Name: Evitar osmótica em Caenorhabditis elegans: Função Synaptic de dois genes, Orthologues dos Direitos Humanos NRXN1 E NLGN1, Como candidatos para o autismo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-11T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprenda a analisar a função sináptica de neurexinas e neuroliginas em Caenorhabditis elegans usando ensaios comportamentais de evitação osmótica. Este método permite estudar mutantes e recuperação do fenótipo selvagem.

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Gostaríamos de agradecer o Dr. Antonio Miranda-Vizuete para a sua valiosa ajuda. Nós também gostamos de expressar nossa gratidão a Salma Boulayoune e Isabel Caballero de assistência técnica valiosa. Este trabalho foi financiado por uma doação da Junta de Andalucía (BIO-272). Esta pesquisa foi realizada de acordo com as leis que regem a experimentação genética na Europa.

1: ensaio de evitar osmótica. <ol><li> Sobre 16-24 horas antes do ensaio, pick L4 animais estágio larval de cada genótipo a uma placa NGM fresco contendo OP50 E. coli andincubate-lo a 20 ° C. No dia seguinte, iniciar o experimento com adultos jovens. </li><li> Recomenda-se realizar o ensaio "cegamente". As placas com cada estirpe a ser ensaiadas devem ser rotulados por um experimentador segundo, da realização do ensaio utilizando as placas rotulados que seria desmascarado quando o experimento foi concluída. </li><li> No dia do ensaio, prepare uma solução estoque 4M de frutose com 1% de solução Vermelho Congo e dissolver completamente em temperatura ambiente. Recomendamos que verifique a solução antes de cada ensaio uma vez que o corante poderia precipitar com o tempo. </li><li> Anel anular (1 cm de diâmetro) na placa NGM é esboçada no centro do meio sólido, com 15 mL da solução de vermelho de 4M frutose. Deixe a solução de frutose mergulhar no agar, o que normalmente leva entre 2 e 5 minutos. </li><li> Lugar individual animais adultos jovens de cada linhagem dentro do anel e siga ao longo dos próximos 10 minutos para determinar a resposta à barreira osmótica. Animais evitando o anel de mais de seis vezes em uma fileira são classificados como normais, aqueles sair do ringue em menos de seis tentativas são considerados defeitos de sensibilidade osmótica. Nota: A tensão de controle deve ser usado em cada ensaio. Animais adultos N2 jovens são utilizados como controle positivo uma vez que decisivamente evitar a barreira do anel. Animais que tenham sido previamente fome, passou por Dauer larvas ou são provenientes de placas que são demasiado seca não deve ser usado. No início, os animais de controle devem ser avaliadas em duplicata, para confirmar que as placas de ensaio ea solução estão corretas. </li></ol> 2: Geração de worms knockdown alimentando RNAi. <ol><li> RNAi placas: placas de alimentação NGM RNAi contém por litro: 17 g de ágar, 2,5 g de peptona, 3,0 g NaCl, 1 ml de 5 mg de colesterol -1 ml; encher o cantil de 1 litro com H 2 O e autoclave. Depois de agar esfria a cerca de 65 ° C, adicione 25 ml de 1 M KPO 4, pH 6,0, 1 ml de CaCl 2 1 M, 1 ml de 1M MgSO 4, 0,5 ml carbenicilina (50 mg ml -1) e 1 ml IPTG 1M. Se você está começando com NGM sólido preparado, derreta meio sólido por microondas e, posteriormente, lugar NGM líquido no banco para esfriar e adicione KPO 4, pH 6,0, CaCl 2, MgSO 4, carbenicilina e IPTG como indicado anteriormente. Adicionar 10 ml de NGM em cada placa de Petri 60 mm. Permitir o resfriamento e inverter as placas mantendo-as a RT noite antes de usar. As placas podem ser armazenadas em um saco plástico a 4 ° C por cerca de 4-5 dias. </li><li> Preparação bacteriana e indução: Isolar colônias de E.coli HT115 (DE3), estirpe transformada com L4440 vetor contendo um fragmento correspondente ao gene-alvo, para Luria-Bertani (LB) ágar (17 g de ágar, 10 g triptona, 5 g extrato de levedura e 10 g de NaCl por litro) contendo ampicilina (50 mcg / ml) e tetraciclina (15 mcg / ml). Escolha uma colônia de bactérias e inocular em LB com 50 mg / ml ampicilina, e cresceu para 6 8 h com agitação a 37 ° C; uma gota de semente desta cultura para as placas NGM preparada e secar os pratos cuidadosamente antes de ser incubada overnight ( 12 24 h) à temperatura ambiente para permitir que as bactérias para crescer e começar a indução. A incubação