Name: T-wave Ion Mobility Spectrometry massa: Basic Procedimentos para Análise Experimental Protein Complex (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 40 s
Description: Aprenda a determinar a forma tridimensional de complexos proteicos usando espectrometria de mobilidade iônica. Este método correlaciona tempos de deriva com seções de choque para elucidar topologia e organização subunitária.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores agradecem os membros do grupo Sharon para a sua revisão crítica, e por suas contribuições ao manuscrito. Estamos gratos pelo apoio dos Programas Morasha e Bikura, a Israel Science Foundation (Grant n. º s 378/08 e 1823-1807), o Josef Cohn Minerva Center for Research biomembrana, a Família Chais Fellows Program para novos cientistas, o Abraham e Sonia Rochlin Foundation, o Family Trust Wolfson Charitable, a Helen e Milton A. Kimmelman Centro de Estrutura Biomolecular e Montagem; o espólio de Shlomo e Beirzwinsky Sabine; Meil ​​de Botton Aynsley, e Karen Siem, Reino Unido.

<ol><li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+mobility-mass+spectrometry+analysis+of+large+proteincomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ion mobility-mass spectrometry analysis of large proteincomplexes.</a> Nat Protoc. 3 (7), 1139-1152 (2008).</li>
<li>Scarff, C. A., Thalassinos, K., Hilton, G. R., Scrivens, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Travelling+wave+ion+mobility+mass+spectrometry+studies+of+protein+structure%3A+biological+significance+and+comparison+with+X-ray+crystallography+and+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Travelling wave ion mobility mass spectrometry studies of protein structure: biological significance and comparison with X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance spectroscopy measurements.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (20), 3297-3304 (2008).</li>
<li>Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+drift+time+measurements+from+travelling+wave+ion+mobility+spectrometry-mass+spectrometry+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Mass+Spectrom+%28Chichester%2C+Eng%29%22%5BJournal%5D)">Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies.</a> Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng). 15 (2), 113-130 (2009).</li>
<li>Leary, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+measuring+conformation+of+solvent-disrupted+protein+subunits+using+T-WAVE+ion+mobility+MS%3A+an+investigation+into+eukaryotic+initiation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Methodology for measuring conformation of solvent-disrupted protein subunits using T-WAVE ion mobility MS: an investigation into eukaryotic initiation factors.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 20 (9), 1699-1706 (2009).</li>
<li>Lorenzen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+stoichiometry+and+conformational+changes+in+the+first+step+of+the+P22+tail+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of stoichiometry and conformational changes in the first step of the P22 tail assembly.</a> J Mol Biol. 379 (2), 385-396 (2008).</li>
<li>Pukala, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+architecture+of+multiprotein+assemblies+determined+using+restraints+from+gas-phase+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Subunit architecture of multiprotein assemblies determined using restraints from gas-phase measurements.</a> Structure. 17 (9), 1235-1243 (2009).</li>
<li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperonin+complexes+monitored+by+ion+mobility+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Chaperonin complexes monitored by ion mobility mass spectrometry.</a> J Am Chem Soc. 131 (4), 1452-1459 (2009).</li>
<li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+macromolecular+protein+rings+in+the+absence+of+bulk+water%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for macromolecular protein rings in the absence of bulk water.</a> Science. 310 (5754), 1658-1661 (2005).</li>
<li>Ruotolo, B. T., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspects+of+native+proteins+are+retained+in+vacuum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Aspects of native proteins are retained in vacuum.</a> Curr Opin Chem Biol. 10 (5), 402-408 (2006).</li>
<li>Giles, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+a+travelling+wave-based+radio-frequency-only+stacked+ring+ion+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Applications of a travelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (20), 2401-2414 (2004).</li>
<li>McKay, A. R., Ruotolo, B. T., Ilag, L. L., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+measurements+of+increased+accuracy+resolve+heterogeneous+populations+of+intact+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Mass measurements of increased accuracy resolve heterogeneous populations of intact ribosomes.</a> J Am Chem Soc. 128 (35), 11433-11442 (2006).</li>
<li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+mobility-mass+spectrometry+reveals+long-lived%2C+unfolded+intermediates+in+the+dissociation+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Ion mobility-mass spectrometry reveals long-lived, unfolded intermediates in the dissociation of protein complexes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 46 (42), 8001-8004 (2007).</li>
<li>Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+virus+capsid+assembly+from+non-covalent+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).</li>
<li>Valentine, S. J., Counterman, A. E., Clemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+database+of+660+peptide+ion+cross+sections%3A+use+of+intrinsic+size+parameters+for+bona+fide+predictions+of+cross+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A database of 660 peptide ion cross sections: use of intrinsic size parameters for bona fide predictions of cross sections.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 10 (11), 1188-1211 (1999).</li>
<li>Mesleh, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+information+from+ion+mobility+measurements%3A+effects+of+the+long-range+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural information from ion mobility measurements: effects of the long-range potential.</a> J Phys Chem. 100, 16082-16086 (1996).</li>
<li>Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+exact+hard-spheres+scattering+model+for+the+mobilities+of+polyatomic+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions.</a> Chem Phys Lett. 261, 86-91 (1996).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo aqui descrito permite definir a seção transversal de colisão de proteínas ou complexos de proteínas com uma estrutura de três desconhecidos dimensional, com o objetivo de fornecer informações sobre sua forma geral, embalagem subunidade e topologia. Para este efeito, uma vez valores colisão seção transversal são retratados é necessário converter esses valores para detalhes estruturais. Este processo requer esforços adicionais experimental bem como a análise computacional, que são brevemente discutidos abaixo. Para começar, recomenda-se a análise de proteínas ou complexos de proteínas com estruturas conhecidas. Estas medidas podem proporcionar um controle de qualidade útil da metodologia e permitirá avaliação da acurácia dos parâmetros de aquisição, comparando os valores teóricos e medidos Ω. O teórico áreas das secções transversais podem ser calculadas a partir da estrutura de cristal coordenadas usando o software MOBCAL 15,16, que é um software de código aberto baseado em FORTRAN que permite a edição de código de acordo com as necessidades do operador. Para a execução de tais cálculos é necessário modificar o programa de tal forma que o número de cálculos iterativos realizados por estrutura de entrada é maior e que os arquivos de coordenadas contendo grande número de átomos são aceitos 1. Uma estratégia IM-MS para a definição de arranjos topológicos de subunidades dentro multicomponentes montagens propôs recentemente 4,6. O método envolve o monitoramento de vias dissociação de grupos de proteínas para os componentes menores. Essa dissociação é conseguido através do ajuste das condições controladas fase de solução, que dá origem a uma distribuição de subcomplexes reflexivo da &quot;blocos de construção&quot; das assembléias. A medição simultânea de valores Ω de ambos os complexos intacta a desmontagem e produtos gera restrições estruturais que são então utilizados para calcular os modelos topológicos dos complexos de proteína. O pressuposto básico subjacente a esta metodologia é que o subcomplexes gerada reter seus nativos como confirmações, e na verdade estudos recentes têm demonstrado que a estrutura de solução dos produtos desmontagem é mantida e nenhum rearranjo importante em qualquer solução ou fases de gás têm ocorrido 4,6. O último passo na atribuição de estrutura quaternária de íons em fase gasosa em proteínas complexas é adequado a colisão valores seção transversal de modelos gerados por computador. Abordagens de modelagem são empregadas, a fim de explorar as diferentes possíveis arranjos topológicos de subunidades e seus valores em silico Ω são calculados e comparados com os experimentais. Atualmente, apenas algumas abordagens computacionais são usados, como o método de granulação grossa spheretype que se aproxima o diâmetro de 1,8 subunidades. No geral, este campo ainda está em seus primeiros anos e desenvolvimento é necessário para fazer essa abordagem genérica e aplicável a uma ampla gama de complexos.

t-wave ion mobility spectrometry massa: basic procedimentos para análise experimental protein complex

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

De mobilidade iônica (IM) é um método que mede o tempo necessário para um íon de viajar através de uma célula pressurizada sob a influência de um campo elétrico fraco. A velocidade pela qual os íons atravessam a região drift depende de seu tamanho: íons grandes vão experimentar um maior número de colisões com o gás de fundo inerte (geralmente N 2) e, assim, viajar mais devagar através do dispositivo de mensagens instantâneas do que os íons que compõem um menor cross-section. Em geral, o tempo que leva para os íons de migrar embora a fase de gás denso separa-los, de acordo com sua colisão transversal (Ω). Recentemente, a espectrometria de IM foi acoplado com espectrometria de massa e uma viagem-wave (onda T) Synapt de mobilidade iônica espectrômetro de massa (IM-MS) foi lançado. Integração de espectrometria de massa com mobilidade de íons permite uma dimensão extra de separação e definição da amostra, produzindo um espectro tridimensional (em massa para o tempo de carga, intensidade e drift). Esta técnica permite a separação de sobreposição espectral a diminuir, e permite a resolução de complexos heterogêneos com massa muito semelhante, ou massa-carga índices, mas os tempos drift diferentes. Além disso, as medidas de tempo deriva fornecer uma importante camada de informações estruturais, como Ω está relacionado com a forma geral e topologia do íon. A correlação entre os valores medidos drift tempo e Ω é calculada usando uma curva de calibração gerada a partir de proteínas de calibração definido com seções transversais 1. O poder da abordagem IM-MS reside na sua capacidade de definir a embalagem subunidade e forma geral das assembleias de proteína em concentrações micromolar, e quase fisiológica condições 1. Vários estudos recentes IM de ambas as proteínas individuais 2,3 e complexos não-covalente de proteínas 4-9, conseguiu demonstrar que a estrutura da proteína quaternária é mantida na fase gasosa, e destacou o potencial dessa abordagem no estudo dos conjuntos de proteínas de geometria desconhecida . Aqui, fornecemos uma descrição detalhada do IMS-MS análise de complexos de proteínas usando o Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrumento (Waters Ltd; o único instrumento IM-MS comerciais disponíveis atualmente) 10. Descrevemos os passos básicos de otimização, a calibração de colisão seções transversais, e métodos de processamento de dados e interpretação. A etapa final do protocolo discute métodos de cálculo dos valores teóricos Ω. No geral, o protocolo não tenta cobrir todos os aspectos do IM-MS caracterização de conjuntos de proteínas, mas sim, seu objetivo é apresentar os aspectos práticos do método para novos pesquisadores no campo.

Ion espectrometria de mobilidade de massa é uma tecnologia emergente fase gasosa que separa íons, com base em sua colisão transversal e massa. O método fornece informações tridimensionais sobre a topologia geral e forma de complexos de proteínas. Aqui, descrevemos um procedimento básico para configuração e otimização de instrumento, calibração de vezes drift, e interpretação dos dados.

T-wave Ion Mobility Spectrometry massa: Basic Procedimentos para Análise Experimental Protein Complex

A mobilidade iônica (IM) é um método que mede o tempo necessário para que um íon percorra uma célula pressurizada sob a influência de um campo elétrico fraco.

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar a forma geral de complexos proteicos. Isso é alcançado mediante a obtenção de dados de mobilidade iônica em espectrometria de massas para íons de complexos proteicos e a medição dos valores de tempo de deriva de cada estado de carga. Como segundo passo, as condições experimentais são validadas para garantir medições de mobilidade de estruturas proteicas nativas.Em seguida, os valores de tempo de deriva medidos são correlacionados com áreas de seção transversal. Os resultados determinam os valores de seção transversal de colisão de proteínas ou complexos proteicos com estruturas tridimensionais desconhecidas. Essas informações fornecem pistas sobre sua forma geral, empacotamento de subunidades e topologia.Olá, sou Isaac Leski do Laboratório de Mic, do departamento de Química Biológica no Instituto de Ciências Wiseman, e sou Naam Kirschenbaum, também do laboratório de mi. Hoje demonstraremos um procedimento de medição da seção transversal de colisão de complexos proteicos utilizando espectrometria de massa híbrida e instrumentos de mobilidade iônica. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a forma geral e a organização espacial de complexos proteicos.Então vamos começar. Este procedimento enfoca a mobilidade de ferro, análise por espectrometria de massas ou IMM MS de complexos proteicos. As etapas de preparação da amostra, calibração do instrumento e procedimentos de otimização da MS e MS em tandem são demonstradas em um protocolo JOVE relacionado.Em geral, este protocolo envolve concentrações na faixa de micromolar baixa do complexo em um tampão volátil, como acetato de amônio. Como são consumidos um a dois microlitros por capilar de fluxo nano, prepare de 10 a 20 microlitros como volume mínimo para permitir a otimização das condições de espectrometria de massas. Para iniciar este procedimento, configure a onda de deslocamento ou T wave do IMMS Synap nas seguintes modalidades de operação: mobilidade TOF, na qual as ondas triplas e as pressões são ajustadas automaticamente tanto para a separação por mobilidade iônica quanto por tempo de voo dos íons, aquisição em modo de íons positivos e modo V, definindo o trajeto dos íons através do tubo de voo e reflexão, e ligue todos os gases aqui.O nitrogênio é usado para separação por IM e o argônio para as regiões de aprisionamento e transferência. Os valores iniciais recomendados são um fluxo de gás de 24 mililitros por minuto para o dispositivo IMS e 1,5 mililitro por minuto para a região de aprisionamento. Em seguida, defina a faixa de aquisição da razão de carga do mastro para um complexo proteico desconhecido.Utilize inicialmente uma faixa ampla de massa, que posteriormente pode ser reduzida aos valores desejados, ajustando o perfil de MS de acordo. Para obter a máxima eficiência de transmissão para complexos grandes, a faixa de aquisição de massa deve ser definida de 1030 a 2000 razão carga/massa e o perfil de MS em automático. Caso contrário, o perfil pode ser definido de acordo com o gráfico mostrado.Verifique a configuração de RF e, se necessário, ajuste para valores apropriados para grandes complexos proteicos, conforme indicado. Em seguida, carregue a amostra, aplique a tensão capilar e pressão de fluxo nanométrico baixa. Uma vez iniciados os jatos, tente reduzir a pressão de fluxo nanométrico a um valor mínimo.Além disso, ajuste a posição da capilar em relação ao cone e ajuste os parâmetros de aquisição do espectrômetro de massas para obter um espectro de MS bem resolvido. Otimize o gradiente de pressão ao longo do instrumento e do cone de amostragem, bem como os ajustes de potencial do cone de extração, do trap de polarização e do transfer, conforme detalhado no protocolo associado da JoVE. Embora esses parâmetros dependam da amostra, a seguir estão as condições utilizadas para a aquisição de espectros de MS de várias massas de ferro, desde peptídeos até complexos proteicos.Íons grandes requerem energias de colisão e tensão de polarização mais altas. Também é recomendado aumentar a pressão de retorno para a análise de grandes complexos proteicos, a fim de minimizar a ativação do complexo. Tente reduzir gradualmente, em etapas de cerca de 10 volts, a extração do cone da amostra, as tensões do cone-trampa e de polarização, sem alterar a posição do pico.Uma vez obtido um espectro de massa ideal, o tempo de deriva ou o perfil de mobilidade iônica (IM) devem ser ajustados ao analisar montagens proteicas. As condições ideais para medições de massa e mobilidade frequentemente são incompatíveis. Portanto, é importante encontrar o equilíbrio adequado entre as duas.No geral, o gráfico de mobilidade iônica deve ser otimizado de modo que os picos estejam distribuídos por toda a faixa de tempo de deriva e o perfil do pico seja suave. Uma assimetria acentuada do pico pode estar relacionada à má separação de múltiplas conformações, à velocidade da onda T, à altura da onda T e à taxa de fluxo do gás IMS, que podem ser ajustadas para otimizar a separação por mobilidade. O aumento da velocidade da onda T amplia o perfil de distribuição do tempo de deriva.Embora valores aumentados da altura da onda T a estreitem, aumentar igualmente o fluxo de gás IMS a partir de um mínimo de 10 mililitros por minuto desloca o perfil do tempo de deriva para valores mais altos, o que ajuda a otimizar o espectro de mobilidade do íon. Fixando duas das três variáveis e otimizando a terceira, ajuste a velocidade da onda T para 250 metros por segundo e o fluxo de gás para 24 mililitros por minuto. Em seguida, como ponto inicial, defina a altura em três volts e, de maneira progressiva, aumente-a em incrementos de um volt.Quando são utilizadas tensões de polarização elevadas, recomenda-se reduzir a pressão do gás na IMS e, dessa forma, permitir a diminuição da tensão de polarização. Como consequência, ativações e dissociações complexas serão reduzidas. Um efeito de sobreposição pode ocorrer quando as condições não estão otimizadas, observado como um pico idêntico na parte inicial do espectro de tempos de deriva e na cauda final.Quando os íons não atravessam o dispositivo IAM, efetivamente sua trajetória pode levar mais tempo do que o necessário para o próximo pacote de íons de ferro ser liberado na célula de mobilidade. Como resultado, um novo grupo de íons é liberado da região da armadilha antes que o pacote anterior tenha sido entregue à região do empurrador. Para eliminar esse artefato, aumente a altura da onda T e diminua a velocidade da onda T e a pressão da IMS.Além disso, o tempo de liberação da armadilha pode ser ajustado. Além disso, é importante validar que a altura da onda de transferência T esteja definida em pelo menos cinco volts. Também para evitar vazamento de íons em direção à célula de IMS.A altura do poço de mobilidade deve ser mantida em níveis máximos. Baixa velocidade e alta amplitude das ondas T de transferência podem levar ao surgimento de ondulações no perfil da distribuição do tempo de deriva. Esse artefato ocorre quando a separação por mobilidade dos íons não é mantida ao longo das regiões de transferência e de contato devido à sincronização parcial entre a frequência de empuxo e a velocidade da onda T de transferência.Para eliminar esse efeito, deve-se ajustar o tempo do impulsionador ou a velocidade da onda T de transferência. Como a frequência do impulsionador está relacionada à faixa de massa, esse artefato pode reaparecer quando este parâmetro é alterado.A altura da onda T exerce um efeito menor. Embora sua redução também possa ajudar a eliminar ondulações. Uma vez que os parâmetros mencionados sejam otimizados, os dados de IMMS podem ser adquiridos para obter alta resolução.Complexos proteicos MS.Peaks são frequentemente ativados dentro do espectrômetro de massas para promover a remoção de água residual e componentes do tampão. No entanto, se a energia de ativação for aumentada além de um valor limite, pode ocorrer desdobramento parcial, formando múltiplos estados intermediários, que dificilmente correspondem à estrutura nativa no estado em solução. Como resultado, o pico de tempo de deriva pode ser deslocado e alargado, refletindo a população heterogênea de estruturas desdobradas.Para obter dados de tempo de deriva consistentes com estruturas em fase aquosa, é essencial controlar cuidadosamente as tensões utilizadas para acelerar íons antes da separação por IM; portanto, aumente gradativamente as tensões do capilar e do cone, monitorando o efeito sobre o espectro de tempo de deriva. Além disso, para alta resolução em MS, é preferível aumentar a tensão de transferência em vez da tensão de aprisionamento. O dispositivo de IM é posicionado primeiro, seguido pela região de transferência e pelo analisador TOF.Como a ativação segue a medição de IM, os dados permanecem inalterados para IM, enquanto a precisão de MS pode ser aumentada para garantir que a aquisição de dados seja realizada em condições que mantenham a estrutura nativa do complexo; é importante coletar dados ao longo de uma variedade de condições experimentais e em solução, em vez de aderir a um único conjunto otimizado de parâmetros. Por essa razão, aumente a tensão de colisão da armadilha de forma progressiva e adquira dados em intervalos de 10 volts, monitorando o efeito no perfil de mobilidade do íon. Por fim, para identificar as conformações desdobradas e avaliar os dados adquiridos, induza manualmente a dissociação do complexo proteico titulando a amostra com ácido acético em uma faixa de pH de dois a sete, registre os dados e prossiga com a análise dos dados no sistema T wave IMS, determinando as áreas transversais por meio de uma abordagem de calibração de tempo de deriva, utilizando proteínas Cain com valores de seção de choque conhecidos.Primeiro, prepare soluções proteicas desnaturadas de calibração a 10 micromolar cada. Utilize citocromo C equino, mioglobina de coração e ubiquitina bovina em uma proporção volumétrica de água, metanol e ácido acético de 49, 49 e 0,2. Em seguida, obtenha os dados de IMMS para as proteínas de calibração nas exatas mesmas condições instrumentais utilizadas para a proteína-alvo ou complexo proteico, mantendo todos os valores de voltagem e pressão idênticos para preservar as configurações de separação por IM.Após adquirir os dados, extraia o valor experimental do tempo de deriva para cada carga. Corrija cada um dos tempos de deriva calibrados T linha D das proteínas Cain utilizando a seguinte equação, em que MOVZ é a razão de carga principal do íon observado, e C é o coeficiente de atraso do ciclo de trabalho aprimorado EDC. Seu valor, tipicamente entre 1,4 e 1,6, depende do instrumento.O valor de EDC é indicado dentro das configurações de aquisição do sistema, na guia de configuração de aquisição, corrigindo cada uma das seções eficazes para o estado de carga do ferro e para a massa reduzida. Onde omega C é a seção eficaz corrigida, omega é a seção eficaz da literatura, Z é o estado de carga do ferro, M é o peso molecular do íon cátion e MG é o peso molecular do ferro.Gás de fundo, que normalmente é nitrogênio, plop o plano de T linha D contra o plano de ômega C. A curva resultante corresponde à seguinte equação. Os parâmetros X e A podem ser extraídos ajustando o gráfico a uma relação linear. A inclinação X corresponde ao fator de proporção exponencial, e A representa a constante determinada pelo ajuste.Calcule o coeficiente de correlação do ajuste R quadrado. Valores aceitáveis para R quadrado são maiores que 0,95. Um valor mais baixo do coeficiente de correlação pode ser devido à desnaturalização incompleta da proteína ou ao envelhecimento da amostra.Condições experimentais distintas utilizadas para proteínas de diferentes tamanhos, espectro ruidoso e processamento incompleto dos dados ou erro de cálculo. Corrija o tempo de deriva do cálcio utilizando o fator exponencial X determinado e valide seus cálculos refazendo o gráfico de ômega C versus T linha D. Defina novamente o coeficiente de correlação. Valores superiores a 0,95 devem ser esperados, de forma semelhante aos passos descritos anteriormente; corrija o tempo de deriva medido da proteína-alvo ou do complexo proteico e calibre o tempo de deriva da proteína-alvo ou do complexo proteico utilizando o fator exponencial X calculado. Calcule o ômega da proteína-alvo ou do complexo proteico utilizando a constante A determinada pelo ajuste, onde ômega é igual a A vezes T vezes D. Repita esses passos para cada condição experimental.Ao definir a área da seção transversal da proteína ou do complexo proteico desconhecido, recomendamos que cada experimento seja repetido pelo menos três vezes e que o desvio padrão dessas medidas em triplicata seja determinado após a obtenção dos valores de seção transversal de colisão. Abordagens de modelagem são empregadas com o objetivo de prever a topologia ou os arranjos do complexo. Isso é feito ajustando os valores experimentais de seção transversal de colisão aos valores Omega calculados in silico a partir de estruturas modelo geradas. No geral, essa área ainda está em seus primeiros anos e é necessária uma maior evolução para tornar essa abordagem genérica e aplicável a uma ampla variedade de complexos.Representação da superfície da forma tetramérica da hemoglobina bovina é mostrada aqui. O complexo transportador de oxigênio, hemoglobina, pode servir como exemplo para a abordagem mencionada acima. A hemoglobina é um complexo proteico tetramérico composto por duas subunidades alfa e duas beta, coloridas respectivamente em azul e vermelho, que formam um dímero de dímeros alfa-beta.O espectro IMMS da hemoglobina é mostrado aqui. O espectro IM ms adquirido do complexo revela uma distribuição principal de séries de cargas correspondente ao complexo intacto e séries de cargas menores, que correspondem às massas do dímero alfa beta e das subunidades monoméricas alfa e beta. O CCS teórico e medido das diferentes formas da hemoglobina é mostrado aqui.Os valores de tempo de deriva recuperados para diversos estados de carga das formas diméricas e tetraméricas foram utilizados para calcular os valores de ômega. Estes foram comparados aos valores teóricos. Considerando que um complexo tetramérico possui três possibilidades de associação, seja empacotamentos cíclicos, diédricos ou em cadeia.Calculando o aumento na ômega ao passar de um dímero para um tetrâmero, pode-se prever a organização estrutural. Estudos anteriores e nossos próprios experimentos demonstraram forte correlação entre os ccss medidos e as áreas superficiais das proteínas derivadas de dados estruturais cristalinos. Essa correlação pode ser utilizada para calcular o aumento esperado na área superficial de um tetrâmero em comparação com um dímero para as diferentes formas de empacotamento.Isso é feito considerando cada subunidade como um objeto asférico. Um arranjo em forma de cadeia aumentará a CCS do tetrâmero em cerca de duas vezes, enquanto um empacotamento C4 ou D2 resultará em um aumento de aproximadamente 1,5 e 1,67, respectivamente. A razão calculada entre os valores de CCS medidos das formas tetramérica e DME da hemoglobina foi de 1,57 ± 0,03.Esse número ilustra que a estrutura nativa não é organizada linearmente, mas disposta em uma forma mais compacta, seja como um tetramero cíclico ou diedral. Ao repetir o mesmo cálculo na estrutura cristalina resolvida da hemoglobina, a razão entre as áreas superficiais das formas tetraméricas e DME foi de 1,63, o que corresponde a uma simetria D dois. Obviamente, esse modelo geométrico foi simplificado e as subunidades proteicas não são meramente esféricas.No entanto, este cálculo demonstra o potencial promissor que a IMMS possui para revelar a estrutura de complexos cujas estruturas de alta resolução são desconhecidas. Acabei de mostrar como medir o tempo de deriva das proteínas e dos complexos proteicos, bem como calcular seus valores de seção transversal de colisão. Ao realizar este procedimento, é importante adquirir os dados de IMMS para as proteínas de calibração utilizando exatamente as mesmas condições usadas para a proteína alvo ou complexos proteicos.Além disso, recomendamos fortemente repetir esses experimentos pelo menos três vezes e determinar o desvio padrão dessas medidas em triplicata. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

t-wave-ion-mobility-mass-spectrometry-basic-experimental-procedures

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Espectrometria de massa tem provado ser uma ferramenta valiosa para a análise de grandes complexos de proteínas. Este método permite insights sobre a arquitetura de estequiometria, composição e global da subunidade multi-montagens. Aqui, descrevemos, passo-a-passo, como realizar uma análise de espectrometria de massa estrutural, e caracterizar as estruturas macromoleculares.

Analisar grandes complexos de proteínas por espectrometria de massa estruturais

Nível de espécies reativas de oxigênio é elevado quando as células encontrar condições de estresse. Aqui mostramos o exemplo de 3'-3 'diaminobenzidina coloração, bem como cysTMT rotulagem e espectrometria de massa para traçar o perfil do proteoma redox...

Profiling Proteome Redox tiol Usando Isótopos Espectrometria de Massa Tagging

A abordagem descrita comparativa, quantitativa proteómica visa obter conhecimentos sobre a composição de complexos multiproteicos sob diferentes condições e é demonstrada através da comparação geneticamente diferentes estirpes. Para a análise quantitativa de volumes iguais de diferentes fracções de um gradiente de densidade de sacarose são misturados e analisados ​​por espectrometria de massa.

Uma Nova Abordagem para a Análise Comparativa de Complexos Multiproteicos Baseado em<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabólica Labeling e quantitativa Espectrometria de Massa

Aqui, descrevemos um ensaio cromatográfico, juntamente com a separação de mobilidade do íon de precursores de peptídeo seguido de alta resolução (~ 30.000) MS-detecção de fragmentos de peptídeo para a quantificação dos padrões de peptídeo cravado em um anticorpo monoclonal digerir.

Um ensaio de HS-MRM para a quantificação de proteínas de célula hospedeira em biofármacos de proteínas por espectrometria de massa líquida cromatografia iônica mobilidade QTOF

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Apresentamos um protocolo para dosar com precisão as proteínas com rotulagem isobárica, fracionamento extensivo, ferramentas de bioinformática e etapas de controle de qualidade em combinação com cromatografia líquida interfaceada com um espectrômetro de massa de alta resolução.

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

A arquitetura de complexos de proteínas é essencial para a sua função. Combinar várias técnicas de espectrometria de massa provou poderosa para estudar seu assembly. Nós fornecemos protocolos para cross-linking química e espectrometria de massa nativa e mostrar como essas técnicas complementares ajudam a elucidar a arquitetura de assemblies multi o subunit da proteína.

Combinando reticulação química e espectrometria de massa de complexos de proteínas intactas para estudar a arquitetura de montagens de proteínas com multi- subunidades

Espectrometria de massa (MS) emergiu como uma importante ferramenta para a investigação da estrutura e a dinâmica dos conjuntos macromoleculares. Aqui, nós integramos abordagens baseadas em MS para interrogar a formação do complexo de proteínas e a ligação do ligante.

Análise de arquiteturas de proteínas e complexos proteína-ligante por espectrometria de massa estrutural Integrativa

Um protocolo detalhado é descrito para a separação, identificação e caracterização de proteoforms em amostras de proteínas usando a zona capilar eletroforese-electrospray em tandem-ionização espectrometria de massa (CZE-ESI-MS/MS). O protocolo pode ser usado para a caracterização de alta resolução do proteoforms em amostras da proteína simples e a identificação em larga escala de proteoforms em amostras complexas proteome.

Em grande escala proteômica de cima para baixo usando zona capilar eletroforese espectrometria de massa em Tandem

A espectrometria de mobilidade de íons (IMS) é um complemento interessante à espectrometria de massa para a caracterização de biomoléculas, notadamente por ser sensível ao isomerismo. Este protocolo descreve um experimento tandem IMS (IMS/IMS), que permite o isolamento de uma molécula e a geração dos perfis de mobilidade de seus fragmentos.

Usando um espectrômetro de mobilidade de íons cíclicos para experimentos de mobilidade de íons tandem

Este artigo descreve um protocolo experimental usando espectrometria eletrospray-ion mobilidade-massa, cálculos quânticos semi-empíricos e dissociação induzida por colisão limiar resolvida pela energia para medir a termoquímica relativa da dissociação de complexos metálicos ternários relacionados.

Estudos Termoquímicos de Ni(II) e Zn(II) Complexos Ternários utilizando Espectrometria de Ion Mobility-Mass

Aprenda a determinar a forma tridimensional de complexos proteicos usando espectrometria de mobilidade iônica. Este método correlaciona tempos de deriva com seções de choque para elucidar topologia e organização subunitária.

T-wave Ion Mobility Spectrometry massa: Basic Procedimentos para Análise Experimental Protein Complex

Explorar mais vídeos