Analisar grandes complexos de proteínas por espectrometria de massa estruturais

O objetivo geral do experimento a seguir é caracterizar grandes conjuntos de proteínas usando espectrometria de massa estrutural. Isso é conseguido preparando capilares banhados a ouro para ionização por eletro spray de nanofluxo. Como segunda etapa, a amostra é preparada e o espectrômetro de massa é calibrado para medições de alta massa.

Em seguida, as condições experimentais são otimizadas para manter os complexos proteicos intactos na fase gasosa. MS e tandem Ms.Spectra são então adquiridos. Os espectros de MS mostraram estados de carga correspondentes em massa ao complexo intacto, enquanto os experimentos de MS em tandem produziram padrão de associação de monômeros e complexos despojados.

Olá, sou Naam Kiba do Laboratório de Miron no Instituto Whiteman de Ciência, e sou Isaac Ky.Também sou do laboratório de michelon. Hoje gostaríamos de mostrar a você o procedimento básico para analisar grandes complexos de proteínas aplicando espectrometria estrutural, E usamos esse procedimento em nosso laboratório para caracterizar complexos de proteínas para definir sua geometria, composição e redes de interação de estoque. Então vamos começar.

A análise de complexos proteicos ligados não correntes é realizada pela técnica de imunização por pulverização de ar usando como emme plus ou qua capilares. Este capilar C pode ser puxado para uma ponta fina de cerca de um mícron de diâmetro e depois revestido por material condutor como ouro. Esses capilares estão disponíveis comercialmente, como você pode ver aqui.

No entanto, é muito mais econômico de usar. Os capilares de vidro, eh, que podem ser do que frios e revestidos para o estado de resfriamento pronto para uso, são realizados neste dispositivo de agrupamento de agulhas e revestimento neste dispositivo de revestimento eh. Para iniciar este procedimento, prenda duas tiras de uma almofada adesiva de dupla face no fundo de uma placa de Petri, mantendo as tiras separadas por dois centímetros.

Coloque uma haste de vidro no centro de uma das almofadas. A almofada adesiva mantém os capilares no lugar e a haste de vidro suporta os capilares preparados e evita que as pontas se quebrem para os capilares. Usado capilares de vidro de silicato Boris com um milímetro de diâmetro externo e 0,78 milímetro de diâmetro.

Insira um capilar na agulha, aperte o capilar suavemente no lugar e ajuste sua posição para que fique no centro do filamento de aquecimento. Aperte os grampos suavemente até que os capilares fiquem firmes em ambas as extremidades. Puxe o capilar usando o programa predefinido mostrado aqui.

No entanto, lembre-se de que o processo de programação do extrator é de tentativa e erro. Até que uma forma de ponta aceitável seja obtida, cada capilar puxado dá origem a dois capilares de formato final. Remova os capilares puxados do instrumento e inspecione as pontas, descartando as que estiverem deformadas ou quebradas.

Use uma pinça de posicionamento rombo para colocar os capilares na placa de Petri. A base dos capilares presos à almofada adesiva e a parte superior se apoiam na haste de vidro com uma ponta apontando para cima. Continue puxando os capilares até que a placa de Petri esteja cheia.

Cerca de 80 capilares cabem em um prato de 10 centímetros de diâmetro. Em seguida, cubra os capilares com ouro. Insira a placa no coter de ouro.

Certifique-se de que o fornecimento de gás seja escolhido de acordo com as instruções do fabricante e ative um ciclo de revestimento predefinido. O revestimento é repetido três a seis vezes até que os capilares estejam uniformemente dourados. Quando os capilares estiverem prontos, prossiga para calibrar o espectrômetro de massa.

A maioria dos experimentos conduzidos em complexos MultiPro são realizados por um espectrômetro de massa de tempo de voo quádruplo al Electrospray como este. Inupt de águas, que é modificado para grandes massas. Antes de carregar a amostra de proteína, calibrar o espectrómetro de massa com iodeto de césio.

Primeiro, prepare uma solução de 100 miligramas por mililitro de césio em água purificada, o césio é usado para calibração de alta massa. Como os aglomerados de sal carregados individualmente se estendem por uma ampla faixa de massa de 393 mastros para taxa de carga a bem mais de 10.000. Usando uma pinça romba, pegue um capilar revestido da placa de Petri e carregue dois microlitros da solução de césio no capilar.

Usando uma ponta carregada de gel einor. Deslize a solução em direção à ponta do capilar, manualmente ou usando um adaptador de rotação. Insira o capilar no suporte capilar e ajuste o capilar de forma que a ponta fique a aproximadamente 10 milímetros de distância da borda do suporte.

