Processamento do Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray
20 de março de 2009
O cDNA microarray PtGen2 foi desenvolvido para estudos de expressão gênica em mudas de pinus, P. taeda, E outras espécies de coníferas. Aqui, vamos mostrar pré e pós-hibridação manuseio e técnicas de lavagem que pode ser usado com esta matriz para produzir uma maior consistência, artefatos reduzida, e fundos mais baixos.
Este vídeo foi produzido por pesquisadores da Escola Warnell de Silvicultura e Recursos Naturais da Universidade da Geórgia. O objetivo deste vídeo de treinamento é detalhar como processar nossa microplaca de cDNA de pinheiro lolly LOB, geração dois, prestando especial atenção ao lavagem e manipulação da placa, tanto antes quanto após a hibridização. Em geral, nossos protocolos seguem aqueles desenvolvidos pelo Instituto de Pesquisa Genômica Tiger e pela Instalação Compartilhada de Microplacas da Vanderbilt, VMSR, onde nossas placas são impressas.
Descobrimos que um processamento mais rigoroso do PT Gen dois é necessário para proporcionar o maior grau de consistência em relação à uniformidade da qualidade do sinal e a fundos baixos. O primeiro passo é uma pré-lavagem. Fazemos isso porque nosso tampão de deposição contém um teor muito alto de sal, e essa pré-lavagem é necessária para remover esse sal.
As lâminas são colocadas em um porta-lâminas para microscópio e mergulhadas vigorosamente de 15 a 20 vezes em uma solução de SDS 0,2% previamente aquecida a 43 graus. Após a lavagem das lâminas na solução de SDS, elas são cuidadosamente removidas com pinça para um frasco de Copeland contendo tampão de pré-hibridização. Este tampão contém cinco XSSC, SDS 0,1% e BSA 1%, e também é aquecido a 43 graus.
O frasco Copeland é coberto com parafina e colocado em uma incubadora a 43 graus por uma hora. Após a pré-hibridização, as lâminas são transferidas para um porta-lâminas e processadas sucessivamente em cinco mudanças de água desionizada, mergulhando de 15 a 20 vezes em cada mudança. Por fim, as lâminas são colocadas em isopropanol e mergulhadas cinco ou seis vezes antes de serem centrifugadas até secagem em uma centrífuga Chip M Mate.
Após a centrifugação, as lâminas são sopradas com ar comprimido passado por um filtro de 0,2 mícron. Em seguida, as lâminas são cobertas com lamínulas elevadoras, que também foram limpas com ar comprimido, e utilizamos uma ponteira de pipeta pequena para ajustar a lamínula elevadora na posição correta sobre a lâmina.
Depois que as lamínulas espaçadoras forem posicionadas, mas antes de adicionar o tampão de hibridização, adicionamos 20 microlitros de dihi de 100 milimolar, três atol aos poços de umidade localizados nas extremidades da câmara. Agora estamos prontos para adicionar as cDNAs alvo, que foram ressuspendidas em tampão de hibridização. A ponta da pipeta é colocada na borda da lamínula espaçadora e da lâmina, e a solução é pipetada lentamente.
Descobrimos que utilizar o efeito capilar para carregar as matrizes fornece a maior consistência e reduz significativamente a incorporação de bolhas indesejadas. Após o material-alvo ter sido adicionado à matriz, a câmara de hibridização é montada e coberta com papel alumínio. Em seguida, a câmara de hibridização é colocada em um banho-maria agitado para incubação noturna, geralmente de 14 a 16 horas.
O banho-maria é ajustado a 48 graus e o agitador é ajustado a 50 rpm. É importante observar também que, a partir do momento da adição da solução de hibridização até todas as lavagens pós-hibridização, os procedimentos são realizados sob luz reduzida para evitar a foto-oxidação. No dia seguinte, as lâminas são retiradas da câmara de hibridização e colocadas em um frasco Copeland contendo a solução de lavagem número um, previamente aquecida a 53 graus.
