Name: Analisar grandes complexos de proteínas por espectrometria de massa estruturais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 35 s
Description: Aprenda a caracterizar grandes complexos proteicos por espectrometria de massa estrutural usando capilares banhados a ouro. Este método permite analisar a composição e arquitetura de macromoléculas intactas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Os autores agradecem os membros do grupo Sharon para a sua revisão crítica, e por suas contribuições ao manuscrito. Estamos gratos pelo apoio dos Programas Morasha e Bikura, a Israel Science Foundation (Grant n. º s 378/08 e 1823-1807), o Josef Cohn Minerva Center for Research biomembrana, a Família Chais Fellows Program para novos cientistas, o Abraham e Sonia Rochlin Foundation, o Family Trust Wolfson Charitable, a Helen e Milton A. Kimmelman Centro de Estrutura Biomolecular e Montagem; o espólio de Shlomo e Beirzwinsky Sabine; Meil ​​de Botton Aynsley, e Karen Siem, Reino Unido. Somos gratos a Dan Tawfik e Yadid Itamar por nos dar a amostra variante lectina.

Parte 1: Preparação de ouro revestidas de capilares para nanofluxo ionização electrospray Análise de não-covalente complexos é normalmente realizada por meio de ionização electrospray nanofluxo (Nesi) 6, usando capilares de vidro ou de quartzo, que foram puxados para uma ponta fina (~ 1 mícron de diâmetro interno) e revestida com material condutor (geralmente de ouro) . Capilares estejam disponíveis ready-to-use de fontes comerciais (Objetivo Novo ou Proxeon), no entanto, pode ser mais rentável para prepará-los em casa: <ol><li> Vara duas tiras de adesivo dupla face para a parte inferior de uma placa de Petri, 2 cm. Coloque uma vareta de vidro (8 cm x 5 mm) no centro de uma das almofadas. O adesivo vai realizar os capilares no local, e da vareta de vidro apoiará os capilares preparado, e manter as pontas de quebrar (Fig. 1). </li><li> Use vidro borossilicato capilares, 1,0 mm de diâmetro externo x 0,78 mm id (usamos embalagens de 500 unidades de parede fina borosilicato capilares da Warner Instruments, cat. Não. G100TF-4). Inserir um capilar para o puxador de agulha (usamos modelo P-97 do Instrumento Sutter Co.). Grampo do capilar suavemente no lugar, e ajustar a sua posição de modo que fica no centro do filamento da agulha extrator de aquecimento. Aperte os grampos com cuidado, até o capilar é mantido firme em ambas as extremidades. </li><li> Puxe o capilar, utilizando um programa pré-definido. Cada capilar puxado dará origem a duas finais, em forma de vasos capilares. O processo de programação do extrator é uma de tentativa e erro, até que uma forma aceitável dica é obtido. Usamos o seguinte programa: <table border="1"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Calor </td><td> Puxe </td><td> Vell </td><td> Tempo </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 750 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 700 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 750 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 80 </td></tr></tbody></table></li><li> Remove os capilares retirado o instrumento e fiscalizar as dicas, descartando qualquer que são deformados ou quebrados. Use uma pinça blunt (usamos pinças de posicionamento de precisão CK), para colocar os vasos capilares na placa de Petri. A base do capilar deve ser anexado ao adesivo ea parte superior deve se inclinar sobre a haste de vidro, com a ponta apontando para cima. </li><li> Uma vez que a placa de Petri está cheia (cerca de 80 capilares se encaixam em um prato de 10 cm de diâmetro), insira a placa no ouro sputter coater (usamos modelo não. EMS550, de EMS). Certifique-se que o fornecimento de gás é escolhido de acordo com as instruções do fabricante, e ativar um ciclo de revestimento pré-definidos (usamos pressão Argon 4 psi, a uma pressão de vácuo de 5 x 10 -2 mbar, uma corrente de 45mA, e um tempo de revestimento de 1 min, por 3-6 ciclos, até os capilares são uniformemente dourada). </li></ol> Parte 2: Preparação da amostra <ol><li> Baixas concentrações micromolar de amostra são necessários (1-20 mM). Se necessário, concentrar a amostra usando dispositivos de ultrafiltração centrífuga (por exemplo, Vivaspin de Sartorius, ou NanoSep da Pall Corporation). É recomendável que você verificar a adsorção do complexo de proteínas para a membrana dispositivo, antes de usar. </li><li> Muitas vezes, os buffers de purificação ou soluções de armazenamento do complexo de proteínas não são compatíveis com Nesi, para o qual apenas soluções voláteis podem ser usadas. Portanto, buffer de troca é necessária. Este passo crucial, em que todos os vestígios de sais, as moléculas de buffer ou qualquer outro não-volátil adutos, como o glicerol, a TDT, ou EDTA são removidos, determina a qualidade dos espectros. Normalmente, a solução aquosa de acetato de amônio é usado, em uma concentração entre 5 mm e 1 M, e em 08/06 pH. Buffer de troca pode ser realizada utilizando uma coluna de filtração em gel de microcentrífuga (por exemplo, Micro Bio-Spin 6 colunas de cromatografia de Bio-Rad). Este passo pode ser repetido 1-3 vezes com uma diluição mínima (menos de um factor de 1,3 por dispositivo 5), até que a troca máxima é alcançada. Se ambos concentração e troca de buffer são necessárias, estas podem ser feitas em conjunto, utilizando ultrafiltração centrífuga (e, g., Vivaspin de Sartorius, ou NanoSep da Pall Corporation). </li></ol> Parte 3: Calibração de espectrômetro de massa para medições de massa de alta A maioria dos experimentos conduzidos na proteína multi-complexos são realizadas usando um electrospray nano quadrupolo-tempo-of-flight (Q-TOF) instrumento. É sugerido que você use um filtro de massa quadrupolar ajustado para baixas freqüências, para permitir a transmissão ea massa análise de íons com alta m / z valores 7,8. Étambém recomendou que entradas de gás 7,8 ou 9 mangas ser adicionado ao instrumento no guia de íons em primeiro lugar, para permitir o controle da pressão na fase de vácuo em primeiro lugar. Este último permite a otimização da transmissão, e dessolvatação de íons muito grande 7-9. Atualmente, comercial ESI-TOF e Q-TOF instrumentos estão disponíveis em diversos fabricantes (por exemplo, Waters, SCIEX, Bruker, ou Agilent), que podem ser modificados de forma relativamente fácil e econômica, para aplicações nativas MS 7,8. É possível, no entanto, para usar as configurações padrão ou ToF QToF em instrumentos como LCT ou QToF1 (Waters) para adquirir espectros de massa para complexos até 1 MDA, sem a necessidade de modificações de hardware 5. O protocolo descrito a seguir foi realizado em um instrumento Synapt (Waters). <ol><li> Prepare 100 mg / ml de CsI em água purificada. CsI ​​é usado para a calibração de massa de alta como os clusters de sal isoladamente cobrado (CSI) n Cs + se estendem por uma vasta massa de largura, a partir de 393 m / z para mais de 10.000 (Fig. 2). </li><li> Usando uma pinça sem corte, faça um capilar revestido da placa de Petri e 2μL carga da solução CsI no capilar, usando uma ponta de GeLoader Eppendorf. </li><li> Inserir o capilar no suporte capilar, e ajuste o capilar de tal forma que a ponta é de aproximadamente 10 mm de distância da borda do titular. </li><li> Deslize a solução para a ponta do capilar manualmente ou usando um adaptador de spin down. </li><li> Coloque o capilar sob um microscópio óptico e aparar a ponta, utilizando as afiadas AA-tipo pinça. </li><li> Conecte o suporte à interface capilar ES nanofluxo. Gire o estágio xyz para trás para evitar danos ao capilar, e empurre o palco para a sua posição ativada. O capilar deve ser colocado 1-10 mm do orifício de cone. </li><li> Aplique a tensão capilar (1050-1400 V) e pressão nanofluxo baixa (0,00-0,03 bar) até spray é iniciado, em seguida, tentar reduzir a pressão nanofluxo para um valor mínimo. </li><li> Otimizar a intensidade do sinal, ajustando a localização do palco xyz, a tensão capilar, a pressão nanofluxo, eo fluxo de gás dessolvatação. </li><li> Para detectar uma ampla gama de massa CsI pico da série, as tensões de aceleração deve ser otimizada (nós usamos os seguintes parâmetros: 1,3-1,7 kV capilar, cone amostra 80-150V, extração de cone 03/01 V). </li><li> Para otimizar a transmissão de íons de alta massa, que exigem condições dessolvatação suave, a pressão de apoio na fase inicial de vácuo, entre a fonte eo analisador, deve ser levantada. Isto pode ser conseguido com cuidado reduzindo a condutância da linha de vácuo de origem para a bomba de deslocamento, por parte de fechar a válvula de isolamento (SpeediValve). , A fim de definir o ponto ótimo, este último deve ser feito durante o monitoramento do efeito da intensidade do sinal (geralmente usamos mBar 3,0-6,5). </li><li> Coletar cerca de 30 scans em 1 scan / seg, em uma faixa de m / z entre 1.000 a 15.000 m / z. </li><li> Após a aquisição, calibrar o TOF usando a tabela de calibração adequadas. </li></ol> Parte 4: MS análise de complexos de proteínas intactas <ol><li> Carregar sua amostra, como descrito (Parte 3, secções 2-5), e iniciar spray. </li><li> Comece por otimização inicial do spray (Parte 3, secções 6-9), até que o sinal é detectado. A posição exata dos estados de carga é a proteína-dependente, no entanto, pode ser previsto, utilizando a relação entre a massa de íons e estado de carga média, assim: (Z médio) 10: Z = 0,0778 av √ (m), em que m é a massa do complexo em Daltons. Para evitar a dissociação complexo, não aquecem a fonte de íons: ou mudar o aquecedor desligado, ou manter a temperatura abaixo de 40 ° C. </li><li> Variar a posição capilar, cone de amostra e tensões extractor para maximizar a transmissão de íons, e verificar as mudanças resultantes nos espectros. Um possível ponto de partida poderia ser tensão cone 100 V; extractor cone: 1 V; tensão capilar 1,5 kV. Otimizar esses parâmetros, em combinação com a pressão nanofluxo. </li><li> Para melhorar dessolvatação e retirar a água residual e componentes buffer, aumentar a tensão de polarização ea pressão do gás na célula de colisão. Esta etapa deve ser realizada com cuidado, para evitar a dissociação do complexo. Tensões de polarização típica estão dentro da faixa de 10-100 V, com um fluxo de gás armadilha de 10-10 ml / min (Fig. 3). Ajuste manual da configuração RF e perfil quadrupolo pode melhorar a transmissão de íons de alta massa. </li><li> Ajuste Trap e energias de colisão de Transferência. Muitas vezes, altas tensões são necessárias para a transmissão de íons de massa elevada (geralmente dentro da faixa de 10-30 V). Neste ponto, é importante para evitar a colisão induzida dissociação do complexo. </li><li> Após um sinal estável é reached, recomenda-se que a pressão ea tensão capilar nanofluxo ser reduzida para valores mínimos, mantendo pulverização estável. </li></ol> Parte 5: espectrometria de massas Tandem: complexos de proteína dissociar <ol><li> Uma vez que um sinal ótima e estável foi obtida, selecione um íon precursor. Definir o centro de massa e largura de isolamento (geralmente usamos uma resolução LM, de 12, e uma resolução de HM entre 13 e 15). Use uma ampla variedade de massas para detectar a massa de alta / products carga baixa dissociação. É recomendável que você defina o intervalo de m / z para o nível máximo, e depois reduzi-lo para os valores desejados. Sugerimos ainda a superposição de MS e MS / MS espectros, para validar o isolamento do íon precursor escolhido. </li><li> Para executar MS / MS, dissociar o íon precursor, aumentando a energia de colisão (CE) ea pressão na célula de colisão. Aumentar ou Armadilha ou Transferência CE gradualmente, em passos de 10-20V, e elevar a pressão do gás de colisão para 0-5 ml / min (valores comuns). Monitorar as mudanças nos espectros até que as condições ótimas de ativação são alcançados. Energia de ativação elevada pode induzir a dissociação de uma ou mais subunidades do complexo intacta, e esclarecer as afinidades interação de diferentes subunidades. Normalmente usamos Argon como um gás de colisão nas células Armadilha / Transferência, embora os benefícios de usar um gás mais pesado (por exemplo, Xe ou SF 6) foram relatados, no entanto, esses gases são substancialmente mais caros 11 (Fig. 3). </li><li> Recomenda-se que mais de um estado de carga ser selecionado para MS / MS análise. No caso de componentes sobrepostos, a aquisição de um conjunto de espectros em tandem MS vai ajudar a resolver a série de carga das diferentes populações. Além disso, os estados superiores carga vai se dissociam mais facilmente, em comparação aos estados carga mais baixa 12. </li><li> Além da caracterização do complexo intacta, sugere-se que subcomplexes menores em solução será gerado, em condições moderadamente desnaturação. As análises de MS e MS / MS de subcomplexes formam a base para a definição da arquitetura subunidade do complexo 13. De ruptura parcial da subunidade subunidade interações, gradualmente adicionar solventes orgânicos (por exemplo, metanol, isopropanol ou acetonitrila) até uma concentração de 50%, ou alterar o pH da solução pela adição de amônia ou ácido fórmico (até uma concentração de 4 %). </li><li> Para determinar as massas das unidades individuais que compõem o complexo, é importante para adquirir um espectro em condições de desnaturação. Isto pode ser efectuado através de Zip Tip-C 4 (Millipore), com uma relação água / acetonitrila 25:75, com 1% de ácido fórmico como o solvente de eluição. </li></ol> Parte 6: Processamento de dados e análise <ol><li> Os dados são analisados ​​off-line, usando um programa de análise espectral para MS espectros. Normalmente usamos o programa MassLynx (Waters). </li><li> Para espectros que abrangem toda uma gama m / z de largura, recomendamos que diferentes regimes de alisamento e parâmetros centróide ser aplicado para a alta e baixa m / z regiões, de modo a reflectir a diferença na resolução de pico destas regiões. </li><li> Para identificar série de carga e calcular os estados de carga e massas, o "manual encontrar" função de MassLynx pode ser aplicada. Em casos de espectros de massa complexa com componentes que se sobrepõem, o cálculo manual de massas pode ser mais fácil. </li><li> Para facilitar estes processos de atribuição, software adicional pode ser usado, por exemplo: MaxEnt para espectros deconvolução 14, SOMMS para a montagem de pico e 15 de simulação, e SUMMIT para atribuir a composição e estequiometria da subcomplexes proteína e gerar redes de interação protéica 13,16,17 . </li></ol> Parte 7: Resultados Representante <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Preparando-se revestidas de ouro nano-electrospray capilares. A. Coloque duas tiras dupla face adesiva a uma placa de Petri, 2 cm. Para apoiar os vasos capilares preparado, coloque uma vareta de vidro (8 cm x 5 mm) no centro de uma das almofadas. B. Cole a extremidade sem corte dos capilares preparado para o adesivo, e magra a ponta da vareta de vidro. C. Uma vez que a placa de Petri é preenchido com os capilares preparado, revesti-los com o ouro até que uma fina película de ouro é depositado uniformemente sobre a superfície externa dos capilares. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Calibração de massa de alta usando íons iodeto de césio. Os grandes aglomerados e monisotopic de CsI tornaram o composto de escolha para a calibração de espectrômetros de massa para análise de massa elevada. A série de picos igualmente espaçados se estendem por uma ampla gama, de m / z 393 para mais de 10.000. Eles são ASSIGned às isoladas cobrado aglomerados sal da composição geral (CSI) n + Cs. Sinais adicionais entre os picos principais são causadas por espécies de duplo e triplo-carregada da série; [(CSI) n CS2] 2 + e [(CSI) n Cs3] 3 +, respectivamente. Aumentando a pressão na fase inicial de vácuo é essencial para detectar os clusters de alta massa. O efeito da pressão sobre os picos de alta massa é demonstrado nos Painéis A. e B. readbacks com pressão de 1,2 e 5,3, respectivamente. C. Expansão do espectro de massa mostrado em B. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Nanofluxo espectros de massa por electrospray de uma lectina pentamérica. A. A espectrometria de massa de um complexo variante lectina (derivado de lib1 B7 por evolução dirigida 18) dá origem a uma distribuição de carga de estado entre 3.000 e 5.000 m / z, no entanto, devido à dessolvatação inadequada dos íons, os picos são largos. Comparação de painel de A. e B. mostram o efeito de aumentar a voltagem de 4V (A). A 15V (B). Sobre a largura do pico. Este aumento nas condições de aceleração faz com que o stripping de água residual e de componentes do tampão, produzindo um espectro altamente resolvido. A massa medida (60.240 ± 38 Da) corresponde a um complexo pentamérica. C. O estado de carregamento 15 foi, então, selecionados para análise em tandem MS (sombreados em cinza no painel B). D. O aumento da energia de colisão provoca a libertação de um monômero altamente carregada, centrado em 1.664 m / z, e um complexo despojado tetramérica, na faixa de 5.000 - 8.000 m / z. Todos os espectros foram obtidos a partir de uma amostra contendo 20 mM de solução em acetato de amónio 0,5 M.

