एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है जो मैक्रोफेज-रोगज़नक़ इंटरैक्शन में साइटोप्लाज्मिक और आणविक घटनाओं की जांच के लिए अनुमति देती है, साथ ही आंतरिक कोनिडिया 14,39,40 की मृत्यु के समय के निर्धारण के लिए। फागोसाइटोसिस ट्राइकोडर्मा-होस्ट इंटरैक्शन में महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। ट्राइकोडर्मा जीनस कई फागोसाइटोसिस मार्गों को संशोधित करता है, जिसमें डेक्टिन -1 और डेक्टिन -2, टोल-जैसे रिसेप्टर 2 और टोल-जैसे रिसेप्टर 4, एमएचसी और एनएफ-बी 25,28,41,42,43 शामिल हैं। ट्राइकोडर्मा समझौता किए गए और गैर-प्रतिरक्षाविज्ञानी व्यक्तियों में ट्राइकोडर्मोसिस का कारण बनताहै। महत्वपूर्ण रूप से, इस जीनस की कई प्रजातियों का उपयोग कृषि में किया जाता है और ट्राइकोडर्मोसिस का संभावित स्रोत हैं। स्ट्रोमैटिकम के विषाणु कारकों को समझना और इन कवक के खिलाफ मानव शरीर में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के तंत्र की तत्काल आवश्यकता है, क्योंकि ट्राइकोडर्मा प्रजातियों के कारण होने वाले व्यावसायिक खतरे, जिनमें टी.स्ट्रोमैटिकम भी शामिल हैं, खतरनाक रूप से बढ़ रहे हैं। यहां प्रस्तुत विधि मानव परिधीय रक्त-व्युत्पन्न मैक्रोफेज में ट्राइकोडर्मा-मैक्रोफेज इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए फागोसाइटोसिस और हत्या परख करने के लिए विवरण प्रदान करती है; हालांकि, इस पद्धति का उपयोग विभिन्न ऊतकों से मैक्रोफेज का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है, जिसमें वायुकोशीय पेरिटोनियल या वंश मैक्रोफेज शामिल हैं।

इस प्रोटोकॉल में पहला कदम कवक की ताजा संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए एक माँ स्टॉक (एम 1) निलंबन के साथ शुरू होता है। ट्राइकोडर्मा संस्कृतियां तेजी से बढ़ती हैं, क्योंकि वे आमतौर पर पूरी प्लेट पर कब्जा कर लेते हैं और 5 दिनों के भीतर हरे रंग का कोनिडिया दिखाना शुरू कर देते हैं। तापमान और प्रकाश ट्राइकोडर्मा विकास के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं, और इन कारकों में परिवर्तन ट्राइकोडर्मा के कैनेटीक्स को प्रभावित कर सकते हैं और प्रयोग44 से समझौता कर सकते हैं।

टी स्ट्रोमैटिकम संस्कृति धोने के बाद, 5-8 एमएल के बीच एक अंतिम मात्रा बरामद की जानी चाहिए। निलंबन की रंग तीव्रता कोनिडिया एकाग्रता के समानुपाती होती है। प्राप्त कोनिडिया निलंबन का उपयोग इन विट्रो और विवो परख के लिए किया जा सकता है, जैसे कि फागोसाइटोसिस26, न्यूट्रोफिल बाह्य कोशिकीय जाल28, इंट्रानैसल एक्सपोजर36,41, इंट्रापेरिटोनियल एक्सपोजर26, इंट्राक्यूटेनियस संक्रमण45, और अंतःशिरा संक्रमण46 का आकलन करने के लिए। मानव मैक्रोफेज के साथ किए गए पिछले शोध ने ट्राइकोडर्मा29 द्वारा प्रेरित ऑटोफैगी का मूल्यांकन किया है और न्यूट्रोफिल28 में बाह्य जाल के गठन को रोकने के लिए जीनस की क्षमता का मूल्यांकन किया है, जो फंगल रोगजनकों और अन्य सूक्ष्मजीवों को खत्म करने के लिए उपयोग किया जाने वाला तंत्र है।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए उपयोग किया जाने वाला संस्कृति माध्यम शंकुधारी अंकुरण(चित्रा 3जी,एच)को प्रभावित कर सकता है। अंकुरण एक विशेष प्रयोग के लिए वांछित नहीं है, तो हम उस विशेष माध्यम में ट्राइकोडर्मा के विकास कैनेटीक्स स्थापित करने के लिए सेल संस्कृति माध्यम के साथ एक प्रारंभिक स्क्रीनिंग परख प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं. यह परख वांछित सेल वंश के साथ इन विट्रो प्रयोगों में शुरू करने से पहले किया जाना चाहिए, और प्रयोग 72h के बाद बंद कर दिया जाना चाहिए अगर माध्यम संगत नहीं पाया जाता है. ट्राइकोडर्मा कोनिडिया (चित्रा 3 जी, एच) का अंकुरण मैक्रोफेज के अंदर और बाहर 96h से देखा जा सकता है।

जैसा कि ट्राइकोडर्मा प्रजातियां आकृति विज्ञान और उनके विकास के लिए इष्टतम तापमान और पीएच में अंतर पेश करती हैं, यहां प्रस्तुत परिणाम जीनस की सभी प्रजातियों के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं हो सकते हैं, और अन्य प्रजातियों के साथ प्रदर्शन किए जाने पर इस प्रोटोकॉल को अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। एक उदाहरण के रूप में, ट्राइकोडर्मा एस्पेरेलोइड्स कोनिडिया टी. स्ट्रोमैटिकम की तुलना में संस्कृति में अधिक तेज़ी से अंकुरित होता है।

