Summary
マクロファージによる真菌分生子の食作用を含む技術は、真菌に対する免疫応答の調節を評価する研究に広く使用されています。この原稿の目的は、 Trichoderma stromaticum conidiaで刺激されたヒト末梢血単核由来マクロファージの食作用とクリアランス能力を評価する方法を提示することです。
Abstract
マクロファージは重要な防衛線であり、さまざまな組織における病原体の増殖とコロニー形成を防ぐ役割を担っています。分生子食作用は、マクロファージと病原体の相互作用に関与する細胞質および分子イベントの調査、および内在化された分生子の死亡時期の決定を可能にする重要なプロセスです。マクロファージによる真菌分生子の食作用を含む技術は、真菌に対する免疫応答の調節を評価する研究に広く使用されています。食作用の回避とファゴソームの脱出は、真菌の病原性のメカニズムです。本稿では、生物防除・バイオ肥料剤として利用され、ヒトへの感染を誘発する真菌である T. stromaticum conidiaの食作用、クリアランス、生存率の解析に用いる手法について報告する。プロトコルは、1) トリコデルマ 培養、2)分生子を得るための洗浄、3)ポリスクロース溶液法を使用した末梢血単核細胞(PBMC)の隔離とマクロファージへのPBMCの微分、4)丸いガラスカバースリップと着色を使用した 生体外 食作用法、および5)分生子食作用後の分生子の生存率を評価するためのクリアランスアッセイで構成されています。要約すると、これらの技術は、マクロファージの真菌クリアランス効率を測定するために使用できます。
Introduction
トリコデルマ属(目:Hypocreales、科:Hypocreaceae)は、他の真菌種の寄生虫であり、商業的に有用な酵素の範囲を生産することができる遍在する腐生菌で構成されています1。これらの真菌種は、異種タンパク質の生産2、セルロース3、エタノール、ビール、ワイン、紙の生産4、繊維産業5、食品産業6、農業の生物的防除剤7,8として使用されています。これらの真菌種に対する産業上の関心に加えて、ヒトにおける感染数の増加により、一部のトリコデルマ種は日和見病原体の地位を得ています9。
Trichoderma spp.は培養で急速に成長し、最初は白と綿のコロニーが緑がかった黄色から濃い緑色に変わります10。それらは広範囲のpHおよび温度条件で生息するように適応しており、日和見種は生理学的pHおよび温度で生き残ることができるため、さまざまなヒト組織にコロニーを形成します11,12,13。重要なことは、トリコデルマ属菌の感染率の上昇は病原性因子と関連している可能性があり、これらは十分に研究されていないことです。さらに、日和見トリコデルマ種に対する免疫応答の理解に焦点を当てた研究はまだまれです。
感染中、好中球とともに、マクロファージは食作用の原因となる防御線を表し、したがって、異なる組織における病原体の増殖およびコロニー形成を防止する。Toll様受容体やC型レクチン受容体などのパターン認識受容体を用いて、マクロファージは貪食菌をファゴリソソームに加工し、呼吸バースト、炎症誘発性サイトカインの放出、および食作用微生物の破壊を促進する14。しかし、食作用のメカニズムは、真菌細胞のサイズや形状など、さまざまな微生物戦略の影響を受け、回避される可能性があります。食作用を妨げるカプセルの存在。食作用誘導受容体の数を減少させる。細胞質におけるアクチン線維の構造のリモデリング。仮足の形成を妨げる。ファゴソームまたはファゴリソソームは、食作用プロセス後に脱出する14。
クリプトコッカス・ネオフォルマンスを含む多くの病原体は、マクロファージをニッチとして利用し、宿主内で生存し、播種し、感染を誘発する15。食作用およびクリアランスアッセイは、病原体に対する免疫応答を評価し、自然免疫系を回避するために採用された微生物戦略を特定するために使用されます15,16,17。この種の手法は、真菌の殺傷を減少させる食作用、ファゴソームの酸性化の遅延、および酸化的バーストの動態の違いを調べるためにも使用できます18。
貪食、真菌の生存、およびファゴソーム成熟過程の回避を評価するために、さまざまな方法を使用することができる。これらには、貪食、細胞位置、および食作用中に生成される分子を観察するために使用される蛍光顕微鏡法が含まれます19。フローサイトメトリーは、食作用に関する定量的データを提供し、プロセスに関与するさまざまなマーカーを評価するために使用されます20,21。生体内顕微鏡検査は、微生物の捕捉とファゴソームの成熟を評価するために使用されます22。病原体の食作用過程の特異性を評価するために使用される抗体媒介性食作用23;その他24,25,26,27。