<ol><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+as+a+collection+of+protein+machines%3A+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li>
<li>Benesch, J. L., Ruotolo, B. T., Simmons, D. A., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+complexes+in+the+gas+phase%3A+technology+for+structural+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein complexes in the gas phase: technology for structural genomics and proteomics.</a> Chem Rev. 107 (8), 3544-3567 (2007).</li>
<li>Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+mass+spectrometry%3A+a+bridge+between+interactomics+and+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology.</a> Nat Methods. 5 (11), 927-933 (2008).</li>
<li>Sharon, M., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mass+spectrometry+in+structure+elucidation+of+dynamic+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes.</a> Annu Rev Biochem. 76, 167-193 (2007).</li>
<li>Hernandez, H., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+stoichiometry+and+interactions+of+macromolecular+assemblies+from+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 2 (3), 715-726 (2007).</li>
<li>Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+properties+of+the+nanoelectrospray+ion+source%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analytical properties of the nanoelectrospray ion source.</a> Analytical Chemistry. 68 (1), 1-8 (1996).</li>
<li>Sobott, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tandem+mass+spectrometer+for+improved+transmission+and+analysis+of+large+macromolecular+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A tandem mass spectrometer for improved transmission and analysis of large macromolecular assemblies.</a> Anal Chem. 74 (6), 1402-1407 (2002).</li>
<li>van den Heuvel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+performance+of+a+quadrupole+time-of-flight+instrument+for+macromolecular+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Improving the performance of a quadrupole time-of-flight instrument for macromolecular mass spectrometry.</a> Anal Chem. 78 (21), 7473-7483 (2006).</li>
<li>Chernushevich, I. V., Thomson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collisional+cooling+of+large+ions+in+electrospray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Collisional cooling of large ions in electrospray mass spectrometry.</a> Anal Chem. 76 (6), 1754-1760 (2004).</li>
<li>Mora, dela, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+of+large+multiply+charged+species+proceeds+via+Dole+s+charged+residue+model%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization of large multiply charged species proceeds via Dole s charged residue model.</a> Anal Chim Acta. 406, 93-104 (2000).</li>
<li>Lorenzen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+macromolecular+tandem+mass+spectrometry+of+large+non-covalent+complexes+using+heavy+collision+gases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Optimizing macromolecular tandem mass spectrometry of large non-covalent complexes using heavy collision gases.</a> Int J Mass Spectrom. 268, 198-206 (2007).</li>
<li>Benesch, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quadrupole-time-of-flight+mass+spectrometer+modified+for+higher-energy+dissociation+reduces+protein+assemblies+to+peptide+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quadrupole-time-of-flight mass spectrometer modified for higher-energy dissociation reduces protein assemblies to peptide fragments.</a> Anal Chem. 81 (3), 1270-1274 (2009).</li>
<li>Taverner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+architecture+of+intact+protein+complexes+from+mass+spectrometry+and+homology+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Subunit architecture of intact protein complexes from mass spectrometry and homology modeling.</a> Acc Chem Res. 41 (5), 617-627 (2008).</li>
<li>Ferrige, A. G., Seddon, M. J., Skilling, J., Ordsmith, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+MaxEnt+to+high+resolution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">The application of MaxEnt to high resolution mass spectrometry.</a> Mass Spectrom. 6, 765-770 (1992).</li>
<li>van Breukelen, B., Barendregt, A., Heck, A. J., van den Heuvel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+stoichiometries+and+oligomeric+states+of+glutamate+synthase+protein+complexes+with+curve+fitting+and+simulation+of+electrospray+mass+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Resolving stoichiometries and oligomeric states of glutamate synthase protein complexes with curve fitting and simulation of electrospray mass spectra.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 20 (16), 2490-2496 (2006).</li>
<li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetrical+modularity+of+the+COP9+signalosome+complex+suggests+its+multifunctionality%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Symmetrical modularity of the COP9 signalosome complex suggests its multifunctionality.</a> Structure. 17 (1), 31-40 (2009).</li>
<li>Hernandez, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+architecture+of+multimeric+complexes+isolated+directly+from+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Subunit architecture of multimeric complexes isolated directly from cells.</a> EMBO Rep. 7 (6), 605-610 (2006).</li>
<li>Yadid, I., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+functional+beta-propeller+lectins+via+homo-oligomeric+assembly+of+shorter+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of functional beta-propeller lectins via homo-oligomeric assembly of shorter fragments.</a> J Mol Biol. 365 (1), 10-17 (2007).</li>
<li>Videler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+intact+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of intact ribosomes.</a> FEBS Lett. 579 (4), 943-947 (2005).</li>
<li>Uetrecht, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mass+spectrometry+of+viral+assemblies%3A+molecular+composition+and+stability+of+dimorphic+hepatitis+B+virus+capsids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-resolution mass spectrometry of viral assemblies: molecular composition and stability of dimorphic hepatitis B virus capsids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9216-9220 (2008).</li>
<li>Uetrecht, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+shape+of+hepatitis+B+virus+capsids+in+vacuo%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Stability and shape of hepatitis B virus capsids in vacuo.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6247-6251 (2008).</li>
<li>Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+virus+capsid+assembly+from+non-covalent+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).</li>
<li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((20S+proteasomes+have+the+potential+to+keep+substrates+in+store+for+continual+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">20S proteasomes have the potential to keep substrates in store for continual degradation.</a> J Biol Chem. 281 (14), 9569-9575 (2006).</li>
<li>van Duijn, E., Heck, A. J., Vies, S. M. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-ring+communication+allows+the+GroEL+chaperonin+complex+to+distinguish+between+different+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Inter-ring communication allows the GroEL chaperonin complex to distinguish between different substrates.</a> Protein Sci. 16 (5), 956-965 (2007).</li>
<li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+mass+spectrometry+of+intact+GroEL-substrate+complexes+reveals+substrate-specific+conformational+changes+in+the+trans+ring%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Tandem mass spectrometry of intact GroEL-substrate complexes reveals substrate-specific conformational changes in the trans ring.</a> J Am Chem Soc. 128 (14), 4694-4702 (2006).</li>
<li>Synowsky, S. A., van Wijk, M., Raijmakers, R., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+multiplexed+mass+spectrometric+analyses+of+endogenously+expressed+yeast+nuclear+and+cytoplasmic+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative multiplexed mass spectrometric analyses of endogenously expressed yeast nuclear and cytoplasmic exosomes.</a> J Mol Biol. 385 (4), 1300-1313 (2009).</li>
<li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+organization+of+the+19S+proteasome+lid%3A+insights+from+MS+of+intact+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural organization of the 19S proteasome lid: insights from MS of intact complexes.</a> PLoS Biol. 4 (8), e267-e267 (2006).</li>
<li>Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+reveals+modularity+and+a+complete+subunit+interaction+map+of+the+eukaryotic+translation+factor+eIF3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry reveals modularity and a complete subunit interaction map of the eukaryotic translation factor eIF3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18139-18144 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Para adquirir a atenção espectros de alta qualidade deve ser dada às etapas de preparação de amostra, que incluem concentração da amostra e troca de buffer. Mais de amostras diluídas renderá um sinal de baixa, enquanto que amostras altamente concentrada pode ser bastante viscoso, e bloquear a agulha electrospray. Além disso, os aditivos solução, tais como sais, glicerol, detergentes, íons metálicos e agentes redutores (DTT ou β-mercaptoetanol), tendem a aderir na superfície externa das proteínas, e causar alargamento dos picos. Portanto, a fim de alcançar o bem-resolvida picos, esses componentes devem ser adicionados nas concentrações mais baixas possíveis. Outro parâmetro importante é a posição do nanofluxo capilar, em relação ao orifício espectrômetro de massa. Encontrar o &quot;sweet spot&quot; pode ser um desafio para usuários inexperientes, no entanto, que influencia significativamente a qualidade dos espectros. Também é importante analisar o nanofluxo capilar antes do início do spray. O tamanho da gota é uma função do diâmetro da ponta, que deve ser ~ 1 Hm. Pequenas gotículas levar a ionização mais eficiente, e, portanto, ser vantajoso. Também é importante para validar que não há bolhas de ar dentro do capilar que possam bloquear o fluxo, e que o revestimento de ouro não é despojado do capilar durante a aquisição, em caso afirmativo, mais aparar a ponta. Tenha em mente que uma quantidade excessiva de amostra aumentará a possibilidade de otimizar as condições MS, tais como a tensão capilar, voltagens de aceleração, pressão e energia de colisão. No geral, os procedimentos explicados no protocolo têm sido usados ​​para determinar a composição, estequiometria e arquitetura de complexos de proteínas numerosos (ver comentários 2,3,4). Análise de grandes complexos MDa como o ribossomo e 19 capsídeos do vírus altamente ordenada 20-22, na definição de substrato de ligação para máquinas moleculares 23-25, ou a caracterização das redes de interação subunidade 26,17,16,17,27,28 servir como apenas alguns exemplos do valor desta abordagem.