As lâminas permanecem no frasco de Copeland por cerca de um minuto, até que os elevadores soltem, momento em que são cuidadosamente removidas com pinça e colocadas em um porta-lâminas para microscópio para prosseguir com as lavagens. Em seguida, as lâminas são mergulhadas vigorosamente cerca de 15 a 20 vezes em um segundo recipiente, que também contém a solução de lavagem número um a 53 graus. O recipiente é então coberto com parafina e colocado em um agitador de incubação com ar regulado a 53 graus e 100 RPM.
Após a incubação de 10 minutos e a solução de lavagem número um, os lâminas são mergulhadas vigorosamente de 15 a 20 vezes em um recipiente com a solução de lavagem número dois, que está à temperatura ambiente. Este recipiente é coberto com filme parafilm e colocado novamente em agitação à temperatura ambiente por uma incubação de 10 minutos. Finalmente, os lâminas são removidos da solução de lavagem número dois e mergulhados vigorosamente de 15 a 20 vezes em um recipiente com a solução de lavagem número três.
Em seguida, as lâminas são transferidas para um segundo recipiente contendo a solução de lavagem número três, coberta com perfil, e novamente colocadas no agitador por 10 minutos. Após a lavagem final, centrifugamos as lâminas até completa secagem. Para isso, colocamos uma tampa Falcon de 15 ml em um tubo cônico de 50 ml e inserimos as matrizes com o lado do código de barras voltado para baixo no tubo cônico.
Os tubos são então centrifugados em rotor de balde oscilante a 1500 RPM, em temperatura ambiente. Após a centrifugação, os lâminas são transferidos para um segundo conjunto de tubos cónicos de 50 mil, previamente cobertos com folha de alumínio. Em seguida, os tubos são purgados com gás nitrogênio, que passa por um filtro de 0,22 mícron, e tampados para transporte ou armazenamento até a digitalização.
Coletamos os dados de varredura em um PerkinElmer ScanArray 5.000. A imagem do arranjo é alinhada em grade e os dados brutos de varredura são processados, sendo a análise inicial dos dados realizada com o conjunto de softwares de imagem da BioDiscovery. Em seguida, as intensidades dos sinais dos pontos são normalizadas e as análises estatísticas são realizadas com as ferramentas BRB Array, um pacote estatístico robusto e de acesso livre para microrrearranjos, disponível para download no Instituto Nacional do Câncer.
Outras análises estatísticas e buscas de padrões de expressão gênica são realizadas com o conjunto de análise e padrão de expressão gênica Jeep PPAs. Outro pacote de análise baseado na web gratuitamente disponível. Obrigado por assistir ao nosso vídeo sobre como processar o microarranjo PT Gen dois da pinha lob lolly.
Os seguintes indivíduos foram responsáveis pelo conteúdo e pela produção deste vídeo de treinamento.
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Visão Geral
Este artigo apresenta a matriz de cDNA PtGen2 desenvolvida para estudos de expressão gênica em pinheiro-lobo (loblolly pine) e outras espécies de coníferas. Detalha as técnicas de manipulação e lavagem antes e após a hibridização para melhorar a consistência e reduzir artefatos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Análise de expressão gênica
- Tecnologia de microarranjos
- Biologia vegetal
Antecedentes
- As microarranjos de cDNA são essenciais para o estudo da expressão gênica.
- O PtGen2 foi especificamente desenvolvido para o pinheiro-loblolly e para gimnospérmicas.
- Técnicas adequadas de manipulação são cruciais para resultados confiáveis.
- O alto teor de sal no tampão de deposição exige uma pré-lavagem.
Objetivo do Estudo
- Para melhorar a consistência dos dados de expressão gênica.
- Para reduzir o ruído de fundo nos resultados de microarranjos.
- Para fornecer um protocolo padronizado aos pesquisadores.
Métodos Utilizados
- Pré-lavagem para remover o sal do tampão de deposição.
- Técnicas de lavagem rigorosas após a hibridização.
- Comparação com protocolos de instituições de pesquisa estabelecidas.
