Name: Zebrafish Injection Ventrículo Cerebral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Aprenda a técnica de injeção ventricular em embriões de zebrafish para visualizar os ventrículos cerebrais e estudar a morfogênese neuroepitelial em desenvolvimento. Este método utiliza corante fluorescente e permite análise detalhada da formação do cérebro em embriões vivos.

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Os autores gostariam de agradecer a Laura Anne Lowery, que desenvolveu essa técnica no laboratório. HS é suportada por NIHMH70926. Jennifer Gutzman foi apoiado pelo companheirismo CSBI / Merck pós-doutorado.

Protocolo Parte 1: Preparando-se para microinjeção <ol><li> Prepare-se para a injeção puxando agulhas capilar utilizando Sutter extrator de agulhas Instruments. </li><li> Preencha a agulha com um corante fluorescente (como Texas Red-Dextran). </li><li> Montar a agulha em um aparelho de microinjeção e micromanipulador. </li><li> Cortar a agulha para o tamanho apropriado em um ângulo para criar uma ponta chanfrada. </li><li> Medir o tamanho de gota e verifique se ele está entre 1-2nl por injecção de óleo. </li></ol> Parte 2: Preparando os embriões <ol><li> Injetar os embriões 30 minutos mais cedo do que o estágio de interesse. Por exemplo, para estudar os ventrículos menos 24 horas após a fertilização (hpf), injetar os embriões em 23,5 hpf. Estágio os embriões de acordo com Kimmel et al. (4). </li><li> Sob o estereomicroscópio, remova cuidadosamente o córion dos embriões usando uma pinça. </li><li> Usando um prato de plástico revestidas com agarose 1%, poke buracos na agarose com uma ponteira de plástico 100-200 mL. Remova cuidadosamente os plugues de agarose dos furos usando uma pinça. </li><li> Transferência de embriões em meios embrião no prato agarose com buracos. </li><li> Adicionar tricaina (feita de acordo com Westerfield (5)) para a mídia para anestesiar os embriões e evitar qualquer movimento durante o experimento. </li><li> Delicadamente, coloque a cauda do embrião para dentro do buraco, e orientá-la de modo que o aparelho de injecção está no lado posterior do embrião. </li></ol> Parte 3: A injeção do ventrículo cerebral <ol><li> Para injetar o ventrículo cerebral, providenciar a instalação de micromanipulação de modo que a ponta da agulha está no mesmo campo de visão como o embrião em potência alta. </li><li> Cuidadosamente coloque a agulha através da roofplate fina do rombencéfalo apenas posterior à hingepoint r0/r1 sem bater o tecido cerebral abaixo. </li><li> Apenas o suficiente injetar corante para encher completamente os ventrículos. Pode levar várias injeções para preencher o espaço ventrículo, dependendo do estágio do embrião. </li></ol> Parte 4: Imaging <ol><li> Usando um limpa 1% agarose prato revestido, poke novos buracos no prato, retire as velas, e adicione tricaina para anestesiar os embriões e impedir o movimento. </li><li> Coloque a cauda do embrião ventrículo-injetado no buraco e posição para uma imagem dorsal. </li><li> Tirar uma foto usando luz transmitida. </li><li> É muito crítico para não mover o embrião ou microscópio. </li><li> Alterar as configurações no microscópio e ter uma imagem com luz fluorescente. </li><li> Reposicionar o embrião para tirar fotos com os dois laterais luz transmitida e luz fluorescente. </li><li> Guardar as imagens como arquivos TIFF para processamento de imagens em Photoshop. </li></ol> Parte 5: Processamento de Imagem <ol><li> Para processar as imagens no Photoshop, abra a luz transmitida e luz fluorescente imagens do embrião mesmo tomadas na mesma posição. Certifique-se de todas as configurações são as mesmas para cada imagem. </li><li> Arraste a imagem fluorescentes para a imagem de luz transmitida e alinhá-las com exatidão. </li><li> Com a imagem selecionada fluorescentes, selecione &quot;Imagem&quot;, &quot;Ajustes,&quot; e depois &quot;Substituir cor&quot; e mudar o fundo preto ao branco. </li><li> No &quot;Substituir cor&quot; janela ajustar a &quot;imprecisão&quot; fator para a direita até as imagens fluorescentes parece uniforme em cor. </li><li> No &quot;Layers&quot; janela, selecione &quot;Multiply&quot; para ver as imagens de sobreposição. Sua imagem de espaço ventrículo deve corresponder à imagem de luz transmitida com exatidão. </li><li> Salve este arquivo e repita para quaisquer outras imagens. </li></ol> Resultados representante / Resultado Adequada imagens injeção ventrículo são mostrados na Figura 1 AD painéis, enquanto um exemplo de imagens de injeção incorreta são mostrados na EH. Injeções adequada têm arestas vivas e não-difusa corante. Injeção incorreta, que ocorre quando a agulha é inserida longe demais para o ventrículo e atinge o tecido cerebral abaixo, pode resultar em corante que é visível fora do espaço ventrículo e na gema. <img src="/files/ftp_upload/1218/1218figure1.png" alt="Figura 1" width="600" height="742" /> Figura 1. Ventrículo injeções de 25 hpf embriões de tipo selvagem. (AD) método de injeção correta e (EH) método de injeção incorreta são mostrados como exemplos. (A, E) imagens brightfield dorsal com correspondentes imagens fluorescentes (B, F) ea sobreposição das imagens fluorescentes e brightfield (C, G) para métodos de injeção corretas e incorretas mostrado. Setas indicam regiões onde corante foi além do espaço do ventrículo cerebral devido a uma injeção ventrículo incorreta (consulte &quot;Solução de problemas&quot;). Anterior é para a esquerda em todas as imagens. Solução de problemas: <table border="1"><tbody><tr style="font-weight:bold; font-size:16px;"><td> Problema </td&gt; <td> Causa </td><td> Remédio </td></tr><tr><td> Você está esmagando o embrião com a agulha. </td><td> Sua agulha é demasiado brusco ou a ponta é muito grande. </td><td> Comece com uma agulha nova e não quebrá-lo, tanto para trás. Bisel da agulha para torná-lo seu afiada como uma agulha de seringa. </td></tr><tr><td> O corante é em todo o embrião e da gema (ver Fig. 1E-H). </td><td> Sua agulha atravessou o tecido e não ficar no espaço ventrículo. </td><td> A agulha não pode ser afiado o suficiente, então você é incapaz de controlar a velocidade de punção. </td></tr><tr><td> O corante é muito fraco ou não na parte frontal do cérebro. </td><td> Você não usar uma pressão alta o suficiente para a injeção, ou a agulha não foi longe o suficiente para alcançar o anterior do prosencéfalo quando injetado o corante. </td><td> Aumentar a sua pressão de injeção ou colocar a agulha um pouco mais durante a injeção anterior. Você pode colocar a agulha através da fronteira mesencéfalo rombencéfalo-se mais detalhe é necessário no prosencéfalo. Você também pode simplesmente esperar um pouco para o corante para difundir ainda mais antes de imagem. </td></tr><tr><td> Suas imagens fluorescentes são escuras em torno das bordas após a substituição de cores no Photoshop. </td><td> Você se esqueceu de mudar a &quot;confusão&quot; na janela de configuração substitui a cor. </td><td> Mover a &quot;confusão&quot; por todo o caminho à direita na janela de substituição de cor. </td></tr><tr><td> A agulha não perfurar a roofplate rombencéfalo. </td><td> A agulha não é cortado corretamente. </td><td> Faça uma nova agulha. Se você estiver fazendo um monte de injeções que você pode precisar de várias agulhas como eles podem obter maçante. </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Gutzman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+zebrafish+midbrain-hindbrain+boundary+constriction+requires+laminin-dependent+basal+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction.</a> Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).</li>
<li>Lowery, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+Classification+of+Zebrafish+Brain+Morphology+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants.</a> Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).</li>
<li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+formation+of+zebrafish+brain+ventricles+occurs+independently+of+circulation+and+requires+the+nagie+oko+and+snakehead%2Fatp1a1a.1+gene+products%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products.</a> Development. 132, 2057-2067 (2005).</li>
<li>Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , University of Oregon Press. (1995).</li>
</ol>

