Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

İnsan Periferik Kanı Mononükleer Kaynaklı Makrofajlar İçinde Trichoderma stromaticum Conidia'nın Canlılık Testi

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65231
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Laboratory of Immunobiology - Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Università Degli Studi di Genova
* These authors contributed equally

Summary

Mantar konidiasının makrofajlar tarafından fagositozunu içeren teknik, mantarlara karşı immün yanıtların modülasyonunu değerlendiren çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu makalenin amacı, Trichoderma stromaticum conidia ile uyarılan insan periferik kan mononükleer kaynaklı makrofajların fagositoz ve klirens yeteneklerini değerlendirmek için bir yöntem sunmaktır.

Abstract

Makrofajlar çok önemli bir savunma hattını temsil eder ve farklı dokularda patojenlerin büyümesini ve kolonizasyonunu önlemekten sorumludur. Konidyal fagositoz, makrofaj-patojen etkileşimlerinde yer alan sitoplazmik ve moleküler olayların araştırılmasına ve ayrıca içselleştirilmiş konidiaların ölüm zamanının belirlenmesine izin veren anahtar bir süreçtir. Mantar konidiasının makrofajlar tarafından fagositozunu içeren teknik, mantarlara karşı immün yanıtların modülasyonunu değerlendiren çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Fagositozdan kaçınma ve fagozomlardan kaçış mantar virülansının mekanizmalarıdır. Burada, biyokontrol ve biyogübre ajanı olarak kullanılan ve insan enfeksiyonlarını indükleyebilen bir mantar olan T. stromaticum conidia'nın fagositozu, klirensi ve canlılığının analizi için kullanılabilecek yöntemleri bildiriyoruz. Protokol şunlardan oluşur: 1) Trichoderma kültürü, 2) konidia elde etmek için yıkama, 3) polisakaroz çözelti yöntemi kullanılarak periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) izolasyonu ve PBMC'lerin makrofajlara farklılaşması, 4) yuvarlak cam lameller ve renklendirme kullanılarak bir in vitro fagositoz yöntemi ve 5) conidia fagositozundan sonra conidia canlılığını değerlendirmek için bir klirens testi. Özetle, bu teknikler makrofajların mantar temizleme etkinliğini ölçmek için kullanılabilir.

Introduction

Trichoderma cinsi (Sipariş: Hypocreales, Aile: Hypocreaceae), diğer mantar türlerinin parazitleri olan ve ticari olarak yararlı bir dizi enzim üretebilen her yerde bulunan, saprofitik mantarlardan oluşur1. Bu mantar türleri, heterolog proteinlerin2 üretiminde, selüloz3, etanol, bira, şarap ve kağıt4 üretiminde, tekstil endüstrisinde5, gıda endüstrisinde6 ve tarımda biyolojik kontrol ajanlarıolarak 7,8 kullanılmaktadır. Bu mantar türlerine olan endüstriyel ilgiye ek olarak, insanlarda artan enfeksiyon sayısı, bazı Trichoderma türlerine fırsatçı patojenlerin statüsünü vermiştir9.

Trichoderma spp. kültürde hızla büyür, başlangıçta yeşilimsi sarıdan koyu yeşile dönüşen beyaz ve pamuksu kolonilerbulunur 10. Çok çeşitli pH ve sıcaklık koşullarında yaşamaya adapte olmuşlardır ve fırsatçı türler fizyolojik pH ve sıcaklıklarda hayatta kalabilir ve böylece farklı insan dokularını kolonize edebilir 11,12,13. Daha da önemlisi, enfeksiyon oranındaki artış Trichoderma spp. virülans faktörleri ile ilişkili olabilir ve bunlar iyi çalışılmamıştır. Ek olarak, fırsatçı Trichoderma türlerine karşı bağışıklık tepkisini anlamaya odaklanan çalışmalar hala nadirdir.

Bir enfeksiyon sırasında, nötrofillerle birlikte, makrofajlar fagositozdan sorumlu savunma hattını temsil eder ve böylece farklı dokularda patojenlerin büyümesini ve kolonizasyonunu önler. Toll benzeri reseptörler ve C-tipi lektin reseptörleri, makrofajlar fagositoz mantarları gibi örüntü tanıma reseptörlerini kullanarak ve bunları fagolizozomlara işler, böylece solunum patlamasını, proinflamatuar sitokinlerin salınımını ve fagositozlu mikroorganizmaların yok edilmesini teşvik eder14. Bununla birlikte, fagositoz mekanizması, mantar hücrelerinin boyutu ve şekli gibi farklı mikrobiyal stratejilerden etkilenebilir ve önlenebilir; fagositozu engelleyen kapsüllerin varlığı; fagositozu indükleyen reseptörlerin sayısını azaltmak; sitoplazmadaki aktin liflerinin yapısının yeniden şekillenmesi; psödopodia oluşumunu engellemek; ve fagositoz işleminden sonra fagozom veya fagolizozom kaçar14.

Cryptococcus neoformans da dahil olmak üzere birçok patojen, konakçıda hayatta kalmak, yayılmak ve enfeksiyonu indüklemek için makrofajları bir niş olarak kullanır15. Fagositoz ve klirens testi, patojenlere karşı bağışıklık tepkisini değerlendirmek ve doğuştan gelen bağışıklık sisteminden kaçmak için kullanılan mikrobiyal stratejileri belirlemek için kullanılır 15,16,17. Bu tür bir teknik, fagositozun diferansiyel kinetiğini, gecikmiş fagozom asitlenmesini ve mantar öldürmesinin azalmasına neden olan oksidatif patlamayı incelemek için de kullanılabilir18.

Fagositoz, mantar sağkalımı ve fagozom olgunlaşma sürecinden kaçınmayı değerlendirmek için farklı yöntemler kullanılabilir. Bunlar arasında fagositozu, hücresel konumu ve fagositoz19 sırasında üretilen molekülleri gözlemlemek için kullanılan floresan mikroskobu; fagositoz hakkında nicel veriler sağlayan ve sürece dahil olan farklı belirteçleri değerlendirmek için kullanılan akış sitometrisi20,21; mikrobiyal yakalama ve fagozom olgunlaşmasını değerlendirmek için kullanılan intravital mikroskopi22; bir patojen23 için fagositoz sürecinin özgüllüğünü değerlendirmek için kullanılan antikor aracılı fagositoz; ve diğerleri 24,25,26,27.

