Name: Processamento do Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Aprenda a processar o microarray de cDNA PtGen2 do pinheiro loblolly, incluindo técnicas de lavagem pré e pós-hibridização. Este método padronizado melhora a consistência dos dados de expressão gênica e reduz artefatos em estudos com coníferas.

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A rotulagem, a hibridização, e protocolos de lavar aqui contêm algumas modificações para os desenvolvidos anteriormente pelo Dr. J. Quackenbush enquanto no The Institute for Genomic Research (TIGR), Dr. Shawn Levy no Microarray Vanderbilt Shared Resource (VMSR), e Dr. Rob Alba, enquanto no Boyce Thompson Institute (BTI) Cornell University.

(Nota Seções 1 - Não 4 demonstraram em Vídeo) Preparando Cy-alvo identificadas cDNA O que se segue é o protocolo que usamos para a síntese de cDNA a partir de RNA total de pinus taeda e rotulagem cDNA microarray indireta antes hibridizações. Apesar de alguns não-trivial modificações foram feitas, o protocolo abaixo é semelhante ao que no manual de instruções fornecido com o Kit Invitrogen de Etiquetagem SuperScript indireta cDNA. Parte 1: First-Strand reação de síntese de cDNA <ol><li> Misture e brevemente girar cada componente do kit antes de usar. </li><li> Prepare reacções como se segue: <ul><li> Xμl DEPC-H 2 O </li><li> Xμl total de RNA, 20 mg / reação (pré-tratados com DNase Turbo é Ambion) </li><li> Ancorado 2μl Oligo (dT) 20 Primer (2.5μg/μl) </li><li> Primer Hexamer 1μl Aleatório </li><li style="list-style:none;"> Volume Total = 18μl </li></ul></li><li> Incubar os tubos a 70 ° lugar C por 5 minutos, e depois em gelo durante 1-2 minutos. </li><li> Adicione o seguinte a cada tubo de reação sobre o gelo: <ul><li> 6μl tampão Strand-First 5X </li><li> 1.5μl 0,1 M DTT </li><li> 1.5μl 10mM dNTP mix </li><li> 1μl RNaseOUT (40U/μl) </li><li> 2μl SuperScript III RT (400U/μl) </li></ul></li><li> Misture delicadamente e girar rapidamente. Incube o tubo durante a noite a 45 ° C. </li><li> Adicionar 15μl de NaOH 1M para cada tubo de reacção e misture bem. </li><li> Incube o tubo a 70 ° C por 10 minutos. </li><li> Adicionar 15μl de 1M HCl; misture delicadamente. </li><li> Adicionar 20μl de acetato de sódio 3M (pH 5,2) e misturar delicadamente. </li></ol> Parte 2: Purificação de First-Strand cDNA. <ol><li> Adicionar 500μl de tampão de carregamento para o cDNA (a partir do Passo 1.9) e misturar bem. </li><li> Colocar uma coluna de purificação SNAP (fornecido com o kit Labeling indireta) em um tubo de coleta e carregar o seu cDNA na coluna. </li><li> Giram a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto; descartar o escoamento. </li><li> Coloque a coluna no tubo SNAP mesma coleção e adicionar 500μl de tampão de lavagem. </li><li> Giram a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto; descartar o escoamento. </li><li> Repita os passos 2.4 e 2.5 três vezes, para um total de três lavagens 500μl. </li><li> Girar mais uma vez a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto seg; descartar o escoamento. </li><li> Coloque a coluna SNAP para um novo tubo de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 50μl de água DEPC quente (50 ° C) para a Coluna SNAP e coluna incubar a temperatura ambiente por 1 minuto. Eluir o cDNA através de um giro em 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto. </li><li> Repita