Requisitos da amostra: <table border="1"><tr><td> Amostra </td><td> Exigência </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Volume </td><td> 1-2 mL </td><td> Por capilar </td></tr><tr><td> Concentração </td><td> 1-20Hm </td><td> Por complexos </td></tr><tr><td> Amortecedor </td><td> Aquanos tampão volátil como o acetato de amônio em pH = 6-8 </td><td> Tipicamente 5 mM-1M </td></tr><tr><td> Detergente </td><td> Mínimo </td><td> Aglomerados de moléculas de detergente produzir picos largos e sem solução </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Mínima (até 5%) </td><td> Adere inespecificamente às proteínas e, conseqüentemente, ampla picos são observados </td></tr><tr><td> Solventes orgânicos </td><td> Até 50% </td><td> Pode desnaturar proteínas complexos </td></tr><tr><td> Ácidos </td><td> Até 4% </td><td> Desnaturar complexos de proteína </td></tr><tr><td> Sais </td><td> Mínimo </td><td> Adutos de sal levar a picos largos e sem solução </td></tr><tr><td> TDT </td><td> Mínimo </td><td> M 02/01 pode estar presente </td></tr><tr><td> Agentes quelantes </td><td> Mínimo </td><td> Acima de 250 mM levar à formação de aduto extensa </td></tr></table>

