Name: Fluxo de Neutrófilos Humanos Secção Ensaio de Adesão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Aprenda a medir a adesão firme de neutrófilos humanos usando um ensaio de câmara de fluxo sob tensão de cisalhamento. Este método permite investigar interações celulares e variações genéticas associadas a doenças autoimunes.

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Este trabalho é patrocinado pelo Instituto Lupus Research (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 e NIH UL1-TR00165. Agradecemos ao Dr. Robert P. Kimberly por seu apoio contínuo.

Todos os doadores recrutados para este estudo deu consentimento informado escrito eo estudo foi aprovado pela Universidade de Alabama em Birmingham Institutional Review Board. 1. HUVEC Cultura Inicial e Subcultura <ol><li> Cultura das células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) in vitro em meio de crescimento completo, que é composta de meio basal de células endoteliais (ver Lista de Materiais) suplementado com factores de crescimento de células endoteliais. Nota: Os factores de crescimento utilizados neste estudo incluem: 5 ng / ml de recombinante humano do Factor de Crescimento Epidérmico (hEGF), 1,0 mg / ml de hidrocortisona, 50 mg / ml de gentamicina e 50 ng / mL de anfotericina-B (GA-1000), 2 % de soro fetal bovino (FBS), 0,5 ng / ml de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), 10 ng / mL de Factor de Crescimento de Fibroblastos-básico com heparina (hFGF-B), 20 ng / ml de factor humano recombinante humana Insulin-like Growth ( R3-IGF-1), 1 ug / ml de ácido ascórbico, e 22,5 ug / ml de heparina. O meio completoé preparado inicialmente a 37 ° C e, em seguida, pode ser armazenado a 4 ° C para utilização no prazo de um mês de preparação. </li><li> Para preparar um frasco de células, meio de crescimento completo é adicionada a um frasco de cultura de tecidos de 75 centímetros 2 (1 ml / 5 cm 2) e, em seguida, o balão é deixado a equilibrar a 37 ° C / 5% de CO 2, num incubador humidificado durante , pelo menos, 30 min. HUVEC humana serão semeadas directamente neste frasco de cultura equilibrado a uma densidade de 2,500-5,000 células / cm 2. </li><li> Enquanto a mídia está equilibrando, descongelar rapidamente o estoque cryovial HUVEC em banho-maria 37 ° C. Dispersar as células no frasco de armazenamento original por vórtex e, em seguida, adicioná-los directamente para o frasco de cultura contendo o meio de crescimento completo HUVEC pré-equilibrada para atingir uma densidade de 2,500-5,000 células / cm 2. Agite suavemente o frasco para distribuir uniformemente as células e, em seguida, devolver o frasco para a incubadora. Estas células representam agora a passagem 1 º. </li> &lt;li&gt; Médio deve ser trocado a cada dois dias até que as células são de 70-80% confluentes. </li><li> O HUVECs pode agora ser colhidas a partir do balão de cultura com tripsina / EDTA. O meio de cultura foi aspirado a partir dos frascos de cultura, seguido por uma lavagem com PBS, para remover qualquer proteína residual e de cálcio das células. Uma solução de Tripsina-EDTA a 0,25% é adicionado e dentro de 2-6 min desprendimento de células deve ser evidente, tal como avaliado através de microscopia de luz. </li><li> Quando 90% das células são arredondadas para fora da placa, parar a tripsinização adicionando um volume igual de 2x inibidor de tripsina. Para facilitar a colheita de células, adicionar uma outra quantidade igual de meio de crescimento completo. Transferir as células destacadas para um tubo de centrífuga de 15 ml estéril. </li><li> Centrifugar as células isoladas a 225 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante, e, em seguida, voltar a suspender as células em 2-3 ml de meio de crescimento completo. Determinar a concentração de células e viabilidade utilizando um hemocitômetro e azul de tripano. </li><li> Para utilizar ªe células para estudo, re-semente adicional 75 centímetros 2 frascos com células a uma densidade de 10.000 células / cm 2 colhidas e vá para o passo 2.2. Alternativamente, as células podem ser congeladas neste ponto para estudos futuros. Para congelamento celular, sedimentar as células por centrifugação a 225 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em FBS contendo DMSO a 10% a uma concentração de 1 x 10 6 células / ml. A suspensão de células é então transferido para criotubos e armazenou-se a -80 ° C após o congelamento das células em um recipiente de congelamento celular. </li></ol> 2. Preparação HUVEC Camada <ol><li> Uso de congelados HUVECs passagem 2 ª: renascimento e da cultura. Se o uso de células em crescimento activo, siga para o passo 2.2. <ol><li> Descongele o cryovial contendo 2 ª HUVECs passagem do passo 1.8 rapidamente em banho-maria 37 ° C. Células Transferência do cryovial para um tubo de centrífuga de 15 ml estéril e adicionar 10 ml de crescimento medium. </li><li> Centrifugar as células a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante para remover o DMSO residual. </li><li> Ressuspender o sedimento de células com meio de crescimento completo e transferência das células para um frasco de 75 cm 2. Adicionar meio de crescimento para um volume total de cerca de 20-25 ml e incubar a 37 ° C / 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Examine visualmente a cultura de células em confluência cada dia com as mudanças de mídia a cada dois dias. Normalmente dentro de 2-4 dias, as células atingem 80-90% de confluência, altura em que estará pronto para a utilização no ensaio de câmara de fluxo. </li><li> Para preparar o prato de cultura que vai ser utilizado na câmara de fluxo (ver secção 5), adicionar 1 ml de 10 ug / ml de fibronectina e de 0,05% (w / v) de gelatina a de 35 mm de cultura de tecidos e louça pipeta várias vezes para fazer Certifique-se de toda a placa de superfície é revestida. Remover a solução de fibronectina e gelatina excessiva e secar a placa pelo menos durante 30 minutos para optimizar a formação de uma matriz de proteínas. O fsolução ibronectin e gelatina pode ser reutilizada até 10 vezes. </li><li> Colher as células HUVEC do passo 2.2 utilizando tripsina-EDTA como descrito nos passos de 1,5-1,7. Semente 500.000 células em cada tecido revestido cultura prato. Adicionar 2 ml de meio de crescimento em cada placa e incubar a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Permitir que as células crescer até à confluência, como no passo 