o passo 2.9, utilizando 100μl de água DEPC quente e mesmo tubo 1,5 ml do eluente. </li><li> Adicionar 20μl de acetato de sódio 3M (pH 5,2) para o eluente das etapas 2.9 e 2.10. </li><li> Adicionar 3μl de glicogênio (20mg/ml) para o tubo e misturar. </li><li> Adicionar 500μl de etanol gelado 100%, misture bem e incubar os tubos durante 1 hora a -80 ° C. </li><li> Girar o tubo a 14.000 g a 4 ° C por 20 minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante. </li><li> Adicionar 500μl de etanol gelado 70% e girar o tubo a 14.000 g a 4 ° C por 5 minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante. </li><li> Secar a amostra por 5 minutos; assegurar que todos os EtOH é removido. </li><li> Aquecer o tampão de acoplamento 2X a 37 ° C por 5 minutos e voltar a suspender a amostra cDNA em 5μl de tampão de acoplamento quente 2X. </li><li> Aqueça o buffer / cDNA Coupling a 50 ° C por 10 minutos e vortex bem. Garantir que o seu pellet cDNA é totalmente re-suspenso no buffer de acoplamento 2X. </li></ol> Parte 3: Rotulagem com corante fluorescente Ao preparar a reação, tenha cuidado para minimizar a exposição da solução de corante à luz. Além disso, DMSO é higroscópico e absorve a umidade do ar, que vai reagir com o éster NHS do corante e reduzir significativamente a eficiência da reação de acoplamento. Manter o DMSO fornecido no kit em um frasco com tampa de rosca âmbar a -20 ° C, e deixe o frasco à temperatura ambiente antes de abrir para evitar a condensação. Use apenas o DMSO fornecidos com este kit. <ol><li> Abra um pacote de Cy-3 ou Cy-5 Dye e adicionar 75μl de DMSO diretamente para o frasco do corante. </li><li> Adicionar 5μl da solução de DMSO / tintura para o tubo de Passo 2,18. </li><li> Misture bem e incubar os tubos em temperatura ambiente no escuro por uma hora. </li><li> Adicionar 20μl da 3M acetato de sódio (pH 5,2) para a solução corante-coupled cDNA. </li><li> Adicionar 500μl de tampão de carregamento para a solução de cDNA. Misture bem em vórtice. </li><li> Coloque uma coluna SNAP em um tubo de coleta clara e carregue a solução de cDNA / buffer. </li><li> Giram a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto; descartar o escoamento. </li><li> Coloque a coluna SNAP na mesma coleçãotubo, adicionar 500μl de tampão de lavagem para a coluna. </li><li> Giram a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto; descartar o escoamento. </li><li> Repita os passos 3. 8-3,9 três vezes, para um total de três lavagens 500μl. </li><li> Girar mais uma vez a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto; descartar o escoamento. </li><li> Coloque a coluna SNAP para um novo tubo de recolha de âmbar. </li><li> Adicionar 65μl de água DEPC quente (50 ° C) para a Coluna SNAP e incubar à temperatura ambiente por 1 minuto. </li><li> Giram a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto e recolher o escoamento. O fluxo através deverá conter 60μl de sua purificada dye-coupled cDNA. </li></ol> Parte 4: Avaliar o procedimento de etiquetagem. <ol><li> Realizar um ensaio de espectrofotômetro para avaliar cada rotulagem Cy-cDNA. Calcular o número total de pmol de cDNA sintetizado: [OD 260 x vol. x 37ng/μl x 10 3 ng / pg] / 324,5 pg / pmol. Calcular o total de pmol incorporados Cy-Dye para cada reação rotulagem: pmol Cy3 = [OD 550 X vol.] / 0,15; pmol Cy5 = [OD 650 X vol.] / 0,25. Em seguida, calcular