Neste vídeo demonstramos como injetar corante fluorescente (Texas-Red Dextran) no desenvolvimento de ventrículos cerebrais zebrafish. Este método é usado para visualizar o espaço do ventrículo cerebral em contraste com a neuroepitélio circundante e é extremamente útil para determinar a forma do espaço ventrículo, bem como a forma do tecido cerebral circundante. Ela nos permite compreender melhor o processo de formação do cérebro e morfogênese do ventrículo cerebral ao longo do tempo no embrião vivo. Esta técnica é uma e...

<table><tbody><tr><td>Pinzas</td><td>Ferramenta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares (agulhas)</td><td>Ferramentas</td><td>Frederick Haer and Co.</td><td>30-30-1</td><td></td></tr><tr><td>Placas revestidas com agarose</td><td>Ferramentas</td><td>Agarose (Seakem GTG; Lonza) Placas (Corning)</td><td>Agarose (50027) Placas (430166)</td><td>Prepare a camada de agarose com aproximadamente 2-3 mm de profundidade na placa, dependendo do estágio do embrião que você está injetando.</td></tr><tr><td>Microsscópio estereoscópico</td><td>Microsscópio</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmera de microscópio com capacidade de fluorescência e software de captura de imagens</td><td>Ferramentas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de 1-200 &amp;mu;L</td><td>Ferramentas</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-0806</td><td>Essas pontas têm o tamanho ideal para furar a agarose e permitir que os embriões se encaixem perfeitamente.</td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Análise de imagem</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laço para embrião</td><td>Ferramentas</td><td></td><td></td><td>Confeccione esses laços com uma pipeta de vidro e um fio de cabelo ou linha de pesca, selando com cera de abelha.</td></tr><tr><td>Microinjetor</td><td>Ferramentas</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PL1-100</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de agulhas</td><td>Ferramentas</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>Configurações (Calor 785, Tração 70, Velocidade 40, Tempo 70).</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Ferramentas</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corante fluorescente Texas-Red Dextran 70.000 MW</td><td>Reagente</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1830</td><td>Outros pesos moleculares estão disponíveis, se desejado.</td></tr><tr><td>Tricaina (éster etílico do ácido 3-aminobenzóico)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Meio para embriões</td><td>Reagente</td><td></td><td></td><td>De acordo com Westerfield (5)</td></tr></tbody></table>

zebrafish injection ventrículo cerebral

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Formação adequada do ventrículo do cérebro durante o desenvolvimento embrionário do cérebro é necessário para a função cerebral normal. Ventrículos cerebrais são as cavidades altamente conservadas dentro do cérebro que são preenchidos com fluido cerebrospinal. Em peixes-zebra, após a formação do tubo neural, o neuroepitélio sofre uma série de constrições e dobras, enquanto ele se enche de fluido, resultando na formação de ventrículo cerebral. A fim de compreender o processo de formação do ventrículo, e as mudanças que ocorrem neuroepiteliais forma, ao mesmo tempo, precisávamos de uma forma de visualizar o espaço do ventrículo em comparação com o tecido cerebral. No entanto, a natureza de embriões zebrafish transparente torna difícil diferenciar o tecido do espaço ventrículo. Por isso, desenvolvemos uma técnica de injeção ventrículo cerebral onde o espaço de ventrículo é preenchido com um corante fluorescente e fotografada pela claro e microscopia de fluorescência. O claro e as imagens fluorescentes são então processadas e sobrepostos no Photoshop. Esta técnica permite a visualização do espaço do ventrículo com o corante fluorescente, em comparação com a forma do neuroepitélio na imagem de campo claro. Injeção cérebro ventrículo no peixe-zebra pode ser empregado a partir de 18 horas após a fecundação até o início fases larval. Temos utilizado esta técnica extensivamente em nossos estudos de formação do cérebro do ventrículo e morfogênese, bem como na caracterização de mutantes cérebro morfogênese (1-3).