2.2. As células devem ser inspeccionados visualmente diariamente com alterações médias a cada dois dias. Antes do ensaio de câmara de fluxo, primo da HUVEC com 20 ng ml de TNF-α humana / de 4-6 horas para regular positivamente e estimular a expressão da adesão molecular. </li></ol> 3. Purificada Ligand Coating <ol><li> Desenhar um círculo de 0,5 cm de diâmetro com um marcador ou uma caneta no centro de 35 mm de cultura de tecidos prato. </li><li> Placa 20 ul de 20 ug / ml de proteína A na área marcada. Use a ponta da pipeta para espalhar a proteína A solução para cobrir toda a área dentro do círculo 0,5 centímetros de diâmetro. É importante não tocar ou arranhar a superfície do dish. Incubar a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Lavar as proteína-A revestidos 3x placa com 1 ml de PBS (pH 8,0). </li><li> Placa 50 ul 1% de BSA na área demarcada para bloquear a ligação não-específica na placa. Incubar durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar as 3x placa bloqueados com 1 ml de PBS, como no passo 3.3. </li><li> Preparar as soluções de proteínas quiméricas do ligando do receptor de Fc-aderência para revestimento. Nesta experiência, uma solução de ICAM-1/Fc quimera, a 25 ug / ml e uma quimera P-Selectin/Fc a 0,5 ug / ml em PBS (pH 8,0) foi usado. </li><li> Revestir a área marcada com 50 ul de substrato. Incubar durante a noite a 4 ° C. O prato deve ser usada dentro de dois dias e a área de revestimento não devem ser deixadas a secar fora. Adicionar PBS, se necessário, para manter a solução de 50 mL na placa. </li></ol> 4. Separação de neutrófilos (Todos os passos realizados na temperatura ambiente) <ol><li> Após a obtenção do consentimento informado, coleta de sangue por flebotomia participante em umn anticoagulante tubo de coleta de sangue ou vacutainer (EDTA ou heparina). Após a coleta de sangue, diluir a 1:01 sangue com PBS antes da separação. </li><li> Prepare uma de duas camadas Ficoll para separar PBMC e neutrófilos em 50 ml tubos de centrífuga. Primeiro adicione 15 ml de Ficoll pesado (veja Lista de Materiais, ρ = 1,118-1,120), e depois com cuidado a camada 10 ml luz Ficoll (ver Lista de Materiais, ρ = 1,077-1,080) em cima do pesado Ficoll. Deve haver uma fronteira nítida entre o Ficoll luz e camadas de Ficoll pesados. Finalmente, a camada cuidadosamente 25 ml da amostra de sangue diluído no topo do Ficoll luz sem perturbar a camada de Ficoll. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 250 xg durante 30 min à temperatura ambiente. Nota: O freio de rotor da centrifugadora deve ser desligado para estas rotações para minimizar potencial ruptura da separação de células durante a desaceleração do rotor, no final da centrifugação. Após a centrifugação, as seguintes camadas (de cima para baixo) estão presentes: a camada superior é o seguin plasmawed pela camada de PBMC no topo da camada de Ficoll luz, a camada de neutrófilos com poucas células vermelhas do sangue (RBC) é entre a luz e Ficoll pesada seguido pela camada de Ficoll e pesado GVs na parte inferior do tubo. </li><li> Colheita e transferir a camada de neutrófilos para um novo tubo de 50 ml com uma pipeta de transferência, adicionar PBS a um volume final de 50 ml e centrifugar a 225 xg durante 10 min à temperatura ambiente. <ol><li> Após centrifugação, ainda pode haver GVs misturados com os neutrófilos. Aspirar o sobrenadante até à marca de 10 ml. Ressuspender o sedimento de neutrófilos-RBC por agitação suave do tubo (ou um breve vórtice a baixa velocidade) e, em seguida, lavar novamente com 50 ml de PBS. </li></ol></li><li> Após a segunda lavagem, aspirar o sobrenadante. Para remover os glóbulos vermelhos contaminantes, ressuspender as células peletizadas em PBS residual por meio de agitação (ou curto vórtice), adicionar 25 mL de H2O e suavemente vórtice durante 10 segundos para lisar os glóbulos vermelhos. <ol><li> Adicionar 25 ml de NaCl 1,8% e misture imediatamentepor centrifugação a 225 xg durante 10 min à temperatura ambiente. O RBC contaminando agora devem ser lisadas deixando um neutrófilos pellet de células brancas. </li></ol></li><li> Lava-se a pelete de células de neutrófilos com PBS. </li><li> Ressuspender as neutrófilos isolados em meio RPMI com 10% de FBS e determinar a concentração de células em microscópio de luz com um hemocitómetro. </li><li> Ajustar a densidade de células a 500.000 células / ml com meio RPMI completo, 10% de FBS. </li></ol> 5. Fluxo Secção Ensaio de Adesão <ol><li> Monte a câmara de fluxo. Coloque o prato de 35 mm contendo as HUVEC confluentes ou ligandos de receptores de adesão purificadas sobre a mesa de microscópio. Ligue a câmara de fluxo de placas paralelas com bomba de seringa, sistema de vácuo e deixar uma linha aberta para a entrada de neutrófilos. Inserir a câmara de fluxo no topo da placa e fixar o conjunto da câmara de escoamento 13. (Ver Figura 1) </li><li> Inicie o programa de gravação de vídeo no computador conectado to microscópio. Ajustar o campo e foco do microscópio até um campo claro com células HUVEC totalmente crescidas ou um domínio dentro da região de revestimento ligante é visível. </li><li> Usando a bomba de seringa, lave a câmara de fluxo com meio RPMI. Certifique-se de que não há bolhas de ar no interior da câmara ou a linha de entrada de neutrófilos. </li><li> Se desejado, os neutrófilos podem ser preparadas com uma dose baixa (10 -8 M) fMLP durante 10 min. Isto vai permitir uma correspondência entre o nível basal de activação dos neutrófilos entre diferentes doadores 14. </li><li> Utilizar a bomba de seringa para injectar os neutrófilos para a câmara de fluxo a uma velocidade definida (uma velocidade de 350 mL / min, o que equivale a uma tensão de corte de 1,5 dines / cm 2 é utilizada neste estudo). Grave o vídeo. Porque a adesão de neutrófilos pode ocorrer rapidamente, um vídeo com uma duração de 4-5 minutos é geralmente suficiente para quantificar os eventos de adesão para análise. </li><li> Uma célula aderente é definida como uma célula que se move menos do que um diâmetro da céluladentro de 5 seg em HUVEC ou ligando de superfície revestida 15,16. Contar o número total de células aderentes no campo presente no vídeo gravado utilizando esta regra. Ao gravar vídeos de comprimento semelhantes com neutrófilos de doadores diferentes, pode-se calcular o aderente células / min para comparar as propriedades de adesão entre os diferentes doadores. </li></ol>