Burada sunulan protokol, fagositozu ve mantar konidiasının öldürülmesini değerlendirmek için bir optik mikroskop ve plaka büyüme testi kullanan yaygın, düşük maliyetli ve doğrudan bir yöntem kullanır. Bu protokol, okuyuculara, T. stromaticum'a maruz kalan insan periferik kan mononükleer türevli makrofajları kullanarak fagositoz ve klirens testini gerçekleştirmek için adım adım talimatlar sağlayacaktır. PBMC'ler kullanıldı çünkü Trichoderma conidia, fitopatojenlere karşı bir biyokontrol ve dünya çapında bitki bitkileri için bir biyogübre olarak uygulandı ve Trichodermosis adı verilen çeşitli insan enfeksiyonlarına neden oldu. Bunun yanı sıra, Trichoderma conidia ile insan bağışıklık sistemi arasındaki etkileşime odaklanan, makrofajlardanötrofilleri 28 ve otofajları29 incelediğimiz sadece iki çalışma var. Bu makale ilk olarak PBMC'den türetilen makrofajlar tarafından T. stromaticum konidiasının fagositozunun nasıl incelenebileceğini ve daha sonra yutulan konidianın canlılığının basit mikroskopi tabanlı teknikler kullanılarak nasıl değerlendirilebileceğini göstermektedir. Bu protokol, makrofajla ilişkili immün yanıt veya immün sistem modülasyonu ile ilgili mekanizmalar hakkındaki araştırmaları daha da kolaylaştırabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik hususlar ve insan denekler
Bu çalışmada açıklanan insanlarla yapılan tüm deneyler, Helsinki Bildirgesi ve Brezilya Federal yasalarına göre gerçekleştirilmiş ve Santa Cruz Eyalet Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (proje tanımlama kodu: 550.382 / 2014).

İnsan periferik kanı, Brezilya'nın Bahia kentindeki Ilhéus şehrinden, incelenen mantarla ilgili mesleki faaliyetlere maruz kalmayan sağlıklı gönüllülerden toplandı. Bildirilen sağlık tıbbi durumları olan veya ilaç kullanan kişiler hariç tutuldu. Tüm denekler gönüllü olarak katılmayı kabul etti ve bu çalışmaya dahil edilmeden önce bilgilendirilmiş bir onam formu imzaladı.

1. Reaktiflerin ve çözeltilerin hazırlanması

NOT: Devam etmeden önce aşağıdaki reaktifleri ve çözeltileri hazırlayın. Reaktif ve malzeme tedarikçisi bilgileri için Malzeme Tablosuna (TOM) bakın.

  1. Dengeli bir steril fosfat tamponlu salin çözeltisi 1x (PBS) hazırlayın.
    NOT: Bu protokolde endotoksin içermeyen PBS kullanılmamıştır.
  2. Patates dekstroz agar (PDA) ortamı hazırlayın ve T. stromaticum kültürü için her Petri kabına 20 mL dökün. Her donör için PDA'lı altı plaka hazırlayın ve her koşul için bir plaka kullanın: 3 saat, 24 saat, 48 saat, 72 saat, 96 saat ve 120 saat. Ek olarak, her kontrol için üç plaka kullanın: Trichoderma kontrolü için üç ve R10 orta kontrolü için üç. Optimum conidia geri kazanımı için 60 mm x 15 mm veya 100 mm x 15 mm'lik petri kapları kullanın.
  3. % 100 gliserol sterilize edin.
  4. Hücre kültürü için bir R10 besiyeri hazırlayın:% 10 fetal sığır serumu,% 1 antibiyotik (penisilin/streptomisin) ile desteklenmiş RPMI ortamı.
  5. Hücre lizizi için damıtılmış suyu sterilize edin.
  6. Renklendirme işlemi için pH 7.0'da su hazırlayın.
    NOT: Gerekirse, bir pH metre ve 0,1 M/L NaOH ve 0,1 M/L HCl çözeltileri kullanarak pH'ı ayarlayın.
  7. Yuvarlak cam lamel (13 mm) ve cımbızı sterilize edin.

2. Trichoderma stromaticum kültürü ve işlenmesi

  1. T. stromaticum'un ana stoğunun (M1) hazırlanması:
    NOT: Tüm deneylerin aynı taze neslin (F1) kültüründen yapıldığından emin olmak için bir ana stok (M1) gereklidir.
    1. Bir T. stromaticum inoculum'u PDA ile Petri kaplarında 28 ° C'de karanlıkta 7-10 gün boyunca conidia gözlenene ve kültür yeşile dönene kadar büyütün.
    2. T. stromaticum kültürünü yıkayın. Bir pipet kullanarak kültür yüzeyine 3-5 mL PBS ekleyin. PBS'yi plakadan toplayın ve pipeti kullanarak conidia'yı kademeli olarak çıkarmak için tekrar kültürün üzerine dağıtın. Süspansiyon koyu yeşile dönene kadar bu işlemi gerektiği kadar tekrarlayın.
      NOT: Alternatif olarak, plakaya 3-5 mL PBS eklenerek kültürün nazikçe yıkanması ve ardından conidia'yı geri kazanmak için süspansiyon yeşile dönene kadar dairesel bir hareket yapılması önerilir. Tekrarlanan pipetleme ile daha fazla conidia toplanabilir.
    3. Geri kazanılan süspansiyonu plakadan bir pipetle 15 mL'lik steril bir tüpe aktarın. Daha fazla conidia elde etmek için 2.1.2-2.1.3 adımlarını gerektiği kadar tekrarlayın.
    4. Süspansiyonu 12 ° C'de 5 dakika boyunca 1.160 x g'da santrifüjleyin ve peleti 5 mL PBS'de yeniden süspanse edin. Hif içermeyen bir süspansiyon elde etmek için bu adımı (2.1.4) üç kez tekrarlayın.
      NOT: Peletleri düzgün bir şekilde yeniden süspanse etmek için, santrifüjlemeden sonra, kısa vorteksleme önerilir.
    5. Son peleti 2-3 mL PBS'de yeniden süspanse edin ve 1:100 veya 1:1.000'lik bir seyreltme kullanarak bir Neubauer haznesindeki conidia'yı sayın.
      NOT: Optimum koşullarda, kültürden 2 x 108 conidia/mL'lik bir nihai konsantrasyon geri kazanılabilir. Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak conidia canlılığının değerlendirilmesi isteğe bağlıdır.
    6. Her tüpe 0,5 mL conidia süspansiyonu (adım 2.1.5'ten itibaren) ekleyerek süspansiyonu 1,5 mL steril tüplere ayırın. Ardından, M1 stokları elde etmek için 0,5 mL steril %100 gliserol ekleyin. Kısaca vorteks, tüpleri tanımlayın ve −20 °C veya −80 °C'de saklayın.
  2. T. stromaticum kültürü ve deney için conidia elde edilmesi
    1. M1 süspansiyonunun 10 μL plakası (adım 2.1'de hazırlanmıştır) PDA'da 28 °C'de karanlıkta 7-10 gün boyunca conidia gözlenene ve kültür taze F1 neslini elde etmek için yeşile dönene kadar.
      NOT: Deney için taze bir T. stromaticum kültürü sağlamak için, mantar büyümesi için gereken süreyi ve makrofaj farklılaşması için gereken süreyi değerlendirin.
    2. 2.1.2-2.1.4 adımlarını tekrarlayarak conidia'yı toplayın.
    3. Son peleti 2-3 mL PBS'de yeniden süspanse edin. Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak conidia canlılığını değerlendirin veya conidia'yı adım 2.1.5'te belirtildiği gibi sayın.

