Zebrafish Injection Ventrículo Cerebral

Este procedimento começa com a estagiamento de embriões de peixe-zebra. Quando os embriões atingirem o estágio de interesse, remova-os da coriona. Em seguida, são criados orifícios em uma placa revestida com aros usando a ponta de uma pipeta para montar os embriões, e os embriões são colocados suavemente nos orifícios com as caudas para baixo.

Após o posicionamento dos embriões, um corante fluorescente é cuidadosamente injetado no espaço ventricular do embrião através do cérebro posterior. Após a injeção no ventrículo, os embriões são imageados e os dados são processados usando o Photoshop. Olá, sou Jennifer Gutman do laboratório da Dra. Hazel Sieve no Whitehead Institute for Biomedical Research no MIT em Cambridge, Massachusetts.

Hoje vamos mostrar um procedimento para injeção no ventrículo cerebral de peixe-zebra. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a formação do ventrículo cerebral e a morfogênese do epitélio neural em peixes-zebra vivos. Devido à natureza dos embriões transparentes de peixe-zebra, caracterizar a forma do ventrículo cerebral pode ser difícil.

Essa técnica é uma maneira útil e simples de diferenciar o espaço preenchido por líquido do tecido circundante e de caracterizar embriões mutantes que possam apresentar defeitos na formação dos ventrículos cerebrais. Então, vamos começar. Para preparar a injeção no ventrículo cerebral de peixe-zebra, começamos pela confecção das agulhas de injeção.

Utiliza-se um polar de agulha da Sutter para puxar as agulhas capilares. Em seguida, a agulha capilar é preenchida com um corante fluorescente, como dextrina Texas Red. Depois disso, a agulha preenchida é montada em um micromanipulador do aparelho de microinjeção.

Corte a agulha no tamanho apropriado em um ângulo. Para criar uma ponta biselada, meça o tamanho da gota da agulha e verifique se está entre um e dois nanolitros por injeção em óleo. Para iniciar esta etapa do procedimento, os embriões, segundo Kimmel, devem ser injetados 30 minutos antes do estágio de interesse.

Por exemplo, para estudar os ventrículos 24 horas após a fertilização, injete os embriões 23 horas e meia após a fertilização. O embrião no estágio de interesse é colocado sob o microscópio estereoscópico, e o córion é cuidadosamente removido do embrião usando pinças. Em seguida, prepara-se um recipiente de aros para os embriões utilizando um recipiente plástico revestido com 1% de aros; faça furos no aros com uma ponteira plástica de pipeta de 1 a 200 microlitros.

Remova cuidadosamente as tampas dos orifícios usando pinça. Transfira o embrião e o meio do embrião para a placa aros com orifícios. Adicione trica ao meio para anestesiar o embrião e impedir seu movimento.

Durante o experimento, coloque suavemente a cauda do embrião para baixo no orifício e oriente-o de modo que o aparelho de injeção fique no lado posterior do embrião. Agora que o embrião está posicionado e orientado corretamente no prato de agarose, estamos prontos para a injeção nos ventrículos cerebrais. Primeiro, organize o conjunto de micro-manipulação para que a ponta da agulha esteja no mesmo campo de visão do embrião em alta potência.

Insira cuidadosamente a agulha através da placa fina do teto do cérebro posterior, logo posterior ao ponto de articulação R zero R um, sem atingir o tecido cerebral abaixo; injete apenas a quantidade suficiente de corante para preencher completamente os ventrículos. Pode ser necessário realizar várias injeções para preencher todo o espaço ventricular, dependendo do estágio do embrião. Quando o embrião tiver sido injetado e estiver pronto para a aquisição de imagens, prepara-se um novo recipiente aros para o embrião.

Usando um prato limpo revestido com 1%aros, faça furos no prato e remova as tampas. Transfira o embrião para o prato e adicione trica para anestesiar o embrião e impedir movimentos. Posicione a cauda do embrião injetado no ventrículo no furo, de forma adequada para uma imagem dorsal.

O embrião está agora pronto para a aquisição de imagens. Adquira uma imagem utilizando luz transmitida. É muito importante não mover o embrião ou o microscópio.

Em seguida, altere as configurações do microscópio e capture uma imagem com luz fluorescente. Reposicione o embrião para obter imagens laterais com luz transmitida e luz fluorescente. Salve todas as imagens em arquivos para o processamento de imagens no Photoshop.

Para processar as imagens no Photoshop, abra as imagens de luz transmitida e de luz fluorescente do mesmo embrião capturadas na mesma posição. Certifique-se de que todas as configurações são iguais. Para cada imagem, arraste a imagem fluorescente para cima da imagem de luz transmitida e alinhe-as exatamente com a imagem fluorescente selecionada. Selecione ajustes de imagem e, em seguida, substitua a cor e altere o fundo preto para branco.

No painel de substituição de cor, ajuste o fator de difusão para a direita até que a imagem fluorescente pareça uniforme em cor. Na janela de camadas, selecione multiplicar. Para visualizar as imagens sobrepostas, sua imagem do espaço ventricular deve coincidir exatamente com a imagem de luz transmitida.

Salve este arquivo e repita o procedimento para quaisquer outras imagens. Se a injeção no ventrículo for realizada corretamente, as imagens devem apresentar bordas nítidas e corante não difuso, como mostrado aqui nessas imagens de 25 horas pós-fertilização, enquanto os embriões do tipo selvagem no painel A mostram a imagem de campo claro, o painel B mostra a imagem fluorescente e o painel C mostra a imagem sobreposta.

Uma visão lateral da imagem sobreposta é mostrada no Painel D. Por outro lado, se durante a injeção no ventrículo a agulha for inserida muito profundamente, ela entrará no tecido cerebral abaixo do espaço ventricular e levará a uma injeção incorreta. Isso resulta em corante visível fora do espaço ventricular e na gema, como mostrado aqui. O Painel E mostra a imagem em campo claro.

O painel F mostra a imagem fluorescente e o painel G mostra a imagem sobreposta. Uma vista lateral da imagem sobreposta é apresentada no painel H. As setas indicam regiões onde o corante ultrapassou o espaço dos ventrículos cerebrais. Neste vídeo, demonstramos como injetar corante fluorescente nos ventrículos cerebrais de peixes-zebra em desenvolvimento.

Este método é utilizado para visualizar o espaço do ventrículo cerebral em contraste com o epitélio neural circundante, sendo extremamente útil para determinar a forma do espaço ventricular, bem como a forma do tecido cerebral adjacente. Esta técnica permite compreender melhor o processo de formação dos ventrículos cerebrais e a morfogênese cerebral ao longo do tempo no embrião vivo. É uma excelente ferramenta para o estudo de defeitos na formação dos ventrículos cerebrais e para a caracterização inicial de mutantes de morfogênese cerebral.

Assim sendo, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.