Processamento do Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

Este vídeo foi produzido por pesquisadores da Warnell School of Forestry and Natural Resources da Universidade da Geórgia. O objetivo deste vídeo de treinamento é detalhar como processar nosso LOB lolly pine pt, gen two CDNA, microarray, prestando atenção especial à lavagem e manuseio da matriz, antes e depois da hibridização. Em geral, nossos protocolos seguem aqueles desenvolvidos no Institute for Genomic Research Tiger e no Vanderbilt Microarray Shared Resource Facility, VMSR, onde nossas matrizes são impressas.

Descobrimos que o processamento mais rigoroso do PT Gen dois é necessário para fornecer a maior consistência em relação à uniformidade da qualidade do sinal e baixos fundos. O primeiro passo é uma pré-lavagem. Fazemos isso porque nosso tampão de manchas contém um teor de sal muito alto e essa pré-lavagem é necessária para remover esse sal.

As lâminas são colocadas em um suporte de lâminas de microscópio e mergulham vigorosamente de 15 a 20 vezes em uma solução de SDS a 0,2% que foi pré-aquecida a 43 graus. Depois que as lâminas são lavadas na solução SDS, elas são removidas cuidadosamente com uma pinça em um frasco Copeland contendo tampão de pré-hibridização. Este tampão contém cinco XSSC 0,1% SDS e 1% BSA, e também é aquecido a 43 graus.

O frasco Copeland é coberto com parfum e colocado em uma incubadora de 43 graus por uma hora. Após a pré-hibridização, as lâminas são removidas para um suporte de lâmina de microscópio e processadas sucessivamente por meio de cinco trocas de água deionizada mergulhando de 15 a 20 vezes em cada troca. Finalmente, as lâminas são colocadas em isopropanol e mergulhadas cinco ou seis vezes antes de serem centrifugadas até a secura em uma centrífuga de chip M mate.

Após a centrifugação, as lâminas são sopradas com ar comprimido passado por um filtro de 0,2 mícron. As lâminas são então revestidas com deslizamentos de elevador, que também foram limpos com ar comprimido, e usamos uma pequena ponta de pipeta para ajustar o deslizamento do elevador na posição correta. No slide.

Depois que os deslizamentos do elevador foram posicionados, mas antes que o tampão de hibridização seja adicionado, adicionamos 20 microlitros de 100 milimolares dihi, três atol aos poços de umidade localizados nas extremidades da câmara. Agora estamos prontos para adicionar os CDNAs de destino, que foram ressuspensos no buffer de hibridização. A ponta da pipeta é colocada na borda da lâmina do elevador e a lâmina e a solução são pipetadas lentamente.

Descobrimos que utilizar o efeito capilar para carregar as matrizes fornece mais consistência e reduz muito a incorporação de bolhas indesejadas. Depois que o material alvo foi adicionado à matriz, a câmara de hibridização é montada e coberta com folha de alumínio. A câmara de hibridização é então colocada em banho-maria agitado para incubação durante a noite, normalmente de 14 a 16 horas.

O banho-maria é ajustado para 48 graus e o agitador é ajustado para 50 rpm. É importante notar também que desde o ponto de adição da solução de hibridização até todas as lavagens pós-hibridização, os procedimentos são realizados com pouca luz para evitar a fotooxidação. No dia seguinte, as lâminas são removidas da câmara de hibridização e colocadas em um frasco Copeland contendo a solução de lavagem número um, que foi pré-aquecida a 53 graus.

As lâminas podem permanecer no frasco Copeland por cerca de um minuto até que as lâminas do elevador caiam, momento em que as lâminas são removidas suavemente com uma pinça e colocadas em um suporte de lâminas de microscópio para prosseguir com as lavagens. As lâminas são então mergulhadas vigorosamente cerca de 15 a 20 vezes em um segundo recipiente, também contendo a solução de lavagem número um a 53 graus. O recipiente é então coberto com parfum e colocado em um agitador de ar da incubadora ajustado a 53 graus e cem RPM.

Após a incubação de 10 minutos e a solução de lavagem, número um, as lâminas são mergulhadas vigorosamente 15 a 20 vezes em um recipiente com a solução de lavagem número dois, que está à temperatura ambiente do recipiente. Isso foi coberto com filme para e colocado novamente em uma coqueteleira em temperatura ambiente para uma incubação de 10 minutos. Finalmente, as lâminas são removidas da solução de lavagem número dois e mergulhadas vigorosamente 15 a 20 vezes em um recipiente com a solução de lavagem número três.

As lâminas são então removidas para um segundo recipiente da solução de lavagem número três coberta com perfil e novamente colocadas no agitador por 10 minutos. Após a lavagem final, centrifugamos as lâminas até a secagem completa. Para fazer isso, colocamos uma tampa Falcon de 15 mil em um tubo cônico de 50 mil e colocamos o lado do código de barras das matrizes voltado para baixo no tubo cônico.

Os tubos são então girados em uma cabeça de caçamba oscilante a 1500 RPM à temperatura ambiente. Após a centrifugação, as lâminas são removidas para um segundo conjunto de tubos cônicos de 50 mil, que foram cobertos com papel alumínio. Os tubos são então purgados com gás nitrogênio, que é filtrado através de um filtro de 0,22 mícron e tampa para transporte ou armazenamento até a digitalização.

Coletamos dados de varredura em uma matriz de varredura PerkinElmer 5.000. A imagem da matriz é quadriculada e os dados brutos de varredura são processados e a análise inicial dos dados é feita com o pacote de software de imagem da biodescoberta. Em seguida, os dados de intensidade do sinal pontual são normalizados à medida que a análise estatística é realizada com as ferramentas de matriz BRB, um pacote estatístico de microarray robusto e disponível gratuitamente que pode ser baixado do National Cancer Institute.

Outras análises estatísticas e pesquisas de padrões de expressão gênica são realizadas com o padrão de expressão gênica e o conjunto de análises Jeep PPAs. Outro pacote de análise baseado na web disponível gratuitamente. Obrigado por assistir ao nosso vídeo sobre como processar o microarray PT Gen dois de pinheiro lolly pine.

Os seguintes indivíduos foram responsáveis pelo conteúdo e produção deste vídeo de treinamento.