3. Periferik kan mononükleer hücre (PBMC) izolasyonu

NOT: PBMC'ler, yoğunluğu 1.077 g/mL30 olan bir polisakroz çözeltisi kullanılarak yoğunluk bariyeri yöntemiyle elde edilir.

  1. Toplanacak her donör numunesi için 15 mL polisakaroz solüsyonunu 50 mL'lik bir tüpe alın.
  2. Üç ila dört EDTA tüpü kullanarak her donörden 20 mL kan toplayın. Deney başına en az dört bağışçı toplayın. Bağışçıların kanını bir araya getirmeyin; Bunun yerine, her numuneyi biyolojik bir kopya olarak ayrı ayrı kullanın. Her donör için, kanı 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 35 mL'lik bir son hacim elde etmek için PBS ekleyin.
  3. Bifazik bir süspansiyon oluşturmak için kan süspansiyonunu (adım 3.2) polisakroz solüsyonunu (adım 3.1) içeren tüpün duvarı boyunca yavaşça aktarın.
    NOT: Kanın polisakaroz çözeltisine karışmasını önlemek için kanı yavaşça ekleyin. PBMC izolasyonu için her donörden en az 7 mL kan kullanılması önerilir.
  4. Bifazik süspansiyonu içeren tüpü hemen 1.600 x g'da 24 °C'de 30 dakika santrifüjleyin. PBMC'lerin santrifüjlenmesini programlayın: santrifüjlemenin aniden durmasını önlemek için hızlanma 1 ve yavaşlama 0'ı kullanın.
  5. Santrifüjlemeden sonra PBMC'leri içeren beyaz bir halkanın oluşumunu gözlemleyin. Kırmızı kan hücreleri ve granülositler alt tabakada bulunur, bir sonraki tabaka polisakaroz çözeltisini içerir ve PBMC'ler polisakaroz çözeltisi ile plazma (üst tabaka) arasındaki beyaz halkada bulunur. Kırmızı kan hücrelerini, plazmayı veya polisakaroz çözeltisini yakalamamak için bir pipet veya steril bir Pasteur pipeti kullanarak hafifçe aspire ederek beyaz halkayı toplayın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
  6. 10 mL'lik bir nihai hacim elde etmek için PBMC'leri içeren 15 mL'lik tüpe PBS ekleyin. Süspansiyonu homojenize edin ve tüpü 24 °C'de 30 dakika boyunca 1.600 x g'da santrifüjleyin.
  7. Hücreleri 10 mL PBS ile 24 ° C'de 5 dakika boyunca 1.600 x g'da üç kez yıkayın. Daha sonra, son peleti 2 mL R10 ortamında yeniden süspanse edin.
  8. Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak hücre canlılığını değerlendirin ve bir Neubauer odasındaki hücreleri sayın.

4. Fagositoz kinetiği

NOT: İnsan periferik kan mononükleer kaynaklı makrofajlar, kontrol olarak 1:10 veya sadece R10 besiyerinde çok sayıda enfeksiyonda (MOI) T . stromaticum conidia ile tedavi edilir. Enfeksiyon çokluğu (MOI), enfeksiyon hedeflerine eklenen enfeksiyöz ajanların oranını temsil eder ve mutlak sayılar olarak sunulur: MOI = ajanlar:hedefler31. Burada 10 makrofaj (hedef) için 1 T. stromaticum conidia (ajan) kullanıyoruz. Daha sonra hücreler 37 °C ve %5CO2'de farklı sürelerde (3 saat, 24 saat, 48 saat, 72 saat, 96 saat ve 120 saat) inkübe edilir. Daha sonra, fagositoz sürecinde yer alan yapışkan makrofajları mikroskop altında görselleştirmek için yuvarlak bir cam lamel kullanılır. Deneysel bir tasarım figürü sağlanmıştır (Şekil 1).

NOT: 24 oyuklu plakaların kullanılması önerilir.

