ביטוי תשואה גבוהה של חלבונים אנושיים רקומביננטי עם transfection חולף של תאי HEK293 בהשעיה

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבטא גליקופרוטאינים של יונקים עם גליקוזילציה מתאימה של יונקים, וזאת על ידי תגית של חלבונים רקומביננטיים לרשתית התוך-פלזמית (ER) ולמסלול ההפרשה המתווך על ידי גולג'י (GOGI). שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח באימונולוגיה, כגון מהו תפקידה של מפרט מסוים, דפוסים במבנה ופוטנציאל הפעלה חיסונית של נוגדנים ופרגמנטים של נוגדנים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בתאים אנושיים כדי לבטא חלבונים אנושיים, דבר המספק את המערכת התאית המתאימה לקיפול ולשינוי תקינים של חלבוני המטרה.

יש להפעיל את המנער המדגרה להקמת התרביות ב-135 RPM, 80% לחות, 8% פחמן דו-חמצני ו-37 מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת לפני הזרקת התרבית. הדליקו את נורת ה-UV של תא הבטיחות הביולוגית, וחממו מראש את בקבוקי המדיום A והמדיום B האטומים במקלח מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כבו את נורות ה-UV וסטריליזו את תא הבטיחות הביולוגית עם תמיסת 70% ethanol ומים.

עקרו בקבוק גידול ארלנמייר בנפח 125 milliliter עם פקק מאוורר, פיפטות, מכשירים לשאיבה של נוזלים (pipetters) ובקבוקי מצע שחוממו מראש, על ידי ריסוס בתמיסת 70% ethanol במים. הניחו פריטים אלו בתוך קבינת הבטיחות הביולוגית לאורך הליך זה. יש לעקר את כל הפריטים באופן זה לפני הכנסתם לקבינת הבטיחות הביולוגית.

הכינו מצע גידול טרי עבור תרבית של 30 milliliter על ידי שאיבת 26 milliliters של מצע A ושלושה milliliters של מצע B והעברתם לבקבוק ארלנמייר של 125 milliliter. ערבבו בערבוב עדין, וחממו אמבולה של תאי HEK 2 93 F שהוקפאו בעבר בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius, באמבט מים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius כדי להפשיר את התאים באופן חלקי. פעולה זו אורכת כדקה, ואין להפשיר את התאים באופן מלא.

בשלב הבא, סטריליזו את החלק החיצוני של הבקבוק באמצעות תמיסת 70% ethanol במים והעבירו אותו לקלייה הביולוגית. באמצעות פיפט של 1 mL, שאבו את תרחיף התאים והעבירו אותו לבקבוק ארלנמייר בנפח 125 mL המכיל 29 mL של מצע גידול טרי. סגרו את מכסה בקבוק התרבית והניחו את הבקבוק באינקובטור רוגז למשך 24 שעות.

24 שעות לאחר הזרקת התרבית. בדוק את צפיפות התאים, עקר את בקבוק התרבית עם תמיסת אתנול 70% ומים והעבר אותו למCבטחת ביולוגית. באמצעות פיפט של מיליליטר אחד ופיפטור, שאב לאט 100 µL מהתרבית והעבר אותם לשפופרת einor סטרילית של 0.5 מיליליטר.

סגרו את מכסה בקבוק התרבית והחזירו את בקבוק התרבית לאינקובטור השוקר בהקדם האפשרי. ערבבו 7.5 µl של תמיסת tripan blue עם 7.5 µl של תאים. ערבבו בעוצמה ולאחר מכן העבירו 7.5 µl מהתערובת ליתרת ספירה.

הפעל את סופר התאים האוטומטי והנח את למד הספירה בתא הטעינה. הקורא האוטומטי מופעל והתאים נספרים באופן אוטומטי ביחידות של מספר תאים למיליליטר ואחוז חיוניות. קבע את נפח תרבית התורם הדרוש להעברה למצע גידול טרי כדי להשיג צפיפות תאים של 300,000 תאים חיים למיליליטר.