ここに示されるプロトコルは真菌の分生子の食作用そして殺害を評価するのに光学顕微鏡および版の成長の試金を使用して共通の、安価、および直接方法を採用する。このプロトコルは、T. stromaticumに曝露されたヒト末梢血単核由来マクロファージを使用して食作用およびクリアランスアッセイを行うためのステップバイステップの指示を読者に提供します。PBMCが使用されたのは、トリコデルマ分生子が植物病原体に対する生物防除および植物作物のバイオ肥料として世界中で適用されており、トリコデルモ症と呼ばれるいくつかのヒト感染症を引き起こしているためです。それ以外に、トリコデルマ分生子とヒトの免疫系との相互作用に焦点を当てた先行研究は2つしかなく、マクロファージの好中球28とオートファジー29を調べました。本稿では、まずPBMC由来のマクロファージによるT. stromaticumの分生子の貪食を研究し、次に、巻き込まれた分生子の生存率を簡単な顕微鏡ベースの技術を用いて評価する方法を示します。このプロトコルは、マクロファージ関連の免疫応答または免疫系の調節関連メカニズムの研究をさらに促進する可能性があります。
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Protocol
倫理的配慮と人間的対象
この研究で説明されている人間を用いたすべての実験は、ヘルシンキ宣言およびブラジル連邦法に従って実施され、サンタクルス州立大学の倫理委員会(プロジェクト識別コード:550.382 / 2014)によって承認されました。
ヒト末梢血は、ブラジルのバイーア州イリェウス市の健康なボランティアから収集され、研究された真菌に関連する職業活動にさらされていません。健康状態が報告されている、または薬を使用している個人は除外されました。すべての被験者は自発的に参加することに同意し、この研究に含める前にインフォームドコンセントフォームに署名しました。
1. 試薬・溶液の調製
注:先に進む前に、以下の試薬と溶液を調製してください。試薬および材料サプライヤー情報については、 材料表 (TOM)を参照してください。
- バランスの取れた滅菌リン酸緩衝生理食塩水1x(PBS)を調製します。
注:このプロトコルでは、エンドトキシンフリーPBSは使用されませんでした。 - ジャガイモデキストロース寒天(PDA)培地を調製し、 T. stromaticum 培養用の各ペトリ皿に20 mLを注ぎます。ドナーごとにPDAを含むプレートを6枚用意し、3時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間ごとに1枚のプレートを使用します。さらに、各コントロールに3枚のプレート( トリコデルマ コントロールに3枚、R10ミディアムコントロールに3枚)を使用します。60 mm x 15 mmまたは100 mm x 15 mmのペトリ皿を使用して、分生子を最適に回収してください。
- 100%グリセロールを滅菌します。
- 細胞培養用のR10培地を調製します:10%ウシ胎児血清と1%抗生物質(ペニシリン/ストレプトマイシン)を添加したRPMI培地。
- 細胞溶解のために蒸留水を滅菌します。
- 着色プロセスのためにpH7.0の水を準備します。
注:必要に応じて、pH メーターと 0.1 M/L NaOH および 0.1 M/L HCl の溶液を使用して pH を調整します。 - 丸いガラスカバーガラス(13 mm)とピンセットを滅菌します。
2. Trichoderma stromaticumの培養と加工
- T. stromaticumの母株(M1)の調製:
注:すべての実験が同じ新世代(F1)の培養物から行われるようにするには、マザーストック(M1)が必要です。- 分生子が観察され、培養物が緑色に変わるまで、暗所で28°CのPDAを使用して7〜10日間、ペトリ皿で T.stromaticum 接種菌を増殖させます。
- T. stromaticumの培養液を洗浄します。ピペットを使用して培養表面に3〜5 mLのPBSを加えます。プレートからPBSを回収し、再び培養液に分注し、ピペットを使用して分生子を徐々に除去します。サスペンションが濃い緑色に変わるまで、このプロセスを必要なだけ繰り返します。
注:あるいは、3〜5 mLのPBSをプレートに加え、懸濁液が緑色に変わるまで円を描くように動かして分生子を回収し、培養物を穏やかに洗浄することをお勧めします。ピペッティングを繰り返すことで、より多くの分生子を採取することができます。 - 回収した懸濁液をプレートからピペットで15 mLの滅菌チューブに移します。手順2.1.2〜2.1.3を必要な回数だけ繰り返して、より多くの分生子を取得します。
- 懸濁液を1,160 x g で12°Cで5分間遠心分離し、ペレットを5 mLのPBSに再懸濁します。この手順(2.1.4)を3回繰り返して、菌糸のない懸濁液を取得します。
注:遠心分離後にペレットを適切に再懸濁するには、短時間のボルテックスをお勧めします。 - 最終ペレットを2〜3 mLのPBSに再懸濁し、1:100または1:1,000の希釈液を使用してノイバウアーチャンバーで分生子をカウントします。
注:最適な条件では、2 x 108 分生子/mLの最終濃度を培養物から回収できます。 トリパンブルー除外法を使用した分生子の生存率の評価はオプションです。 - 各チューブに分生子懸濁液(ステップ2.1.5から)0.5 mLを加えて、懸濁液を1.5 mL滅菌チューブに分注します。次に、0.5 mL の滅菌済み 100% グリセロールを添加して M1 ストックを得ます。ボルテックスを短時間観察し、チューブを特定し、-20°Cまたは-80°Cで保存します。