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<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+variations+in+absolute+wall+shear+stress+levels+within+one+species+and+between+species%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species.</a> Atherosclerosis. 195 (2), 225-235 (2007).</li>
<li>Nagaoka, T., Yoshida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+evaluation+of+wall+shear+stress+on+retinal+microcirculation+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1113-1119 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo orienta a separação e isolamento de neutrófilos ativados minimamente para a quantificação cuidadosa de adesão de neutrófilos sob condições de estresse pura. Adesão de neutrófilos é um processo crítico em inflamação. Porque variantes genéticas em várias moléculas neste processo têm sido demonstrados para predispor ao desenvolvimento de doença auto-imune 1,2, um sistema de ensaio capaz de avaliar quantitativamente humano firme adesão de neutrófilos é necessária. O método descrito neste protocolo permite a determinação cuidadosa e quantitativa do potencial adesiva firme de neutrófilos num ambiente controlado in vitro sob tensão de cisalhamento. Este método permite, assim, a comparação direta de adesão de neutrófilos quantitativa entre indivíduos genotipados para determinar a importância da variação genética em moléculas de adesão 14. Diversas etapas deste método merecem consideração cuidadosa para alcane resultados altamente reprodutíveis e quantitativos. Na preparação de HUVEC, que é fundamental para atingir 100% de confluência de células antes de utilizá-los na câmara de fluxo. Para utilizar as superfícies revestidas com ligando purificado, a área do revestimento de substrato nunca deve ser deixado secar ao evitar a desnaturação do ligando. Além disso, a preparação de neutrófilos humanos é crítico para o sucesso da experiência. As questões fundamentais em isolar os neutrófilos a partir de sangue incluem manipulação suavemente minimizando vórtex para evitar a activação, mantendo as células à temperatura ambiente (isto é, o sangue não deve ser armazenado em gelo e centrifugação passos devem ser realizados à temperatura ambiente) e completando o isolamento e a experiência no menor espaço de tempo possível. Há métodos adicionais de isolamento de neutrófilos que também podem ser utilizados para preparar as células para estes ensaios 17,18. A partir de uma perspectiva prática ensaios, de adesão utilizando neutrófilos humanos recém-isoladas<html> deve ser iniciada dentro de 3-6 horas após a participante flebotomia. Como os neutrófilos são extremamente sensíveis à manipulação, tempos prolongados entre a coleta de sangue e uso podem afetar os resultados do ensaio. Determinação cuidadosa da concentração de células de neutrófilos antes do ensaio de câmara de fluxo é também necessária para alcançar resultados precisos e reprodutíveis. Durante o ensaio de câmara de fluxo, é importante controlar a gravação de vídeo com cuidado para garantir que a velocidade de fluxo é constante e não há nenhuma turbulência durante toda a duração da experiência. As alterações nas velocidades de fluxo ou a presença de turbulência, seria necessário que o experimento ser repetido. Após a experiência, que também é importante para avaliar os neutrófilos restantes microscopicamente para assegurar que os neutrófilos não estão aglomerem. Aglomeração neste ponto que indicaria que os neutrófilos ativados se tornaram o que pode alterar significativamente a densidade de neutrófilos durante o experimento. conteúdo &quot;&gt; A câmara de fluxo cria uma tensão próximo homogénea pura dentro da câmara (τ = 6Qμ / (wh 2), onde Q = caudal, μ = viscosidade dinâmica, e w = largura da câmara de fluxo, h = altura da câmara de fluxo 15). Nos nossos estudos, utilizou-se uma taxa de fluxo de 350 mL / min para a adesão de neutrófilos, o que cria uma tensão de cisalhamento de 1,5 dines / cm 2 (w = 0,25 cm, h = 0,01 cm, a viscosidade da água a 37 ° C (0,007 poise) foi usado como uma aproximação da viscosidade dos meios RPMI). Para uma câmara de fluxo específico, pode-se alterar a taxa de fluxo para atingir diferentes níveis de tensão de cisalhamento para simular diferentes condições fisiológicas. shear stress fisiológico típica em vasos sanguíneos humanos pode varia entre 0,5-5,0 dyne / cm 13,16. Tensão de cisalhamento em outros vasos sanguíneos e outros animais foram listadas na Tabela 1 113,16,19 20. Enquanto o nosso método tem-se centrado no estudo da adesão de neutrophi humanols, este método não se limita aos neutrófilos e pode facilmente ser aplicado a estudos de adesão ou de rolamento de outros tipos de células, com modificações simples. Além disso, os substratos neste método pode ser modificado para fins diferentes. Embora este protocolo é facilmente adaptável a diferentes estudos, existem algumas limitações. O protocolo como implementado aqui requer grande número de células primárias para análise. Isso pode impedir a análise de células primárias de pequenos animais. Além disso, a necessidade de imobilizar ligandos de adesão purificadas numa conformação activa / disponíveis podem limitar a gama de ligantes. A utilização de proteínas de fusão Fc-aumenta grandemente as possibilidades de conseguir a conformação do ligando apropriado sobre a superfície da placa. No entanto, o nosso método não tem uma flexibilidade significativa para permitir a análise quantitativa de eventos de adesão. Estes estudos irão melhorar muito a nossa compreensão de pares receptor-ligante de adesão, bem como a importância da função potencial de variantes genéticasnestas proteínas, na patogénese de doenças humanas.

Variantes genéticas em ambos β 2 integrinas e em ligandos ICAM são reconhecidos agora a ser associada com o desenvolvimento de doença auto-imune 1,2. A determinação das consequências funcionais destas variantes em células derivadas de indivíduos com essas variantes é necessário para a nossa compreensão de como essas variantes contribuir para a patogênese da doença auto-imune. Tais estudos funcionais permitir a determinação dos mecanismos através dos quais ocorrem naturalmente, variantes genéticas moldam a resposta imune na saúde e na doença. No exemplo específico de LES, agora sabemos que as variantes em ITGAM (CD11b) e seu ligante, ICAM-1, associam fortemente com o desenvolvimento da doença 1,2. Porque neutrófilos são críticos em respostas inflamatórias, o estudo quantitativo de adesão de neutrófilos pode fornecer insights sobre como os mecanicistas variantes genéticas em ITGAM / ICAM alterar a inflamação. NeutropHil adesão firme às células endoteliais (CE) é um processo altamente regulado e desempenha um papel essencial na resposta inflamatória 3,4. A adesão firme dos neutrófilos segue rolando neutrófilos inicial e captura no CE e, finalmente, pode resultar em transmigração in vivo. Estes processos envolvem vários tipos diferentes de moléculas de adesão, incluindo ICAM-1, ICAM-2, P-selectina, E-selectina em células endoteliais e β 2 integrinas na neutrófilos 5-9. Assim, a quantificação cuidadosa de adesão de neutrófilos de doadores com diferentes variantes alélicas de moléculas de adesão será importante para compreender as conseqüências funcionais e patológicas dessas variantes genéticas. O uso experimental de uma câmara de fluxo pode criar um ambiente in vitro, com a tensão de corte de fluido semelhante ao observado no meio de vasos sanguíneos in vivo de 10-12. De facto, um ensaio de câmara de fluxo acoplado com umbili humanocal de células endoteliais de veia (HUVEC) podem simular o ambiente in vivo de um vaso sanguíneo. Usando este método, é possível estudar as propriedades adesivas celulares globais em direção das células endoteliais. Além disso, o ambiente altamente controlado da câmara de fluxo, também permite a avaliação da ligação de células a ligandos de adesão purificadas, tais como ICAM-1 a fim de facilitar o estudo da interacção receptor-ligando específicas. Apresentamos aqui um método que utiliza um sistema de ensaio de adesão de câmara de fluxo para estudar as propriedades adesivas de neutrófilos de sangue periférico humano a HUVEC e a substratos de ligandos purificados. Usando este método com células de doadores que expressam diferentes variantes da molécula de adesão alélicas nos permite avaliar como essas variações genéticas podem alterar humano adesão firme dos neutrófilos.

<table><tbody><tr><td>0,25% de tripsina/EDTA</td><td>Life technologies</td><td>25200-056</td><td>com vermelho de fenol</td></tr><tr><td>2x inibidor de tripsina</td><td>Life technologies</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 35 mm</td><td>Corning Inc.</td><td>430165</td><td>Superfície tratada com cultura de tecidos padrão</td></tr><tr><td>75 cm2 frasco de cultura de tecidos</td><td>Corning Inc.</td><td>430641</td><td>Câmera CCD de superfície tratada com cultura de tecidos padrão</td></tr><tr><td></td><td>Dage-MTI</td><td>Modelo 300T-RC</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de congelamento de células&nbsp;</td><td>Biocisão</td><td>BCS-045</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td>HUVEC crescimento basal médio</td></tr><tr><td>EGM-2 Bulletkit</td><td>Lonza Inc</td><td>CC-4176</td><td>HUVEC fatores de crescimento para meio basal</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life technologies</td><td>10082-147</td><td>Certificado, Gelatina Inativada por Calor</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>de pele bovina</td></tr><tr><td>Hemacitômetro</td><td>Fisher scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>a partir de plasma humano</td></tr><tr>Câmara<td>de fluxo</td><td>Glyco Tech</td><td>31-001</td><td>Câmara de fluxo circular para pratos de 35 mm</td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma</td><td>47729</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-11191</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Heavy Ficoll</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2517A</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R& D Systems</td><td>720-IC</td><td>Fc quimera</td></tr><tr><td>Meio de separação de linfócitos</td><td>Mediatech Inc.</td><td>25072CV</td><td>Light Ficoll</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 médio</td><td>Tecnologias de vida</td><td>11875</td><td>com L-glutamina e fenol vermelho</td></tr><tr><td>Proteína A</td><td>Sigma</td><td>P6031</td><td>ressuspender em PBS</td></tr><tr><td>P-Selectin</td><td>R & D Systems</td><td>137-PS</td><td>Fc chimera</td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>KD Scientific</td><td>KDS270</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&#945;</td><td>Life technologies</td><td>PHC3015</td> solução azul de tripano <td>de proteína humana recombinante</td></tr><tr><td>, 0,4%</td> <td>Tecnologias de vida</td><td>15250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