  1. İnsan kaynaklı makrofajların T. stromaticum conidia ile tedavisi
    1. Steril cımbız kullanarak her oyuğa steril yuvarlak bir cam lamel (13 mm) ekleyin.
    2. 3.7-3.8 adımlarında elde edilen hücre süspansiyonunun hacmini, oyuk başına 8 x 105 hücreye R10 ortamı ile 1 mL'lik bir nihai hacme ayarlayın. Hücre morfolojisini değerlendirmek için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın.
      NOT: Hücreler ortamda asılı olmalı ve yuvarlak bir morfolojiye sahip olmalıdır.
    3. Hücreleri 7 gün boyunca% 5 CO2 atmosferi altında 37 ° C'de inkübe edin ve monositlerin makrofajlara farklılaşması için ortamı her 2 günde bir taze R10 ortamı ile değiştirin32. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hücre morfolojisini gözlemleyin. Makrofajlar, düzleştirilmiş ve genişletilmiş şekillerle iğ morfolojisi sunacaktır; artmış bir sitoplazmatik oran ve psödopodia varlığı da gözlenebilir. Yapışık mononükleer türevli makrofajları arayın.
      NOT: Farklılaşmamış monositlerin çok küçük bir kısmı ortamda asılı kalabilir.
    4. Bir pipet kullanarak her bir kuyucuğun ortamını çıkarın ve kalıntıları ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için hücreleri 1 mL PBS ile yıkayın.
    5. R10 ortamında 8 x 104 conidia/mL nihai konsantrasyonda yeni bir T. stromaticum conidia süspansiyonu hazırlamak için adım 2.2'de hazırlanan süspansiyonu kullanın.
    6. 1:10'luk bir MOI elde etmek için her bir işlem kuyucuğuna (3 saat, 24 saat, 48 saat, 72 saat, 96 saat ve 120 saat) adım 4.1.5'te hazırlanan 1 mL conidia süspansiyonu ekleyin. Kontrollere, kuyuya sadece 1 mL R10 ortamı ekleyin.
    7. Makrofajlara 3 saat boyunca T. stromaticum conidia 37 ° C'de% 5 CO2 atmosferi altında meydan okuyun. 3 saat sonra, ortamı çıkarın ve fagositozlu olmayan conidia'yı çıkarmak için hücreleri yıkayın.
    8. Her kuyucuğa 1 mL R10 ortamı ekleyin ve plakayı farklı sürelerde (3 saat, 24 saat, 48 saat, 72 saat, 96 saat ve 120 saat) 37 ° C'de% 5 CO2 atmosferi altında inkübe edin.
  2. Renklendirme ve analiz
    1. İlgili inkübasyon (adım 4.1.8) tamamlandıktan sonra ortamı her bir kuyucuktan çıkarın ve o kuyucuğa 1 mL PBS ekleyin.
    2. Steril cımbız ve boyama kiti ile renklendirmek için bir iğne kullanarak yuvarlak cam lamelleri kuyulardan çıkarın.
      NOT: Alternatif olarak, May Grünwald-Giemsa boyası33 kullanılarak boyama yapılabilir.
    3. Yuvarlak cam lamellerin her birine, boyama kitinin bileşenleri olan leke sabitleyici (5 s), Boya 1 (5 s), Boya 2 (2 s) ve tamponlanmış su pH 7.0 (5 s) ekleyin. Kuruyana kadar bekleyin ve lamelleri montaj maddesi kullanarak bir cam kızak üzerine sabitleyin.
    4. Sonucu ölçün: Her zaman koşulu için toplam 100 makrofaj (Mø) sayın. Optik bir mikroskop kullanarak, 100x objektif ve daldırma yağı kullanarak fagositozlu conidia ile makrofajların sayısını sayın (denklem [1]).
      Equation 1 (1)
    5. Makrofaj başına konidia fagositoz sayısını elde edin: 100 makrofajda bulunan conidia'yı makrofaj sayısına en az bir fagositozlu konidyum ile ilişkilendirin (denklem [2])34.
      Equation 2 (2)
      NOT: Conidia'yı değerlendirmek ve saymak için ImageJ yazılımıkullanılabilir 35.
    6. Sonuçları sunmak için 40x ve 100x objektif kullanarak her numune ve zaman koşulundan fagositozu fotoğraflayın.

Figure 1
Şekil 1: İnsan periferik kan mononükleer türevli makrofajları kullanarak fagositoz ve konidiyal canlılık testinin şematik gösterimi. (1-10) Fagositoz testi: T. stromaticum PDA'da büyütülmeli ve konidia, plakanın PBS ile yıkanmasıyla geri kazanılır. PBMC'ler, tarif edilen protokol kullanılarak yoğunluk bariyeri yöntemi ile izole edilmeli, makrofajlara farklılaşmak için 7 gün boyunca steril yuvarlak cam lameller ile 24 oyuklu plakalarda kültürlenmeli ve daha sonra farklı zaman aralıklarında 1:10'luk bir MOI ile muamele edilmelidir. Yuvarlak cam lameller çıkarılarak boyama kiti ile boyanır ve sonuçlar ışık mikroskobu kullanılarak analiz edilir. (1-8,11-13) Conidia canlılık testi: İzolasyondan sonra, PBMC'ler, makrofajlara farklılaşmak için 7 gün boyunca yuvarlak cam lameller olmadan 24 oyuklu plakalarda kültürlenir ve daha sonra farklı zaman aralıkları için 1:10'luk bir MOI ile muamele edilir. Hücreler damıtılmış su ile inkübasyon yoluyla parçalanmalıdır; süspansiyon daha sonra santrifüjlenir ve daha sonra yeniden süspanse edilen pelet, Trichoderma'nın büyüme kinetiğini analiz etmek için PDA'da kaplanır. Bu şekil, bir görüntü veritabanı kullanılarak tasarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. Fagositoz sonrası konidiyal canlılık deneyi

NOT: Deneysel bir tasarım figürü sağlanmıştır (Şekil 1).

NOT: 24 oyuklu plakalar kullanın.