o pmol de nucleótidos / pmol relação de corante para cada reação. Reações ótima gerar&gt; 6000pmol de cDNA (por 60ul),&gt; 200pmol de Cy-Dye (por 60ul), e uma relação de nucleótidos / corante que é &lt;30. </li></ol> Parte 5: Slide de pré-lavagem <ol><li> O Array PtGen2 é impresso em slides Corning UltraGaps (amino-silano revestido) e cDNAs são UV-reticulado. Pontos de impressão são claramente visíveis devido ao alto teor de sal do buffer. </li><li> Use uma caneta de ponta de diamante para marcar o slide para as áreas superiores e inferiores da área de impressão (opcional). </li><li> Coloque cerca de 250mL pré-aquecido a 43 ° C 0,2% de solução SDS em microscópio de lavar prato de slides (3 &quot;x 4&quot;). </li><li> Colocar as lâminas de ser pré-hibridizada no rack de slides e mergulhe na solução de SDS 15-20 vezes muito vigorosamente para remover os sais nos slides. </li><li> Usando pinça, retire cuidadosamente os slides da prateleira e colocá-los em um frasco contendo tampão de hibridização Coplin Pré-(SSC 5X, SDS 0,1%, BSA 1%) que foi pré-aquecido a 43 ° C. Incubar a 43 ° C por pelo menos uma hora. </li></ol> Parte 6: Pré-hibridação <ol><li> Criar cinco pratos de slides de lavar roupa, cada uma preenchida com millipure dH 2 O, e um frasco cheio de Coplin molecular grau isopropanol. Colocar as lâminas em um rack de slides e processo sequencial através de cinco pratos com dunking 20 vezes cada. </li><li> Retirar as lâminas duas de cada vez a partir da lavagem com água e mergulhe quinta 5-6 vezes no lugar isopropanol e imediatamente em slides na microcentrífuga slide (de bancada Chipmate, 2 posições) e spin 1 minuto para secar. </li><li> Slides limpa com ar comprimido filtrado através de um cartucho de filtro de 0,22 mM e colocá-los com o código de barras virado para cima em uma Câmara Genomic Solutions hibridação. </li><li> LifterSlips Clean ™ com ar filtrado e posicioná-los nos slides com as tiras brancas voltada para baixo. Use a ponta da pipeta amarelo para alinhar suavemente o deslizamento levantador no slide (lavar LifterSlips ™ primeiro em etanol 70% é opcional. Descobrimos que ele seja desnecessário.) </li></ol> Parte 7: Hibridização Deve ser realizada à luz escura ou baixa. <ol><li> Para cada slide a ser hibridizado, calcular a quantidade de Cy-5 e Cy-3 rotulado cDNA para dar 50 75pmol de cada alvo. Combine os montantes em um único tubo e seca num exsicador de vácuo com a configuração de calor em 37-45 ° C. Evite secar completamente! </li><li> Volte a suspender as sondas secas em tampão de hibridação 60mL (feito fresco naquele dia) e brevemente vortex. </li><li> Incubar a cDNAs ressuspenso por 5 minutos em um banho de 95 ° C e depois de microcentrífuga rápida por 30 segundos. </li><li> Carregue o volume de sonda por toda ressuspenso lentamente na pipetagem o slide LifterSlip-junção ™ na parte inferior (fim do código de barras) do slide. O slide será carregado por meio de ação capilar. (Alguns preferem pipeta para o slide e então suavemente sobrepor a LifterSlip ™ este é um método um tiro, pois se você ficar bolhas você não pode mover o ™ LifterSlip após a colocação que pode levar a manchas local artefatos) </li><li> 20uL lugar de DTT 100mM em cada umidade bem localizado nas extremidades da câmara. </li><li> Coloque a parte superior da câmara e aperte os parafusos cam. Cobrir a câmara com folha de alumínio e