fluxo de neutrófilos humanos secção ensaio de adesão

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Firme adesão de neutrófilos às células endoteliais desempenham um papel crítico na inflamação na saúde e na doença. O processo de adesão firme dos neutrófilos envolve muitas moléculas de adesão diferentes, incluindo membros da família integrina β 2 e respectivos contra-receptores da família ICAM. Recentemente, de ocorrência natural em ambas as variantes genéticas β 2 integrinas e ICAMs são relatados para ser associada com a doença auto-imune. Assim, a capacidade adesiva quantitativa de neutrófilos de indivíduos com diferentes formas alélicas destas moléculas de adesão é importante para estudar em relação aos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento de auto-imunidade. Estudos de adesão dos sistemas de câmara de fluxo pode criar um ambiente com tensão de corte de fluido semelhante ao observado no meio de vasos sanguíneos in vivo. Aqui, apresentamos um método que utiliza um sistema de ensaio de câmara de fluxo para estudar as propriedades adesivas quantitativas de neutrófilos no sangue periférico humanos de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e substratos de ligandos purificados. Com este método, as capacidades adesivas de neutrófilos a partir de doadores com diferentes variantes alélicas de receptores de adesão pode ser avaliada e comparada. Este método também pode ser modificado para avaliar a adesão de outros tipos de células primárias ou linhas celulares.

Exemplos de ligação de neutrófilos para um ligando purificado (ICAM-1/P-Selectin) câmara de fluxo revestida (Figura 2) ou de ligação a um ensaio de câmara de fluxo revestida HUVEC (Figura 3) neutrófilos são mostrados. Como mostrado nas figuras, os neutrófilos continuam a acumular / aderir à superfície revestida ou HUVEC sob condições de fluxo contínuo. Nas nossas condições típicas da experiência, podemos observar 50-70 neutrófilos humanos firmemente aderem à superfície revestida ou HUVEC durante um período de gravação de quatro minutos. No entanto, variantes alélicas das moléculas de adesão de neutrófilos, ou variantes alélicas do substrato (ligando purificado ou HUVEC), poderia alterar substancialmente a adesão de neutrófilos quantitativa 14. Também se avaliou a dependência do tempo de acontecimentos de adesão de neutrófilos observado nos nossos estudos. Enquanto que mantêm as condições de fluxo constante, é possível que as propriedades adesivas das células mudam ao longo do tempo. However, ao longo dos cursos de tempo relativamente curtos em nossos estudos, não observamos diferenças consistentes na taxa de adesão ao longo do tempo. Por exemplo, avaliar a adesão nos pontos de tempo 1-2 minutos em relação a aderência observada entre os 3-4 pontos no tempo mínimo não são consistentemente diferente. É claro que, se as células estão a ser estimulado durante a experiência de adesão, em seguida, as alterações nas propriedades adesivas ao longo do tempo poderia ser esperado. Nos nossos estudos, controlado por isolamento da activação dos neutrófilos induzida por intencionalmente priming as células com baixa dose de fMLP (10 -8 M) durante 10 minutos antes do estudo. As células endoteliais (HUVEC em nossos estudos) também necessitam de ativação antes de upregulate molécula de adesão expressão para melhor adesão firme dos leucócitos. Na ausência de pré-tratamento, as células endoteliais (HUVECs) vai apoiar muito pouca aderência de neutrófilos. Nos nossos estudos, utilizou-se 10 ng / ml de TNF para o tratamento de 4-6 horas antes de utilizar. IL-1β (10 ng / ml) e<html> LPS (0,5-1 ug / ml) também pode ser utilizado para pré-activar as células endoteliais. Importante, as HUVEC não tratada pode ser utilizada como controlo negativo para assegurar que a adesão das células é causada por específico interacções celulares de neutrófilos-endotelial (mediada por receptores). Alternativamente, os anticorpos anti-receptor podem ser utilizados para bloquear os receptores específicos para avaliar a especificidade de adesão. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1.jpg" /> Configuração câmara Figura 1. Fluxo no palco microscópio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> oad/51410/51410fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2 tiros de tela de um vídeo de amostra de neutrófilos que aderem a ICAM-1/P-Selectin superfície revestida em momentos diferentes (A:. 0 ponto de tempo, B: 1 ponto min tempo, C: 2 min ponto do tempo, e D: intervalo de 4 min). A concentração de ICAM-1 é de 25 ug / ml e P-selectina é de 0,5 ug / ml. Velocidade do fluxo de neutrófilos é de 350 ul / min com a densidade de neutrófilos em 500.000 células / ml. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3.jpg" /> Tiros Figura 3 Tela de uma amostra de vídeo de neutrófilos que aderem à superfície de HUVEC revestidos em diferentes pontos de tempo (A: 0 ponto de tempo, B: 1 min de ponto de tempo, C: 2 min ponto do tempo, e D: Ponto de tempo de 4 min)..Velocidade do fluxo de neutrófilos é de 350 ul / ml, com a densidade de neutrófilos em 500.000 células / ml. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td> Espécies </td><td > Localização </td><td > Tensão de cisalhamento (dinas / cm 2) </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Artéria caroid comum </td><td> 11,6 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Artéria branquial </td><td> 6.5 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Artéria femoral comum </td><td> 4.3 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Aorta supra-renal </td><td> 7.3 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Aorta supracelíaco </td><td> 4.2 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Artéria fermoral Superficial </td><td> 4.4 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Vênulas </td><td> 0,5-5,0 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Retina primeiros arteríolas </td><td> 40,2 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Segundo arteríolas da retina </td><td> 0,001 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Retina primeiros vênulas </td><td> 23,2 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Segundo vênulas da retina </td><td> 0,43 </td></tr><tr ><td> Cão </td><td> Artéria caroid comum </td><td> 15,8 </td></tr><tr ><td> Coelho </td><td> Artéria caroid comum </td><td> 23,3 </td></tr><tr ><td> Rato </td><td> Artéria caroid comum </td><td> 46,6 </td></tr><tr ><td> Mouse </td><td> Artéria caroid comum </td><td> 64,8 </td></tr><tr ><td> Cão </td><td> Artéria femoral comum </td><td> 9,8 </td></tr><tr ><td> Coelho </td><td> Artéria femoral comum </td><td> 156,8 </td></tr><tr ><td> Rato </td><td> Artéria femoral comum </td><td> 65,9 </td></tr></tbody></table> Amostra estresse Tabela 1. Cisalhamento em diferentes órgãos e espécies diferentes. * Sintetizada a partir de referências 13, 16, 19 e 20.