  1. İnsan kaynaklı makrofajlara T. stromaticum conidia ile meydan okuyun.
    1. Monositleri ayırt etmek için 4.1.2-4.1.8 adımlarını tekrarlayın ve makrofajları T. stromaticum conidia ile tedavi edin.
      NOT: Kuyularda yuvarlak cam lameller kullanmayınız. Fagositoz kinetiğini test etmek için kullanılan aynı zaman aralıklarını kullanın, böylece fagositoz konidiyal canlılık ile ilişkilendirilebilir.
    2. R10 ortamının T. stromaticum büyümesi üzerindeki etkisini, adım 4.1.5'te (R10 ortamı + conidia) kontrol olarak hazırlanan süspansiyonlu kuyucukları kullanarak değerlendirin.
  2. Konidiyal canlılık testi
    1. Her inkübasyon periyodundan sonra (3 saat, 24 saat, 48 saat, 72 saat, 96 saat ve 120 saat) ortamı çıkarın ve fagositozlanmamış conidia'yı çıkarmak için hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.
      NOT: R10 medium + conidia içeren kumanda yıkanmamalıdır.
    2. Her kuyucuğa 0,5 mL steril damıtılmış su ekleyin ve plakayı 37 °C ve %5CO2'de 30 dakika inkübe edin. Bu süreden sonra, hücrelerin parçalandığından emin olmak için hücre morfolojisini ters mikroskop altında gözlemleyin.
    3. Süspansiyonu toplayın ve 1,5 mL'lik tüplere aktarın. Süspansiyonu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 6.000 x g'da bir mini santrifüj kullanarak santrifüjleyin.
    4. Süpernatanı dikkatlice atın, peleti 10 μL steril damıtılmış suda yeniden süspanse edin ve 10 μL süspansiyonu karanlıkta 28 °C'de PDA içeren plakaya aşılayın.
    5. T. stromaticum büyümesi için pozitif bir kontrol hazırlayın: 8 x 106 conidia/mL nihai konsantrasyona sahip yeni bir süspansiyon hazırlamak için T. stromaticum conidia süspansiyonunu (adım 2.2) kullanın. Bu süspansiyonun plakası 10 μL, karanlıkta 28 ° C'de PDA'da.
      NOT: Bu süspansiyonun 10 μL'si, kandaki mononükleer türevli makrofajları enfekte etmek için kullanılan aynı sayıda conidia (8 x 104) içerecektir. Bu pozitif kontrol ile adım 5.1.2'de bahsedilen kontrol arasındaki fark, yukarıda adım 5.1.2'de bahsedilen kontrolün, fagositoz sırasında R10 ortamının Trichoderma büyümesi üzerindeki olası etkisini değerlendirmek için kullanılmasıdır. PBS'de toplanan T. stromaticum conidia'nın süspansiyonunu kullanan adım 5.2.5'teki bu pozitif kontrol, mantarın doğal olarak nasıl büyüdüğünü yansıtmak için R10 ortamının etkisi olmadan Trichoderma büyümesi için bir kontrolü temsil eder. Bu kontrolü kullanarak, R10 ortamının Trichoderma büyümesini etkileyip etkilemediğini değerlendirmek mümkündür.
    6. Her gün PDA'da T. stromaticum'un büyüme kinetiğini gözlemleyin ve kültürü fotoğraflayın.
    7. Analiz: Sonuçları değerlendirmek için iki nokta kullanılabilir: 1) kültürün tüm kültür plakasını kaplaması için gereken süre (gün olarak) ve 2) kültürde T. stromaticum conidia'nın karakteristik yeşil pigmentasyonunun ortaya çıkmasına kadar geçen süre (gün olarak).

6. İstatistiksel analiz

  1. 8 grup/tedavi arasındaki istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları belirlemek için bir Kruskal-Wallis testi kullanın. p < 0.05'i istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edin. Tüm veriler standart sapma (SD) ± ortalamalar olarak sunulmaktadır. Şekillerde, # p < 0.05'te istatistiksel anlamlılığı gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mantar konidiasının makrofajlar tarafından fagositozunu içeren teknik, mantarlara karşı immün yanıtların modülasyonunu değerlendiren çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Fagositozdan kaçınma ve fagozomların kaçışı mantar virülansının mekanizmaları olduğundan, fagositozdan sonra conidia'nın canlılığını değerlendirmek için T. stromaticum conidia'nın fagositozunu kullandık. Araştırmacılar, klinik açıdan ilgi çekici bir türü araştırırken bu teknikleri ilk tahlillerden biri olarak uygulamalıdır.

Figure 2
Şekil 2: Fagositozu T. stromaticum conidia insan periferik kan mononükleer kaynaklı makrofajlar tarafından. Fagositoz kinetiğinin temsili sonuçları (A) 40x ve (B) 100x hedefleri T . stromaticum conidia içeren PBMC'den türetilmiş makrofajları gösterir. (C) T. stromaticum conidia içermez ve dış zara bağlanır; (D) Makrofajlar tarafından tamamen içselleştirilen T. stromaticum conidia; (E) T. stromaticum conidia bir üst düzlemde; (F) çoklu fagositoz; ve (G) makrofajların içinde (H) ve dışında conidia çimlenmesi. Oklar: sarı, serbest conidia; dış zara bağlı beyaz, conidia; siyah, tamamen içselleştirilmiş conidia; makrofajların içinde kırmızı, conidia çimlenmesi. Kesikli oklar: siyah, çoklu fagositoz; makrofajların dışındaki R10 ortamında çimlenen kırmızı, conidia; beyaz, üst düzlemde conidia. Ölçek çubuğu 20 μm'yi gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2, fagositoz kinetiğinin temsili sonuçlarını göstermektedir. Fagositoz sürecinin başlangıcında, serbest T. stromaticum conidia gözlenebildiği gibi, makrofajların dış zarına bağlı veya onlar tarafından tamamen içselleştirilmiş konidia da gözlenebilir (Şekil 2A-C). Fagositoz süresi arttıkça makrofajların dış zarına daha az konidia serbest veya bağlı olarak gözlemlenebilir.

Özellikle, bu çalışmada, konidia serbest ve fagositoz sürecinin başlangıcında dış zara yapışık (Şekil 2C), makrofajlar tarafından tamamen içselleştirilmiş (Şekil 2D) veya makrofajlara kıyasla bir üst düzlemde (Şekil 2E) ancak fagosite edilmemiş olarak bulunabilir ve aynı makrofajda birden fazla konidyum bulunabilir (Şekil 2F). Uzun süreler sonra (96 saat), fagositozlu konidia makrofajların içinde filizlenebilir (Şekil 2G) ve serbest konidia, 37 ° C'de hif oluşturmak için R10 ortamında filizlenebilir (Şekil 2H).

Fagositozdan sonra, T. stromaticum conidia'nın insan PBMC'den türetilen makrofajlarla 120 saatlik etkileşimden sonra bile canlı kaldığını gözlemlemek mümkün oldu. Temsili sonuçlar, geri kazanılan conidia kültürünü gösterir (Şekil 3A) ve kültürün tüm kültür plakasını kaplaması (Şekil 3B) ve renkli yeşil conidia oluşturması (Şekil 3C) için gereken süreyi (gün cinsinden) temsil eder. Sadece ayrık T. stromaticum conidia fagozomdan kaçabildi ve insan periferik kan mononükleer kaynaklı makrofajların sitoplazmasında serbest bulundu29. Trichoderma'nın reaktif oksijen ve nitrojen türlerinin üretimini azaltma yeteneği, fagozom içindeki conidia'nın hayatta kalmasına da katkıda bulunabilir ve fagositoz sonrası canlılığı açıklayabilir 28,29,36. Şimdiye kadar, fagositozlu conidia'nın canlı kaldığını ve 120 saat sonra bile PDA ortamında büyüyebildiğini gösterdik. Aspergillus 27,37 ve Cryptococcus38 gibi makrofajlar tarafından yutulduktan sonra diğer mikroorganizmaların da hayatta kaldığı bildirilmiştir.

