Zebrafish Injection Ventrículo Cerebral

Este procedimento começa com o estadiamento de embriões de peixe-zebra. Quando os embriões atingirem o estágio de interesse, remova-os do córion. Em seguida, os orifícios são criados em um prato revestido com aros com uma ponta de pipeta para montar os embriões e os embriões são colocados suavemente nos orifícios com as caudas para baixo.

Depois que os embriões são montados, uma matriz fluorescente é cuidadosamente injetada no espaço ventricular do embrião através do cérebro posterior. Após a injeção do ventrículo, os embriões são fotografados e os dados são processados usando o Photoshop. Olá, sou Jennifer Gutman, do laboratório da Dra. Hazel Sieve no Instituto Whitehead de Pesquisa Biomédica no MIT em Cambridge, Massachusetts.

Hoje mostraremos um procedimento para injeção de ventrículo cerebral de peixe-zebra. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a formação de ventrículos cerebrais e a morfogênese neuroepitelial em peixes-zebra vivos. Devido à natureza dos embriões transparentes de peixe-zebra, caracterizar a forma do ventrículo cerebral pode ser difícil.

Essa técnica é uma maneira útil e simples de diferenciar o espaço cheio de líquido do tecido circundante e caracterizar embriões mutantes que podem ter defeitos na formação do ventrículo cerebral. Então vamos começar. Para nos prepararmos para injetar o ventrículo cerebral do peixe-zebra, começamos fazendo as agulhas de injeção.

A agulha polar de um instrumento Sutter é usada para puxar as agulhas capilares. A agulha capilar é então preenchida com um corante fluorescente, como a dextrina vermelha do Texas. Em seguida, a agulha cheia é montada em um micro manipulador em aparelho de microinjeção.

Corte a agulha no tamanho apropriado em ângulo. Para criar uma ponta chanfrada, meça o tamanho da gota da agulha e verifique se ela está entre um a dois nanolitros por injeção em óleo. Para iniciar esta fase de procedimento, os embriões, de acordo com Kimmel, todos os embriões devem ser injetados 30 minutos antes da fase de interesse.

Por exemplo, para estudar os ventrículos 24 horas após a fertilização, injete os embriões 23 horas e meia após a fertilização. O embrião no estágio de interesse é colocado sob o microscópio estéreo e o córion é cuidadosamente removido do embrião usando uma pinça. Em seguida, uma placa de aros para os embriões é feita usando uma placa de plástico revestida com 1% de aros faz furos no aros com uma ponta de pipeta de plástico de um a 200 microlitros.

Remova cuidadosamente os plugues aros dos orifícios usando uma pinça. Transfira o embrião e o meio embrionário para a placa aros com orifícios. Adicione trica ao meio para anestesiar o embrião e evitar o movimento.

Durante o experimento, coloque suavemente a cauda do embrião no orifício e oriente-a de forma que o aparelho de injeção fique no lado posterior do embrião. Agora que o embrião está colocado e orientado corretamente na placa levantada, estamos prontos para a injeção do ventrículo cerebral. Primeiro, organize a configuração de micromanipulação de modo que a ponta da agulha fique no mesmo campo de visão que o embrião em alta potência.

Com cuidado, coloque a agulha na placa fina do telhado do cérebro posterior logo posterior ao ponto de dobradiça R zero R um sem atingir o tecido cerebral abaixo, injete corante suficiente para preencher completamente os ventrículos. Pode levar várias injeções para preencher o espaço do ventrículo, dependendo do estágio do embrião. Quando o embrião foi injetado e está pronto para a imagem, uma nova placa aros para o embrião é preparada.

Usando um prato limpo revestido de 1%aros, faça furos no prato e remova os plugues. Transfira o embrião para o prato e adicione trica para anestesiar o embrião e evitar o movimento. Coloque a cauda do ventrículo injetado embrião no orifício na posição para uma imagem dorsal.

O embrião agora está pronto para a imagem. Tire uma imagem usando luz transmitida. É muito importante não mover o embrião ou o microscópio.

Em seguida, altere as configurações do microscópio e tire uma imagem com luz fluorescente. Reposicione o embrião para tirar imagens laterais com luz transmitida e luz fluorescente. Salve todas as imagens como arquivos para processamento de imagem do Photoshop.

Para processar as imagens no Photoshop, abra as imagens de luz transmitida e luz fluorescente do mesmo embrião tiradas na mesma posição. Certifique-se de que todas as configurações sejam as mesmas Para cada imagem, arraste sua imagem fluorescente para a imagem de luz transmitida e alinhe-as exatamente com a imagem fluorescente selecionada. Selecione os ajustes de imagem e, em seguida, substitua a cor e altere o fundo preto para branco.

Na janela de substituição de cor, ajuste o fator de imprecisão para a direita até que a imagem fluorescente pareça uniforme em cores. Na janela de camadas, selecione multiplicar. Para visualizar as imagens de sobreposição, a imagem do espaço ventricular deve corresponder à imagem da luz transmitida. Exatamente.

Salve este arquivo e repita para quaisquer outras imagens. Se a injeção do ventrículo for realizada corretamente, as imagens devem ter bordas afiadas em corante não difuso, como mostrado aqui nestas imagens de 25 horas. Pós-fertilização enquanto o tipo embriões o painel A mostra a imagem de campo claro, o painel B mostra a imagem fluorescente e o painel C mostra a imagem de sobreposição.

Uma vista lateral da imagem de sobreposição é mostrada no Painel D. Por outro lado, se durante a injeção do ventrículo a agulha for inserida muito longe, ela entrará no tecido cerebral abaixo do espaço do ventrículo e levará a uma injeção incorreta. Isso resulta em corante visível fora do espaço do ventrículo e na gema, como mostrado aqui. O painel E mostra a imagem de campo claro.

O painel F mostra a imagem fluorescente e o painel G mostra a imagem sobreposta. Uma vista lateral da imagem sobreposta é mostrada no painel H. As setas indicam regiões onde o corante ultrapassou o espaço do ventrículo cerebral. Neste vídeo, demonstramos como injetar corante fluorescente nos ventrículos cerebrais do peixe-zebra em desenvolvimento.

Este método é usado para visualizar o espaço do ventrículo cerebral em contraste com o neuro epitélio circundante e é extremamente útil para determinar a forma do espaço do ventrículo, bem como a forma do tecido cerebral circundante. Essa técnica nos permite entender melhor o processo de formação do ventrículo cerebral e a morfogênese cerebral ao longo do tempo no embrião vivo. É uma excelente ferramenta para estudar defeitos de formação de ventrículos cerebrais e para caracterização inicial de mutantes da morfogênese cerebral.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.