analisar grandes complexos de proteínas por espectrometria de massa estruturais

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Células vivas controlar e regular seus processos biológicos por meio da ação coordenada de um grande número de proteínas que se reúnem em uma matriz de dinâmica, proteína multi-complexos 1. Para obter uma compreensão mecanicista dos vários processos celulares, é crucial para determinar a estrutura de complexos de proteínas tais, e revelam como a sua organização estrutural determina sua função. Muitos aspectos da proteína multi-complexos são, no entanto, difícil de caracterizar, devido à sua natureza heterogênea, a estrutura assimétrica e dinâmica. Portanto, novas abordagens são necessárias para o estudo dos níveis de organização superior de proteína. Uma das ferramentas de biologia estrutural emergentes para a análise de complexos macromoleculares é a espectrometria de massa (MS) 2-5. Este método produz informações sobre a composição das proteínas complexas, estequiometria subunidade, e topologia estrutural. O poder do MS deriva de sua alta sensibilidade e, como conseqüência exigência de amostra, baixo, o que permite o exame de complexos de proteínas expressas em níveis endógenos. Outra vantagem é a rapidez da análise, que permite o monitoramento de reações em tempo real. Além disso, a técnica pode medir simultaneamente as características das populações separadas co-existentes em uma mistura. Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para a aplicação de MS estruturais para a análise de conjuntos de proteínas de grande porte. O procedimento começa com a preparação de ouro revestidas de capilares para nanofluxo ionização electrospray (Nesi). Em seguida, continua com a preparação da amostra, enfatizando as condições de buffer que deve ser compatível com Nesi por um lado, e permitem manter intacta complexos, de outro. Em seguida, explicar, passo-a-passo, como otimizar as condições experimentais para medições de massa de alta e adquirir MS e tandem MS espectros. Finalmente, o gráfico de processamento de dados e análises que se seguem. Ao invés de tentar caracterizar cada aspecto dos conjuntos de proteínas, este protocolo apresenta procedimentos básicos MS, permitindo o desempenho de MS e MS / MS experimentos sobre a não-covalente complexos. No geral, nosso objetivo é fornecer aos pesquisadores não familiarizados com o campo da MS estrutural, com o conhecimento das principais ferramentas experimentais.

Espectrometria de massa tem provado ser uma ferramenta valiosa para a análise de grandes complexos de proteínas. Este método permite insights sobre a arquitetura de estequiometria, composição e global da subunidade multi-montagens. Aqui, descrevemos, passo-a-passo, como realizar uma análise de espectrometria de massa estrutural, e caracterizar as estruturas macromoleculares.

Analisar grandes complexos de proteínas por espectrometria de massa estruturais

As células vivas controlam e regulam seus processos biológicos por meio da ação coordenada de um grande número de proteínas que se organizam em um ...

