ביטוי של חלבונים רקומביננטי השמרים Methylotrophic Pichia pastoris

הפרוטוקול הבא מתאר ביטוי חלבון באמצעות אופוס שמרים מתיל אטרופיים. מוצגת הכנת תאי שמרים מוכשרים אלקטרו-והפיכת הווקטור עם הגן המעניין ל-PPA, ואחריו שלב טיהור DNA של שמרים כדי לבדוק אינטגרציה נכונה של הגן המעניין שלך בגנום השמרים. בסוף נבצע את הביטוי של החלבון הרקומביננטי.

היי, אני מריה מהמעבדה של סטיבן האלאם במחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה באוניברסיטת קולומביה הבריטית. אני גם מרקוס ממעבדת הלם. היום נראה לכם נוהל לביטוי חלבונים רקומביננטיים בשמרי TRO PQ. סיפורי עבר.

אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור חלבונים ממיקרואורגניזמים לא מסודרים שבהם DNA סביבתי חולץ ומאוחסן בארכיון וספריות מטא-אטומיות. אז בואו נתחיל. הביטוי של חלבונים רקומביננטיים בשמרים מתיל אטרופיים PIAAs מזל שור דורש CLO הגן המעניין שלך במסגרת וקטור אב PPA.

בניסוי שלנו, אנו משתמשים בווקטור PPIC Z alpha A.וקטור זה מכיל את מקדם AO X אחד לביטוי המושרה על ידי מתנול מווסת היטב של הגן המעניין, אות הפרשת גורם אלפא להפרשת החלבון הרקומביננטי, zaas וגן עמידות לברירה הן ב-e coli והן ב-pic, פפטיד מסוף C המכיל אפיטופ אצמי ותג פולי היסטמין לזיהוי וטיהור החלבון הרקומביננטי לפני שינוי. ליניאריזציה של הווקטור המכיל את הגן המעניין שלך על ידי תקציר הגבלה. אנו משתמשים באנזים PME, אך אתרי הגבלה אחרים אפשריים כל עוד התוספת שלך אינה מכילה את אתר ההגבלה הזה.

כדי להשיג מספיק DNA וקטורי ליניארי, הגדר שלוש עד ארבע הגבלות של 50 מיקרוליטר, עכל תגובות בצינורות נפרדים לאחר העיכול, שלב את כל התמיסות ורכז את המבנה שלך. באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי AmCon ויחידת מסנן צנטריפוגלי MicroCon, תזדקק לחמישה עד 20 מיקרוגרם של DNA ליניארי בחמישה עד 10 מיקרוליטר מים סטריליים להפיכה ל- PPA dous. כדי להכין תאים מוכשרים לפס PPA על צלחת A-Y-P-D-S ללא SN ארבעה ימים לפני הטרנספורמציה המיועדת, יש לגדל בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יום עד יומיים או עד שנוצרות מושבות בודדות יומיים לפני הטרנספורמציה.

גדלו חמישה מיליליטר של ה-PPA או הזננו במדיום YPD בשפופרת פלקון של 50 מיליליטר ב-30 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הנח את צינור הפלקון בבקבוק כדי לקבע אותו בשייקר יום אחד לפני השינוי. השתמש ב-0.25 מיליליטר מתרבית הלילה כדי לחסן 500 מיליליטר של מדיום YPD טרי בבקבוק של שני ליטר.

גדל שוב בן לילה בשייקר ב-30 מעלות צלזיוס ל-OD 600 של 1.3 עד 1.5. ביום הטרנספורמציה, יש קרח, מים קרים וסטריליים וסורביטול טוחנת אחת בהישג יד. צנטריפוגה של התאים ב-1500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הצנטריפוגה אנו משעים את הגלולה עם 500 מיליליטר קרח, מים קרים וסטריליים. בהתאם לקיבולת צינורות הצנטריפוגה, ייתכן שתצטרך לפצל את הנפח לשני צינורות נפרדים או לבצע ריצות מרובות. צנטריפוגה שוב של התאים והשעיה מחדש את הכדור עם 250 מיליליטר קרח, מים קרים וסטריליים.