Figure 3
Şekil 3: T. stromaticum conidia ile enfekte olmuş insan periferik kan mononükleer türevli makrofajların temizleme yeteneği. T. stromaticum conidia (3 saat, 24 saat, 48 saat, 72 saat, 96 saat veya 120 saat) ile yapılan bir meydan okumadan sonra, PBMC'den türetilen makrofajlar parçalandı ve süspansiyon, fagositozlu konidianın canlılığını değerlendirmek için PDA'da kaplandı. (A) PBMC'den türetilen makrofajlar tarafından fagositoz sonrası T. stromaticum büyümesinin temsili sonuçları gösterilmiştir. PBS'de T. stromaticum ile pozitif kontrol için (B) T. stromaticum büyümesinin ve (C) konidiasyonunun farklı günlerde izlenmesi (bkz. adım 5.2.5), R10 ortamının kontrolü (bkz. adım 5.1.2) ve farklı zaman periyotları için makrofajlar tarafından konidia fagosite edildi (3 saat, 24 saat, 48 saat, 72 saat, 96 saat, 120 saat). Dört sağlıklı donörden temsili sonuçlar. Ortalama ± standart sapması (SD). Kruskal-Wallis testi. # sembolü, p < 0.05, n = 4'te önemi gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans ve diğerleri dahil olmak üzere çeşitli mantar patojenleri için, konidiyal veya maya fagositozu, makrofaj-patojen etkileşimlerinde sitoplazmik ve moleküler olayların araştırılmasına ve ayrıca içselleştirilmiş conidia'nın ölüm zamanının belirlenmesine izin veren anahtar bir süreçtir 14,39,40. Fagositoz, Trichoderma-host etkileşimindeki anahtar süreçtir. Trichoderma cinsi, Dectin-1 ve Dectin-2, Toll benzeri reseptör 2 ve Toll benzeri reseptör 4, MHC ve NF-κB 25,28,41,42,43 dahil olmak üzere çeşitli fagositoz yollarını modüle eder. Trichoderma, riskli ve bağışıklığı baskılanmamış bireylerde trikodermoza neden olur9. Daha da önemlisi, bu cinsin birkaç türü tarımda kullanılmaktadır ve Trichodermosis'in potansiyel kaynağıdır. T. stromaticum'un virülans faktörlerini ve insan vücudundaki bu mantarlara karşı bağışıklık tepkisinin mekanizmasını anlamak acilen gereklidir, çünkü T.stromaticum da dahil olmak üzere Trichoderma türlerinin neden olduğu mesleki tehlikeler endişe verici bir şekilde artmaktadır. Burada sunulan yöntem, insan periferik kandan türetilen makrofajlarda Trichoderma-makrofaj etkileşimini incelemek için fagositoz ve öldürme testinin gerçekleştirilmesi için ayrıntılar sağlar; Bununla birlikte, bu yöntem aynı zamanda alveolar, peritoneal veya soy makrofajları dahil olmak üzere farklı dokulardan makrofajları incelemek için de kullanılabilir.

Bu protokoldeki ilk adım, mantarın taze kültürlerini elde etmek için bir ana stok (M1) süspansiyonu ile başlar. Trichoderma kültürleri, genellikle tüm tabağı kapladıkları ve 5 gün içinde yeşil renkli konidia göstermeye başladıkları için hızlı büyürler. Sıcaklık ve ışık, Trichoderma'nın büyümesi için çok önemli faktörlerdir ve bu faktörlerdeki değişiklikler Trichoderma'nın kinetiğini etkileyebilir ve deneyitehlikeye atabilir 44.

T. stromaticum kültürü yıkandıktan sonra, 5-8 mL arasında bir son hacim geri kazanılmalıdır. Süspansiyonun renk yoğunluğu, conidia konsantrasyonu ile orantılıdır. Elde edilen conidia süspansiyonu, fagositoz26, nötrofil hücre dışı tuzaklar28, burun içi maruziyet36,41, intraperitoneal maruziyet26, intrakütan enfeksiyon45 ve intravenöz enfeksiyon46'nın değerlendirilmesi gibi in vitro ve in vivo deneyler için kullanılabilir. İnsan makrofajları ile yapılan önceki araştırmalar, Trichoderma29'un neden olduğu otofajiyi ve cinsin, mantar patojenlerini ve diğer mikroorganizmaları ortadan kaldırmak için kullanılan bir mekanizma olan nötrofillerde(28) hücre dışı tuzakların oluşumunu engelleme yeteneğini değerlendirmiştir.

Hücreleri korumak için kullanılan kültür ortamının konidiyal çimlenmeyi etkileyebileceğine dikkat etmek önemlidir (Şekil 3G, H). Belirli bir deney için çimlenme istenmiyorsa, söz konusu ortamda Trichoderma'nın büyüme kinetiğini belirlemek için hücre kültürü ortamı ile bir ilk tarama testi yapmanızı öneririz. Bu tahlil, istenen hücre soyu ile in vitro deneylere başlamadan önce yapılmalı ve ortamın uyumlu olmadığı tespit edilirse deney 72 saat sonra durdurulmalıdır. Trichoderma conidia'nın çimlenmesi (Şekil 3G,H) makrofajların içinde ve dışında 96 saatten itibaren gözlemlenebilir.

Trichoderma türleri morfolojide ve büyümeleri için en uygun sıcaklık ve pH'da farklılıklar gösterdiğinden, burada sunulan sonuçlar cinsin tüm türleri için tekrarlanabilir olmayabilir ve bu protokol diğer türlerle gerçekleştirildiğinde uyarlamalara ihtiyaç duyabilir. Örnek olarak, Trichoderma asperelloides conidia, kültürde T. stromaticum'unkinden daha hızlı filizlenir.

