ביטוי תשואה גבוהה של חלבונים אנושיים רקומביננטי עם transfection חולף של תאי HEK293 בהשעיה

ייצור בקנה מידה מעבדתי של חלבונים אוקריוטיים עם שינוי מתאים לאחר התרגום מייצג מחסום משמעותי. להלן פרוטוקול חזק עם התבססות מהירה ותפנית לביטוי חלבון באמצעות מערכת ביטוי יונקים. מערכת זו תומכת בחומצות אמינו סלקטיביות, תיוג סלקטיבי של חלבונים ומודולטורים של מולקולות קטנות של הרכב הגליקן.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבטא גליקופרוטאינים של יונקים עם גליקוזילציה מתאימה של יונקים על ידי מיקוד חלבונים רקומביננטיים למסלול ההפרשה המתווך ER ו-GOGI. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח באימונולוגיה כגון מה תפקידו של מפרט, דפוסים במבנה ופוטנציאל ההפעלה החיסונית של נוגדנים ושברי נוגדנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בתאים אנושיים כדי לבטא חלבונים אנושיים, מה שמספק את המיסיונר התאי המתאים לקיפול ושינוי נכון של חלבוני המטרה.

יש להפעיל את שייקר החממה להקמת תאים ב-135 סל"ד, 80% לחות, 8% פחמן דו חמצני ו-37 מעלות צלזיוס לפחות שעה לפני חיסון התרבית. הפעל את מנורת ה-UV של ארון הבטיחות הביולוגית, חמם מראש את הבקבוקים האטומים של בינוני A ובינוני B באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. כבה את נורות ה-UV ועיקר את ארון הבטיחות הביולוגית עם תמיסת אתנול ומים של 70%.

עקרו בקבוק גידול ארלנמאייר בנפח 125 מיליליטר עם פיפטות כובע מאווררות, פיפטרים ובקבוקי מדיה מחוממים מראש על ידי ריסוס עם אתנול 70% בתמיסת מים. הנח פריטים אלה בארון הבטיחות הביולוגית לאורך הליך זה. יש לעקר את כל הפריטים בצורה זו לפני הכנסתם לארון הבטיחות הביולוגית.

הכן מדיום תרבית טרי לתרבית של 30 מיליליטר על ידי משיכת 26 מיליליטר של מדיום A ושלושה מיליליטר של מדיום B והעברתו לבקבוק ארלנמאייר בנפח 125 מיליליטר. מערבבים על ידי ניעור עדין, חם, בקבוקון של תאי HEK 2 93 F שהוקפאו בעבר במינוס 80 מעלות צלזיוס באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס כדי להפשיר חלקית את התאים. זה לוקח כדקה ואין להפשיר את התאים לחלוטין.

לאחר מכן, עקרו את החלק החיצוני של הבקבוקון עם תמיסת אתנול 70% במים והעבירו אותו לארון הבטיחות הביולוגית. בעזרת פיפטה של מיליליטר אחד, משוך את מתלה התאים והעביר אותו לבקבוק ארלנמאייר בנפח 125 מיליליטר המכיל 29 מיליליטר של מדיום תרבית טרי. סוגרים את מכסה בקבוק התרבות ומכניסים את הבקבוק לשייקר החממה למשך 24 שעות.

24 שעות לאחר חיסון תרבית. בדוק את צפיפות התאים, עקר את בקבוק התרבית עם תמיסת אתנול ומים 70% והעביר אותו לארון הבטיחות הביולוגית. בעזרת פיפטה ופיפטר של מיליליטר אחד מושכים לאט לאט 100 מיקרוליטר מהתרבית ומעבירים אותה לצינור עינור סטרילי של 0.5 מיליליטר.

סגור את מכסה בקבוק התרבות והחזיר את בקבוק התרבות לשייקר החממה בהקדם האפשרי. מערבבים 7.5 מיקרוליטר של תמיסה כחולה טריאן עם 7.5 מיקרוליטר תאים. מערבבים במרץ ואז מעבירים 7.5 מיקרוליטר מהתערובת לשקופית ספירה.