foi no escuro, porque a tetraciclina é sensível à luz e pode afetar a variabilidade dos ensaios RNAi entre placas. É necessário o uso de um positivo e um controle negativo para os experimentos de alimentação RNAi. O controle positivo é E.coli célula HT115 transformada com o vetor contendo a seqüência L4440 unc-22 gene. O knockdown da unc-22 gene produz um "fenótipo espasmos". O controle negativo é E.coli HT115 célula transformada com o vetor L4440 vazio. </li><li> Manipulação de verme e de pontuação: O primeiro dia, coloque L4 worms palco de uma placa NGM semeados com OP50 em placas NGM sem bactérias e incubar a 20 ° C por 12 horas (em jejum). No dia seguinte, a transferência de jovens adultos hermafroditas jejum em uma placa seedded com as bactérias expressando o gene alvo específicos RNAi. Deixe 40-48 horas a 20 ° C para gerar progênie F1. Em seguida, coloque alguns vermes adultos F1 noutra placa semeada com a mesma bactéria. Após 24-48 horas, selecionar e isolar da progênie F2, adultos jovens (totalmente formado vulva protuberante com poucos ovos) e escore de fenótipos. Nota: a indução de RNAi em neurônios têm algumas limitações por causa das propriedades refratárias do sistema de C elegans nervoso para RNAi.. Para superar os problemas desta ineficiência no neurônio é recomendado o uso da cepa RRF-3, um fundo hipersensíveis aos efeitos da RNAi em neurônios 10. Em nossos experimentos não diferenes foram encontradas entre Bristol e RRF N2-3 cepas para os genes e do fenótipo analisado. </li></ol> 3: As cepas utilizadas. O C. elegans cepas utilizadas neste trabalho são apresentados na Tabela 1. Cepas mutantes estavam cruzados contra N2 selvagens - tipo, pelo menos, quatro vezes para remover indesejados mutações aleatórias que poderia ter sido gerada durante o protocolo de mutagênese. . OP50 E coli cepa foi suppliied por Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, EUA E.coli HT115 (DE3) com o plasmídeo carregando pL4440 NRX-1 (JA: C29A12.5). Florins e-1 (JA: C40C9.5 fragmentos de genes) foram fornecidos pelo Dr. Peter Askjaer, Centro Andaluz de Biologia del Desarrollo ('Abd), Universidad Pablo Olavide CSIC, Sevilla, Espanha. 4: Os resultados representativos. Resultados ilustrativos são representados nas Figuras 1 e 2. Dez animais de cada cepa e um mínimo de três experimentos foram realizados réplica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/1616/1616Fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Experimentos de comportamento de evitação osmótica. Estirpes de controlo e NRX-1 (ok1649 e tm1961) mutantworms V deficiente responder, invertendo para trás quando se deparam com uma barreira osmótica (4M frutose). NLG-1 (ok259 e tm474) X mutantes não conseguem detectar essa barreira. Mutantes duplos deficiente em NLG-1 e NRX-1, cepas CRR21 (ok1649; ok259) VX e CRR23 (tm1961; ok259) VX recuperou o fenótipo de tipo selvagem. O * indica diferenças significativas (P ≤ 0,001) pelo teste t-student, na resposta de cada cepa para a N2 Bristol tipo selvagem por t-student <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/1616/1616Fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Experimentos com worms knockdown alimentando RNAi. E.coli HT115 (DE3) transformadas com o vetor pL4440 vazio ou contendo um fragmento correspondente aos genes alvo NRX-1 ou NLG-1 foram utilizados para cepas de vírus alimentados com diferentes. O * indica diferenças significativas (P ≤ 0,001) pelo teste t-student, na resposta da cepa N2 alimentados com bactérias carregando o vetor pL4440 com um fragmento do gene alvo NLG-1 em comparação com a cepa N2 alimentados com vector pL4440 vazia .

<ol><li>Sudhof, T. C. Nature. 455 (7215), 903-903 (2008).</li>
<li>Fabrichny, I. P., Leone, P., Sulzenbacher, G. Neuron. 56 (6), 979-979 (2007).</li>
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</ol>

Neurexinas e neuroliginas desempenhar papéis essenciais na transmissão sináptica 11 e diferenciação das conexões sinápticas 12. Ambas as moléculas têm sido identificadas como genes candidatos para o autismo 13,14. Neste vídeo mostramos um método simples que nos permite estudar o efeito de genes que afetam a resposta de esquiva osmótica em C. elegans. Neuroligina mutantes deficientes são defeituosos na detecção de resistência osmótica, mas mutantes de...