הכינו מצע גידול טרי כפי שהודגם בעבר על ידי העברת 23 milliliters של מצע A ושלושה milliliters של מצע B לבקבוק תרבית טרי של 125 milliliter. לאחר מכן, הוציאו את בקבוקי המלאי של מצע A ומצע B ממנדף הבטיחות הביולוגית כדי להפחית את הסיכון לזיהומם. הוציאו את בקבוק תרבית תאי HEK 2 93 F מהאינקובטור.

רסס זאת בתמיסת אתנול 70% ומים והנח אותה בקבינט בטיחות ביולוגית. באמצעות פיפטה חדשה, שאיב את המנה המדויקת של תאים מהתרבית והעבר אותה לבקבוק המכיל מצע גידול רענן. העבר את שתי התרביות מהקבינט בטיחות ביולוגית למנערת האינקובטור.

גדלו את התאים עד לצפיפות מקורבת של שני עד 3 מיליון תאים חיים למילילטר לפני הטרנספקציה. בדקו את צפיפות התאים כפי שהודגם קודם לכן וקבעו את כמות התאים הנדרשת לטרנספקציה. השתמשו בפיפטה סרולוגית סטרילית.

העבירו את הנפח המתאים של תרחיף התאים לשפופרת צנטריפוגה בנפח 250 milliliter. אספו את התאים על ידי סבב צנטריפוגה ב-100 times G למשך חמש דקות. לאחר עיקור, העבירו את השפופרת המכילה את משקע התאים אל תוך קבינת הביו-בטיחות.

השתמש בפפיטה סטרילית כדי להסיר את העלייה (supernatant) המורכבת מתווך גידול משומש. השהה את התאים השקועים (pelleted cells) בעוצמה על ידי שאיבה ופליטה (pipetting up and down) באמצעות 10 milliliters של תווך גידול טרי, והעבר אותם לבקבוק שהוכן מראש המכיל תווך גידול טרי לטרנספקציה. סגור את הפקק של בקבוק תרבית התאים המאוורר והדגר את הבקבוק במעזער (incubator shaker) למשך 15 דקות עד שעה בזמן שהתאים עוברים הדגרה.

דללו את מלאי ה-plasma DNA וה-POLYETHERAMINE או ה-PEI באמצעות מצע תרבית טרי עד לריכוז סופי של 0.5 µg/µL. הוציאו את בקבוק התרבית עם התאים המפוזרים מהאינקובטור המנער והעבירו אותו לקללת הביו-בטיחות; בעזרת מיקרו-פיפט, הוסיפו 300 µL של plasma DNA לתרבית וערבבו על ידי ניעור ידני עדין, ולאחר מכן הוסיפו 900 µL של PEI לתרבית וערבבו שוב. לבסוף, הוסיפו 3.8 mL של מצע תרבית טרי.

העבירו את הבקבוק לדגירה במנער למשך 24 שעות. 24 שעות לאחר הטרנספקציה, יש לדלל את תרבית התאים. כדי להכין תחילה את מצע הדילול, השתמשו בפיפט סרולוגי סטרילי של 1 ml כדי לשאוב 1 ml של חומצה ואלפרוית (VPA) בריכוז 220 millimolar שחוממה מראש, והעבירו אותה למבחנה סטרילית של 50 ml.

בשלב הבא, השתמשו בפיפט סרולוגי סטרילי כדי להוסיף 5 milliliters של מצע B מחומם מראש ו-44 milliliters של מצע A מחומם מראש לתמיסת ה-VPA. פעולה זו תביא לקבלת 50 milliliters של מצע תרבית טרי בריכוז סופי של 4.4 millimolar של VPA. הוציאו את התרבית שעברה טרנספקציה מהאינקובטור.

עקרו את החלק החיצוני של הבקבוק והניחו את הבקבוק בתוך קבינת הבטיחות הביולוגית. הוסיפו את תוך המדלל שהוכן לתרבית. העבירו את הבקבוק בחזרה למכשיר השילוב של האינקובטור והמנער למשך ארבעה עד חמישה ימים נוספים לאחר הטרנספקציה.

יש לנטר את חיוניות התאים מדי יום לפי הפרוצדורה שהודגמה קודם לכן. יש לשמור מדי יום מנות (aliquots) לצורך ניתוח ביטוי חלבונים, חמישה עד שישה ימים לאחר הטרנספקציה או אם חיוניות התאים יורדת מתחת ל-50%. יש לקצור את התאים על ידי צנטריפוגציה של התאים יחד עם המצע במהירות של 1000 ×g למשך חמש דקות. אספו את הנוזל העליון (supernatant) שיכיל את החלבון המופרש; הוסיפו 5 mL של תמיסת אקונומיקה 10% למשקע של תאי ה-HEK והשליכו אותו כפסולת ביולוגית מסוכנת.

לאחר מכן, החלבון מטוהר מהעליון (supernatant) שנאסף. מערכת ביטוי זו הניבה תפוקה גבוהה של חלבונים גליקוזילתיים, כפי שמוצג בדפוס ביטוי טיפוסי זה של IgG one fc לאחר טרנספקציה זמנית של תאי HK 2 93 F. טיהור באפיניות באמצעות עמודת חלבון עבור IgG one FC או עמודת ניקל עבור GFP מתויג בהיסטדין עם FC gamma receptor three A הניב חלבונים ברמת טוהר גבוהה.

מערכת זו ביטאה ביעילות IgG one FC מועשר איזוטופית בספקטרום NMR דו-ממדי זה, המתאם בין תדר התהודה של גרעיני המימן לבין חנקן האמיד הקשור אליהם באופן ישיר. נצפו אותות מפוזרים היטב של 15 אטומים. צורות גליקוסיליציה שונות הופקו באמצעות תאי HEK 2 93 F ו-HEK 2 93 s תחת תנאי תרבית שונים, כפי שהודגם בניתוחי ספקטרומטריית מסה מסוג matrix assisted laser DESORPTION ionization.

IgG1 FC שהובע מתאי HEK 293S נשא גליקנים שהיו בצורה של חמשה residues של mannose ושניים של N-acetylglucosamine, אשר לא הכילו פוקוז. גליקנים מחומרי ביטוי של תאי HEK 293F היו בצורת bi-antennary מסוג מורכב, עם ליבת פוקוז וברובם עם N-acetylglucosamine טרמינלי או פרופורציה קטנה של צורות מונו או די-אנטנריות. הוספה של מעכב גליקוזילציה לביטוי שבוצע באמצעות תאי HEK 293F הראתה הפחתה של מעל 90% בשילוב פוקוז. לאחר השליטה בתהליך, ניתן להשלים את הטרנספקציה הזמנית בתוך 1.5 שעות ביום הראשון ו-15 דקות ביום השני. לאחר תקופת ביטוי של ארבעה עד שישה ימים, ניתן לאסוף את התמיסה המכילה את החלבון בתוך 15 דקות.

לבסוף, טיהור החלבון ייארך כ-1.5 שעות; בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על תרבית יציבה לפני הטרנספקציה, לבצע טרנספקציה לתאים הגדלים באופן פעיל ולהוסיף DNA לפני הוספת ה-PEI. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אפיון תפקודי של החלבון באמצעות מגוון טכניקות ביופיזיות, כדי לבחון את המבנה והתפקוד של הגליקופרוטאין המובע לאחר פיתוחו.

טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום האימונולוגיה לבחון את הקשר בין המבנה לפעילות של IgG וגליקוזילציה in vitro ו-in vivo. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ההכנה והטיהור של גליקופרוטאינים באמצעות השילוב שלנו של תאי K 2 93 F והווקטור PZ N two.