הפעל את מונה התאים האוטומטי והנח את שקופית הספירה בתא הטעינה. הקורא האוטומטי מופעל והתאים נספרים אוטומטית ביחידות של מספר תאים למיליליטר ואחוז כדאיות. קבע את נפח תרבית התורם הנדרש להעברה למדיום תרבית טרי כדי לקבל צפיפות תאים של 300,000 תאים חיים למיליליטר.

הכן מדיום תרבית טרי כפי שהוצג קודם לכן על ידי העברת 23 מיליליטר מדיום A ושלושה מיליליטר בינוני B לבקבוק תרבית טרי של 125 מיליליטר. לאחר מכן, הסר את בקבוקי המלאי של בינוני A ובינוני B מארון הבטיחות הביולוגית כדי להפחית את הסיכון לזיהום שלהם. אחזר את בקבוק תרבית התאים HEK 2 93 F מהחממה.

רססו אותו בתמיסת אתנול ומים 70% והניחו אותו בארון הבטיחות הביולוגית באמצעות פיפטה חדשה. משוך את הכמות הנכונה של תאים מהתרבית והעביר אותה לבקבוק המכיל תרבית טרייה. בינוני. העבירו את שתי התרביות מארון הבטיחות הביולוגית לשייקר החממה.

לגדל את התאים לצפיפות משוערת של שניים עד 3 מיליון תאים חיים למיליליטר לפני הטרנספקציה. בדוק את צפיפות התאים כפי שהודגם קודם לכן וקבע את כמות התאים עבור הטרנספקציה. שימוש בפיפטה סרולוגית סטרילית.

העבר את הנפח המתאים של תרחיף התאים לצינור צנטריפוגה של 250 מיליליטר. אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה ב 100 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר העיקור, העבירו את הצינור המכיל את התאים הגלולים לארון הבטיחות הביולוגית.

השתמש בפיפטה סטרילית כדי לשפוך את הסופרנטנט המורכב מבוזבז. מדיום תרבית שולח מחדש במרץ את התאים הגלולים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה באמצעות 10 מיליליטר של מדיום תרבית טרי, ומעביר לבקבוק מוכן המכיל תרבית טרנספקציה טרייה. בינוני. הברג את המכסה על בקבוק תרבית התאים המאוורר ודגר את הבקבוק בשייקר החממה למשך 15 דקות עד שעה בזמן שהתאים דוגרים.

לדלל את מלאי ה-DNA וה-POLYETHERAMINE או PEI של הפלזמה באמצעות מדיום תרבית טרי לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם למיקרוליטר. מוציאים את בקבוק התרבית עם התאים המפוזרים משייקר החממה ולוקחים אותו לארון הבטיחות הביולוגית באמצעות מיקרו פיפטה ו-300 מיקרוליטר DNA פלזמה לתרבית ומערבבים על ידי ניעור ידני עדין ב-900 מיקרוליטר PEI לתרבית ומערבבים שוב. ואז ב -3.8 מיליליטר של מדיום תרבות טרי.

העבירו את הבקבוק לשייקר החממה למשך 24 שעות. 24 שעות לאחר הטרנספקציה, יש לדלל את תרבית התאים. כדי להכין תחילה את מדיום הדילול, השתמש בפיפטה סרולוגית סטרילית של מיליליטר אחד כדי למשוך מיליליטר אחד של חומצה ולפרואית PREWARM 220 מילי-מולרית או VPA ולהעביר אותו לצינור סטרילי של 50 מיליליטר.

לאחר מכן, השתמש בפיפטה סרולוגית סטרילית כדי להוסיף חמישה מיליליטר של מדיום B חם מראש ו-44 מיליליטר של מדיום A חם מראש לתמיסת ה-VPA. התוצאה היא 50 מיליליטר של מדיום תרבית טרי עם ריכוז סופי של 4.4 מילי-מולרי של VPA. אחזר את התרבות שעברה טרנספטציה מהחממה.

עקר את החלק החיצוני של הבקבוק והנח את הבקבוק בארון הבטיחות הביולוגית. הוסף את מדיום הדילול המוכן לתרבות. העבירו את הבקבוק בחזרה לשייקר האינקובטור למשך ארבעה עד חמישה ימים נוספים לאחר ההעברה.

עקוב אחר כדאיות התאים מדי יום על ידי ההליך שהודגם קודם לכן. יש לשמור גם Aliquots מדי יום לניתוח ביטוי חלבון, חמישה עד שישה ימים לאחר הטרנספקציה או אם כדאיות התא יורדת מתחת ל-50%קצור תאים על ידי צנטריפוגה של התאים פלוס מדיום ב-1000 פעמים G למשך חמש דקות. אספו את הסופרנטנט שיכיל חלבון מופרש בחמישה מיליליטר של תמיסת אקונומיקה של 10% לגלולת תאי HEK והשליכו כסכנה ביולוגית.

לאחר מכן, החלבון מטוהר מהסופרנטנט שנאסף. מערכת ביטוי זו יצרה תפוקה גבוהה של חלבונים מסוכררים המומחשת על ידי דפוס ביטוי טיפוסי זה של IgG fc אחד לאחר טרנספקציה חולפת של תאי HK 2 93 F. טיהור זיקה באמצעות עמודת חלבון עבור IgG אחד FC או עמודת ניקל עבור GFP מתויג היסטמין עם קולטן גמא FC 3 A הביא לחלבונים בעלי טוהר גבוה.

מערכת זו ביטאה ביעילות IgG מועשר איזוטופי אחד FC בספקטרום NMR דו-ממדי זה המתאם את תדר התהודה של גרעיני המימן וחנקן האמיד הקשור ישירות. נראו 15 אטומים אותות מפוזרים היטב. צורות גליקו שונות הופקו עם תאי HEK 2 93 F ו- HEK 2 93 s בתנאי תרבית שונים כפי שמוצג על ידי ניתוחי ספקטרומטריית מסה של יינון יינון לייזר בעזרת מטריצה.

IgG FC אחד שהתבטא מתאי HEK 2 93 s, מכיל וגליקנים שהיו בצורה עם חמישה anos בתוספת שני שאריות גלוקוזאמין N שהכילו גליקנים של גלוקוז FU מחומר אקספרס HEK 2 93 F היו צורות מסלול מורכבות מסוג דו-מסלול עם גלוקוז FU ליבה ובעיקר בעלות גלוקוזאמין N סופי או חלק קטן של צורות מונו או מורחבות. תוספת של מעכב גליקן לביטוי שבוצע באמצעות תאי HEK 2 93 F הראתה ירידה של יותר מ-90% בשילוב פוקו לאחר שליטה, ניתן להשלים את קביעת הטרנספקציה החולפת תוך 1.5 שעות ביום הראשון ו-15 דקות ביום השני. לאחר תקופת ביטוי של ארבעה עד שישה ימים, ניתן לקצור את התמיסה המכילה את החלבון תוך 15 דקות.

לבסוף, טיהור החלבון ייקח כ-1.5 שעות תוך כדי ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על תרבית יציבה לפני טרנספקציה של תאים הגדלים באופן פעיל ולהוסיף DNA לפני הוספת PEI. בצע הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אפיון פונקציונלי של חלבון באמצעות מגוון טכניקות ביופיזיקליות על מנת לחקור את המבנה והתפקוד של הגליקופרוטאין המתבטא לאחר התפתחותו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור את יחסי הפעילות המבנית של IgG וגליקוזילציה במבחנה וב-vivo. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להכין ולטהר גליקופרוטאינים באמצעות השילוב שלנו של תאי K 2 93 F ווקטור PZ N 2.