Tabela 1. C. cepas elegans. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Tensão </td><td> Gene </td><td> Alelo </td><td> Fonte </td></tr><tr><td> Bristol N2 </td><td> - </td><td> - </td><td> ACGC </td></tr><tr><td> VC228 </td><td> NLG-1 </td><td> ok259 </td><td> CGC </td></tr><tr><td> FX00474 </td><td> NLG-1 </td><td> tm474 </td><td> BNBP n-JAPAN </td></tr><tr><td> VC1416 </td><td> NRX-1 </td><td> ok1649 </td><td> CGC </td></tr><tr><td> FX1961 </td><td> NRX-1 </td><td> tm1961 </td><td> NBP-JAPAN </td></tr><tr><td> NL2099 </td><td> RRF-3 </td><td> pk1436 </td><td> CGC </td></tr><tr><td> CRR21 </td><td> NRX-1; NLG-1 </td><td> ok1649; ok259 </td><td> Este trabalho </td></tr><tr><td> CRR22 </td><td> NRX-1; NLG-1 </td><td> tm1961; ok259 </td><td> Este trabalho </td></tr></tbody></table> a. Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, EUA. b. Projeto Nacional para a Bioresource Experimental Animal &quot;Nematóides C. elegans&quot;. Médica da Mulher de Tóquio University, no Japão.

evitar osmótica em caenorhabditis elegans: função synaptic de dois genes, orthologues dos direitos humanos nrxn1 e nlgn1, como candidatos para o autismo

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexinas e neuroliginas são moléculas de adesão de células presentes nas sinapses excitatórios e inibitórios, e eles são necessários para o funcionamento correto da rede neurônio 1. Estas proteínas são encontradas nas membranas pré-sinápticas e pós-sinápticos 2. Estudos em ratos indicam que neurexinas e neurologins têm um papel essencial na transmissão sináptica 1. Relatórios recentes têm mostrado que alterou conexões neuronais durante o desenvolvimento do sistema nervoso humano pode constituir a base da etiologia da numerosos casos de distúrbios do espectro do autismo 3. Caenorhabditis elegans pode ser usado como uma ferramenta experimental para facilitar o estudo do funcionamento dos componentes sináptica, devido à sua simplicidade para a experimentação de laboratório, e dado que seu sistema nervoso e fiação sináptica tem sido completamente caracterizado. Em C. Elegans NRX-1 e NLG-1 genes ortólogos são para humanos NRXN1 e NLGN1 genes que codificam a alfa-neurexin-1 e neuroligina-1 proteínas, respectivamente. Em humanos e nematóides, a organização de neurexinas e neuroliginas é semelhante no que respeita aos domínios funcionais. O chefe do nematóide contém o amphid, um órgão sensorial do nemátodo, que medeia as respostas a diferentes estímulos, incluindo a força osmótica. O amphid é feito de 12 neurônios sensoriais bipolares com dendritos e um axônio ciliadas terminal pré-sináptico 4. Dois desses neurônios, chamado ASHR e ASHL são particularmente importantes em função sensorial osmótica, detectando solúvel em água repelentes com força osmótica elevada 5. Os dendritos destes dois neurônios alongar até a ponta da boca e os axônios estendem ao anel nervoso, onde fazem conexões sinápticas com outros neurônios determinar a resposta comportamental 6. Para avaliar as implicações da neurexin e neuroligina em evitar alta resistência osmótica, mostramos a resposta diferente de mutantes C. elegans com defeito no NRX-1 e 1-NLG genes, usando um método baseado em um anel de frutose 4M 7. Os fenótipos comportamentais foram confirmados utilizando clones específicos RNAi 8. Em C. elegans, o dsRNA necessário para acionar RNAi pode ser administrado através da alimentação 9. A entrega de dsRNA através dos alimentos induz a interferência RNAi do gene de interesse permitindo assim a identificação dos componentes genéticos e caminhos de rede.

Neurexinas e neuroliginas são proteínas da membrana do neurônio-adesão que desempenham papéis essenciais na diferenciação e transmissão sináptica. Mutantes neuroligina deficiente de<em&gt; C. elegans</em&gt; Estão com defeito na detecção de resistência osmótica, mas quando eles contêm também uma mutação no gene que codifica neurexin, eles recuperar o fenótipo do tipo selvagem.

