Electrosoldável célula visualizado com microscopia de fluorescência
July 1st, 2010
Neste vídeo demonstramos eletrofusão eficiente de células In vitro Por meio do método de adesão modificados utilizando eletroporação ea detecção posterior de visualização células fundidas com microscopia de fluorescência.
A eletrofusão envolve a aplicação de pulsos elétricos curtos de alta tensão às células em um contexto próximo. Neste vídeo, demonstramos a eletrofusão de células in vitro por meio de Adherence.Method modificado. Experimentos foram realizados em células de melanoma de camundongo, BF uma.
Para o experimento, siga estas etapas. Cultive células em dois frascos de cultura separados até 80% de confluência. Separadamente, adicione 2,1 microlitros de cada solução estoque.
10 milimolares C-M-F-D-A ou CMRA respectivamente a três mililitros de Krebs Hess Buffer em um tubo de centrífuga. Lavar as células duas vezes com tampão Krebs Hess e introduzir as soluções de carga nos frascos. As soluções de carregamento contêm aproximadamente sete CMD Micromolar ou CMRA, respectivamente.
Incubar as células durante 30 minutos numa atmosfera controlada. Durante esta primeira incubação, as regiões passam livremente através das membranas celulares para o citosol, onde são transformadas em produtos de reação permeada por IMP de membrana. Após esta primeira incubação, enxaguar e depois incubar as células com meio de cultura durante mais duas horas.
As células são observadas usando um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera CCD resfriada no software de aquisição. Defina o comprimento de onda de excitação para 548 nanômetros e escolha uma imagem de fluorescência de ameaça de filtro passa-banda apropriada das células carregadas com CMRA para as células carregadas com CMFA. Defina o comprimento de onda de excitação para 492 nanômetros e escolha um filtro passa-banda para olhos de tripsina de imagem de fluorescência verde e conte as células em ambos os frascos e misture as células vermelhas e verdes Em uma proporção de um para um, ajuste a concentração da célula para 5 milhões de células por mililitro.
Coloque uma gota de 20 microlitros de suspensão celular no meio de cada poço. Em uma placa de 24 poços, incube as células em uma atmosfera controlada por 20 minutos para permitir que as células se fixem levemente à superfície do poço em uma monocamada e estabeleçam contatos celulares entre si. Coloque o multi-poço com células no microscópio stage.
Posicione os eletrodos no fundo do poço e conecte-os ao gerador de pulsos Para obter a eletrofusão ideal e manter a viabilidade da célula, parâmetros adequados de pulsos elétricos devem ser usados. Esses parâmetros dependem da linhagem celular e devem ser determinados em experimentos preliminares. Remover o meio de cultura e lavar as células com um mililitro de tampão fosfato de potássio ISO omu a 350 microlitros de tampão fosfato de potássio de Miller para induzir o inchaço celular.
Deixe as células em tampão hiperosmal por dois minutos antes de aplicar pulsos elétricos. Os pulsos elétricos devem ser aplicados quando as células estão próximas de seus volumes máximos. Isso é antes de começarem o volume regulatório.
Diminuição em nosso experimento. Um trem de oito pulsos retangulares com duração de 100 microssegundos a um hertz foi aplicado. Após a entrega do pulso.
Deixe as células intactas por 10 minutos após 10 minutos. Determinado o rendimento da difusão por meio de contraste facial e microscópio fluorescente. E adquirem três imagens, contraste facial, fluorescência vermelha e verde em cinco campos de visão escolhidos aleatoriamente.
Em cada um, crie imagens de três canais a partir de cada trigêmeo de imagem no software de imagem J para melhorar a qualidade visual das imagens para que as etapas de pré-processamento possam ser aplicadas às imagens originais, fundo, subtração e aprimoramentos de contraste com conjuntos de parâmetros padrão. Finalmente, imagens de três canais são compostas usando o plug-in RGB para imagem cinza J. Nessa imagem, o citoplasma em repouso pode ser visto junto com as membranas celulares.
Assim, poucas células podem ser facilmente determinadas na contagem de imagens de três canais em todos os três tipos de células, vermelha, verde e duplamente fluorescente. Determine a porcentagem de células duplamente fluorescentes dividindo o número de células duplamente fluorescentes por um número de todas as células em cada imagem. O rendimento da fusão é então definido como a porcentagem de células duplamente fluorescentes multiplicada por dois.
Como metade das células de exibição não são detectadas quando as células da mesma cor são visualizadas.
Visão Geral
Este vídeo demonstra a eletrofusão eficiente de células in vitro usando um método de adesão modificado combinado com eletroporação. O processo inclui a detecção de células fundidas através de microscopia de fluorescência.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Técnicas de fusão celular
- Métodos de eletroporação
- Aplicações de microscopia de fluorescência
Fundo
- Eletrofusão é uma técnica que aplica pulsos elétricos para facilitar a fusão celular.
- O método pode aumentar a eficiência de criação de células híbridas.
- A microscopia de fluorescência permite a visualização de células fundidas.
- Compreender a fusão celular é crucial para várias aplicações biológicas.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um método confiável para eletrofusão de células.
- Visualizar e quantificar a eficiência da fusão celular.
- Fornecer um protocolo que possa ser replicado em outros laboratórios.
Métodos Utilizados
- Células de melanoma de camundongo foram cultivadas e preparadas para fusão.
- Corantes fluorescentes foram usados para marcar as células antes da fusão.
- Pulsos elétricos foram aplicados para induzir a fusão celular.
- Microscopia de fluorescência foi empregada para analisar os resultados da fusão.
Principais Resultados
- Foi alcançada uma fusão bem-sucedida de células, indicada pela fluorescência.
- O percentual de células duplo-fluorescentes foi calculado para determinar o rendimento da fusão.
- Parâmetros ótimos de pulso elétrico foram identificados para a viabilidade celular.
- A qualidade visual das imagens foi aprimorada por meio de técnicas de processamento de imagem.
Conclusões
- O método de adesão modificado é eficaz para eletrofusão celular.
- A microscopia de fluorescência é uma ferramenta valiosa para avaliar a eficiência da fusão.
- Este protocolo pode ser adaptado para vários tipos de células na pesquisa.