mergulhe em um banho de água 48 ° C por 12-18 horas, com agitação suave a 50-60 rpm. </li></ol> Parte 8: Pós-hibridação Lava Todas as lavagens devem ser realizadas à luz escura ou baixa. Slides nunca deve ser deixada para secar até a etapa final. <ol><li> Criar um jar Coplin preenchido com solução de lavagem # 1 @ 53 ° C, e quatro pratos de slides de lavar cheia de 250mL de cada um dos seguintes: 1) Wash Solução # 1 @ 53 ° C, 2) Solução de Lavagem # 2 @ temperatura ambiente, 3 e 4) dois pratos contendo solução de lavagem # 3 @ temperatura ambiente. </li><li> Remova cuidadosamente os slides das câmaras de hibridação e coloque-os dois de uma vez dentro do frasco Coplin. Deixe descansar por 30 segundos, em seguida, levante a deslizar para fora lentamente e os slip levantador permanecerá na jarra. Colocar as lâminas em porta-lâminas e imediatamente mergulhe na solução de lavagem # 1 (1X SSC, 0,2% SDS, pré-aqueça a 43 ° C). Repita até que todos LifterSlips são removidos e todas as lâminas a serem lavadas na solução de lavagem # 1 prato. Mergulhe em rack cima e para baixo 10 vezes vigorosamente. </li><li> Coloque no prato de 53 ° C no ar shaker com agitação 50-100 rpm em 10 minutos. </li><li> Transferência de rack para Solução de lavagem # 2 (0,1 x SSC, 0,2% SDS), mergulhe 10 vezes, e incubar à temperatura ambiente, lenta agitação por 10 minutos. </li><li> Dip em rack de 15 vezes para a solução de lavagem primeira # 3 (0,1 x SSC) para remover qualquer SDS residual transitar de Solução de Lavagem # 2. Rack de lugar na solução de lavagem segunda # 3 prato, mergulhar 10 vezes, e em seguida lenta agitação por 10 minutos. </li><li> Colocar as lâminas em 50 mL tubos Falcon nivelado e girar @ 1.500 rpm em centrífuga equipado com um rotor de caçamba móvel. Retirar as lâminas à luz recipiente à prova, usamos um outro tubo de Falcon coberto com papel alumínio e ar de purga do tubo com gás nitrogênio, tampa bem (o que reduz a oxidação dos corantes Cy, especialmente Cy-5 no verão, quando os níveis de ozônio são mais elevados ). Lâminas podem ser armazenadas por algumas horas antes da digitalização nos tubos de nitrogênio purgado, no entanto, melhores resultados são obtidos quando sinal de digitalização é feito imediatamente após a lavagem. </li></ol> Parte 9: Coleta de Dados e Análise Estatística <ol><li> Dados de imagem de verificação é recolhida em um ScanArray PerkinElmer. Nós usamos uma configuração de digitalização de 10 micra e equilíbrio Cy3 e Cy5 sinais utilizando o método de ajuste da linha de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> TIF são grade e dados de sinal primas coletadas e filtradas com ImaGene Versão 7.5 (Biodiscovery, Inc., El Segundo, CA) </li><li> Normalização de dados e avaliação para determinar estatisticamente espécie válida diferencialmente expressos é feito com ferramentas de matriz BRB Ver. 3.7. </li><li> Análise de padrões para facilitar a determinação de genes expressos coordenadamente é feito com Gene Software Análise de Expressão de Padrão (GEPAS) Ver. 3.1. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1182/Figure1_WWLorenz-1.png" alt="Figura 1" /> Figura 1. Exemplo de PtGen2 série processados ​​usando este l. Protoco <img src="/files/ftp_upload/1182/Figure2_WWLorenz.png" alt="Figura 2" /> Figura 2. Exemplo de PtGen2 série processados ​​usando hibridização e protocolos padrão de lavar roupa.

<ol><li>Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+stress-responsive+genes+in+loblolly+pine+%28Pinus+taeda%29+roots+identified+by+analyses+of+expressed+sequence+tag+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Physiol%22%5BJournal%5D)">Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries.</a> Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).</li>
<li>Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.</li>
<li>Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concise+guide+to+cDNA+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A concise guide to cDNA microarray analysis.</a> Biotechniques. 29, 548-562 (2000).</li>
<li>Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESTs%2C+cDNA+microarrays%2C+and+gene+expression+profiling%3A+tools+for+dissecting+plant+physiology+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development.</a> The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).</li>
<li>Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. August 25-29, Quebec City, Quebec, , (2008).</li>
<li>Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. September 24-27, Albena, Bulgaria, , (2008).</li>
</ol>

PtGen2 é um recentemente desenvolvido, personalizado microarray de cDNA, que foi projetado para ser usado principalmente pela comunidade de pesquisa loblolly pinho. Os resultados preliminares gerados até o momento têm demonstrado a matriz para ser uma ferramenta valiosa na avaliação de eventos transcricionais que ocorrem em resposta ao estresse hídrico, bem como no monitoramento das mudanças que ocorrem durante o desenvolvimento do embrião no pinheiro bravo, Pinus pinaster 5,6 Temos também demonstrou...