Evitar osmótica em Caenorhabditis elegans: Função Synaptic de dois genes, Orthologues dos Direitos Humanos NRXN1 E NLGN1, Como candidatos para o autismo

Neurexinas e neuroliginas são moléculas de adesão celular presentes em sinapses excitatórias e inibitórias, sendo necessárias para o funcionamento correto da rede neuronal1. Estas proteínas encontram-se nas membranas pré e pós-sinápticas 2. Estudos em camundongos indicam que as neurexinas e neuroliginas desempenham um papel essencial na transmissão sináptica 1. Relatos recentes demonstraram que alterações nas conexões neuronais durante o desenvolvimento do sistema nervoso humano poderiam constituir a base da etiologia de inúmeros casos de transtornos do espectro autista 3. O Caenorhabditis elegans poderia ser utilizado como uma ferramenta experimental para facilitar o estudo do funcionamento de componentes sinápticos, devido à sua simplicidade para experimentação laboratorial e dado que o seu sistema nervoso e a sua fiação sináptica foram totalmente caracterizados. Em C. elegans, os genes nrx-1 e nlg-1 são ortólogos aos genes humanos NRXN1 e NLGN1, que codificam as proteínas alfa-neurexina-1 e neuroligina-1, respectivamente. Em humanos e nematodos, a organização das neurexinas e neuroliginas é semelhante em relação aos domínios funcionais. A cabeça do nematodo contém o anfídeo, um órgão sensorial do nematodo que medeia respostas a diferentes estímulos, incluindo a força osmótica. O anfídeo é composto por 12 neurónios bipolares sensoriais com dendritos ciliados e um axónio terminal pré-sináptico 4. Dois destes neurónios, denominados ASHR e ASHL, são particularmente importantes na função sensorial osmótica, detetando repelentes solúveis em água com elevada força osmótica 5. Os dendritos destes dois neurónios prolongam-se até à ponta da boca e os axónios estendem-se até ao anel nervoso, onde estabelecem conexões sinápticas com outros neurónios que determinam a resposta comportamental 6. Para avaliar as implicações da neurexina e da neuroligina na evitação de elevada força osmótica, demonstramos a resposta distinta de mutantes de C. elegans deficientes nos genes nrx-1 e nlg-1, utilizando um método baseado num anel de frutose 4M 7. Os fenótipos comportamentais foram confirmados utilizando clones específicos de RNAi 8. Em C. elegans, o dsRNA necessário para desencadear o RNAi pode ser administrado por alimentação 9. A entrega de dsRNA através do alimento induz a interferência de RNAi do gene de interesse, permitindo assim a identificação de componentes genéticos e vias de rede.