- T. stromaticumの培養と実験のための分生子の取得
- M1懸濁液(ステップ2.1で調製)10μLをPDAにプレートし、分生子が観察され、培養物が緑色に変わるまで、暗所で28°Cで7〜10日間、新鮮なF1生成を得る。
注:実験用の新鮮な T.ストロマティカム 培養を確実にするために、真菌の増殖に必要な時間とマクロファージの分化に必要な時間を評価します。 - 手順2.1.2-2.1.4を繰り返して、分生子を収集します。
- 最終ペレットを2〜3 mLのPBSに再懸濁します。トリパンブルー除外法を使用して分生子の生存率を評価するか、ステップ2.1.5で説明したように分生子をカウントします。
- M1懸濁液(ステップ2.1で調製)10μLをPDAにプレートし、分生子が観察され、培養物が緑色に変わるまで、暗所で28°Cで7〜10日間、新鮮なF1生成を得る。
3.末梢血単核細胞(PBMC)の分離
注:PBMC は、密度 1.077 g/mL30 のポリスクロース溶液を使用した密度バリア法によって得られます。
- 採取するドナーサンプルごとに、15 mL のポリスクロース溶液を 1 本の 50 mL チューブに分注します。
- 3〜4本のEDTAチューブを使用して、各ドナーから20 mLの血液を採取します。実験ごとに最低 4 人のドナーを募集します。ドナーの血液をプールしないでください。代わりに、各サンプルを生物学的複製として別々に使用してください。ドナーごとに、血液を1本の50 mLチューブに移し、PBSを添加して最終容量の35 mLにします。
- 血液懸濁液(ステップ3.2)をポリスクロース溶液を含むチューブの壁に沿ってゆっくりと移し(ステップ3.1)、二相性懸濁液を形成します。
注意: ポリスクロース溶液と血液の混合を防ぐために、血液をゆっくりと加えてください。PBMCの分離には、各ドナーから最低7 mLの血液を使用することをお勧めします。 - 二相性懸濁液の入ったチューブを1,600 x g で直ちに遠心分離し、24°Cで30分間加熱します。 PBMC の遠心分離をプログラムする: 遠心分離が突然停止しないように、加速度 1 と減速 0 を使用します。
- 遠心分離後にPBMCを含む白いリングが形成されるのを観察します。赤血球と顆粒球は下層に存在し、次の層にはポリスクロース溶液が含まれ、PBMCはポリスクロース溶液と血漿の間の白いリング(上層)に存在します。赤血球、血漿、またはポリスクロース溶液をキャッチしないように、ピペットまたは滅菌パスツールピペットを使用して穏やかに吸引して白いリングを回収し、1本の15 mLチューブに移します。
- PBMC を含む 15 mL チューブに PBS を添加し、最終容量 10 mL にします。懸濁液を均質化し、チューブを 1,600 x g で 24 °C で 30 分間遠心分離します。
- 1,600 x g で 24 °C で 5 分間、10 mL の PBS で細胞を 3 回洗浄します。次に、最終ペレットを2 mLのR10培地に再懸濁します。
- トリパンブルー排除法を用いて細胞生存率を評価し、ノイバウアーチャンバー内の細胞をカウントします。
4. 食作用態
注:ヒト末梢血単核由来マクロファージは、T . stromaticum conidiaで1:10の感染多重度(MOI)または対照としてR10培地のみで処理されます。感染の多重度(MOI)は、感染ターゲットに追加される感染性病原体の比率を表し、絶対数で表されます:MOI = agents:targets31。ここでは、10個のマクロファージ(標的)に対して1 T. stromaticum conidia (薬剤)を使用します。次に、細胞を37°Cおよび5%CO2 で異なる期間(3時間、24時間、48時間、72時間、96時間、および120時間)インキュベートします。次に、丸いガラスのカバーガラスを使用して、食作用プロセスに関与する付着マクロファージを顕微鏡で視覚化します。実験計画図が提供されています(図1)。
注:24ウェルプレートの使用をお勧めします。
- T. stromaticum conidiaによるヒト由来マクロファージの処理
- 滅菌ピンセットを使用して、滅菌済みの丸いガラスカバーガラス(13 mm)を各ウェルに追加します。
- ステップ3.7〜3.8で得られた細胞懸濁液の容量を調整して、R10培地で最終容量1mLになるようにウェルあたり8 x 105 細胞を播種します。倒立顕微鏡を使用して、細胞の形態を評価します。
注:細胞は培地に懸濁され、丸みを帯びた形態を持っている必要があります。 - 細胞を5%CO2 雰囲気下で37°Cで7日間インキュベートし、単球をマクロファージに分化させるために、2日ごとに培地を新しいR10培地と交換します32。倒立顕微鏡で細胞の形態を観察します。マクロファージは、扁平で伸びた形状の紡錘状の形態を示します。細胞質化比の増加および仮足の存在も観察することができる。付着した単核由来のマクロファージを探します。
注:未分化な単球のごく一部が培地に懸濁したままである可能性があります。 - ピペットを使用して各ウェルの培地を除去し、1 mLのPBSで細胞を洗浄して、破片や非接着細胞を除去します。