<table><tbody><tr><td>Tampão de pré-hibridização</td><td>Tampão</td><td></td><td></td><td>5X SSC, 0,1% SDS, 1% BSA</td></tr><tr><td>Tampão de hibridização</td><td>Tampão</td><td></td><td></td><td>30% formamida, 5X SSC, 5X Denhardt&amp;rsquo;s, RNA PolyA 1%, (Invitrogen, POLYA.GF), SDS 0,1%</td></tr><tr><td>Solução Lavagem nº 1</td><td>Tampão</td><td></td><td></td><td>1X SSC, 0,2% SDS, pré-aquecer a 43&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Solução Lavagem nº 2</td><td>Tampão</td><td></td><td></td><td>0,1X SSC, 0,2% SDS</td></tr><tr><td>Solução Lavagem nº 3</td><td>Tampão</td><td></td><td></td><td>0,1X SSC</td></tr><tr><td>Álcool Isopropílico</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34959-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 50 mL</td><td>Outro</td><td>Falcon BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 15 mL</td><td>Outro</td><td>Falcon BD</td><td>352196</td><td>Use esta ou uma tampa semelhante colocada na parte inferior de cada tubo cônico de 50 mL durante a centrifugação</td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td></td><td>Wheaton</td><td>900520</td><td></td></tr><tr><td>Placa de coloração &amp;& Suporte </td><td>Outro</td><td>Wheaton</td><td>900200</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Outro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9418</td><td></td></tr><tr><td>RNA poliA</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>POLYA.GF</td><td></td></tr><tr><td>Rotulagem Indireta de cDNA SuperScriptTM </td><td>Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L1014-02</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>Sistema</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corante Cy-5</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25001</td><td></td></tr><tr><td>Corante Cy-3</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23001</td><td></td></tr><tr><td>LifterSlips&amp;#8482;</td><td>Outro</td><td>Erie Scientific</td><td>25X601</td><td></td></tr><tr><td>HybChambers</td><td>Equipamento</td><td>GeneMachines</td><td>JHYB200003</td><td></td></tr></tbody></table>

processamento do loblolly pine ptgen2 cdna microarray

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 é um microarray de cDNA contendo funcionalidade 26.496 ESTs pinheiros loblolly amplificada. A matriz é produzido em nosso laboratório a ser utilizado por pesquisadores que estudam a expressão gênica em espécies de coníferas de pinheiros e outras. PtGen2 foi desenvolvido como resultado de nossos esforços gene descoberta em pinheiro, e é composta de seqüências identificadas principalmente a partir de tecidos de raiz, mas também de agulha e tronco 1,2. PtGen2 foi testado por hibridação diferentes Cy dye-rotulados cDNAs alvo de coníferas , usando tanto amplificadas e não amplificadas métodos de rotulagem indireta, e também testados com uma série de condições de hibridização e lavagem. Este vídeo enfoca a manipulação e processamento de slides antes e após a pré-hibridização, bem como após a hibridização, utilizando-se algumas modificações para os procedimentos desenvolvidos anteriormente 3,4. Também estão incluídos, em forma de texto único, são os protocolos utilizados para a geração, rotulagem e limpeza de cDNA s alvo, bem como informações sobre o software usado para processamento de dados a jusante. PtGen2 é impresso com um buffer de impressão proprietária que contém altas concentrações de sal que pode ser difícil de remover completamente. As lâminas são lavadas primeiro em uma solução SDS quente antes de pré-hibridização. Após a pré-hibridização, as lâminas são lavadas vigorosamente em várias mudanças de água para completar a remoção dos sais remanescentes. LifterSlips ™ são limpos e, em seguida, posicionado na slides e rotulado cDNA é cuidadosamente carregado no microarray por meio de ação capilar que prevê a distribuição uniforme da amostra em todo o slide, e reduz a chance de incorporação de espuma. Hibridação de metas para a matriz é feita a 48 ° C em condições de alta umidade. Após a hibridização, uma série de lavagens padrão são feitas a 53 ° C e temperatura ambiente por longos períodos. Processamento PtGen2 slides usando esta técnica reduz o sal ea SDS-artefatos derivados muitas vezes visto quando a matriz é processada menos rigorosa. Hibridação alvos derivado de várias fontes diferentes de coníferas RNA, este protocolo de processamento rendeu menos artefatos, fundo reduzida, e desde uma maior consistência entre os diferentes grupos experimentais de matrizes.