O objetivo geral do experimento a seguir é caracterizar grandes complexos proteicos utilizando espectrometria de massas estrutural. Isso é alcançado pela preparação de capilares revestidos com ouro para ionização por eletrosspray em fluxo nanométrico. Como segundo passo, a amostra é preparada e o espectrômetro de massas é calibrado para medições de alta massa.Em seguida, as condições experimentais são otimizadas para manter os complexos proteicos intactos na fase gasosa. Em seguida, são adquiridos espectros de MS e de MS/MS. Os espectros de MS mostraram estados de carga correspondentes em massa ao complexo intacto, enquanto experimentos de MS/MS geraram o padrão de associação de monômeros e complexos desprovidos de subunidades.Olá, sou Naam Kiba do Laboratório de Miron no Instituto de Ciências Whiteman, e eu sou Isaac Ky. Também sou do laboratório de michelon. Hoje gostaríamos de mostrar a vocês o procedimento básico para analisar grandes complexos proteicos aplicando espectrometria estrutural, e utilizamos este procedimento em nosso laboratório para caracterizar complexos proteicos, definindo sua geometria estequiométrica, composição e redes de interação. Então, vamos começar.A análise de complexos proteicos ligados não correntes é realizada pela técnica de imunização por pulverização aérea, utilizando capilares emme plus ou a qua. Esse capilar C pode ser puxado até uma ponta fina de cerca de um micrômetro de diâmetro e, em seguida, revestido com um material condutor, como ouro. Esses capilares estão disponíveis comercialmente, como pode ser visto aqui.No entanto, é muito mais econômico de usar. Os capilares de vidro, eh, que podem ser resfriados e revestidos até o estado pronto para uso, são resfriados neste dispositivo de agrupamento de agulhas e revestidos neste dispositivo de revestimento, eh. Para iniciar este procedimento, fixe duas tiras de uma almofada adesiva dupla face na parte inferior de uma placa de Petri, mantendo as tiras separadas por dois centímetros.Coloque uma haste de vidro no centro de uma das almofadas. A almofada adesiva mantém os capilares no lugar e a haste de vidro sustenta os capilares preparados, evitando que as pontas dos capilares quebrem. Utilize capilares de vidro de borosilicato Boris com um milímetro de diâmetro externo e 0,78 milímetro de diâmetro interno.Insira um capilar na agulha, acomode suavemente o capilar no lugar e ajuste sua posição para que fique no centro do filamento de aquecimento. Aperte levemente as braçadeiras até que os capilares fiquem firmes em ambas as extremidades. Puxe o capilar utilizando o programa predefinido mostrado aqui.No entanto, lembre-se de que o processo de programação do puxador é um processo de tentativa e erro. Até que uma forma aceitável da ponta seja obtida, cada capilar puxado dá origem a dois capilares finalmente moldados. Remova os capilares puxados do instrumento e inspecione as pontas, descartando aqueles que estiverem deformados ou quebrados.Use pin&ccedil;as de posicionamento rombas para colocar os capilares na placa de Petri. A base dos capilares fica presa ao suporte adesivo e a parte superior se apoia no bast&atilde;o de vidro com a ponta voltada para cima. Continue puxando os capilares at&eacute; que a placa de Petri esteja cheia.Aproximadamente 80 capilares cabem em um prato de 10 centímetros de diâmetro. Em seguida, recubra os capilares com ouro. Insira a placa no aparelho de pulverização catódica de ouro.Certifique-se de que a fonte de gás seja escolhida de acordo com as instruções do fabricante e ative um ciclo de revestimento predefinido. O revestimento é repetido de três a seis vezes até que os capilares fiquem uniformemente dourados. Uma vez que os capilares estejam prontos, prossiga para calibrar o espectrômetro de massas.A maioria dos experimentos realizados em complexos MultiPro é conduzida por um espectrômetro de massas com eletrospray, quadrupolo e tempo de voo, como este. Fornecido pela Waters, foi modificado para massas elevadas. Antes de carregar a amostra proteica, calibre o espectrômetro de massas utilizando iodeto de césio.Primeiro, prepare uma solução de 100 miligramas por mililitro de césio em água purificada. O césio é usado para calibração de alta massa, pois os aglomerados de sal monocarregados se estendem por uma ampla faixa de massa, de 393 da razão massa/carga até bem acima de 10.000. Usando pinças rombudas, pegue uma capilar revestida da placa de Petri e carregue dois microlitros da solução de césio na capilar.Usando uma ponteira carregada com gel einor. Deslize a solução em direção à ponta da capilaridade, manualmente ou com o uso de um adaptador de centrifugação. Insira a capilaridade no suporte de capilaridade e ajuste-a de modo que a ponta fique aproximadamente a 10 milímetros da borda do suporte.Coloque a capilaridade sob um microscópio óptico e use pinças finas do tipo AA para cortar a ponta. É importante verificar se não há bolhas de ar dentro da capilaridade que possam obstruir o fluxo e se a capilaridade não está entupida. Além disso, certifique-se de que o revestimento de ouro não foi removido da capilaridade.Se for o caso, substitua a capilar ou corte a ponta e remova a seção não revestida. Em seguida, conecte o suporte da capilar ao interface ESI de fluxo nanométrico. Gire o estágio XY, Z para trás para evitar danificar a capilar e empurre o estágio para sua posição ativada.O capilar deve ser posicionado a uma distância de um a dez milímetros do orifício do cone. Aplique tensão ao capilar e pressão de fluxo nano baixa até que a pulverização seja iniciada. Em seguida, tente reduzir a pressão de fluxo nano a um valor mínimo.Otimize a intensidade do sinal ajustando a posição do estágio XYZ, a tensão da capilar, a pressão do fluxo nano e o fluxo de gás de dessolvatação. Para detectar uma ampla faixa de massa de séries de picos sazonais, as tensões de aceleração devem ser otimizadas. Os parâmetros utilizados aqui são capilar de 1,3 a 1,7 quilovolts, cone da amostra de 80 a 150 volts e cone de extração de um a três volts, para otimizar a transmissão de íons de alta massa, que exigem condições suaves de dessalização.A pressão de contra-pressão é elevada para cinco a seis milibares na fase inicial de vácuo entre a fonte e o analisador. Para aumentar a pressão de contra-pressão, reduza cuidadosamente a condutância da linha de vácuo da fonte até a bomba espiral fechando parcialmente a válvula de isolamento, ao mesmo tempo em que monitora o efeito sobre a intensidade do sinal. Ao configurar completamente os espectrômetros de massa, colete cerca de 30 varreduras a uma varredura por segundo em uma faixa de razão carga-mestra entre 1000 e 15.000; após a aquisição, calibre o tempo de voo utilizando a tabela de calibração apropriada.Agora que a calibração está concluída, a amostra proteica pode ser carregada. A amostra é preparada antes da calibração do espectrômetro de massas, sendo necessárias concentrações micromolares baixas. Se necessário, concentre a amostra utilizando dispositivos de ultrafiltração centrífuga.Verifique se o complexo proteico não está absorvido na membrana do dispositivo antes do uso. Ao verificar o volume e a absorbância na