Olá, meu nome é Manuel Ruiz Rubio, do Departamento de Genética da Universidade de Córdoba, na Espanha. Estamos utilizando o *C. elegans* como ferramenta experimental no estudo do autismo, aproveitando o sistema nervoso completamente caracterizado do *C. elegans*. Estamos estudando mutantes do nematodo, afetados em genes envolvidos na sinapse neural e que têm sido associados ao autismo.Rein Regans são moléculas de adesão da membrana presentes na sinapse. A cabeça de C. elegans contém o amfídio, um órgão sensorial do nematodo que media respostas a diferentes estímulos, incluindo a força osmótica. O amfídio é composto por 12 neurônios sensoriais bipolares com cílios e um axônio terminal pré-sináptico.Dois desses neurônios, denominados ASHR e ASHL, são particularmente importantes na função sensorial osmótica, detectando repelentes solúveis em água com alta força osmótica. Aqui, apresentamos um método baseado em anel de frutose para medir a evitação osmótica em mutantes com defeitos na sinapse de C. elegans.Para avaliar as implicações das neuro e neuro na evitação de alta força osmótica, relatamos a resposta diferente de C. elegans mutantes defeituosos nos genes neuro neural, utilizando um método baseado em uma solução de frutose quatro molar. No dia do experimento, prepare uma solução estoque de quatro molar de frutose com 1% de vermelho de Congo e dissolva completamente à temperatura ambiente. Desenhe um anel de um centímetro de diâmetro em uma placa de NGM, traçado logo abaixo do centro do meio sólido.Usando 15 microlitros da solução vermelha de frutose quatro molar. Deixe a frutose penetrar no ágar por cerca de cinco minutos. O experimento deve ser realizado de forma cega. A placa com cada linhagem a ser S8 deve ser identificada por um segundo pesquisador.O SA é realizado utilizando essas marcas que são não solicitadas. Quando o experimento tiver terminado, cerca de 24 horas antes da realização da venda, é necessário selecionar L quatro larvas de cada genótipo e transferi-las para uma placa AFL NGM contendo bactérias e coli, mantendo-as a 20 graus Celsius no dia seguinte. O experimento deve ser iniciado com adultos jovens.Coloque um verme individual de cada linhagem dentro do círculo de repouso e acompanhe cada animal até o momento em que responder à barreira de tic. Devem ser utilizados 10 animais de cada linhagem e um mínimo de três experimentos replicados para se obter um resultado conclusivo. Aqueles que evitarem o anel vermelho seis vezes consecutivas são classificados como normais.Aqueles que saem do anel em menos de seis tentativas são considerados defeituosos no controle da sensibilidade à osmose; a linhagem de controle deve ser usada em cada SA Bristol, e dois animais são utilizados como controles positivos porque evitam o anel de barreira. As linhagens-controle respondem movendo-se para trás quando encontram uma barreira osmótica composta por frutose quatro molar. Mutantes deficientes em neuro apresentam um comportamento semelhante a esses em relação ao tipo de força.No entanto, mutantes deficientes em NEUR não conseguiram detectar essa barreira osmótica. As forças dos mutantes duplos car em diferentes alelos neur e nout recuperaram o fenótipo selvagem, respondendo à intensidade osmótica para obtenção de vermes para baixo por alimentação com interferência de RNA, isolando colônias de E. coli da estirpe HD 11 cinco que foi transformada com vetor L 44 40 contendo um fragmento correspondente ao gene alvo. As bactérias são isoladas em placas LBA ou com carbônico no dia seguinte.Escolha uma colônia de bactérias e inocule o meio líquido LV. Incube por cerca de sete horas com agitação a 37 graus. Coloque uma gota dessa cultura em uma placa de NGM com tampa de carbonato e IPTG e deixe overnight à temperatura ambiente, permitindo que as bactérias cresçam e iniciem a indução da expressão do fragmento do gene alvo.É necessário usar um controle positivo e um controle não negativo para o experimento de interferência por RNA. Experimentos de alimentação. O controle negativo é igual.A linhagem I HT 11 cinco transformada com o vetor TL 44 40. Os controles positivos ELI HT 11 cinco células transformadas com o vetor L 44 40 contendo uma sequência do gene 22. A inativação deste gene origina um fenótipo de tremor facilmente distinguível ao microscópio estéril.Primeiro dia. Quatro larvas de estágio L1 provenientes de placas NGM com bactéria são transferidas para uma placa com bactéria e Kuwait a 20 graus Celsius durante 12 horas. Este é um período de jejum.No dia seguinte, transfira o adulto jovem rápido para uma placa inoculada com bactérias expressando o gene-alvo específico de interferência por RNA. Incube por cerca de 48 horas a 20 graus Celsius para obtenção da prole F1. Em seguida, selecione alguns adultos F1 bomba e transfira-os para outra placa inoculada com as mesmas bactérias nos dois dias seguintes.Selecione e isole adultos jovens da prole F2, identificando os fenótipos da linhagem selvagem Bristol N2, gorda, com bactérias ocorrendo empatia. O vetor L4440 estava indo para trás quando fino. A barreira osmótica.A linhagem tipo verdadeira branca de Bristol alimentada com bactérias expressando um fragmento do gene neur de C. elegans falhou em detectar as soluções osmóticas. No entanto, o mutante deficiente em neur, incapaz de detectar a barreira osmótica, recuperou essa capacidade quando foi alimentado com bactérias expressando um fragmento do gene nlg-1 de C. elegans. Neste vídeo, mostramos um método simples que permite estudar o efeito de genes que afetam a resposta de evitação osmótica em C. elegans.Um anel de frutose formal apertado com vermelho Congo é usado para analisar a resposta do verme à força osmótica. Mutantes deficientes em neurologina apresentam defeito nesta resposta; no entanto, mutantes NU não têm a detecção de estresse osmótico prejudicada, mostrando uma resposta semelhante à da linhagem selvagem. Este vídeo mostra que linhagens de mutantes duplos portadoras de diferentes alelos nulos em genes de ligação e liberação recuperaram o fenótipo selvagem, respondendo à força osmótica.Essas observações foram confirmadas utilizando interferência por RNA, com abordagem de alimentação em contenção. Desta forma, a linhagem selvagem apresentou dificuldade em reconhecer a barreira osmótica quando alimentada com bactérias expressando a sequência correspondente do gene ING. Por outro lado, mutantes defeituosos em neur, incapazes de detectar a solução de frutose mais concentrada, recuperaram esse comportamento quando alimentados com bactérias expressando a sequência correspondente do gene NNU.Os resultados mostrados neste experimento indicam que nrx-1 e nlg-1 podem estar envolvidos na conexão sináptica dos neurônios sensoriais do nematodo e também que interagem entre si de maneira que afeta a função sináptica. Ok, adeus e boa sorte com seus experimentos.

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