O cDNA microarray PtGen2 foi desenvolvido para estudos de expressão gênica em mudas de pinus,<em&gt; P. taeda</em&gt;, E outras espécies de coníferas. Aqui, vamos mostrar pré e pós-hibridação manuseio e técnicas de lavagem que pode ser usado com esta matriz para produzir uma maior consistência, artefatos reduzida, e fundos mais baixos.

Processamento do Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

O PtGen2 é um microarray de cDNA com 26.496 características, contendo ESTs amplificadas de pinheiro-taeda. O array é produzido em nosso laboratório para uso por pesquisadores...

Este vídeo foi produzido por pesquisadores da Escola Warnell de Silvicultura e Recursos Naturais da Universidade da Geórgia. O objetivo deste vídeo de treinamento é detalhar como processar nossa microplaca de cDNA de pinheiro lolly LOB, geração dois, prestando especial atenção ao lavagem e manipulação da placa, tanto antes quanto após a hibridização. Em geral, nossos protocolos seguem aqueles desenvolvidos pelo Instituto de Pesquisa Genômica Tiger e pela Instalação Compartilhada de Microplacas da Vanderbilt, VMSR, onde nossas placas são impressas.Descobrimos que um processamento mais rigoroso do PT Gen dois é necessário para proporcionar o maior grau de consistência em relação à uniformidade da qualidade do sinal e a fundos baixos. O primeiro passo é uma pré-lavagem. Fazemos isso porque nosso tampão de deposição contém um teor muito alto de sal, e essa pré-lavagem é necessária para remover esse sal.As lâminas são colocadas em um porta-lâminas para microscópio e mergulhadas vigorosamente de 15 a 20 vezes em uma solução de SDS 0,2% previamente aquecida a 43 graus. Após a lavagem das lâminas na solução de SDS, elas são cuidadosamente removidas com pinça para um frasco de Copeland contendo tampão de pré-hibridização. Este tampão contém cinco XSSC, SDS 0,1% e BSA 1%, e também é aquecido a 43 graus.O frasco Copeland é coberto com parafina e colocado em uma incubadora a 43 graus por uma hora. Após a pré-hibridização, as lâminas são transferidas para um porta-lâminas e processadas sucessivamente em cinco mudanças de água desionizada, mergulhando de 15 a 20 vezes em cada mudança. Por fim, as lâminas são colocadas em isopropanol e mergulhadas cinco ou seis vezes antes de serem centrifugadas até secagem em uma centrífuga Chip M Mate.Após a centrifugação, as lâminas são sopradas com ar comprimido passado por um filtro de 0,2 mícron. Em seguida, as lâminas são cobertas com lamínulas elevadoras, que também foram limpas com ar comprimido, e utilizamos uma ponteira de pipeta pequena para ajustar a lamínula elevadora na posição correta sobre a lâmina.Depois que as lamínulas espaçadoras forem posicionadas, mas antes de adicionar o tampão de hibridização, adicionamos 20 microlitros de dihi de 100 milimolar, três atol aos poços de umidade localizados nas extremidades da câmara. Agora estamos prontos para adicionar as cDNAs alvo, que foram ressuspendidas em tampão de hibridização. A ponta da pipeta é colocada na borda da lamínula espaçadora e da lâmina, e a solução é pipetada lentamente.Descobrimos que utilizar o efeito capilar para carregar as matrizes fornece a maior consistência e reduz significativamente a incorporação de bolhas indesejadas. Após o material-alvo ter sido adicionado à matriz, a câmara de hibridização é montada e coberta com papel alumínio. Em seguida, a câmara de hibridização é colocada em um banho-maria agitado para incubação noturna, geralmente de 14 a 16 horas.O banho-maria é ajustado a 48 graus e o agitador é ajustado a 50 rpm. É importante observar também que, a partir do momento da adição da solução de hibridização até todas as lavagens pós-hibridização, os procedimentos são realizados sob luz reduzida para evitar a foto-oxidação. No dia seguinte, as lâminas são retiradas da câmara de hibridização e colocadas em um frasco Copeland contendo a solução de lavagem número um, previamente aquecida a 53 graus.As lâminas permanecem no frasco de Copeland por cerca de um minuto, até que os elevadores soltem, momento em que são cuidadosamente removidas com pinça e colocadas em um porta-lâminas para microscópio para prosseguir com as lavagens. Em seguida, as lâminas são mergulhadas vigorosamente cerca de 15 a 20 vezes em um segundo recipiente, que também contém a solução de lavagem número um a 53 graus. O recipiente é então coberto com parafina e colocado em um agitador de incubação com ar regulado a 53 graus e 100 RPM.Após a incubação de 10 minutos e a solução de lavagem número um, os lâminas são mergulhadas vigorosamente de 15 a 20 vezes em um recipiente com a solução de lavagem número dois, que está à temperatura ambiente. Este recipiente é coberto com filme parafilm e colocado novamente em agitação à temperatura ambiente por uma incubação de 10 minutos. Finalmente, os lâminas são removidos da solução de lavagem número dois e mergulhados vigorosamente de 15 a 20 vezes em um recipiente com a solução de lavagem número três.Em seguida, as lâminas são transferidas para um segundo recipiente contendo a solução de lavagem número três, coberta com perfil, e novamente colocadas no agitador por 10 minutos. Após a lavagem final, centrifugamos as lâminas até completa secagem. Para isso, colocamos uma tampa Falcon de 15 ml em um tubo cônico de 50 ml e inserimos as matrizes com o lado do código de barras voltado para baixo no tubo cônico.Os tubos são então centrifugados em rotor de balde oscilante a 1500 RPM, em temperatura ambiente. Após a centrifugação, os lâminas são transferidos para um segundo conjunto de tubos cónicos de 50 mil, previamente cobertos com folha de alumínio. Em seguida, os tubos são purgados com gás nitrogênio, que passa por um filtro de 0,22 mícron, e tampados para transporte ou armazenamento até a digitalização.Coletamos os dados de varredura em um PerkinElmer ScanArray 5.000. A imagem do arranjo é alinhada em grade e os dados brutos de varredura são processados, sendo a análise inicial dos dados realizada com o conjunto de softwares de imagem da BioDiscovery. Em seguida, as intensidades dos sinais dos pontos são normalizadas e as análises estatísticas são realizadas com as ferramentas BRB Array, um pacote estatístico robusto e de acesso livre para microrrearranjos, disponível para download no Instituto Nacional do Câncer.Outras análises estatísticas e buscas de padrões de expressão gênica são realizadas com o conjunto de análise e padrão de expressão gênica Jeep PPAs. Outro pacote de análise baseado na web gratuitamente disponível. Obrigado por assistir ao nosso vídeo sobre como processar o microarranjo PT Gen dois da pinha lob lolly.Os seguintes indivíduos foram responsáveis pelo conteúdo e pela produção deste vídeo de treinamento.

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Muitos tecidos vegetais, incluindo floema e xilema do pinheiro...