पिछले प्रलेखित प्रोटोकॉल फागोसाइटोसिस और प्रवाह साइटोमेट्री और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग रोगज़नक़ की हत्या का मूल्यांकन करने के लिए महंगा अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है, लेकिन वे फागोसाइटोसिस प्रक्रिया19 के बारे में विशिष्ट जानकारी प्रदान करते हैं. इस आलेख में प्रस्तुत प्रोटोकॉल केवल एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप और थाली विकास फागोसाइटोसिस का मूल्यांकन करने के लिए और फागोसाइटोसिस प्रक्रिया की व्यापक छवियों प्रदान करता है की आवश्यकता है. विभिन्न प्रोटोकॉल विभेदित मैक्रोफेज प्राप्त करने और मैक्रोफेज lysis प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन प्रोटोकॉल के बजाय मैक्रोफेज भेदभाव के लिए अलग अलग समय का उपयोग शामिल 7 दिनों यहाँ26 या 2.5% deoxycholate47 का उपयोग 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 30 मिनट के लिए आसुत जल के बजाय मैक्रोफेज lyse करने के लिए, के रूप में इस प्रोटोकॉल में यहाँ इस्तेमाल किया. इन विधियों को विभिन्न कवक प्रजातियों जैसे ए. फ्यूमिगेटस27, ए. निडुलन्स18, और क्रिप्टोकोकस नियोफ़ॉर्मन्स15 के लिए प्रभावी ढंग से उपयोग किया गया है।

इस प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं पीबीएस के उपयोग से संबंधित हैं जो एंडोटॉक्सिन मुक्त नहीं है, गोल ग्लास कवरस्लिप का उपयोग, और मानव रक्त का उपयोग। हम कोशिकाओं पर पीबीएस (एंडोटॉक्सिन मुक्त नहीं) का परीक्षण करने की सलाह देते हैं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह मोनोसाइट्स को सक्रिय नहीं कर सकता है और प्रयोग को पूर्वाग्रह नहीं दे सकता है। गोल ग्लास coverslips का उपयोग धुंधला और कोशिकाओं की गिनती के लिए बहुत उपयोगी है, लेकिन कोशिकाओं को स्लाइड के तहत समान रूप से फैल नहीं सकता है, के रूप में कुछ कोशिकाओं को अच्छी तरह से थाली के किनारे करने के लिए माइग्रेट और इस अंतर दौर गिलास coverslips में अनुमानित कुल सेल संख्या पर एक प्रभाव हो सकता है. जैसा कि हम इस प्रोटोकॉल में इम्यूनोफ्लोरेसेंस या इसी तरह की तकनीकों का उपयोग नहीं करते हैं, मैक्रोफेज की तुलना में ऊपरी विमान में गैर-फागोसाइटोस्ड कोनिडिया की उपस्थिति से फागोसाइटोसिस परिणामों की गलत व्याख्या हो सकती है। जैसा कि हम मानव दाताओं से रक्त का उपयोग करते हैं, अंतिम पीबीएमसी गिनती दाताओं के बीच भिन्न होती है, और कम दाता सेल गिनती सभी प्रयोगों के लिए पर्याप्त नहीं हो सकती है।

सारांश में, इन तकनीकों का उपयोग मैक्रोफेज और फंगल क्लीयरेंस के कार्य को मापने के लिए किया जा सकता है, विशेष रूप से फिलामेंटस कवक जैसे ट्राइकोडर्मा और अन्य रोगाणुओं, जैसे खमीर और बैक्टीरिया के लिए। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल isogenic पशु मॉडल या सेल लाइनों का उपयोग कर नहीं देखा जा सकता है जो मानव आबादी में conidia बनाने कवक के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में वास्तविक परिवर्तनशीलता का अध्ययन करने के लिए भविष्य के दिशा-निर्देश प्रदान करता है.

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Disclosures

सभी लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस काम को निम्नलिखित ब्राज़ीलियाई वित्तपोषण संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) RED0011/2012 और RED008/2014 के अनुदान के साथ। U.R.S., J.O.C., और M.E.S.M. क्रमशः Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) और FAPESB द्वारा दी गई छात्रवृत्ति को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tubes Corning CLS431470 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate Kasvi K12-024 Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator Sanyo 303082 A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL Capp 5101500 Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm Olen K5-0015 Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets Esco Lifesciences group 2010274 Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium Merck 145 Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube FirstLab FL5-1109L EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan Merck 1.07961  Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum Gibco A2720801 Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon  database of images
Glycerol Merck 24900988 The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077 polysucrose solution
Image J  Image analysis software
Microscopy slides Precision 7105 Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge Prism C1801 The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber Kasvi K5-0011 The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast  Laborclin 620529 Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution - 10,000U LGC- Biotechnology  BR3011001 antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth Cralplast 18248 Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS) thermo fisher Scientific 10010001 PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile Accumax AP-3-B-S STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge Thermo Scientific TS-HM16R The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium Merck MFCD00217820 HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes Eppendorf Z683809 Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor Corning 4894 Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope LABOMED VU-7125500 It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.

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References

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