Fluxo de Neutrófilos Humanos Secção Ensaio de Adesão

Um método de quantificação da aderência de neutrófilos é relatado. Este método cria um ambiente dinâmico de fluxo semelhante ao encontrado em um vaso sanguíneo. Ele permite a investigação de adesão de neutrófilos, quer moléculas de adesão purificadas (ligando) ou substrato de células endoteliais (HUVEC) num contexto semelhante ao ambiente in vivo com tensão de cisalhamento.

O objetivo geral deste procedimento é medir a adesão firme de neutrófilos usando um ensaio de câmara de fluxo que permite a adesão de neutrófilos humanos na presença de tensão de cisalhamento. Isso é feito preparando primeiro um substrato de moléculas de adesão purificadas ou uma superfície de célula endotelial, como veia umbilical humana, células endoteliais ou ve. O segundo passo é separar os neutrófilos do sangue periférico humano usando um método de centrifugação de chamada PHI de duas camadas.

Em seguida, a câmara de fluxo é montada para permitir a injeção dos neutrófilos humanos isolados sob tensão de cisalhamento no substrato de adesão, ligantes ou ve. A etapa final é registrar os eventos de adesão de neutrófilos na câmara de fluxo, seguido pela quantificação cuidadosa da adesão firme. Em última análise, o ensaio da câmara de fluxo é usado para mostrar a adesão firme de neutrófilos em direção a moléculas de adesão purificadas e uma superfície HX.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo autoimune, como a importância funcional das variações genéticas em moléculas de tecido que são conhecidas por estarem associadas ao desenvolvimento de autoimunidade. Estudos genéticos em pacientes com ptose sistêmica de lúpus e eritema demonstraram forte associação com variantes e integrina Abeta dois, uma proteína envolvida na adesão firme de neutrófilos. Desenvolvemos este sistema de ensaio para avaliar as consequências funcionais da variação genética neste endócrino beta dois chamado Mac one na adesão firme Para preparar as placas de cultura para uso na câmara de fluxo.

Adicione um mililitro de uma solução de fibrina e gelatina a cada placa de cultura de tecidos de 35 milímetros e pipete várias vezes para garantir que toda a superfície da placa esteja revestida. Remova o excesso de solução de fibronectina e gelatina e seque as placas ao ar por pelo menos 30 minutos. Para otimizar a formação da matriz proteica, colha células endoteliais da veia umbilical humana ou qve que foram cultivadas a 80 a 90% de confluência usando tripsina EDTA semeie 500.000 células em cada placa de cultura de tecidos revestida.

Adicione dois mililitros de meio de crescimento a cada prato e incube a 37 graus Celsius. As células de 5% de CO2 devem ser inspecionadas visualmente diariamente com trocas de meio a cada dois dias. Permita que as células cresçam até 80 a 90% de confluência.

Para iniciar este procedimento, use um marcador ou caneta para desenhar um círculo de 0,5 centímetros de diâmetro no centro de uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros. 20 microlitros de uma proteína de 20 microgramas por mililitro, uma solução na área marcada. Use a ponta da pipeta para espalhar a proteína, uma solução para cobrir toda a área dentro do círculo de 0,5 centímetros de diâmetro.

É importante não tocar ou arranhar a superfície do prato. Incube as placas de cultura de tecidos a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, lave cada proteína em um prato revestido três vezes com um mililitro de PBS.

Depois de remover o PBS da terceira placa de lavagem, 50 microlitros de 1% BSA na área marcada para bloquear a ligação não específica na placa. Incube a quatro graus Celsius por duas horas. Depois de duas horas.

Lave a placa entupida três vezes com um mililitro de PBS. Prepare as soluções de proteína quimérica do ligante do receptor de adesão FC para revestimento e este experimento e ICAM um FC Kyra a 25 microgramas por mililitro e uma P selectina FC Kyra a 0,5 microgramas por mililitro serão usados. Cubra a área marcada com 50 microlitros do substrato, incube as placas de cultura de tecidos durante a noite a quatro graus Celsius.

A loiça deve ser utilizada no prazo de dois dias e a área revestida não deve secar. Se necessário. Adicione PBS para manter os 50 microlitros de solução na placa.

Os neutrófilos para este estudo são isolados do sangue dos participantes que deram consentimento informado por escrito. Depois de coletar sangue por flebotomia em um tubo de coleta de sangue anticoagulante ou vacutainer, dilua o sangue um a um com PBS execute todas as etapas deste procedimento. À temperatura ambiente, prepare uma chamada de phy de duas camadas para separar células mononucleares do sangue periférico ou p BMCs e neutrófilos em tubos de centrífuga de 50 mililitros.

Primeiro, adicione 15 mililitros de chamada PHI pesada e, em seguida, coloque cuidadosamente 10 mililitros de chamada fi leve em cima da chamada fi pesada. Deve haver uma borda nítida entre as camadas de chamada de fi leve e de chamada de fi pesada. Finalmente, coloque cuidadosamente 25 mililitros da amostra de sangue diluída em cima da chamada de luz sem perturbar o PHI.

Centrifugue os tubos por 30 minutos à temperatura ambiente após a centrifugação, várias camadas devem estar presentes. A camada de neutrófilos com poucos glóbulos vermelhos está entre o phi leve e pesado. Chame usando uma pipeta de transferência e transfira a camada de neutrófilos para um novo tubo de 50 mililitros e adicione PBS a um volume final de 50 mililitros.

Centrifugue a 225 vezes G por 10 minutos. À temperatura ambiente após a centrifugação, ainda pode haver glóbulos vermelhos misturados com os neutrófilos. Aspirar o sobrenadante até aos 10 mililitros.

Marcos Resus. Suspenda o grânulo vermelho neutrófilo brevemente, vórtice em baixa velocidade e, em seguida, lave novamente com 50 mililitros de PBS aspire o sobrenadante para remover os glóbulos vermelhos contaminantes. Ressuspenda as células peletizadas no PBS residual por um breve vórtice de baixa velocidade.

Adicione 25 mililitros de água e bata suavemente por 10 segundos. Para piolhos. Os glóbulos vermelhos adicionam 25 mililitros de cloreto de sódio a 1,8% e misturam imediatamente por centrifugação a 225 vezes G por 10 minutos.

Os glóbulos vermelhos contaminantes devem agora ser deitados, deixando um pellet branco de células neutrófilas. Lave o pellet de células neutrófilas com PBS, descarte o sobrenadante e ressuspenda os neutrófilos isolados em meio RPMI com 10% de FBS. Depois de determinar a concentração celular sob um microscópio óptico com um hemocitômetro, ajuste a densidade celular para 500.000 células por mililitro com meio RPMI 10% FBS completo.

Antes de iniciar o ensaio de adesão da câmara de fluxo, prepare o VE com 20 nanogramas por mililitro de TNF alfa humano por quatro a seis horas para regular positivamente e estimular a expressão da molécula de adesão. Quando o VE estiver pronto, monte a câmara de fluxo. Coloque a placa de 35 milímetros contendo o VE confluente na mesa do microscópio.

Para os fins deste vídeo, apenas a adesão de neutrófilos ao VE será examinada, mas o mesmo procedimento se aplica ao estudo da adesão de neutrófilos a moléculas de adesão purificadas, conectam a câmara de fluxo de placas paralelas com a bomba de seringa e o sistema de vácuo e deixam uma linha aberta para a entrada de neutrófilos. Insira a câmara de fluxo na parte superior da placa e aperte o conjunto da câmara de fluxo. Inicie o programa de gravação de vídeo no computador conectado ao microscópio.

Ajuste o campo e o foco do microscópio até que um campo claro com VE totalmente crescido seja visível. Usando a bomba de seringa, enxágue a câmara de fluxo com meio RPMI. Certifique-se de que não haja bolhas de ar dentro da câmara ou da linha de entrada de neutrófilos.

Use a bomba de seringa para injetar os neutrófilos na câmara de fluxo em velocidades definidas. Grave o vídeo como a adesão de neutrófilos pode ocorrer rapidamente, um vídeo de quatro a cinco minutos geralmente é suficiente para quantificar os eventos de adesão para análise. Este videoclipe mostra um exemplo de neutrófilos se ligando a uma câmara de fluxo revestida com HU E.

Uma célula aderente é definida como uma célula que se move com menos de um diâmetro de célula em cinco segundos. Na superfície revestida de HU e. Aqui são mostradas capturas de tela em diferentes pontos de tempo de vídeos de amostra de neutrófilos aderindo a uma superfície revestida com ICAM, uma selectina P ou uma superfície revestida com uve.

Em ambos os experimentos, a velocidade do fluxo de neutrófilos é de 350 microlitros por minuto com uma densidade de neutrófilos de 500.000 células por mililitro. Em condições típicas, observou-se que 50 a 70 neutrófilos humanos aderiram firmemente ao ligante ou à superfície revestida com VE durante um período de registro de quatro minutos. No entanto, variantes alélicas de moléculas de adesão de neutrófilos ou variantes alélicas no substrato podem alterar substancialmente a adesão quantitativa de neutrófilos gravando vídeos de duração semelhante com doadores diferentes.

Neutrófilos, o número de células de adesão por minuto pode ser calculado para comparar as propriedades de adesão entre diferentes doadores. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de verificar visualmente os neutrófilos quanto ao clampeamento celular causado pela ativação celular induzida pelo isolamento. Além disso, a avaliação citometria de fluxo paralelo da ativação celular pode ser realizada para garantir que o estado de ativação das células seja compatível entre doadores e entre experimentos.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da autoimunidade explorarem a adesão celular em células humanas primárias de doadores de genótipos que possuem diferentes alelos de região codificante da cadeia CD 11 B da integrina beta dois, MAC um. Esses estudos permitiram uma avaliação cuidadosa e quantitativa do impacto funcional dessas variantes alélicas no sistema humano.