Um método melhorado de isolamento de RNA Pine Loblolly ( P. taeda L.) e espécies de coníferas Outros

Uma busca fundamentais em biologia celular é definir os mecanismos subjacentes à identidade dos organelos que tornam as células eucarióticas. Aqui é proposto um método para identificar os genes responsáveis ​​pela integridade morfológica e funcional de organelas vegetais utilizando microscopia de fluorescência e as ferramentas a próxima geração de sequenciação.

Microscopia de fluorescência de Triagem e seqüenciamento da próxima geração: Ferramentas úteis para a identificação de genes envolvidos na integridade das Organelas

Este manuscrito descreve o uso de tecnologia de ponta fornecida por microarrays de DNA. Os microarrays fornecem uma visão geral das alterações transcriptômicas em bactérias incorridas sob uma condição específica. Além disso, destacamos a facilidade com que grandes quantidades de dados podem ser analisadas usando pacotes de software desenvolvidos internamente convenientes.

A Pipeline rápido e confiável para estudo de Análise de Caso bacteriana transcriptoma: Regulamento Gene Serina-dependente em<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

A tecnologia de microarray permite a medição quantitativa e o perfil de expressão gênica de transcritos em todo o genoma. Portanto, este protocolo fornece um procedimento técnico otimizado em uma matriz bovina personalizada de duas cores usando embriões bovinos do Dia 7 para demonstrar a viabilidade do uso de baixa quantidade de RNA total.

Transcriptoma Profiling de In-Vivo embriões produzidos pré-implantação dos bovinos por meio de duas cores Plataforma Microarray

Este artigo descreve a aplicação de metabolômica irrelevantes, transcriptomics e análise estatística multivariada para transcrições baga da uva e metabolitos, a fim de ter uma visão sobre o conceito terroir, ou seja, o impacto do meio ambiente sobre características de qualidade de baga.

O Conceito Terroir Interpretado através da baga da uva Metabolomics e transcriptómica

Este artigo descreve o procedimento para a identificação e caracterização de uma família de gene em videira aplicada à família de Arabidopsis Tóxicos em Levadura (ATL) E3 ubiquitina ligases.

Fluxo de trabalho abrangente para a identificação de todo o genoma e Meta-análise da expressão da ATL E3 ubiquitina Ligase Gene família em videira

Este protocolo descreve os processos gerais e controle de qualidade verifica necessário para a preparação de células simples mamíferos adultas saudáveis para preparações de RNA-Seq de célula única baseada em gotículas, alta taxa de transferência. Parâmetros de sequenciamento, alinhamento de leitura e análise de bioinformatic a jusante de célula única também são fornecidos.

Transcriptomics de célula única baseada em código de barras da gota de tecidos de mamíferos adultos

Este estudo apresenta um protocolo multioma espacial Trekker–CUT&amp;Tag que combina codificação de barras espacial direta de uma seção de tecido com análise multioma de célula única. Essa abordagem permite o perfilamento espacialmente resolvido de uma única célula da expressão gênica e a modificação da histona H3K27ac simultaneamente, oferecendo insights mecanicistas sobre a regulação gênica no contexto da microanatomia tecidual.

Perfilamento Multiômico Integrado de Célula Única Espacialmente Resolvido do Transcriptoma e Alvos Epigenômicos em Seções de Tecido Congelado

Para estudar os processos de desenvolvimento de ascósporos em Gibberella zeae, um procedimento de coleta em condições estéreis é filmado de forma a gerar o maior nível de informação para a descrição do protocolo. Isso deve facilitar a reprodutibilidade do experimento, um aspecto crucial quando completa do genoma testes perfil de expressão são implementadas.

Gibberella zeae produção de ascósporos e Coleta de Experimentos de Microarray.

Aprenda a processar o microarray de cDNA PtGen2 do pinheiro loblolly, incluindo técnicas de lavagem pré e pós-hibridização. Este método padronizado melhora a consistência dos dados de expressão gênica e reduz artefatos em estudos com coníferas.

Processamento do Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

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