בהתאם לקיבולת צינורות הצנטריפוגה, ניתן לשלב את כדורי התאים הנפרדים בצינור אחד. כאשר Resus משהה את הצנטריפוגה, התאים שוב הפעם משהים את הגלולה. ב-20 מיליליטר של קור קרח, סורביטול מולארי אחד מעביר את התאים המרחפים לצינור בז של 50 מיליליטר ולצנטריפוגה.

לאחר צנטריפוגה אחרונה, החייאה השעתה את הגלולה במיליליטר אחד של קור קרח, סורביטול טוחנת אחת לנפח סופי של כ-1.5 מיליליטר. התאים המרחפים בצינורות מיקרו צנטריפוגות מאחסנים תאים על קרח או בארבע מעלות צלזיוס עד שהם משמשים לטרנספורמציה. לפני הפיכת המבנה הליניארי המרוכז לתאי אחסון PPA, הכינו את הריאגנטים והמכשירים הבאים.

מלאו צינור מיקרו צנטריפוגה במיליליטר אחד של סורביטול טוחנת אחת והניחו אותו על קרח. מניחים אלקטרופורציה של 0.2 סנטימטר. וטרינר על קרח.

סמן צינור זכוכית סטרילי של 15 מיליליטר והחזק סטרילית מעבר לפיפטה שלך בהישג יד. העבירו 80 מיקרוליטר מהתאים האלקטרו המוכשרים שהוכנו בעבר לקור הקרח. נקודה שני סנטימטר אלקטרופורציה ווט.

הוסף את תמיסת ה-DNA של הפלזמה לתאים וערבב על ידי הזזת קצה הפיפטה מצד לצד. בבדיקת האלקטרופורציה. דגרו את הווט עם התאים על הקרח למשך חמש דקות.

לאחר מכן, נגב את החלק החיצוני של הווט עם הרקמה ודפק את התאים בהתאם לפרמטרים לשמרים ניצנים כפי שהוצע על ידי היצרן של מכשיר האלקטרופורציה הספציפי שלך. בהדגמה זו נעשה שימוש בגן BioRad Pulser עם התנאים הבאים. מתח טעינה של 1500 וולט, קיבול של 25 מיקרו ברזלים והתנגדות של 200 אוהם מיד לאחר הפעימה.

הוסף מיליליטר אחד של קור כקרח, סורביטול טוחנת אחד לווטרינר. העבירו את תכולת הווט לשפופרת סטרילית של 15 מיליליטר באמצעות זכוכית סטרילית מעבר לפיפטה שלכם. דגרו את הצינור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס מבלי לנער למשך 1.5 שעות.

לאחר 1.5 שעות, התאים האלקטרופוטיים מוכנים לציפוי. הוסף חמישה עד 10 חרוזי זכוכית מעוקרים לכל אחת מארבע צלחות YPTS מסומנות המכילות 100 מיקרוגרם למיליליטר זאין. מורחים 250 מיקרוליטר מהאלקטרופורציה.

מערבבים על כל צלחת ומנערים את הצלחת אופקית כדי לפזר את התאים באופן שווה. הניחו לצלחות להתייבש במשך 15 דקות ואז הוציאו את החרוזים מהאגרו על ידי היפוך הצלחות. עטפו את הצלחות בניילון שחור כדי למנוע פירוק של הזאין הרגיש לאור ודגרו על צלחות הפוכות במשך יומיים-שלושה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עד להיווצרות מושבות לאחר היווצרות מושבות.

בחר 12 מושבות. טהר אותם על ידי פס השיבוטים על לוחות YPDS טריים המכילים 100 מיקרוגרם למיליליטר. כדי להכין תאי PPA לביטוי חלבון, בחרו מושבה בודדת ממושבות הפיצ'יה המטוהרות וחיסנו ב-25 מיליליטר של מדיום VMGY בבקבוק סטרילי של 250 מיליליטר הגדל ב-30 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד עד שהתרבית מגיעה ל-OD 600 של שתיים עד שש.