Após a formação do tubo neural, o neuroepitélio contrai e dobras, enquanto o tubo se enche de líquido cefalorraquidiano embrionárias (eCSF) para formar os ventrículos do cérebro embrionário. Nós desenvolvemos esta técnica de injeção do ventrículo para visualizar melhor o espaço cheio de líquido, em contraste com a forma neuroepiteliais em um embrião vivo.

Zebrafish Injection Ventrículo Cerebral

A formação adequada dos ventrículos cerebrais durante o desenvolvimento cerebral embrionário é necessária para o funcionamento normal do cérebro. Os ventrículos cerebrais são as estruturas altamente conservadas...

Este procedimento começa com a estagiamento de embriões de peixe-zebra. Quando os embriões atingirem o estágio de interesse, remova-os da coriona. Em seguida, são criados orifícios em uma placa revestida com aros usando a ponta de uma pipeta para montar os embriões, e os embriões são colocados suavemente nos orifícios com as caudas para baixo.Após o posicionamento dos embriões, um corante fluorescente é cuidadosamente injetado no espaço ventricular do embrião através do cérebro posterior. Após a injeção no ventrículo, os embriões são imageados e os dados são processados usando o Photoshop. Olá, sou Jennifer Gutman do laboratório da Dra. Hazel Sieve no Whitehead Institute for Biomedical Research no MIT em Cambridge, Massachusetts.Hoje vamos mostrar um procedimento para injeção no ventrículo cerebral de peixe-zebra. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a formação do ventrículo cerebral e a morfogênese do epitélio neural em peixes-zebra vivos. Devido à natureza dos embriões transparentes de peixe-zebra, caracterizar a forma do ventrículo cerebral pode ser difícil.Essa técnica é uma maneira útil e simples de diferenciar o espaço preenchido por líquido do tecido circundante e de caracterizar embriões mutantes que possam apresentar defeitos na formação dos ventrículos cerebrais. Então, vamos começar. Para preparar a injeção no ventrículo cerebral de peixe-zebra, começamos pela confecção das agulhas de injeção.Utiliza-se um polar de agulha da Sutter para puxar as agulhas capilares. Em seguida, a agulha capilar é preenchida com um corante fluorescente, como dextrina Texas Red. Depois disso, a agulha preenchida é montada em um micromanipulador do aparelho de microinjeção.Corte a agulha no tamanho apropriado em um ângulo. Para criar uma ponta biselada, meça o tamanho da gota da agulha e verifique se está entre um e dois nanolitros por injeção em óleo. Para iniciar esta etapa do procedimento, os embriões, segundo Kimmel, devem ser injetados 30 minutos antes do estágio de interesse.Por exemplo, para estudar os ventrículos 24 horas após a fertilização, injete os embriões 23 horas e meia após a fertilização. O embrião no estágio de interesse é colocado sob o microscópio estereoscópico, e o córion é cuidadosamente removido do embrião usando pinças. Em seguida, prepara-se um recipiente de aros para os embriões utilizando um recipiente plástico revestido com 1% de aros; faça furos no aros com uma ponteira plástica de pipeta de 1 a 200 microlitros.Remova cuidadosamente as tampas dos orifícios usando pinça. Transfira o embrião e o meio do embrião para a placa aros com orifícios. Adicione trica ao meio para anestesiar o embrião e impedir seu movimento.Durante o experimento, coloque suavemente a cauda do embrião para baixo no orifício e oriente-o de modo que o aparelho de injeção fique no lado posterior do embrião. Agora que o embrião está posicionado e orientado corretamente no prato de agarose, estamos prontos para a injeção nos ventrículos cerebrais. Primeiro, organize o conjunto de micro-manipulação para que a ponta da agulha esteja no mesmo campo de visão do embrião em alta potência.Insira cuidadosamente