Fluxo de Neutrófilos Humanos Secção Ensaio de Adesão

O objetivo geral deste procedimento é medir a adesão firme de neutrófilos utilizando um ensaio em câmara de fluxo que permite a adesão de neutrófilos humanos na presença de tensão de cisalhamento. Isso é realizado primeiramente preparando um substrato de moléculas de adesão purificadas ou uma superfície de células endoteliais, como células endoteliais de veia umbilical humana ou ve. O segundo passo é separar neutrófilos do sangue periférico humano utilizando um método de centrifugação em dois níveis com PHI.

Em seguida, a câmara de fluxo é montada para permitir a injeção dos neutrófilos humanos isolados sob estresse cisalhante sobre o substrato de adesão, ligantes ou ve. O passo final consiste em registrar os eventos de adesão de neutrófilos na câmara de fluxo, seguido por uma cuidadosa quantificação da adesão firme. Em última análise, o ensaio em câmara de fluxo é utilizado para demonstrar a adesão firme de neutrófilos frente a moléculas de adesão purificadas e uma superfície HX.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de autoimunidade, como a importância funcional de variações genéticas em moléculas teciduais que se sabe estarem associadas ao desenvolvimento de doenças autoimunes. Estudos genéticos em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico demonstraram forte associação com variantes da integrina Abeta dois, uma proteína envolvida na adesão firme de neutrófilos. Desenvolvemos este sistema de ensaio para avaliar as consequências funcionais da variação genética nesta integrina beta dois chamada Mac-1 na adesão firme. Para preparar as placas de cultura para uso na câmara de fluxo.

Adicione um mililitro de uma solução de fibrina e gelatina a cada placa de cultura tecidual de 35 milímetros e pipete várias vezes para garantir que toda a superfície da placa esteja revestida. Remova o excesso de solução de fibronectina e gelatina e seque as placas ao ar por pelo menos 30 minutos. Para otimizar a formação da matriz proteica, recolha células endoteliais de veia umbilical humana ou qve que tenham sido cultivadas até 80 a 90% de confluência utilizando tripsina-EDTA e semeie 500.000 células em cada placa de cultura tecidual revestida.

Adicione dois mililitros de meio de crescimento a cada placa e incube a 37 graus Celsius. As células com 5%CO2 devem ser inspecionadas visualmente diariamente, com trocas de meio a cada dois dias. Deixe as células crescerem até atingirem 80 a 90% de confluência.

Para iniciar este procedimento, use uma caneta ou marcador para desenhar um círculo de 0,5 centímetros de diâmetro no centro de uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros. Adicione 20 microlitros de uma solução de proteína A a 20 microgramas por mililitro na área marcada. Use a ponteira da pipeta para espalhar a solução de proteína A, cobrindo toda a área dentro do círculo de 0,5 centímetro de diâmetro.

É importante não tocar nem arranhar a superfície da placa. Incube as placas de cultura tecidual a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, lave cada placa revestida com a proteína a três vezes com um mililitro de PBS.

Após remover o PBS do terceiro poço de lavagem, adicione 50 microlitros de BSA 1% na área marcada para bloquear a ligação inespecífica na placa. Incube a quatro graus Celsius por duas horas. Após duas horas.

Lave a placa bloqueada três vezes com um mililitro de PBS. Prepare as soluções de proteínas quiméricas de ligantes de receptores de adesão FC para revestimento e este experimento; será utilizada ICAM-1 FC Quimera a 25 microgramas por mililitro e P-selectina FC Quimera a 0,5 microgramas por mililitro. Revestir a área marcada com 50 microlitros do substrato e incubar as placas de cultura tecidual durante a noite a quatro graus Celsius.

As placas devem ser usadas dentro de dois dias e a área revestida não deve secar. Se necessário, adicione PBS para manter os 50 microlitros de solução na placa.

Os neutrófilos para este estudo são isolados do sangue de participantes que deram consentimento informado por escrito. Após a coleta de sangue por flebotomia em um tubo de coleta de sangue com anticoagulante ou vacutainer, dilua o sangue em uma proporção de um para um com PBS e realize todas as etapas deste procedimento. À temperatura ambiente, prepare um gradiente de dois níveis com Ficoll para separar as células mononucleares do sangue periférico ou PBMCs e neutrófilos em tubos de centrífuga de 50 mililitros.

Primeiro, adicione 15 mililitros de meio denso de PHI e, em seguida, sobreponha cuidadosamente 10 mililitros de meio leve de fi sobre o meio denso de fi. Deve haver uma fronteira nítida entre as camadas do meio leve de fi e do meio denso de fi. Por fim, sobreponha cuidadosamente 25 mililitros da amostra de sangue diluída sobre o meio leve de fi sem perturbar o PHI.