UV, apenas soluções voláteis podem ser usadas na NESI, o que frequentemente torna necessária a troca de tampão. Uma coluna de filtração em gel de microcentrífuga pode ser utilizada para remover todos os vestígios de sais, moléculas de tampão ou quaisquer outros adutos não voláteis.Em vez disso, suspenda a amostra em uma solução aquosa de acetato de amônio. Esta etapa crítica determina a qualidade dos espectros.Repita a troca de tampão até três vezes com diluição mínima, menos de um fator de 1,3 por dispositivo, até que a troca máxima seja alcançada. Se forem necessárias tanto a concentração quanto a troca de tampão, estas podem ser realizadas simultaneamente utilizando ultrafiltração centrífuga, conforme mostrado no início desta seção. Em seguida, carregue a amostra conforme indicado para a calibração com iodeto de césio e inicie a pulverização.Inicie com a otimização inicial da pulverização até que o sinal seja detectado. Utilize a equação para o estado de carga médio mostrada, na qual M é a massa do complexo. Em Daltons, no entanto, a posição exata dos estados de carga depende da proteína.Para evitar a dissociação do complexo, não aqueça a fonte de ferro. Desligue o aquecedor ou mantenha a temperatura abaixo de 40 graus Celsius. Varie a posição da cápsula, do cone de amostra e das tensões do extrator.Para maximizar a transmissão de íons, um possível ponto de partida é a tensão do cone, 100 volts no cone extrator, um volt e tensão de capilar de 1,5 quilovolts. Verifique a alteração resultante nos espectros. Otimize esses parâmetros em combinação com uma pressão de fluxo nano para melhorar a desolvatação e remover componentes residuais de água e tampão.Aumente a tensão de polarização com a pressão do gás na célula de colisão. Tensões de polarização típicas estão na faixa de 10 a 100 volts, com um fluxo de gás de aprisionamento de um a 10 mililitros por minuto. Realize isso com cuidado para evitar a associação do complexo, ajustando as energias de colisão da armadilha e de transferência.Normalmente, são necessárias tensões mais altas, geralmente na faixa de 10 a 30 volts, para a transmissão de íons de alta massa. Neste ponto, é importante evitar a dissociação induzida por colisão do complexo, conforme mostrado aqui. Após alcançar um sinal estável, recomenda-se que a pressão do fluxo nano e a tensão da capilar sejam reduzidas aos valores mínimos, mantendo ao mesmo tempo uma pulverização estável.Após coletar vários espectros, prossiga para identificar os componentes do complexo por espectrometria de massas em tandem. Uma vez obtido um sinal ótimo e estável para o complexo proteico, selecione um íon precursor e defina o centro de massa na largura de isolamento. Geralmente, utilize uma resolução de massa baixa de 12 e uma resolução de massa alta entre 13 e 15, com um intervalo de massa amplo para detectar os produtos de dissociação de alta massa e baixa carga, e depois reduza-o para os valores desejados para realizar a ms.A dissociação por MS do precursor de ferro é realizada aumentando a energia de colisão, abreviada como CE, e a pressão na célula de colisão; aumente gradativamente a CE do tipo armadilha ou transferência em etapas de 10 a 20 volts e eleve a pressão do gás de colisão de zero a cinco mililitros por minuto. Monitore as alterações nos espectros até que as condições ótimas de ativação sejam alcançadas. Uma energia de ativação elevada pode induzir a dissociação de uma ou mais subunidades a partir do complexo intacto e esclarecer as afinidades de interação entre diferentes subunidades.Selecione mais de uma carga para a análise por espectrometria de massas (MS). No caso de componentes sobrepostos, adquirir um conjunto de espectros de MS em tandem auxilia na resolução da série de cargas das diferentes populações. Além disso, estados de carga mais altos se dissociam mais facilmente em comparação com estados de carga mais baixos, o que superpõe o MS e o ms.Spectros de MS para validar o isolamento do íon precursor escolhido. Além da caracterização do complexo intacto por MS e MS/MS, realize a geração de subcomplexos menores em solução sob condições brandas de desnaturação e caracterize-os também.A análise por espectrometria de massas (EM) e EM/EM de subcomplexos constitui a base para definir a arquitetura de subunidades do complexo. Para a desestabilização parcial de interações entre subunidades, adicione gradualmente solventes orgânicos até uma concentração de 50%, ou altere o pH da solução mediante adição de amônia ou ácido fórmico até uma concentração de 4%. Por fim, para determinar as massas das subunidades individuais que compõem o complexo, é importante obter o espectro em condições desnaturantes. Isso pode ser realizado utilizando um zip tip C4 com uma proporção de 25 a 75 de água e acetonitrila contendo 1% de ácido fórmico como solvente de eluição. Todos os dados coletados devem ser processados e os resultados analisados conforme detalhado no protocolo escrito que acompanha. Antes de carregar a amostra do complexo proteico, os espectrômetros de massas devem ser calibrados utilizando iodeto de césio.A série de picos igualmente espaçados marcados em vermelho se estende por uma ampla faixa, desde uma razão de carga principal de 393 até bem acima de 10.000. Eles são atribuídos a aglomerados de sal com carga simples de composição geral do complexo cério mais. Sinais adicionais entre os picos principais marcados em preto são causados por espécies com carga dupla e tripla da série complexo cério dois mais e complexo cério três mais.O aumento da pressão na fase inicial de vácuo é essencial para detectar os aglomerados de alta massa. O efeito da pressão sobre os picos de alta massa é demonstrado aqui com leituras de pressão de 1,2 e 5,3 milibar. O espectro de massa para a pressão mais elevada é mostrado expandido aqui.Aqui está um exemplo de espectrometria de massas de um complexo de variante de lectina que gera uma distribuição de estados de carga entre 3000 e 5.000 razão massa/carga. No entanto, devido a uma dessalinização inadequada dos íons, os picos são largos. O aumento da tensão de polarização de quatro para 15 volts, o que provoca um aumento nas condições de aceleração, causa a remoção de água residual e componentes do tampão, resultando em um espectro altamente resolvido, cuja massa medida corresponde a um complexo pentamérico.O estado de carga positivo 15 foi então selecionado para análise por espectrometria de massas em tandem. O aumento na energia de colisão provoca a liberação de um monômero altamente carregado centrado na razão carga/massa de 1.664 e de um complexo tetramérico desprovido na faixa de razão massa/carga de 5.000 a 8.000. O complexo da variante de lectina também foi examinado sob condições desnaturantes, levando à associação do complexo.Dessa forma, pode-se determinar a massa exata das subunidades individuais que compõem o complexo. Acabamos de mostrar como adquirir espectros de MS e espectros em tandem de íons de alta massa. Ao realizar este procedimento, é importante preparar adequadamente a sua amostra e utilizar apenas tampões voláteis compatíveis com espectrometria de massas.Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