Um método de quantificação da aderência de neutrófilos é relatado. Este método cria um ambiente dinâmico de fluxo semelhante ao encontrado em um vaso sanguíneo. Ele permite a investigação de adesão de neutrófilos, quer moléculas de adesão purificadas (ligando) ou substrato de células endoteliais (HUVEC) num contexto semelhante ao ambiente in vivo com tensão de cisalhamento.

Fluxo de Neutrófilos Humanos Secção Ensaio de Adesão

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

O objetivo geral deste procedimento é medir a adesão firme de neutrófilos utilizando um ensaio em câmara de fluxo que permite a adesão de neutrófilos humanos na presença de tensão de cisalhamento. Isso é realizado primeiramente preparando um substrato de moléculas de adesão purificadas ou uma superfície de células endoteliais, como células endoteliais de veia umbilical humana ou ve. O segundo passo é separar neutrófilos do sangue periférico humano utilizando um método de centrifugação em dois níveis com PHI.Em seguida, a câmara de fluxo é montada para permitir a injeção dos neutrófilos humanos isolados sob estresse cisalhante sobre o substrato de adesão, ligantes ou ve. O passo final consiste em registrar os eventos de adesão de neutrófilos na câmara de fluxo, seguido por uma cuidadosa quantificação da adesão firme. Em última análise, o ensaio em câmara de fluxo é utilizado para demonstrar a adesão firme de neutrófilos frente a moléculas de adesão purificadas e uma superfície HX.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de autoimunidade, como a importância funcional de variações genéticas em moléculas teciduais que se sabe estarem associadas ao desenvolvimento de doenças autoimunes. Estudos genéticos em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico demonstraram forte associação com variantes da integrina Abeta dois, uma proteína envolvida na adesão firme de neutrófilos. Desenvolvemos este sistema de ensaio para avaliar as consequências funcionais da variação genética nesta integrina beta dois chamada Mac-1 na adesão firme. Para preparar as placas de cultura para uso na câmara de fluxo.Adicione um mililitro de uma solução de fibrina e gelatina a cada placa de cultura tecidual de 35 milímetros e pipete várias vezes para garantir que toda a superfície da placa esteja revestida. Remova o excesso de solução de fibronectina e gelatina e seque as placas ao ar por pelo menos 30 minutos. Para otimizar a formação da matriz proteica, recolha células endoteliais de veia umbilical humana ou qve que tenham sido cultivadas até 80 a 90% de confluência utilizando tripsina-EDTA e semeie 500.000 células em cada placa de cultura tecidual revestida.Adicione dois mililitros de meio de crescimento a cada placa e incube a 37 graus Celsius. As células com 5%CO2 devem ser inspecionadas visualmente diariamente, com trocas de meio a cada dois dias. Deixe as células crescerem até atingirem 80 a 90% de confluência.Para iniciar este procedimento, use uma caneta ou marcador para desenhar um círculo de 0,5 centímetros de diâmetro no centro de uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros. Adicione 20 microlitros de uma solução de proteína A a 20 microgramas por mililitro na área marcada. Use a ponteira da pipeta para espalhar a solução de proteína A, cobrindo toda a área dentro do círculo de 0,5 centímetro de diâmetro.É importante não tocar nem arranhar a superfície da placa. Incube as placas de cultura tecidual a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, lave cada placa revestida com a proteína a três vezes com um mililitro de PBS.Após remover o PBS do terceiro poço de lavagem, adicione 50 microlitros de BSA 1% na área marcada para bloquear a ligação inespecífica na placa. Incube a quatro graus Celsius por duas horas. Após duas horas.Lave a placa bloqueada três vezes com um mililitro de PBS. Prepare as soluções de proteínas quiméricas de ligantes de receptores de adesão FC para revestimento e este experimento; será utilizada ICAM-1 FC Quimera a 25 microgramas por mililitro e P-selectina FC Quimera a 0,5 microgramas por mililitro. Revestir a área marcada com 50 microlitros do substrato e incubar as placas de cultura tecidual durante a noite a quatro graus Celsius.As placas devem ser usadas dentro de dois dias e a área revestida não deve secar. Se necessário, adicione PBS para manter os 50 microlitros de solução na placa.Os neutrófilos para este estudo são isolados do sangue de participantes que deram consentimento informado por escrito. Após a coleta de sangue por flebotomia em um tubo de coleta de sangue com anticoagulante ou vacutainer, dilua o sangue em uma proporção de um para um com PBS e realize todas as etapas deste procedimento. À temperatura ambiente, prepare um gradiente de dois níveis com Ficoll para separar as células mononucleares do sangue periférico ou PBMCs e neutrófilos em tubos de centrífuga de 50 mililitros.Primeiro, adicione 15 mililitros de meio denso de PHI e, em seguida, sobreponha cuidadosamente 10 mililitros de meio leve de fi sobre o meio denso de fi. Deve haver uma fronteira nítida entre as camadas do meio leve de fi e do meio denso de fi. Por fim, sobreponha cuidadosamente 25 mililitros da amostra de sangue diluída sobre o meio leve de fi sem perturbar o PHI.Chame a centrífuga em camadas os tubos por 30 minutos à temperatura ambiente após a centrifugação; devem estar presentes múltiplas camadas. A camada de neutrófilos, com poucas hemácias, situa-se entre o gradiente leve e o gradiente pesado. Utilizando uma pipeta de transferência, colete e transfira a camada de neutrófilos para um novo tubo de 50 mililitros e adicione PBS até um volume final de 50 mililitros.Centrifugar a 225 vezes G durante 10 minutos. À temperatura ambiente após a centrifugação, ainda podem haver glóbulos vermelhos misturados aos neutrófilos. Aspire o sobrenadante até o volume de 10 mililitros.Marque Resus. Suspenda o pellet de neutrófilos e hemácias girando brevemente em velocidade baixa e, em seguida, lave novamente com 50 mililitros de PBS, aspirando o sobrenadante para remover as hemácias contaminantes. Re-suspenda as células em pellet no PBS residual mediante uma breve agitação em velocidade baixa.Adicione 25 mililitros de água e vorte suavemente por 10 segundos. Para os piolhos. Adicione 25 mililitros de cloreto de sódio 1,8% às hemácias e misture imediatamente por centrifugação a 225 × g durante 10 minutos.As células vermelhas do sangue contaminantes devem agora estar lisadas, deixando um pellet branco de neutrófilos. Lave o pellet de neutrófilos com PBS, descarte o sobrenadante e re-suspenda os neutrófilos isolados em meio RPMI com 10% de FBS. Após determinar a concentração celular em microscópio óptico com um hemocitômetro, ajuste a densidade celular para 500.000 células por mililitro com meio RPMI completo contendo 10% de FBS.Antes de iniciar o ensaio de adesão em câmara de fluxo, prime a VE com 20 nanogramas por mililitro de TNF alfa humano por quatro a seis horas para aumentar e estimular a expressão de moléculas de adesão. Quando as VE estiverem prontas, monte a câmara de fluxo. Coloque o recipiente de 35 milímetros contendo a monocamada de VE confluentes sobre a mesa do microscópio.Para os fins deste vídeo, será examinada apenas a adesão de neutrófilos ao VE, mas o mesmo procedimento se aplica ao estudo da adesão de neutrófilos a moléculas de adesão purificadas. Conecte a câmara de fluxo de placas paralelas à bomba de seringa e ao sistema de vácuo, deixando uma linha aberta para a entrada de neutrófilos. Insira a câmara de fluxo sobre a placa e fixe o conjunto da câmara de fluxo. Inicie o programa de gravação de vídeo no computador conectado ao microscópio.Ajuste o campo e o foco do microscópio até que um campo nítido com VE totalmente desenvolvido seja visível. Usando a bomba de seringa, lave a câmara de fluxo com meio RPMI. Certifique-se de que não haja bolhas de ar dentro da câmara ou na linha de entrada de neutrófilos.Use a bomba de seringa para injetar os neutrófilos na câmara de fluxo em velocidades definidas. Grave o vídeo, pois a adesão de neutrófilos pode ocorrer rapidamente; um vídeo de quatro a cinco minutos geralmente é suficiente para quantificar os eventos de adesão para análise. Este clipe mostra um exemplo de neutrófilos se ligando a uma câmara de fluxo revestida com HU E.Uma célula aderente é definida como uma célula que se move menos que um diâmetro celular em cinco segundos. Na superfície revestida com HU e. Aqui são mostradas capturas de tela em diferentes momentos de vídeos amostra de neutrófilos aderindo a uma superfície revestida com ICAM um P-selectina, ou a uma superfície revestida com uve.Em ambos os experimentos, a velocidade do fluxo de neutrófilos é de 350 microlitros por minuto, com uma densidade de neutrófilos de 500.000 células por mililitro. Em condições típicas, observou-se que de 50 a 70 neutrófilos humanos aderiram firmemente à superfície revestida com ligante ou VE durante um período de gravação de quatro minutos. No entanto, variantes alélicas das moléculas de adesão de neutrófilos ou variantes alélicas no substrato podem alterar substancialmente a adesão quantitativa de neutrófilos ao registrar vídeos de duração semelhante com diferentes doadores.Neutrófilos, o número de células aderentes por minuto pode ser calculado para comparar as propriedades de adesão entre diferentes doadores. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de verificar visualmente os neutrófilos quanto ao agrupamento celular causado pela ativação induzida durante o isolamento. Além disso, pode ser realizada uma avaliação paralela por citometria de fluxo da ativação celular para garantir que o estado de ativação das células seja equivalente entre doadores e entre experimentos.Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de autoimunidade explorarem a adesão celular em células humanas primárias de doadores com genótipos que possuem diferentes alelos da região codificadora da cadeia CD11b do integrina beta dois, MAC-1. Esses estudos permitiram uma avaliação cuidadosa e quantitativa do impacto funcional dessas variantes alélicas no sistema humano.

human-neutrophil-flow-chamber-adhesion-assay

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um ensaio de freqüência de adesão para medir cinética de interação receptor-ligante, quando ambas as moléculas estão ancoradas nas superfícies das células que interagem é descrito. Este ensaio mecanicamente baseado é exemplificado usando uma micropipeta pressurizado glóbulo vermelho humano como sensor de adesão e integrinas αLβ2 e molécula-1 de adesão intercelular como interagindo receptores e ligantes.

Ensaio de aderência de freqüência para In Situ Análise Cinética de Cross-juncional interações moleculares na interface célula-célula

Este artigo primeiro descreve um procedimento para isolar células endoteliais humanas a partir de veias umbilicais e, em seguida, mostra como usar estas células para examinar transmigração de neutrófilos em condições de escoamento. Ao utilizar uma câmara de fluxo de baixo volume feita a partir de um polímero com as características ópticas do vidro, ao vivo de células imagem fluorescente de populações de células raras é também possível.

Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

Este vídeo demonstra o ensaio de quimiotaxia de neutrófilos usando um método all-on-chip. O método permite o isolamento direto de neutrófilos do sangue total por seleção imunomagnética negativa seguida de ensaio de quimiotaxia em um chip microfluídico.

Um método baseado em chip microfluídico para análise rápida de quimiotaxia de neutrófilos usando sangue total

Este vídeo demonstra um ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar a interação de leucócitos e parceiros celulares, como células endoteliais. Este método fornece informações dinâmicas sobre adesão, desadesão e transmigração de leucócitos quando perfundidos sobre uma camada intacta e confluente de células vasculares.

Um ensaio baseado em fluxo laminar para estudar as interações entre leucócitos e células endoteliais

O vídeo demonstra um método para investigar o impacto das células estromais no recrutamento de leucócitos. Em um modelo de câmara de fluxo de placas paralelas, citocinas pró-inflamatórias induzem a expressão de receptores de adesão pelas células endoteliais, facilitando o recrutamento e a migração de neutrófilos. A conversa cruzada entre células estromais e células endoteliais diminui o recrutamento de neutrófilos para as células endoteliais.

Uma investigação de fluxo in vitro do efeito das células estromais no recrutamento de leucócitos

A aderência de neutrófilos ao endotélio activado em locais de infecção é um componente integral da resposta inflamatória do hospedeiro. Descritos neste relatório é um ensaio de ligação de neutrófilos, que permite...

Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

Este protocolo detalha um ensaio concebido para medir a quimiotaxia de neutrófilos humanos a partir de uma gota de sangue total com reprodutibilidade robusta. Esta abordagem evita a necessidade de separação de neutrófilos e requer apenas alguns minutos de ensaio tempo de preparação. O chip de microfluídica permite a medida repetida de quimiotaxia de neutrófilos ao longo do tempo em crianças ou pequenos mamíferos, onde o volume da amostra é limitado.

Plataforma microfluídica para medição de quimiotaxia de neutrófilos não transformados Sangue Total

Recrutamento de leucócitos para o fígado ocorre dentro dos canais especializados dos sinusóides hepáticos, que são revestidas por células endoteliais sinusoidais hepáticas únicas. Microscopia de contraste de fase de recrutamento de leucócitos através do endotélio sinusoidal hepática humana em condições de tensão de cisalhamento fisiológico pode facilitar a elucidação dos mecanismos moleculares que estão na base deste processo.

Um fluxo de Adesão Ensaio para o Estudo de Recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento

Os leucócitos atravessam a monocamada endotelial utilizando o paracelular ou o percurso intracelular. Foi desenvolvido um ensaio simples para seguir a distribuição de juncional endógeno VE-caderina e PECAM-1 durante a migração transendotelial de leucócitos sob fluxo fisiológico para discriminar entre as duas vias de transmigração.

Imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante Neutrophil Transmigração Sob Fisiológica Fluxo

Este artigo fornece o método detalhado de realização de um teste rápido de quimiotaxis de neutrófilos integrando o isolamento de neutrófilos no chip do sangue total e o teste de quimiotaxia em um único microfluídico.

Um método All-on-chip para análise rápida de quimiotaxis de neutrófilos diretamente de uma gota de sangue

Leucócitos, avidamente, interagir com células vasculares e plaquetas após lesão de parede do vaso ou durante a inflamação. Aqui, descrevemos um simples ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar os mecanismos moleculares que fundamentam as interações entre os leucócitos e os seus parceiros de celulares.

Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

Aprenda a medir a adesão firme de neutrófilos humanos usando um ensaio de câmara de fluxo sob tensão de cisalhamento. Este método permite investigar interações celulares e variações genéticas associadas a doenças autoimunes.

Fluxo de Neutrófilos Humanos Secção Ensaio de Adesão

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