- Avaliação da qualidade do sinal e dos níveis de fundo.
Resultados Principais
- Observou-se melhoria na consistência da qualidade do sinal.
- Níveis mais baixos de ruído de fundo alcançados com técnicas aprimoradas.
- Os protocolos demonstraram eficácia em múltiplos experimentos.
- Foram fornecidas recomendações para estudos futuros.
Conclusões
- Técnicas aprimoradas de manipulação e lavagem são fundamentais para o sucesso da microarray.
- Protocolos padronizados podem levar a dados mais confiáveis de expressão gênica.
- Pesquisas futuras podem se basear nestes achados para obter melhores resultados.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo aborda um desafio fundamental na genômica de plantas: obter dados reprodutíveis de microarranjos apesar dos tampões de deposição de alta salinidade, que podem introduzir artefatos. Ao padronizar os passos de lavagem antes e após a hibridização, o método melhora a consistência dos dados e reduz o ruído de fundo, permitindo um perfil confiável de expressão gênica em espécies de coníferas. Isso contribui para os esforços de validação de alvos na biotecnologia florestal, possibilitando a detecção mais clara de genes diferencialmente expressos sob condições experimentais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de respostas transcricionais em tecidos de coníferas, apoiando testes de hipóteses em vias de estresse ou desenvolvimento.
- Valor Operacional: Reduz a variabilidade técnica decorrente de artefatos de sal, aumentando a confiança na identificação de alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz lâminas de microarranjo padronizadas e de baixo fundo, adequadas para hibridização reprodutível entre grupos experimentais.
- Valor Operacional: Estabelece um fluxo de trabalho robusto de preparação de lâminas que melhora a reprodutibilidade e a escalabilidade do ensaio.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a desmistificação mecanicista ao fornecer perfis de expressão confiáveis de tecidos de pinheiro, úteis no estudo da adaptação ambiental ou da formação da madeira.
- Valor Operacional: Facilita a comparabilidade entre estudos por meio do processamento consistente de lâminas, auxiliando a continuidade translacional.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no fluxo de trabalho da biologia de descoberta, apoiando especificamente o perfilhamento confiável de alvos em sistemas de plantas não modelares onde as ferramentas genéticas são limitadas.
- Biologia de Descoberta: Permite análise de expressão orientada por hipóteses em pinheiro-loblolly, esclarecendo respostas gênicas em tecidos de raiz, agulha e caule.
- Triagem: Fornece lâminas de microarranjo com qualidade uniforme de sinal, possibilitando triagem comparativa confiável da expressão gênica sob diferentes condições.
- Análise: Gera dados de intensidade de sinal limpos e normalizados, compatíveis com ferramentas posteriores como BRB Array Tools e JePPAs para análise estatística.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade do descobrimento gênico até a validação funcional, fornecendo bases confiáveis de expressão.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um protocolo reutilizável de preparação de lâminas que pode ser aplicado em múltiplas espécies de coníferas e delineamentos experimentais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Melhora a confiabilidade preditiva das medidas de expressão gênica ao minimizar artefatos derivados de sais e SDS.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade entre lâminas e laboratórios por meio de etapas definidas de lavagem e manipulação.
- Valor Estratégico: Reduz o risco de resultados falsos positivos/negativos no perfil de expressão, favorecendo decisões mais assertivas de avançar/não avançar na validação de alvos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de genes candidatos com base em dados de expressão mais limpos e confiáveis.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manuseio de microarranjos e técnicas de hibridização.
- Requer acesso a banhos-maria com controle de temperatura, incubadoras e centrífugas para o processamento das lâminas.
- Exige reagentes padronizados, incluindo SDS, SSC, BSA e isopropanol, para lavagem e desidratação.
- Requer adaptação do controle de umidade e do tempo de hibridização com base na origem do RNA alvo e no método de marcação.
- Limitação prática: o tampão de deposição com alta concentração de sal exige uma pré-lavagem rigorosa; a remoção incompleta do sal pode persistir se os passos forem abreviados.