analyzing-large-protein-complexes-by-structural-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ion espectrometria de mobilidade de massa é uma tecnologia emergente fase gasosa que separa íons, com base em sua colisão transversal e massa. O método fornece informações tridimensionais sobre a topologia geral e forma de complexos de proteínas. Aqui, descrevemos um procedimento básico para configuração e otimização de instrumento, calibração de vezes drift, e interpretação dos dados.

T-wave Ion Mobility Spectrometry massa: Basic Procedimentos para Análise Experimental Protein Complex

A purificação por afinidade das proteínas marcadas em combinação com espectrometria de massa (STDA) é um método poderoso para o mapeamento sistemático de redes de interacção de proteínas e para a investigação do mecanismo de base de processos biológicos. Aqui, descrevemos um otimizado seqüencial peptídeo afinidade (SPA) APMS procedimento desenvolvido para a...

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Medição de massa exata representa um passo importante durante a investigação de proteínas. De matriz assistida por laser de dessorção / ionização (MALDI) Espectrometria de massa (MS) pode ser utilizado para tal determinação e a sua principal vantagem é a tolerância para os sais, detergentes e contaminantes. Aqui, ilustramos uma abordagem acessível para a análise de proteínas maiores do que 100 kDa, por MALDI-MS.

Matrix-assisted laser dessorção / ionização Time of Flight (MALDI-TOF) espectrometria de massa Análise de proteínas intactas maior que 100 kDa

A abordagem descrita comparativa, quantitativa proteómica visa obter conhecimentos sobre a composição de complexos multiproteicos sob diferentes condições e é demonstrada através da comparação geneticamente diferentes estirpes. Para a análise quantitativa de volumes iguais de diferentes fracções de um gradiente de densidade de sacarose são misturados e analisados ​​por espectrometria de massa.

Uma Nova Abordagem para a Análise Comparativa de Complexos Multiproteicos Baseado em<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabólica Labeling e quantitativa Espectrometria de Massa

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

A arquitetura de complexos de proteínas é essencial para a sua função. Combinar várias técnicas de espectrometria de massa provou poderosa para estudar seu assembly. Nós fornecemos protocolos para cross-linking química e espectrometria de massa nativa e mostrar como essas técnicas complementares ajudam a elucidar a arquitetura de assemblies multi o subunit da proteína.

Combinando reticulação química e espectrometria de massa de complexos de proteínas intactas para estudar a arquitetura de montagens de proteínas com multi- subunidades

Aqui nós apresentamos um protocolo para monitorar a montagem e desmontagem da toxina antraz usando interferometria biolayer (BLI). Na sequência de montagem/desmontagem na superfície biosensor, os grandes complexos de proteínas são liberados da superfície para visualização e identificação dos componentes dos complexos usando microscopia eletrônica e espectrometria de massa, respectivamente.

Analisando a dinâmica da proteína montada sobre e libertado da interferometria Biolayer Biosensor usando espectrometria de massa e de microscopia eletrônica

Espectrometria de massa (MS) emergiu como uma importante ferramenta para a investigação da estrutura e a dinâmica dos conjuntos macromoleculares. Aqui, nós integramos abordagens baseadas em MS para interrogar a formação do complexo de proteínas e a ligação do ligante.

Análise de arquiteturas de proteínas e complexos proteína-ligante por espectrometria de massa estrutural Integrativa

Um protocolo versátil de cryoslicing BN-MS usando um micrótomo é apresentado para o perfilamento complexome de alta resolução.

Perfilamento Complexome de alta resolução por Cryoslicing BN-MS Analysis

Os procedimentos experimentais para a realização de rotulagem covalente à base de diethylpirocarbonato com detecção espectrométrica em massa são descritos. O dietilpirocarbonato é simplesmente misturado com o complexo de proteínas ou proteínas de interesse, levando à modificação de resíduos de aminoácidos acessíveis solventes. Os resíduos modificados podem ser identificados após a digestão proteolítica e a análise da cromatografia líquida/espectrometria de massa.

Rotulagem covalente com dietilpirocarbonato para estudar estrutura de alta ordem de proteína por espectrometria de massa

Aprenda a caracterizar grandes complexos proteicos por espectrometria de massa estrutural usando capilares banhados a ouro. Este método permite analisar a composição e arquitetura de macromoléculas intactas.

Analisar grandes complexos de proteínas por espectrometria de massa estruturais

Explorar mais vídeos