- ステップ2.2で調製した懸濁液を使用して、R10培地中で最終濃度8 x 104分生子/mLのT. stromaticum conidiaの新しい懸濁液を調製します。
- ステップ4.1.5で調製した分生子懸濁液1 mLを各処理ウェル(3時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間)に加え、MOIが1:10になる。コントロールには、1 mLのR10培地のみをウェルに加えます。
- T. stromaticum conidiaを用いて、5% CO2雰囲気下で37°Cでマクロファージに3時間挑戦します。3時間後、培地を除去し、細胞を洗浄して、貪食されていない分生子を除去します。
- 各ウェルに R10 培地 1 mL を加え、プレートを 5% CO2 雰囲気下で 37 °C で異なる時間(3 時間、24 時間、48 時間、72 時間、96 時間、120 時間)インキュベートします。
- 着色と分析
- 対応するインキュベーション(ステップ4.1.8)が完了したら、各ウェルから培地を取り出し、そのウェルに1 mLのPBSを加えます。
- 滅菌ピンセットと染色キットで着色するための針を使用して、丸いガラスのカバーガラスをウェルから取り外します。
注:あるいは、May Grünwald-Giemsa染色試着33を使用して染色することもできます。 - 丸いガラスカバーガラスのそれぞれに、染色キットの成分である染色固定具(5秒)、染料1(5秒)、染料2(2秒)、および緩衝水pH7.0(5秒)を追加します。カバーガラスが乾くまで待ち、封入剤を使用してスライドガラスにカバーガラスを固定します。
- 結果を定量化する:時間条件ごとに合計100個のマクロファージ(Mø)をカウントします。光学顕微鏡を用いて、100倍の対物レンズと浸漬油を用いて、分生子を貪食したマクロファージの数を数えます(式[1])。
(1) - マクロファージごとに貪食された分生子の数を得る:100個のマクロファージに存在する分生子をマクロファージの数で割ったものを、少なくとも1つの食作用のある分生子と相関させる(式[2])34。
(2)
注:分生子を評価およびカウントするには、ImageJソフトウェアを使用できます35。 - 40倍と100倍の対物レンズを使用して、各サンプルと時間条件から食作用を撮影し、結果を提示します。
(1)
(2)
図1:ヒト末梢血単核由来マクロファージを用いた食作用および分生子生存率アッセイの模式図。 (1-10)食作用アッセイ:T. stromaticumはPDAで増殖させる必要があり、分生子はPBSでプレートを洗浄することによって回収されます。PBMCは、記載されたプロトコルを使用して密度バリア法で単離し、マクロファージに分化させるために滅菌済みの丸いガラスカバーガラスを備えた24ウェルプレートで7日間培養し、その後、異なる時間間隔で1:10のMOIで処理する必要があります。丸いガラスカバーガラスを除去し、染色キットで染色し、その結果を光学顕微鏡で分析します。(1-8,11-13)分生子生存率アッセイ:単離後、PBMCを丸いガラスカバーガラスのない24ウェルプレートで7日間培養してマクロファージに分化させ、その後、異なる時間間隔で1:10のMOIで処理します。細胞は蒸留水とのインキュベーションによって溶解されなければなりません。次に、懸濁液を遠心分離し、再懸濁したペレットをPDAに播種して、トリコデルマの増殖速度を分析します。この図は、画像のデータベースを使用して設計されました。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
5. 食作用後の分生子生存率アッセイ
注:実験計画図が提供されています(図1)。
注:24ウェルプレートを使用してください。
- T. stromaticum conidiaでヒト由来のマクロファージに挑戦します。
- 手順4.1.2〜4.1.8を繰り返して単球を分化し、マクロファージを T.stromaticum分 生子で処理します。
注意: ウェルに丸いガラスのカバーガラスを使用しないでください。食作用速度論のアッセイに使用したのと同じ時間間隔を使用して、食作用を分生子の生存率と相関させることができます。 - ステップ4.1.5で調製した懸濁液(R10培地+分生子)を対照としてウェルを使用して、 T.stromaticum の成長に対するR10培地の影響を評価します。
- 手順4.1.2〜4.1.8を繰り返して単球を分化し、マクロファージを T.stromaticum分 生子で処理します。
- 分生子生存率アッセイ
- 各インキュベーション期間(3時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間)後に培地を除去し、細胞をPBSで2回洗浄して、貪食されていない分生子を除去します。
注意: R10培地+分生子を含むコントロールは洗浄しないでください。 - 各ウェルに0.5 mLの滅菌蒸留水を加え、プレートを37°C、5%CO2 で30分間インキュベートします。この後、倒立顕微鏡で細胞の形態を観察し、細胞が溶解していることを確認します。