Coloque o capilar sob um microscópio óptico e use uma pinça afiada do tipo AA para aparar a ponta. É importante validar se não há bolhas de ar dentro do capilar que possam bloquear o fluxo e se o capilar não está entupido. Além disso, certifique-se de que o revestimento de ouro não seja retirado do capilar.

Nesse caso, substitua o capilar ou apare a ponta e remova a seção não revestida. Em seguida, conecte o suporte capilar à interface ESI de nano fluxo. Gire o estágio XY, Z para trás para evitar danificar o capilar e empurre o estágio para sua posição ativada.

O capilar deve ser colocado a uma distância de um a 10 milímetros do orifício do cone. Aplique tensão capilar e baixa pressão de fluxo nano até que a pulverização seja iniciada. Em seguida, tente reduzir a pressão do fluxo nano para um valor mínimo.

Otimize a intensidade do sinal ajustando a localização do estágio XYZ, a tensão capilar, a pressão do fluxo nano e o fluxo de gás de solvatação diss. Para detectar uma ampla faixa de massa de séries de pico de temporada, as tensões de aceleração devem ser otimizadas. Os parâmetros usados aqui são capilares de 1,3 a 1,7 quilovolts de cone de amostra de 80 a 150 volts, um cone de extração, de um a três volts para otimizar a transmissão de íons de alta massa, que requerem condições de dessalinização suaves.

A pressão de apoio é aumentada para cinco a seis milibar no estágio inicial de vácuo entre a fonte e o analisador. Para aumentar a pressão de apoio, reduza cuidadosamente a condutância da linha de vácuo da fonte para a bomba scroll fechando parcialmente a válvula de isolamento enquanto monitora o efeito na intensidade do sinal. Ao configurar os espectrômetros de massa completos, colete cerca de 30 varreduras em uma varredura por segundo em uma faixa de taxa de carga mestre entre 1000 a 15.000 após a aquisição calibre o tempo de voo usando a tabela de calibração apropriada.

Agora que a calibração está concluída, a proteína sample pode ser carregado. A amostra é preparada antes de calibrar o espectrômetro de massa, são necessárias baixas concentrações micromolares. Se necessário, concentrar a amostra utilizando dispositivos centrífugos de ultrafiltração.

Verifique se o complexo proteico não é absorvido pela membrana do dispositivo antes de usar. Ao verificar o volume e a absorbância de UV, apenas soluções voláteis podem ser usadas para NESI, muitas vezes tornando necessária a troca de tampão. Uma coluna de filtração de gel de microcentrífuga pode ser usada para remover todos os vestígios de sais, moléculas tampão ou quaisquer outros adutos não voláteis.

Em vez disso, suspenda a amostra. Solução aquosa de acetato de amónio. Esta etapa crítica determina a qualidade dos espectros.

Repita a troca de buffer até três vezes com diluição mínima, menos de um fator de 1,3 por dispositivo até que a troca máxima seja alcançada. Se a concentração e a troca de tampão forem necessárias, elas podem ser feitas juntas usando ultrafiltração centrífuga, conforme mostrado no início desta seção. Em seguida, carregue a amostra conforme mostrado para a calibração do iodeto de césio e inicie a pulverização.

Comece pela otimização inicial do spray até que o sinal seja detectado. Use a equação para o estado de carga médio mostrado em que M é a massa do complexo. Em Daltons, no entanto, a posição exata dos estados de carga é dependente da proteína.

Para evitar dissociação complexa, não aqueça a fonte de ferro. Desligue o aquecedor ou mantenha a temperatura abaixo de 40 graus Celsius. Varie a posição capilar, o cone de amostra e as tensões do extrator.

Para maximizar a transmissão de ferro, um possível ponto de partida é a tensão do cone, o cone extrator de 100 volts, um volt e a tensão capilar de 1,5 quilovolts. Verifique a mudança resultante nos espectros. Otimize esses parâmetros em combinação com uma pressão de fluxo nano para melhorar a deificação e remover a água residual e os componentes do tampão.

Aumente a tensão de polarização na pressão do gás na célula de colisão. As tensões de polarização típicas estão na faixa de 10 a 100 volts com o fluxo de gás de armadilha de um a 10 mililitros por minuto. Faça isso com cuidado para evitar a associação do complexo, ajuste a armadilha e transfira as energias de colisão.

Freqüentemente, tensões mais altas, geralmente na faixa de 10 a 30 volts, são necessárias para a transmissão de íons de alta massa. Neste ponto, é importante evitar a dissociação induzida por colisão do complexo, conforme mostrado aqui. Depois que um sinal estável é alcançado, recomenda-se que a pressão do fluxo nano e a tensão capilar sejam reduzidas para valores mínimos, mantendo a pulverização estável.

Depois de coletar várias varreduras, prossiga para identificar os componentes do complexo por espectrometria de massa em tandem. Uma vez que um sinal ótimo e estável tenha sido obtido para o complexo de proteínas, selecione um íon precursor e defina o centro de massa na largura de isolamento. Geralmente, uma resolução de massa baixa de 12 e uma resolução de massa alta entre 13 e 15 usam uma ampla faixa de massa para detectar os produtos de dissociação de alta massa e baixa carga e, em seguida, reduzi-los aos valores desejados Para executar ms.

MS dissociar o ferro precursor Ao aumentar a energia de colisão abreviada CE e a pressão na célula de colisão, aumente a armadilha ou transfira CE gradualmente em etapas de 10 a 20 volts e eleve a pressão do gás de colisão para zero a cinco mililitros por minuto. Monitore as mudanças nos espectros até que as condições ideais de ativação sejam alcançadas. A alta energia de ativação pode induzir a dissociação de uma ou mais subunidades do complexo intacto e esclarecer as afinidades de interação de diferentes subunidades.

Selecione mais de uma cobrança para análise ms MS. No caso de componentes sobrepostos, a aquisição de um conjunto de MS Spectra em tandem ajuda a resolver a série de carga das diferentes populações. Além disso, estados de carga mais altos se dissociam mais facilmente em comparação com estados de carga mais baixos se sobrepõem ao MS e ms.

Ms para validar o isolamento do íon precursor escolhido. Além da caracterização do complexo intacto por MS e ms. MS gera subcomplexos menores e solução sob condições desnaturantes suaves e caracteriza estes também.

A análise MS e ms MS de subcomplexos formam a base para definir a arquitetura da subunidade do complexo para interrupção parcial das interações entre subunidades de subunidades, adicione gradualmente solventes orgânicos até uma concentração de 50% ou altere o pH da solução adicionando amônia ou ácido fórmico até uma concentração de 4% Finalmente, Para determinar as massas das subunidades individuais que compõem o complexo, é importante adquirir espectro em condições de desnaturação. Isso pode ser realizado usando a ponta zip C quatro com uma proporção de aceto nitrilo de 25 a 75 água com 1% de ácido fórmico como solvente elúcio com todos os dados coletados, processe e analise os resultados conforme detalhado no protocolo escrito que acompanha. Antes de carregar a amostra do complexo proteico, os espectrômetros de massa calibrados usando iodeto de césio.

A série de picos igualmente espaçados marcados em vermelho se estende por uma ampla faixa de uma taxa de carga mestre de 393 a bem mais de 10.000. Eles são designados para carregar individualmente os aglomerados de sal da composição geral do césio mais complexo. Sinais adicionais entre os picos principais marcados em preto são causados por espécies de carga dupla e tripla da série césio dois mais complexo e césio três mais complexo.

Aumentar a pressão no estágio inicial de vácuo é essencial para detectar os aglomerados de alta massa. O efeito da pressão nos picos de massa alta é demonstrado aqui com leituras de pressão de 1,2 e 5,3 milibar. O espectro de massa para a pressão mais alta é mostrado expandido aqui.

Aqui está um exemplo de espectrometria de massa de um complexo variante de lectina dando origem a uma distribuição de estado de carga entre 3000 e 5.000 razão de carga mestre. No entanto, devido a uma dessalinização adequada dos íons, os picos são largos. Aumentar a tensão de polarização de quatro volts para 15 volts, o que provoca um aumento nas condições de aceleração, causa a remoção de água residual e componentes de buffer produzindo um espectro altamente resolvido, a massa medida corresponde a um complexo pentamérica.

O estado de carga mais 15 foi então selecionado para análise de MS em tandem. O aumento na energia de colisão causa a liberação de um monômero altamente carregado centrado em 1.664 razão de carga mestre e um complexo tetramérica despojado na faixa de 5.000 a 8.000 razão de carga mássica. O complexo variante da lectina também foi examinado em condições de desnaturação, levando à associação complexa.

Desta forma, a massa precisa das subunidades individuais que compõem o complexo pode ser determinada. Acabamos de mostrar como adquirir MS e tandem Ms Spectra de íons de alta massa. Ao fazer este procedimento, é importante preparar adequadamente sua amostra e usar apenas buffers de volatilidade compatíveis com espectrometria de massa.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.