Chame a centrífuga em camadas os tubos por 30 minutos à temperatura ambiente após a centrifugação; devem estar presentes múltiplas camadas. A camada de neutrófilos, com poucas hemácias, situa-se entre o gradiente leve e o gradiente pesado. Utilizando uma pipeta de transferência, colete e transfira a camada de neutrófilos para um novo tubo de 50 mililitros e adicione PBS até um volume final de 50 mililitros.

Centrifugar a 225 vezes G durante 10 minutos. À temperatura ambiente após a centrifugação, ainda podem haver glóbulos vermelhos misturados aos neutrófilos. Aspire o sobrenadante até o volume de 10 mililitros.

Marque Resus. Suspenda o pellet de neutrófilos e hemácias girando brevemente em velocidade baixa e, em seguida, lave novamente com 50 mililitros de PBS, aspirando o sobrenadante para remover as hemácias contaminantes. Re-suspenda as células em pellet no PBS residual mediante uma breve agitação em velocidade baixa.

Adicione 25 mililitros de água e vorte suavemente por 10 segundos. Para os piolhos. Adicione 25 mililitros de cloreto de sódio 1,8% às hemácias e misture imediatamente por centrifugação a 225 × g durante 10 minutos.

As células vermelhas do sangue contaminantes devem agora estar lisadas, deixando um pellet branco de neutrófilos. Lave o pellet de neutrófilos com PBS, descarte o sobrenadante e re-suspenda os neutrófilos isolados em meio RPMI com 10% de FBS. Após determinar a concentração celular em microscópio óptico com um hemocitômetro, ajuste a densidade celular para 500.000 células por mililitro com meio RPMI completo contendo 10% de FBS.

Antes de iniciar o ensaio de adesão em câmara de fluxo, prime a VE com 20 nanogramas por mililitro de TNF alfa humano por quatro a seis horas para aumentar e estimular a expressão de moléculas de adesão. Quando as VE estiverem prontas, monte a câmara de fluxo. Coloque o recipiente de 35 milímetros contendo a monocamada de VE confluentes sobre a mesa do microscópio.

Para os fins deste vídeo, será examinada apenas a adesão de neutrófilos ao VE, mas o mesmo procedimento se aplica ao estudo da adesão de neutrófilos a moléculas de adesão purificadas. Conecte a câmara de fluxo de placas paralelas à bomba de seringa e ao sistema de vácuo, deixando uma linha aberta para a entrada de neutrófilos. Insira a câmara de fluxo sobre a placa e fixe o conjunto da câmara de fluxo. Inicie o programa de gravação de vídeo no computador conectado ao microscópio.

Ajuste o campo e o foco do microscópio até que um campo nítido com VE totalmente desenvolvido seja visível. Usando a bomba de seringa, lave a câmara de fluxo com meio RPMI. Certifique-se de que não haja bolhas de ar dentro da câmara ou na linha de entrada de neutrófilos.

Use a bomba de seringa para injetar os neutrófilos na câmara de fluxo em velocidades definidas. Grave o vídeo, pois a adesão de neutrófilos pode ocorrer rapidamente; um vídeo de quatro a cinco minutos geralmente é suficiente para quantificar os eventos de adesão para análise. Este clipe mostra um exemplo de neutrófilos se ligando a uma câmara de fluxo revestida com HU E.

Uma célula aderente é definida como uma célula que se move menos que um diâmetro celular em cinco segundos. Na superfície revestida com HU e. Aqui são mostradas capturas de tela em diferentes momentos de vídeos amostra de neutrófilos aderindo a uma superfície revestida com ICAM um P-selectina, ou a uma superfície revestida com uve.

Em ambos os experimentos, a velocidade do fluxo de neutrófilos é de 350 microlitros por minuto, com uma densidade de neutrófilos de 500.000 células por mililitro. Em condições típicas, observou-se que de 50 a 70 neutrófilos humanos aderiram firmemente à superfície revestida com ligante ou VE durante um período de gravação de quatro minutos. No entanto, variantes alélicas das moléculas de adesão de neutrófilos ou variantes alélicas no substrato podem alterar substancialmente a adesão quantitativa de neutrófilos ao registrar vídeos de duração semelhante com diferentes doadores.

Neutrófilos, o número de células aderentes por minuto pode ser calculado para comparar as propriedades de adesão entre diferentes doadores. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de verificar visualmente os neutrófilos quanto ao agrupamento celular causado pela ativação induzida durante o isolamento. Além disso, pode ser realizada uma avaliação paralela por citometria de fluxo da ativação celular para garantir que o estado de ativação das células seja equivalente entre doadores e entre experimentos.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de autoimunidade explorarem a adesão celular em células humanas primárias de doadores com genótipos que possuem diferentes alelos da região codificadora da cadeia CD11b do integrina beta dois, MAC-1. Esses estudos permitiram uma avaliação cuidadosa e quantitativa do impacto funcional dessas variantes alélicas no sistema humano.