- 懸濁液を回収し、1.5 mLチューブに移します。懸濁液を6,000 x g のミニ遠心分離機で室温で5分間遠心分離します。
- 上澄み液を慎重に廃棄し、ペレットを10μLの滅菌蒸留水に再懸濁し、10μLの懸濁液を暗所で28°CのPDA含有プレートに接種する。
- T. stromaticum 増殖のポジティブコントロールを調製する:T. stromaticum 分生子の懸濁液(ステップ 2.2)を使用して、最終濃度が 8 x 106 分生子/mL の新しい懸濁液を調製します。この懸濁液10 μLをPDAに28°Cで暗所でプレートします。
注:この懸濁液の10 μLには、血中単核由来マクロファージに感染するために使用されたのと同じ数の分生子(8 x 104)が含まれます。.このポジティブコントロールとステップ5.1.2で述べたコントロールとの違いは、ステップ5.1.2で述べたコントロールが、食作用時の トリコデルマ 増殖に対するR10培地の影響の可能性を評価するために使用されることです。PBSで採取された T. stromaticum conidiaの懸濁液を用いたステップ5.2.5のこのポジティブコントロールは、真菌が自然に増殖する方法を反映するために、R10培地の影響を受けずに トリコデルマ 増殖のコントロールを表しています。このコントロールを使用して、R10培地が トリコデルマ の増殖に影響を与えるかどうかを評価することができます。 - PDA中のT. stromaticumの成長動態を毎日観察し、培養を写真に収めます。
- 分析:1)培養が培養プレート全体を占めるのに必要な時間(日数)、および2)培養中に T.stromaticum 分生子の特徴的な緑色の色素沈着が出現するまでの時間(日数)の2つのポイントを使用して結果を評価できます。
- 各インキュベーション期間(3時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間)後に培地を除去し、細胞をPBSで2回洗浄して、貪食されていない分生子を除去します。
6. 統計解析
- Kruskal-Wallis検定を使用して、8つのグループ/処理間の統計的に有意な差を決定します。 p < 0.05 を統計的に有意なものと考えます。すべてのデータは、標準偏差 (SD) ±平均として表示されます。図中、#は p <0.05での統計的有意性を示しています。
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Representative Results
マクロファージによる真菌分生子の食作用を含む技術は、真菌に対する免疫応答の調節を評価する研究に広く使用されています。貪食の回避とファゴソームの脱出は真菌の病原性のメカニズムであるため、 T. stromaticum 分生子の食作用を用いて、食作用後の分生子の生存率を評価した。研究者は、臨床的に関心のある種を調査する際に、最初のアッセイの1つとしてこれらの手法を実行する必要があります。
図2:ヒト末梢血単核由来マクロファージによるT. stromaticum conidiaの貪食。(A)40倍以下、(B)100倍対物レンズの食作用態の代表的な結果から、T. stromaticum conidiaを含むPBMC由来のマクロファージが示されました。(C)T. stromaticum 分生子が遊離し、外膜に付着している。(D)マクロファージによって完全に内在化されたT. stromaticum conidia;(E)上面のT. stromaticum 分生子;(f)多発性食作用;(G)マクロファージの内側と外側の分生子の発芽。矢印:黄色、自由分生子。白、分生子が外膜に付着している。黒く、完全に内在化された分生子。赤、マクロファージ内の分生子の発芽。破線の矢印:黒色、多発性食作用;赤、マクロファージの外側のR10培地で発芽する分生子。白、上面に分生子。スケールバーは20μmを示しています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2に食作用動態の代表的な結果を示します。食作用プロセスの開始時には、遊離T.ストロマティカム分生子、およびマクロファージの外膜に付着した分生子、またはそれらによって完全に取り込まれた分生子が観察されます(図2A-C)。貪食時間が長くなるにつれて、マクロファージの外膜に付着した分生子が少なくなります。
注目すべきは、この研究では、分生子が遊離して外膜に付着していること(図2C)、マクロファージによって完全に内在化されている(図2D)、またはマクロファージと比較して上面にある(図2E)が貪食されていないこと、および同じマクロファージに複数の分生子が見つかったことです(図2F)。長時間(96時間)後、貪食された分生子がマクロファージ内で発芽し(図2G)、遊離分生子がR10培地で発芽して37°Cで菌糸を形成します(図2H)。
食作用後、T. stromaticum 分生子は、ヒトPBMC由来のマクロファージと120時間相互作用した後でも生存可能であることを観察することができました。代表的な結果は、回収された分生子の培養(図3A)を示し、培養物が培養プレート全体を占め(図3B)、緑色の分生子を形成するのに必要な時間(日数)を表しています(図3C)。離散的なT. stromaticum 分生子のみがファゴソームを回避し、ヒト末梢血単核由来マクロファージの細胞質に遊離して発見することができた29。活性酸素と窒素種の産生を減少させるトリコデルマの能力も、ファゴソーム内の分生子の生存に寄与し、食作用後の生存率を説明する可能性があります28,29,36。これまでのところ、貪食された分生子は生存可能であり、120時間後でもPDA培地で増殖できることを示しました。他の微生物も、アスペルギルス27,37やクリプトコッカス38など、マクロファージに飲み込まれた後も生き残ることが報告されています。
図3:T. stromaticum conidiaに感染したヒト末梢血単核由来マクロファージのクリアランス能力。 T. stromaticum 分生子(3時間、24時間、48時間、72時間、96時間、または120時間)で試射した後、PBMC由来のマクロファージを溶解し、懸濁液をPDAに播種して、食作用した分生子の生存率を評価しました。(A)PBMC由来マクロファージによる貪食後のT. stromaticum増殖の代表的な結果を示す。(B)PBS中のT.stromaticumによるポジティブコントロール(ステップ5.2.5を参照)、R10培地のコントロール(ステップ5.1.2を参照)、および異なる期間(3時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間)のマクロファージによる分生子貪食の異なる日のT.stromaticumの成長と(C)分生子のモニタリング。4人の健康なドナーからの代表的な結果。標準偏差±平均値 (SD)。Kruskal-Wallis検定。記号 # は、p < 0.05、n = 4 での有意性を示します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
Aspergillus fumigatus、Cryptococcus、Candida albicansなどのいくつかの真菌病原体にとって、分生子または酵母の食作用は、マクロファージと病原体の相互作用における細胞質および分子イベントの調査、および内在化された分生子の死亡時期の決定を可能にする重要なプロセスです14,39,40。食作用は、トリコデルマと宿主の相互作用における重要なプロセスです。トリコデルマ属は、デクチン-1およびデクチン-2、Toll様受容体2およびToll様受容体4、MHC、およびNF-κB 25,28,41,42,43を含むいくつかの食作用経路を調節する。トリコデルマは、免疫不全の人と免疫不全でない人にトリコデルモスを引き起こします9。重要なことに、この属のいくつかの種は農業に使用されており、トリコデルモ症の潜在的な原因です。T. stromaticum の病原性因子と、これらの真菌に対する人体の免疫応答のメカニズムを理解することは、T. stromaticum を含むトリコデルマ種によって引き起こされる職業上の危険が憂慮すべきほど増加しているため、緊急に必要とされています。ここで紹介する方法は、ヒト末梢血由来マクロファージにおけるトリコデルマとマクロファージの相互作用を研究するための食作用および殺傷アッセイを実施するための詳細を提供します。ただし、この方法は、肺胞マクロファージ、腹膜マクロファージ、系統マクロファージなど、さまざまな組織由来のマクロファージの研究にも使用できます。
このプロトコルの最初のステップは、真菌の新鮮な培養物を得るための母株(M1)懸濁液から始まります。 トリコデルマ 培養物は、通常プレート全体を引き継ぎ、5日以内に緑色の分生子を示し始めるため、急速に成長します。温度と光は トリコデルマ の成長にとって重要な要素であり、これらの要因の変化は トリコデルマ の動態に影響を与え、実験を損なう可能性があります44。
T. stromaticum培養物を洗浄した後、5〜8 mLの最終容量を回収する必要があります。懸濁液の色の濃さは分生子濃度に比例します。得られた分生子懸濁液は、食作用26、好中球細胞外トラップ28、鼻腔内曝露36,41、腹腔内曝露26、皮内感染45、および静脈内感染46の評価などのin vitroおよびin vivoアッセイに用いることができる。ヒトマクロファージを用いたこれまでの研究では、トリコデルマ29によって誘導されるオートファジーと、好中球における細胞外トラップの形成を阻害するトリコデルマ属の能力28(真菌病原体やその他の微生物を排除するメカニズム)が評価されてきた。
細胞の維持に使用される培地は、分生子の発芽に影響を与える可能性があることに注意することが重要です(図3G、H)。特定の実験で発芽が望ましくない場合は、細胞培養培地で初期スクリーニングアッセイを実施して、その特定の培地でのトリコデルマの増殖速度を確立することをお勧めします。このアッセイは、目的の細胞系譜でin vitro実験を開始する前に実施する必要があり、培地が適合しないことが判明した場合は、72時間後に実験を中止する必要があります。トリコデルマ分生子(図3G,H)の発芽は、マクロファージの内側と外側の96時間から観察することができます。
Trichoderma種が形態および成長のための最適温度およびpHの相違を示すので、ここに示される結果は属のすべての種のために再現可能ではないかもしれないし、このプロトコルは他の種と行なわれるとき適応を必要とするかもしれない。一例として、Trichoderma asperelloides conidiaは、T. stromaticumのものよりも培養でより早く発芽します。
フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡を用いて食作用および病原体の死滅を評価するための以前に文書化されたプロトコルは、高価な試薬を必要とするが、それらは食作用プロセスに関する特定の情報を提供する19。この記事で紹介するプロトコルは、食作用を評価するために光学顕微鏡とプレート成長のみを必要とし、食作用プロセスの包括的な画像を提供します。異なるプロトコルを使用して、分化したマクロファージを取得し、マクロファージ溶解を誘導することができます。これらのプロトコルには、マクロファージの分化に異なる時間を使用することが含まれます ここで使用される7日間26 または、このプロトコルでここに使用されるように、37 °C で蒸留水と 5% CO2 の代わりにマクロファージを溶解するための 2.5% デオキシコール酸47 の使用。これらの方法は、A. fumigatus27、A. nidulans18、Cryptococcus neoformans15 など、さまざまな真菌種に効果的に使用されています。
このプロトコルのいくつかの制限は、エンドトキシンフリーではないPBSの使用、丸いガラスカバースリップの使用、およびヒト血液の使用に関連しています。PBS(エンドトキシンフリーではない)を細胞でテストして、単球を活性化して実験にバイアスがかからないことを確認することをお勧めします。丸いガラスカバーガラスの使用は、細胞の染色とカウントに非常に便利ですが、一部の細胞がプレートの端にうまく移動するため、細胞がスライドの下に均一に広がらない可能性があり、この違いは、丸いガラスカバーガラスの推定総細胞数に影響を与える可能性があります。このプロトコルでは免疫蛍光法または同様の技術を使用していないため、マクロファージと比較して上面に貪食されていない分生子が存在すると、食作用の結果が誤って解釈される可能性があります。ヒトドナー由来の血液を使用するため、最終的なPBMC数はドナーによって異なり、ドナー細胞数が少ないだけではすべての実験に十分ではない場合があります。
要約すると、これらの技術は、特に トリコデルマ などの糸状菌や酵母や細菌などの他の微生物について、マクロファージの機能および真菌クリアランスを測定するために使用することができる。なお、このプロトコルはisogenic動物モデルかセルラインを使用して観察することができない人間の集団の分生子形成菌類に対する免疫応答の実質の変動を調査するための未来の方向を提供する。
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Disclosures
すべての著者は、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
この活動は、ブラジルの金融機関であるFundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia(FAPESB)の助成を受け、2012年RED0011および2014年RED008が助成されました。U.R.S.、J.O.C.、およびMESMは、それぞれCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior(CAPES)とFAPESBによって付与された奨学金を認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | CLS431470 | 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile |
| 24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate | Kasvi | K12-024 | Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation; |
| Cell culture CO2 incubator | Sanyo | 303082 | A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types. |
| Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL | Capp | 5101500 | Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens |
| Circular coverslip 15 mm | Olen | K5-0015 | Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm |
| Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets | Esco Lifesciences group | 2010274 | Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface. |
| Dextrose Potato Agar medium | Merck | 145 | Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi |
| EDTA vacuum blood collection tube | FirstLab | FL5-1109L | EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology. |
| Entellan | Merck | 1.07961 | Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A2720801 | Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells. |
| Flaticon | database of images | ||
| Glycerol | Merck | 24900988 | The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores |
| Histopaque-1077 | polysucrose solution | ||
| Image J | Image analysis software | ||
| Microscopy slides | Precision | 7105 | Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections |
| Mini centrifuge | Prism | C1801 | The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time. |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0011 | The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles. |
| Panoptic fast | Laborclin | 620529 | Laborclin's panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology |
| Penicillin/Streptomycin Solution - 10,000U | LGC- Biotechnology | BR3011001 | antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow. |
| Petri dish 90 x 15 mm Smooth | Cralplast | 18248 | Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | thermo fisher Scientific | 10010001 | PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells. |
| Pipette Pasteur 3 mL Sterile | Accumax | AP-3-B-S | STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile |
| Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | TS-HM16R | The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g. |
| RPMI-1640 Medium | Merck | MFCD00217820 | HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
| The single channel micropipettes | Eppendorf | Z683809 | Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids. |
| Tip for Micropipettor | Corning | 4894 | Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable |
| Triocular inverted microscope | LABOMED | VU-7125500 | It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems. |
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