a agulha através da placa fina do teto do cérebro posterior, logo posterior ao ponto de articulação R zero R um, sem atingir o tecido cerebral abaixo; injete apenas a quantidade suficiente de corante para preencher completamente os ventrículos. Pode ser necessário realizar várias injeções para preencher todo o espaço ventricular, dependendo do estágio do embrião. Quando o embrião tiver sido injetado e estiver pronto para a aquisição de imagens, prepara-se um novo recipiente aros para o embrião.Usando um prato limpo revestido com 1%aros, faça furos no prato e remova as tampas. Transfira o embrião para o prato e adicione trica para anestesiar o embrião e impedir movimentos. Posicione a cauda do embrião injetado no ventrículo no furo, de forma adequada para uma imagem dorsal.O embrião está agora pronto para a aquisição de imagens. Adquira uma imagem utilizando luz transmitida. É muito importante não mover o embrião ou o microscópio.Em seguida, altere as configurações do microscópio e capture uma imagem com luz fluorescente. Reposicione o embrião para obter imagens laterais com luz transmitida e luz fluorescente. Salve todas as imagens em arquivos para o processamento de imagens no Photoshop.Para processar as imagens no Photoshop, abra as imagens de luz transmitida e de luz fluorescente do mesmo embrião capturadas na mesma posição. Certifique-se de que todas as configurações são iguais. Para cada imagem, arraste a imagem fluorescente para cima da imagem de luz transmitida e alinhe-as exatamente com a imagem fluorescente selecionada. Selecione ajustes de imagem e, em seguida, substitua a cor e altere o fundo preto para branco.No painel de substituição de cor, ajuste o fator de difusão para a direita até que a imagem fluorescente pareça uniforme em cor. Na janela de camadas, selecione multiplicar. Para visualizar as imagens sobrepostas, sua imagem do espaço ventricular deve coincidir exatamente com a imagem de luz transmitida.Salve este arquivo e repita o procedimento para quaisquer outras imagens. Se a injeção no ventrículo for realizada corretamente, as imagens devem apresentar bordas nítidas e corante não difuso, como mostrado aqui nessas imagens de 25 horas pós-fertilização, enquanto os embriões do tipo selvagem no painel A mostram a imagem de campo claro, o painel B mostra a imagem fluorescente e o painel C mostra a imagem sobreposta.Uma visão lateral da imagem sobreposta é mostrada no Painel D. Por outro lado, se durante a injeção no ventrículo a agulha for inserida muito profundamente, ela entrará no tecido cerebral abaixo do espaço ventricular e levará a uma injeção incorreta. Isso resulta em corante visível fora do espaço ventricular e na gema, como mostrado aqui. O Painel E mostra a imagem em campo claro.O painel F mostra a imagem fluorescente e o painel G mostra a imagem sobreposta. Uma vista lateral da imagem sobreposta é apresentada no painel H. As setas indicam regiões onde o corante ultrapassou o espaço dos ventrículos cerebrais. Neste vídeo, demonstramos como injetar corante fluorescente nos ventrículos cerebrais de peixes-zebra em desenvolvimento.Este método é utilizado para visualizar o espaço do ventrículo cerebral em contraste com o epitélio neural circundante, sendo extremamente útil para determinar a forma do espaço ventricular, bem como a forma do tecido cerebral adjacente. Esta técnica permite compreender melhor o processo de formação dos ventrículos cerebrais e a morfogênese cerebral ao longo do tempo no embrião vivo. É uma excelente ferramenta para o estudo de defeitos na formação dos ventrículos cerebrais e para a caracterização inicial de mutantes de morfogênese cerebral.Assim sendo, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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