Akış sitometrisi ve floresan mikroskobu kullanılarak fagositozu ve patojenin öldürülmesini değerlendirmek için önceki belgelenmiş protokoller pahalı reaktifler gerektirir, ancak fagositoz süreci hakkında spesifik bilgiler sağlarlar19. Bu makalede sunulan protokol, fagositozu değerlendirmek için sadece bir optik mikroskop ve plaka büyümesi gerektirir ve fagositoz sürecinin kapsamlı görüntülerini sağlar. Diferansiye makrofajlar elde etmek ve makrofaj lizizini indüklemek için farklı protokoller kullanılabilir. Bu protokoller, makrofajların farklılaşması için burada kullanılan 7 günyerine farklı zamanların kullanılmasını içerir 26 veya makrofajları 37 ° C'de damıtılmış su yerine parçalamak için% 2.5 deoksikolat47 ve 30 dakika boyunca% 5 CO2 kullanımı, burada bu protokolde kullanıldığı gibi. Bu yöntemler, A. fumigatus27, A. nidulans18 ve Cryptococcus neoformans15 gibi farklı mantar türleri için etkili bir şekilde kullanılmıştır.

Bu protokolün bazı sınırlamaları, endotoksin içermeyen PBS kullanımı, yuvarlak cam lamellerin kullanımı ve insan kanının kullanımı ile ilgilidir. Monositleri aktive edemediğinden ve deneyi önyargılı hale getiremediğinden emin olmak için PBS'yi (endotoksin içermeyen) hücreler üzerinde test etmenizi öneririz. Yuvarlak cam lamellerin kullanımı, hücrelerin boyanması ve sayılması için çok kullanışlıdır, ancak bazı hücreler plakanın kenarına iyi göç ettiğinden, hücreler lamın altına eşit olarak yayılmayabilir ve bu fark, yuvarlak cam lamellerdeki tahmini toplam hücre sayısı üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Bu protokolde immünofloresan ve benzeri teknikler kullanmadığımız için, makrofajlara göre bir üst düzlemde fagosite edilmemiş konidia varlığı fagositoz sonuçlarının yanlış yorumlanmasına yol açabilir. İnsan donörlerinden alınan kanı kullandığımızdan, nihai PBMC sayısı donörler arasında değişir ve düşük donör hücre sayıları tüm deneyler için yeterli olmayabilir.

Özetle, bu teknikler, özellikle Trichoderma gibi filamentli mantarlar ve mayalar ve bakteriler gibi diğer mikroplar için makrofajların işlevini ve mantar klirensini ölçmek için kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol, insan popülasyonlarında konidia oluşturan mantarlara karşı bağışıklık tepkisindeki gerçek değişkenliği incelemek için gelecekteki yönleri sağlar, bu da izojenik hayvan modelleri veya hücre dizileri kullanılarak gözlemlenemez.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmez.

Acknowledgments

Bu çalışma aşağıdaki Brezilya finansman kurumları tarafından desteklenmiştir: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) RED0011/2012 ve RED008/2014 hibeleriyle. U.R.S., J.O.C. ve M.E.S.M. sırasıyla Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) ve FAPESB tarafından verilen bursu kabul eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tubes Corning CLS431470 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate Kasvi K12-024 Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator Sanyo 303082 A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL Capp 5101500 Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm Olen K5-0015 Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets Esco Lifesciences group 2010274 Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium Merck 145 Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube FirstLab FL5-1109L EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan Merck 1.07961  Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum Gibco A2720801 Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon  database of images
Glycerol Merck 24900988 The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077 polysucrose solution
Image J  Image analysis software
Microscopy slides Precision 7105 Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge Prism C1801 The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber Kasvi K5-0011 The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast  Laborclin 620529 Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution - 10,000U LGC- Biotechnology  BR3011001 antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth Cralplast 18248 Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS) thermo fisher Scientific 10010001 PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile Accumax AP-3-B-S STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge Thermo Scientific TS-HM16R The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium Merck MFCD00217820 HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes Eppendorf Z683809 Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor Corning 4894 Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope LABOMED VU-7125500 It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
  2. Nevalainen, H., Peterson, R. Chapter 7 - Heterologous expression of proteins in Trichoderma. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  3. Do Vale, L. H. F., Filho, E. X. F., Miller, R. N. G., Ricart, C. A. O., de Sousa, M. V. Chapter 16 - Cellulase systems in Trichoderma: An overview. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  4. Ferreira, N. L., Margeot, A., Blanquet, S., Berrin, J. G. Chapter 17 - Use of cellulases from Trichoderma reesei in the twenty-first century part I: Current industrial uses and future applications in the production of second ethanol generation. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  5. Puranen, T., Alapuranen, M., Vehmaanperä, J. Chapter 26 - Trichoderma enzymes for textile industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  6. Kunamneni, A., Plou, F. J., Alcalde, M., Ballesteros, A. Chapter 24 - Trichoderma enzymes for food industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  7. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Herrera-Estrella, A., Schmoll, M., Kenerley, C. M. Trichoderma research in the genome era. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 105-129 (2013).
  8. Mukherjee, M., et al. Trichoderma-plant-pathogen interactions: Advances in genetics of biological control. Indian Journal of Microbiology. 52 (4), 522-529 (2012).
  9. dos Santos, U. R., dos Santos, J. L. Trichoderma after crossing kingdoms: Infections in human populations. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 26 (2), 97-126 (2023).
  10. Asis, A., et al. Identification patterns of Trichoderma strains using morphological characteristics, phylogenetic analyses and lignocellulolytic activities. Molecular Biology Reports. 48 (4), 3285-3301 (2021).
  11. Antal, Z., et al. Comparative study of potential virulence factors in human pathogenic and saprophytic Trichoderma longibrachiatum strains. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 52 (3-4), 341-350 (2005).
  12. Hatvani, L., Manczinger, L., Vágvölgyi, C., Kredics, L. Trichoderma as a human pathogen. Trichoderma: Biology and Applications. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Singh, U. S., Mukherjee, M., Schmoll, M. , Wallingford, UK. (2013).
  13. Kredics, L., et al. Clinical importance of the genus Trichoderma: A review. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 50 (2-3), 105-117 (2003).
  14. Erwig, L. P., Gow, N. A. R. Interactions of fungal pathogens with phagocytes. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 163-176 (2016).
  15. Nicola, A. M., Casadevall, A. In vitro measurement of phagocytosis and killing of Cryptococcus neoformans by macrophages. Methods in Molecular Biology. 844, 189-197 (2012).
  16. Medina, E., Goldmann, O. In vivo and ex vivo protocols for measuring the killing of extracellular pathogens by macrophages. Current Protocols in Immunology. , Chapter 14, Unit 14 1-17 (2011).
  17. Drevets, D. A., Canono, B. P., Campbell, P. A. Measurement of bacterial ingestion and killing by macrophages. Current Protocols in Immunology. 109, 1-17 (2015).
  18. Gresnigt, M. S., et al. Differential kinetics of Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus phagocytosis. Journal of Innate Immunity. 10 (2), 145-160 (2018).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Yan, Q., Ahn, S. H., Fowler, V. G. Macrophage phagocytosis assay of Staphylococcus aureus by flow cytometry. Bio-Protocol. 5 (4), 1406 (2015).
  21. Marr, K. A., Koudadoust, M., Black, M. Early events in macrophage killing of Aspergillus fumigatus conidia New flow cytometric viability assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1240-1247 (2001).
  22. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128, 12-19 (2017).
  23. Siggins, M. K., et al. Differential timing of antibody-mediated phagocytosis and cell-free killing of invasive African Salmonella allows immune evasion. European Journal of Immunology. 44 (4), 1093-1098 (2014).
  24. Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. Journal of Cell Science. 101 (4), 907-913 (1992).
  25. Harvath, L., Terle, D. A. Assay for phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 115, 281-290 (1999).
  26. dos Santos, A. G., et al. Trichoderma asperelloides spores downregulate dectin1/2 and TLR2 receptors of mice macrophages and decrease Candida parapsilosis phagocytosis independent of the M1/M2 polarization. Frontiers in Microbiology. 8, 1681 (2017).
  27. Souza, J. A. M., et al. Characterization of Aspergillus fumigatus extracellular vesicles and their effects on macrophages and neutrophils functions. Frontiers in Microbiology. 10, 2008 (2019).
  28. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Inhibition of extracellular traps by spores of Trichoderma stromaticum on neutrophils obtained from human peripheral blood. Molecular Immunology. 141, 43-52 (2022).
  29. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Trichoderma stromaticum spores induce autophagy and downregulate inflammatory mediators in human peripheral blood-derived macrophages. Current Research in Microbial Sciences. 3, 100145 (2022).
  30. Johnston, L., Harding, S. A., La Flamme, A. C. Comparing methods for ex vivo characterization of human monocyte phenotypes and in vitro responses. Immunobiology. 220 (12), 1305-1310 (2015).
  31. Abedon, S. T., Bartom, E. Multiplicity of infection. Brenner's Encyclopedia of Genetics. Second Edition. Maloy, S., Hughes, K. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  32. Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
  33. Lombard, Y., Giaimis, J., Makaya-Kumba, M., Fonteneau, P., Poindron, P. A new method for studying the binding and ingestion of zymosan particles by macrophages. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 155-165 (1994).
  34. Ghoneum, M., Gollapudi, S. Phagocytosis of Candida albicans by metastatic and non metastatic human breast cancer cell lines in vitro. Cancer Detection and Prevention. 28 (1), 17-26 (2004).
  35. Nunes, J. P. S., Dias, A. A. M. ImageJ macros for the user-friendly analysis of soft-agar and wound-healing assays. BioTechniques. 62 (4), 175-179 (2017).
  36. Alves-Filho, E. R., et al. The biocontrol fungus Trichoderma stromaticum downregulates respiratory burst and nitric oxide in phagocytes and IFN-gamma and IL-10. Journal of Toxicology and Environmental Health - Part A: Current Issues. 74 (14), 943-958 (2011).
  37. Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
  38. Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: Evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 15 (3), 403-411 (2013).
  39. Alonso, M. F., et al. The nature of the fungal cargo induces significantly different temporal programmes of macrophage phagocytosis. The Cell Surface. 8, 100082 (2022).
  40. Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
  41. Dos Santos, U. R., et al. Exposition to biological control agent Trichoderma stromaticum increases the development of cancer in mice injected with murine melanoma. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 252 (2020).
  42. Wang, G., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii induces macrophage activation. Carbohydrate Polymers. 149, 112-120 (2016).
  43. Xu, Y., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii promotes maturation of murine dendritic cells. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 1155-1161 (2016).
  44. Schmoll, M., Esquivel-Naranjo, E. U., Herrera-Estrella, A. Trichoderma in the light of day - Physiology and development. Fungal Genetics and Biology. 47 (11), 909-916 (2010).
  45. Zhang, G., Li, D. Trichoderma longibrachiatum-associated skin inflammation and atypical hyperplasia in mouse. Frontiers in Medicine. 9, 865722 (2022).
  46. Paredes, K., Capilla, J., Mayayo, E., Guarro, J. Virulence and experimental treatment of Trichoderma longibrachiatum, a fungus refractory to treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (8), 5029-5032 (2016).
  47. Perkhofer, S., Speth, C., Dierich, M. P., Lass-Flörl, C. In vitro determination of phagocytosis and intracellular killing of Aspergillus species by mononuclear phagocytes. Mycopathologia. 163 (6), 303-307 (2007).

Tags

Canlılık Deneyi Trichoderma Stromaticum Conidia İnsan Periferik Kan Mononükleer Kaynaklı Makrofajlar Fagositoz Makrofaj-patojen Etkileşimleri Mantarlara Karşı İmmün Yanıtlar Fagozom Kaçışı Mantar Virülansı Biyokontrol Ajanı Biyogübre Ajanı İnsan Enfeksiyonları Trichoderma Kültürü Yıkama Conidia Periferik Kan Mononükleer Hücreleri (PBMC'ler) Makrofaj Farklılaşması İn Vitro Fagositoz Yöntemi Klirens Testi Mantar Klirens Etkinliği
İnsan Periferik Kanı Mononükleer Kaynaklı Makrofajlar İçinde <em>Trichoderma stromaticum</em> Conidia'nın Canlılık Testi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

dos Santos, U. R., de Castro, J. O., … More

dos Santos, U. R., de Castro, J. O., Santos Matos, M. E., De Bonis, G., dos Santos, J. L. Viability Assay of Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (200), e65231, doi:10.3791/65231 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter