T-wave Ion Mobility Spectrometry massa: Basic Procedimentos para Análise Experimental Protein Complex

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar a forma geral dos complexos de proteínas. Isso é obtido adquirindo dados de mobilidade de ferro por espectrometria de massa para íons complexos de proteínas e medindo os valores de tempo de deriva de cada estado de carga. Como segunda etapa, as condições experimentais são validadas para garantir medições de mobilidade de estruturas de proteínas nativas.

Em seguida, os valores de tempo de deriva medidos são correlacionados com as áreas da seção transversal. Os resultados determinam os valores da seção transversal de colisão de proteínas ou complexos de proteínas com estruturas tridimensionais desconhecidas. Essas informações fornecem pistas sobre sua forma geral, empacotamento de subunidades e topologia.

Olá, sou Isaac Leski do Laboratório de Mic, departamento de Química Biológica do Instituto Wiseman de Ciências, e sou Naam Kirschenbaum também do laboratório de mi. Hoje mostraremos um procedimento de medição de complexos de proteínas transversais de colisão usando espectrometria de massa híbrida e instrumentos de mobilidade de ferro. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a forma geral e a organização dos complexos proteicos.

Então vamos começar. Este procedimento se concentra na mobilidade do ferro, espectrometria de massa ou análise IMM MS de complexos proteicos. As etapas de preparação da amostra, calibração do instrumento e procedimentos de otimização de MS e MS em tandem são demonstrados em um protocolo JO relacionado.

Em geral, este protocolo envolve baixas concentrações micromolares de complexo em um tampão volátil, como o acetato de amônio. Dado que um a dois microlitros são consumidos por nano capilar de fluxo, prepare 10 a 20 microlitros como volume mínimo para permitir a otimização das condições de MS. Para iniciar este procedimento, defina a onda viajante ou a onda T synap IMMS para os seguintes modos de operação mobilidade tof em que a onda tripla e as pressões são definidas automaticamente para IM e tempo de separação de íons de voo, aquisição de íons positivos e modo V, definindo o caminho dos íons através do tubo de vôo e a reflexão liga todos os gases aqui.

O nitrogênio é usado para a separação IM e o argônio para as regiões de armadilha e transferência. Os valores iniciais recomendados são um fluxo de gás de 24 mililitros por minuto para o dispositivo IMS e 1,5 mililitros por minuto para a região do purgador. Em seguida, defina a faixa de aquisição da taxa de carga do mastro para um complexo de proteína desconhecido.

Use uma ampla faixa de massa inicialmente, que pode ser reduzida aos valores desejados, ajuste o perfil MS de acordo. Para máxima eficiência de transmissão para grandes complexos, a faixa de massa de aquisição deve ser definida de 1030 2000 MA taxa de carga e o perfil MS para auto. Caso contrário, o perfil pode ser definido de acordo com o gráfico mostrado.

Verifique a configuração de RF e, se necessário, ajuste para valores apropriados para grandes complexos de proteínas, conforme mostrado. Em seguida, carregue a amostra, aplique tensão capilar e baixa pressão de fluxo nano. Uma vez iniciados os sprays, tente reduzir a pressão do fluxo nano para um valor mínimo.

Além disso, ajuste a posição do capilar em relação ao cone, ajuste os parâmetros de aquisição de MS para adquirir um espectro de MS bem resolvido. Otimize o gradiente de pressão ao longo do instrumento e do cone de amostragem, bem como as configurações potenciais da armadilha e transferência de polarização do cone de extração, conforme detalhado no protocolo JoVE associado. Embora esses parâmetros sejam mostrados em função da amostra, aqui estão as condições usadas para adquirir espectros de MS de várias massas de ferro de peptídeos a complexos de proteínas.

Íons grandes requerem energias de colisão e tensão de polarização mais altas. Também é recomendado aumentar a contrapressão para a análise de grandes complexos proteicos para minimizar a ativação do complexo. Tente reduzir gradualmente em etapas de cerca de 10 volts, a extração do cone da amostra, a armadilha do cone e as tensões de polarização sem alterar a posição do pico.

Uma vez obtido um espectro de massa ideal, o tempo de deriva ou o perfil IM devem ser ajustados ao analisar os conjuntos de proteínas. As condições ideais para medições de massa e mobilidade são muitas vezes incompatíveis. Portanto, é importante encontrar o equilíbrio adequado entre os dois.

No geral, o gráfico de mobilidade do ferro deve ser otimizado de forma que os picos sejam distribuídos por toda a faixa de tempo de deriva e o perfil do pico seja suave. Aproximando-se de uma distribuição de giana, a assimetria de pico significativa pode estar relacionada à má separação de múltiplas conformações, a velocidade da onda T, a altura da onda T e a taxa de fluxo de gás IMS podem ser ajustadas para otimizar a separação da mobilidade. Aumentar a velocidade da onda T amplia o perfil de distribuição do tempo de deriva.

Enquanto os valores aumentados da altura da onda T se estreitam da mesma forma, aumentar o fluxo de gás IMS começando em 10 mililitros por minuto no mínimo muda o perfil de tempo de deriva para valores mais altos, trabalhando para otimizar o espectro de mobilidade do ferro. Fixando duas das três variáveis e otimizando a terceira, defina a velocidade da onda T para 250 metros por segundo e o fluxo de gás para 24 mililitros por minuto. Em seguida, como ponto de partida, defina a altura para três volts e, gradualmente, aumente-a em incrementos de um volt.

Quando são utilizadas tensões de polarização elevadas, recomenda-se reduzir a pressão do gás IMS e, desta forma, permitir a diminuição da tensão de polarização. Como consequência, a ativação e a dissociação complexas serão reduzidas. Um efeito de capotamento pode aparecer quando as condições não são otimizadas, observado como um pico idêntico na primeira parte do espectro de tempos de deriva e na borda de rejeito.

Quando os íons não atravessam o dispositivo IAM, efetivamente sua jornada pode levar mais tempo do que o tempo necessário para que o próximo pacote de ferro seja liberado na célula de mobilidade. Como resultado, um novo grupo de íons é liberado da região da armadilha antes que o pacote anterior seja entregue à região do empurrador. Para eliminar esse artefato, aumente a altura da onda T e diminua a velocidade da onda T e a pressão IMS.

Além disso, o tempo de liberação da armadilha pode ser ajustado. Além disso, é importante validar se a altura da onda T de transferência está definida para pelo menos cinco volts. Também para evitar vazamento de íons para a célula IMS.

A altura do coletor de mobilidade deve ser mantida em níveis máximos. A baixa velocidade e a alta amplitude das ondas T de transferência podem levar à ondulação do perfil de distribuição do tempo de deriva. Este artefato ocorre quando a separação de mobilidade dos íons não é mantida através das regiões de transferência e resistentes devido à sincronização parcial entre a frequência pusha e a velocidade da onda T de transferência.

Para eliminar esse efeito, o tempo do empurrador ou a velocidade da onda T de transferência devem ser ajustados. Como a frequência do pusha está relacionada à faixa de massa, esse artefato pode reaparecer. Quando este parâmetro é alterado.

A altura da onda T exerce um efeito menor. Embora sua redução também possa ajudar a eliminar ondulações. Uma vez que os parâmetros mencionados acima são otimizados, os dados do IMMS podem ser adquiridos para obter uma resolução altamente elevada.

Ms. Os complexos de proteínas Peaks são frequentemente ativados dentro do espectrômetro de massa para promover a remoção de água residual e componentes tampão. No entanto, se a energia de ativação for aumentada além de um valor limite, o desdobramento parcial pode ocorrer formando vários estados intermediários, que provavelmente não corresponderão à estrutura de estado da solução nativa. Como resultado, o pico do tempo de deriva pode ser deslocado e ampliado refletindo a população hidrogênica de estruturas desdobradas.

Para obter dados de tempo de deriva consistentes com as estruturas da fase de solução, é essencial controlar cuidadosamente as tensões usadas para acelerar os íons antes da separação IM, portanto, aumentar a tensão capilar e do cone de maneira gradual enquanto monitora o efeito no espectro de tempo de deriva. Além disso, para alta resolução MS, é preferível aumentar a transferência em vez da tensão de armadilha. O dispositivo IM é posicionado primeiro, seguido pela região de transferência e pelo analisador TOF.

Uma vez que a ativação segue a medição IM que permanece inalterada para IM, enquanto a precisão MS pode ser aumentada para garantir que a aquisição de dados seja realizada sob condições que mantêm a estrutura nativa do complexo, é importante coletar dados em uma variedade de condições experimentais e de solução, em vez de aderir a um único conjunto otimizado de parâmetros. Por esse motivo, aumente a tensão de colisão do purgador de maneira gradual e adquira dados em intervalos de 10 volts enquanto monitora o efeito no perfil de mobilidade do ferro. Finalmente, para identificar as confirmações desdobradas e avaliar os dados adquiridos, induzir manualmente a dissociação do complexo proteico titulando a amostra com ácido acético em uma faixa de pH de dois a sete e registrar os dados, prossiga para analisar os dados no sistema IMS de onda T, as áreas da seção transversal definidas por uma abordagem de calibração de tempo de deriva, usando proteínas Cain com valores de seção transversal conhecidos.

Primeiro, prepare soluções de proteína de calibre desnaturado a 10 micromolares cada. Use citocromo C equino, cavalo, mioglobina cardíaca e ubiquitina bovina em 49, 49, 0,2 volume, água, metanol, ácido acético. Em seguida, adquira dados IMMS para as proteínas de calibre exatamente nas mesmas condições de instrumento usadas para a proteína alvo ou complexo de proteínas, mantenha todas as tensões e valores de pressão idênticos para preservar as configurações de separação IM.

Depois de adquirir os dados, extraia o valor do tempo de desvio experimental para cada carga. As proteínas do estado de Caim corrigem cada um dos tempos de deriva do calibre T prime D usando a seguinte equação onde MOVZ é a razão de carga mestre do íon observado e C é o coeficiente de atraso EDC do ciclo de trabalho aprimorado. Seu valor normalmente entre 1,4 e 1,6 depende do instrumento.

O valor EDC é indicado nas configurações de aquisição do sistema, uma guia de configuração de aquisição, corrija cada uma das seções transversais do calibre para o estado de carga do ferro e a massa reduzida. Onde ômega C é a seção transversal corrigida, ômega é a seção transversal da literatura Z é a carga de ferro. O estado M é o peso molecular do íon caim e MG é o peso molecular do ferro.

Gás de fundo, que é tipicamente nitrogênio plop thelan de T prime D contra thelan de ômega C.A curva resultante corresponde à seguinte equação. Os parâmetros X e A podem ser extraídos ajustando o gráfico a uma relação linear. A inclinação X corresponde ao fator de proporção exponencial e A representa a constante determinada de ajuste.

Calcule o coeficiente de correlação de ajuste R ao quadrado. Os valores aceitáveis para R ao quadrado são maiores que 0,95. Um valor de coeficiente de correlação mais baixo pode ser devido ao desdobramento incompleto da proteína, envelhecimento da amostra.

Condições experimentais diferentes utilizadas para as proteínas de diferentes calibres, espectro ruidoso e processamento incompleto dos dados ou erro de cálculo. Corrija o tempo de deriva ca usando o fator exponencial X determinado e valide seus cálculos realocando ômega C versus T linha D.Defina novamente, o coeficiente de correlação. Valores superiores a 0,95 são esperados de forma semelhante às etapas descritas anteriormente, corrija o tempo de deriva medido da proteína alvo ou complexo de proteínas e calibre o tempo de deriva da proteína alvo ou complexo de proteínas usando o fator exponencial calculado X. Calcule ômega da proteína alvo ou complexo de proteínas usando a constante de ajuste determinada A, onde ômega é igual a um TD. Repita essas etapas para cada condição experimental.

Ao definir a área da seção transversal da proteína desconhecida ou complexo de proteínas, recomendamos que cada experimento seja repetido pelo menos três vezes e o desvio padrão dessas medições triplicadas determinado assim que os valores da seção transversal de colisão forem determinados. Abordagens de modelagem são empregadas para prever a topologia ou arranjos do complexo. Isso é feito ajustando os valores experimentais da seção transversal de colisão dentro dos valores Omega silico calculados a partir de estruturas de modelo geradas em geral, este campo ainda está em seus primeiros anos e é necessário um desenvolvimento adicional para tornar essa abordagem genérica e aplicável a uma ampla gama de complexos.

A representação superficial da forma tetramérica da hemoglobina bovina é mostrada aqui. O complexo de hemoglobina do transportador de oxigênio pode servir de exemplo para a abordagem mencionada acima. A hemoglobina é um complexo proteico tetramérica composto por duas subunidades alfa e duas beta, coloridas em azul e vermelho, respectivamente, que formam um dímero de dímeros alfa beta.

O espectro IMMS da hemoglobina é mostrado aqui. O espectro IM ms adquirido do complexo revela uma distribuição de série de carga principal correspondente ao complexo intacto e à série de carga menor, que se ajusta às massas do dímero alfa beta e das subunidades monoméricas alfa e beta. O CCS teórico e medido das diferentes formas de hemoglobina é mostrado aqui.

Os valores de tempo de deriva recuperados para vários estados de carga das formas dimérica e tetramérica foram usados para calcular os valores ômega. Estes foram comparados com os valores teóricos. Dado que um complexo tetramérica tem três possibilidades de associação: ou cíclico, diedro ou empacotamento em cadeia.

Ao calcular o aumento do ômega ao passar de um dímero para um tetrâmero, a organização estrutural pode ser prevista. Estudos anteriores e nossos próprios experimentos mostraram forte correlação entre ccss medidos e áreas de superfície de proteínas derivadas de dados estruturados em cristal. Essa correlação pode ser usada para calcular o aumento esperado na área de superfície de um tetrâmero em comparação com um dímero para as diferentes formas de empacotamento.

Isso é feito considerando cada objeto asférico de subunidade. Uma cadeia como um conjunto aumentará o tetrâmero CCS em cerca de duas vezes, enquanto um empacotamento C quatro ou D dois produzirá um aumento de cerca de 1,5 e 1,67, respectivamente. A razão calculada entre os valores de CCS medidos das formas tetramérica e DME da hemoglobina foi de 1,57 mais ou menos 0,03.

Este número ilustra que a estrutura nativa não é organizada linearmente, mas está disposta de uma forma mais compacta, seja como um tetrâmero cíclico ou diedro. Ao repetir o mesmo cálculo na estrutura cristalina resolvida da hemoglobina, a proporção das áreas de superfície das formas tetramérica e DME foi de 1,63, o que se encaixa em uma simetria D dois. Obviamente, esse modelo geométrico foi simplificado e as subunidades de proteínas não são meramente esféricas.

No entanto, esse cálculo demonstra o potencial empolgante que o IMMS possui para revelar o empacotamento de complexos com estruturas desconhecidas de alta resolução. Acabei de mostrar como medir o tempo de deriva da proteína e os complexos de proteínas envolvem como calcular seus valores de seção transversal de colisão. Ao fazer este procedimento, é importante adquirir os dados do IMMS para as proteínas de calibre usando exatamente as mesmas condições usadas para a proteína alvo ou complexos de proteínas.

Além disso, recomendamos fortemente repetir pelo menos três vezes esses experimentos e determinar o desvio padrão dessas medições triplicadas. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.