כאשר התאים הגיעו ל-OD 600 המתאים, הכינו מלאי גליצרול של התאים לאחסון. העבירו 800 מיקרוליטר מתרבית התאים לבקבוקון קריוגני של שני מיליליטר והוסיפו 200 מיקרוליטר של גליצרול מעוקר. אחסן את ציר הגליצרול במינוס 80 מעלות צלזיוס.

בנוסף, העבירו 1.5 מיליליטר מתרבית התאים לצינור מיקרו צנטריפוגה. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה ב-1300 GS למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. אחסן את הגלולה בארבע מעלות צלזיוס.

תאים אלה ישמשו לטיהור DNA של שמרים כדי לנתח את איראן הפיצ'יה לאחר PCR עם הכנסת פריימרים ספציפיים על ג'ל גרוז כדי לאשר שהגן המעניין השתלב בגנום הפיצ'יה. העבירו את שאר תרבית ה-25 מיליליטר לצינור פלקון של 50 מיליליטר וקצרו את התאים על ידי צנטריפוגה ב-3000 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, שפכו את הסופרנטנט והניחו את הצינור הפוך על טישו כדי להסיר כל שאריות מדיה כדי לשטוף את החייאת כדורי התא. השעו אותו על ידי מערבולת או פיפטינג למעלה ולמטה ב-20 מיליליטר של צנטריפוגה בינונית BMMY.

השעיית התא שוב לאחר הניקוי, הסופרנטנט משהה מחדש את כדור התא על ידי מערבולת או פיפטינג למעלה ולמטה ל-OD 600 של 1.0 ב-BMMY. מדיום לגרימת ביטוי. העבירו את התרבות לבקבוק מבולבל של ליטר אחד וכסו את הבקבוק בשיא של 200 מיליליטר.

אנו ממליצים בחום להשתמש בצלוחיות מבולבלות מכיוון שהן מכניסות יותר חמצן לתרבות. מדיה לביטוי חלבון יעיל במהלך השראת מתנול, דוגרים את הבקבוק באינקובטור להמשך צמיחה ב-30 מעלות צלזיוס. חשוב שהטמפרטורה לא תעלה על 30 מעלות צלזיוס אם הטמפרטורה של החממה שלך משתנה.

הגדר את הטמפרטורה על 28 מעלות צלזיוס. הוסף מתנול טהור מעוקר לריכוז סופי של 0.5% מתנול כל 24 שעות כדי לשמור על אינדוקציה בנקודות זמן מסוימות לאחר תחילת הביטוי, העביר מיליליטר אחד מהתרבית לצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר ב-1300 גרם למשך 2.5 דקות. בטמפרטורת החדר, העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו צנטריפוגה נפרד בנפח 1.5 מיליליטר.

אחסן את כדורי הסופרנטנט והתאים במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף. הדגימות מנקודות זמן שונות ינותחו כדי לקבוע את פרק הזמן האופטימלי לביטוי חלבון לאחר השראה. כעת אנו מראים כמה תוצאות מייצגות של ביטוי מוצלח של חלבונים רקומביננטיים באמצעות PIA Pastis כמערכת מארח.

תמונת הכתם המערבי הזו מציגה ארבעה חלבונים מבוטאים לאחר 24 שעות של ביטוי. הנוגדן ששימש להכתמה חיסונית היה נוגדן HRP אסמי. הנתיב השני הוא בקרה שלילית והועמס על מתאים שאינם מבטאים חלבון רקומביננטי מכיוון שהם עברו טרנספורמציה עם וקטור האב.

זה עתה הראינו לכם כיצד לבטא חלבונים רקומביננטיים באמצעות המארח האיקריוטי PQ. בנוסף, בעת ביצוע הליך זה חשוב לרצף את המבנה שלך כדי לאשר שהגן המעניין שלך משוכפל וממוסגר, ולהכין את כל הצלחות והריאגנטים שלך לפני שתתחיל. כמו כן, חשוב שתכין כמות מספקת של פלסמיד ליניארי כדי להשיג מספר גבוה של שנאים לפני ביטוי חלבון על ידי השראת מתנול. הקפד לשטוף את התאים שלך מרופד היטב כדי להסיר את כל שאריות הגליצרול שיכולות לעכב את ביטוי החלבון שלך.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים.