Name: Electrosoldável célula visualizado com microscopia de fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Aprenda a técnica de eletrofusão de células de melanoma de camundongo usando microscopia de fluorescência. Este método demonstra como visualizar e quantificar a eficiência da fusão celular in vitro.

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Este trabalho foi financiado pela Agência de Pesquisa esloveno (projeto J2-9764 e um programa de P2-0249). Este vídeo representa material suplementar para o &quot;Eletroporação baseado em Tecnologias e Tratamentos&quot; workshop científico e pós-graduação, organizado pela Faculdade de Engenharia Elétrica da Universidade de Ljubljana, na Eslovénia.

I. Colocação das células com Cell trackers CMFDA e CMRA <ol><li> Experimentos foram realizados em células de camundongo previamente preparado linhagem de células de melanoma (B16-F1). As células são cultivadas em dois separados 25 cm 2 frascos de cultura (TPP, ZDA) a confluência de 70-80% em meio de cultura DMEM (meio modificado Dulbecco Eagle), suplementado com 10% de soro fetal bovino, 0,15 mg / ml L-glutamina, 16 mg / ml de gentamicina (todos da Sigma-Aldrich, Alemanha), 200 unidades / ml crystacillin (Pliva, Croácia), e incubados em 5% de CO 2 a 37 ° C. </li><li> Prepare duas soluções 10 mM estoque de trackers Cell (Invitrogen, EUA), acrescentando 10,76 mL e 9 mL (para CMFDA Verde e Laranja para CMRA, respectivamente) de DMSO (Sigma-Aldrich, Alemanha) a 50 mg do corante no original frasco Invitrogen. A solução de reserva podem ser armazenadas no frigorífico a 4 ° C por alguns meses. Antes de iniciar os experimentos, aquecer a solução até que os cristais de DMSO dissolver. </li><li> Prepare-bicarbonato livre Krebs-Hepes tampão (130 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 11,7 mM D-glucose, 1,3 mM CaCl 2, 10 mM HEPES, pH 7,4). Em dois tubos de 15 ml Eppendorf separadamente mistura 2,1 mL de cada solução estoque (10 mM CMFDA ou CMRA, respectivamente) em 3 ml de bicarbonato de livre tampão Krebs-Hepes. Isso gera uma "solução de carga", contendo cerca de 7 mM CMFDA (ou CMRA). </li><li> Lave as células duas vezes com bicarbonato sem tampão Krebs-Hepes e insira o carregamento soluções para os frascos. Incubar as células por 30 minutos em 5% CO 2 a 37 ° C. Durante esta primeira incubação reagentes passar livremente através das membranas celulares, mas uma vez dentro da célula, os reagentes são transformados em células impermeant produtos da reação fluorescente. </li><li> Após a incubação em primeiro lugar, lavar e incubar as células com meio de cultura por mais duas horas em 5% CO 2 a 37 ° C. </li><li> Trypsinize células em ambos os frascos (carregado com CMFDA e CMRA) e misturar as células vermelhas e verdes juntos em uma proporção de 1:1 em um tubo de centrífuga de 50 ml (TPP, ZDA). Ajuste a concentração de células de 5 x 10 6 células / ml por diluição com meio DMEM ou por concentração com a centrífuga. Colocar uma gota 20 l de suspensão de células em cada poço da placa de 24 com vários poços (TPP, ZDA). Incubar as células em 5% de CO 2 a 37 ° C por 20 min para permitir que um pouco anexar à superfície do poço e estabelecer contatos celular. </li></ol> II. Eletrofusão <ol><li> Prepare tampão fosfato de potássio isoosomolar (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1mM MgCl 2, 250 mM de sacarose) e tampão fosfato de potássio hypoosmolar (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1mM MgCl 2, 75 mM de sacarose) . </li><li> Coloque a vários poços com células para a posição microscópio estágio, os eletrodos no fundo do poço e conectá-los ao gerador de pulsos. </li><li> Lavar as células com 1 ml de tampão fosfato de potássio isoosomolar. Adicionar 350 mL de tampão fosfato de potássio hypoosmolar a fim de induzir inchaço celular. O buffer deve cobrir os eletrodos. </li><li> Deixe células em tampão hypoosmolar por 2 minutos antes da aplicação de impulsos elétricos. Durante este tempo influxo de moléculas de água dentro das células devido ao desequilíbrio osmótico entre o interior eo exterior das células causar um aumento do volume celular. Pulsos elétricos devem ser aplicados quando as células estão perto do seu volume máximo, antes de começar a regulamentar o volume diminui. </li><li> Para alcançar eletrofusão ideal e manter a viabilidade celular, os parâmetros ideais de pulsos elétricos devem ser usados. Estes dependem de linha celular utilizada [1]. Neste experimento um trem de pulsos retangulares de 8 (cada uma com duração de 100 mS a 1 Hz) é aplicado a cada amostra, utilizando dispositivo de eletroporação (no nosso caso Cliniporator, IGEA, Itália). Os pulsos são entregues a duas paralelas eletrodos Pt / Ir fio com 0,8 mm de diâmetro e 5 mm de distância entre eles, criando um campo elétrico de aproximadamente 1200 V / cm entre os eletrodos em cada bem, exceto para o controle de poço. </li><li> Deixam as células sem ser perturbado por 10 minutos após a entrega de pulso. Determine o rendimento de fusão por meio de microscopia de contraste fluorescente e fase. </li></ol> III. Aquisição de imagem e determinação do rendimento de fusão <ol><li> As células são observados usando um microscópio de fluorescência (no nosso caso Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Alemanha) equipado com um objetivo (x20) e uma câmera CCD refrigerado (VisiCam 1280, Visitron, Alemanha). As imagens são adquiridas em Metamorph 7.1.1 (dispositivos Molecular, EUA), mas o software de aquisição semelhante também pode ser usado. CMFDA está animado com um monocromador (Polychrome IV, Visitron, Alemanha) a 492 nm e 548 nm no CMRA. A fluorescência de CMFDA e CMRA é adquirido através de dois filtros de emissão, um centrado em 535 nm (HQ535/30m, por CMFDA) e os outros centrada em 510 nm (D605/55m, para CMRA, tanto Chroma, EUA). O uso de espelho dicróico (Q515LP) impediu a conversa entre canais. </li><li> Adquirir três imagens (contraste de fase, fluorescência vermelha e verde) para cinco campos escolhidos aleatoriamente em cada poço. Criar três imagens de cada canal triplet imagem. Na imagem, citoplasma fluorescentes podem ser vistos em conjunto com as membranas celulares. Células fusionadas podem assim ser facilmente determinado [Figura 1]. </li><li> Contar todos os três tipos de células (vermelho, verde e duplamente fluorescente) em cada imagem do canal três. Determinar a porcentagem de células duplamente fluorescentes, dividindo o número de células duplamente fluorescentes com o número de todas as células em cada imagem. Rendimento de fusão é definida como a porcentagem de células duplamente fluorescentes multiplicado por 2 já que metade das células fundidas não são detectadas (quando as células do fusível da mesma cor). </li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1991/1991fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Três imagem de microscopia canal de B16F1 células após eletrofusão:. Contraste de fase, CMRA de fluorescência (excitação em 548 nm) e CMFDA de fluorescência (excitação a 492 nm), ampliação da objetiva 20x

<ol><li>Čemazar, M., Jarm, T., Miklavčič, D., Maček-Lebar, A., Ihan, A., Kopitar, N. A., Serša, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+electric-field+intensity+on+electropermeabilization+and+electrosensitivity+of+various+tumor-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Electro.+Magnetobiol%22%5BJournal%5D)">Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro.</a> Electro. Magnetobiol. 17, 263-272 (1998).</li>
<li>Trontelj, K., Reberšek, M., Kandušer, M., čurin šerbec, V., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+bulk+cell+electrofusion+in+vitro+for+production+of+human-mouse+heterohybridoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells.</a> Bioelectrochemistry. 74, 124-129 (2008).</li>
<li>Rols, M. -P., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+electrically+induced+permeabilization+and+fusion+of+Chinese+hamster+ovary+cells+by+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of electrically induced permeabilization and fusion of Chinese hamster ovary cells by osmotic pressure.</a> Biochemistry. 29, 4561-4567 (1990).</li>
<li>Neil, G., Zimmermann, U. Electrofusion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeil%2C+G+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 220, 174-196 Forthcoming.</li>
<li>Abidor, I. G., Li, L. -H., Hui, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+cell+pellets%3A+II.+Osmotic+properties%2C+electroporation%2C+and+related+phenomena%3A+Membrane+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Studies of cell pellets: II. Osmotic properties, electroporation, and related phenomena: Membrane interactions.</a> Biophysical journal. 67, 427-435 (1994).</li>
<li>Jaroszeski, M. J., Gilbert, R., Fallon, P. G., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+facilitated+cell-cell+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mechanically facilitated cell-cell electrofusion.</a> Biophys J. 67 (4), 1574-1581 (1994).</li>
<li>Ramos, C., Bonefant, D., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hybridization+by+electrofusion+on+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell hybridization by electrofusion on filters.</a> Analytical biochemistry. 302, 213-219 (2002).</li>
<li>Cao, Y., Yang, J., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+high-throughput+cell+electrofusion+in+a+microelectrode-array+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Study of high-throughput cell electrofusion in a microelectrode-array chip.</a> Microfluid Nanofluid. 5, 669-675 (2008).</li>
<li>Ušaj, M., Trontelj, M., Kandušer, M., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+size+dynamics+and+viability+of+cells+exposed+to+hypotonic+treatment+and+electroporation+for+electrofusion+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Radiol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cell size dynamics and viability of cells exposed to hypotonic treatment and electroporation for electrofusion optimization.</a> Radiol. Oncol. 43, 108-119 (2009).</li>
<li>Teissié, J., Ramos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+electric+field+pulse+induced+long-lived+permeabilization+and+fusogenicity+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Correlation between electric field pulse induced long-lived permeabilization and fusogenicity in cell membranes.</a> Biophys. J. 74, 1889-1898 (1998).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A capacidade das membranas celulares para fundir não especificamente, por exemplo, por campos elétricos externos, é importante para a medicina, biotecnologia e pesquisa em biologia. Fusão inespecíficos como permite a produção de grande valor células híbridas e seus produtos, tais como anticorpos monoclonais, e fornece informações sobre os mecanismos fundamentais de fusão [2]. Eletrofusão é um método muito eficaz, já que pode ser devidamente ajustada para diferentes tipos de células. Eletrofusão é alcançado quando as células em contato físico são trazidos para seu estado fusogenic (propenso a fusão), por meio de pulsos de alta tensão elétrica. A eficiência de eletrofusão depende de vários parâmetros que afetam duas partes do processo de eletrofusão. Primeira parte do processo de eletrofusão é realização do contato físico entre as células, que pode ser obtido com diferentes métodos [3-8]. Método de aderência (células de crescimento de confluência) pode ser usado de forma eficiente, devido aos contatos célula espontaneamente estabelecido nas zonas de grande entre as células, no entanto, produz muito grandes células com núcleos fundidos muitos. Estamos usando o método modificado adesão, onde as células mais pequenas (com 2-5 núcleos), que são mais propensos a sobreviver e proliferar, são obtidos (Figura 1). Contato entre as células também se beneficiam com inchaço osmótica das células, devido ao tratamento osmótico utilizado no experimento [9]. Segunda parte do processo de eletrofusão é a realização do Estado fusogenic das membranas celulares. Estado Fusogenic se correlaciona bem com o estado electropermeabilized da membrana (células não são especificamente permeabilizadas de moléculas que normalmente não podem passar através da membrana intacta) e é regida pelos mesmos parâmetros dos pulsos elétricos (amplitude, número, comprimento e freqüência) [10] . Os valores dos parâmetros elétricos necessários para o eletroporação ideal [1] e eletrofusão diferem entre diferentes células e dependem de células tamanho e suas propriedades biológicas. Parâmetros elétricos, portanto, precisam ser otimizadas para diferentes linhagens celulares, que são usados ​​como parceiros de fusão, a obtenção de fusão.

<table><tbody><tr><td>CMRA</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>C34551</td><td>Corante fluorescente citosólico</td></tr><tr><td>CMFDA</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td>Corante fluorescente citosólico</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM </td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modificado de Eagle&amp;rsquo;meio s</td></tr><tr><td>soro fetal bovino</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>crystacilina</td><td>Reagente</td><td>Pliva</td><td>625110</td><td>antibiótico</td></tr><tr><td>gentamicina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>antibiótico</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reagente</td><td>Merck &amp;& Cia., Inc.</td><td>A124873 927</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4248</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reagente</td><td>Fluka</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Reagente</td><td>Merck &amp;& Cia., Inc.</td><td>A154336 908</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>sacarose</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>Gerador de pulsos elétricos</td><td>Ferramenta</td><td>IGEA</td><td></td><td>Cliniporator VITAE</td></tr><tr><td>Placa de múltiplos poços</td><td>Ferramenta</td><td>Techno Plastic Products</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga de 50 ml</td><td>Ferramenta</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga de 15 ml</td><td>Ferramenta</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; frasco de cultura</td><td>Ferramenta</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodos</td><td>Ferramenta</td><td>Personalizado</td><td></td><td>Pt/Ir</td></tr></tbody></table>

electrosoldável célula visualizado com microscopia de fluorescência

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Eletrofusão celular é um método seguro e não-virais e não-químicas que podem ser usados ​​para preparar células híbridas para terapia humana. Eletrofusão consiste na aplicação de curto pulsos de alta voltagem elétrica para as células que estão em contato próximo. Aplicação de curto, pulsos de alta tensão elétrica provoca desestabilização da membrana plasmática celular. Membranas desestabilizado são mais permeáveis ​​para moléculas diferentes e também propenso à fusão com qualquer membranas vizinhas desestabilizadas. Eletrofusão é, portanto, um método conveniente para alcançar uma fusão não-específicos de células muito diferentes<em&gt; In vitro</em&gt;. A fim de obter membranas de fusão, celular, desestabilizado por campo elétrico, deve estar em contato próximo para permitir a fusão de suas bicamadas lipídicas e, conseqüentemente, seu citoplasma. Neste vídeo, demonstramos eletrofusão eficiente de células<em&gt; In vitro</em&gt; Por meio do método de adesão modificado. Neste método, as células podem se conectar apenas ligeiramente à superfície do poço, de modo que o meio pode ser trocado e as células conservam a sua forma esférica. Visualização de fusão é avaliada pela rotulagem de pré-citoplasma de células com diferentes corantes fluorescentes rastreador celular; metade das células são rotulados com laranja CMRA ea outra metade com o verde CMFDA. Rendimento de fusão é determinada como o número de células fluorescentes duplamente dividida com o número de todas as células, multiplicado por dois.

Neste vídeo demonstramos eletrofusão eficiente de células<em&gt; In vitro</em&gt; Por meio do método de adesão modificados utilizando eletroporação ea detecção posterior de visualização células fundidas com microscopia de fluorescência.

Electrosoldável célula visualizado com microscopia de fluorescência

A eletrofusão celular é um método seguro, não viral e não químico que pode ser utilizado para a preparação de células híbridas para terapia humana. A eletrofusão envolve...

A eletrofusão envolve a aplicação de pulsos elétricos curtos e de alta voltagem em células em contato próximo. Neste vídeo, demonstramos a eletrofusão de células in vitro por meio do Método de Adesão modificado. Os experimentos foram realizados com células de melanoma de camundongo, BF um.Para o experimento, siga estes passos. Cultive células em dois frascos de cultura separados até atingirem 80% de confluência. Separadamente, adicione 2,1 microlitros de cada solução estoque.10 milimolar de C-M-F-D-A ou CMRA, respectivamente, em três mililitros de tampão Krebs Hess em um tubo de centrífuga. Lave as células duas vezes com tampão Krebs Hess e, em seguida, adicione as soluções de carregamento aos frascos. As soluções de carregamento contêm aproximadamente sete micromolar de C-M-F-D-A ou CMRA, respectivamente.Incube as células por 30 minutos em uma atmosfera controlada. Durante esta primeira incubação, as regiões passam livremente através das membranas celulares para o citosol, onde são transformadas em produtos de reação permeáveis à membrana IMP. Após esta primeira incubação, lave e, em seguida, incube as células com meio de cultura por mais duas horas.As células são observadas utilizando um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera CCD refrigerada no software de aquisição. Ajuste o comprimento de onda de excitação para 548 nanômetros e escolha um filtro de passagem de banda apropriado para a imagem de fluorescência das células carregadas com CMRA para as células carregadas com C-M-F-D-A. Ajuste o comprimento de onda de excitação para 492 nanômetros e escolha um filtro de passagem de banda para a imagem de fluorescência verde dos olhos de tripsina e conte as células em ambos os frascos, misturando as células vermelhas e verdes em uma proporção de um para um; ajuste a concentração celular para 5 milhões de células por mililitro.Coloque uma gota de 20 microlitros de suspensão celular no centro de cada poço. Em uma placa de 24 poços, incube as células em atmosfera controlada por 20 minutos para permitir que as células adiram levemente à superfície do poço em uma monocamada e estabeleçam contatos celulares entre si. Coloque a placa com as células sobre a platina do microscópio.Posicione os eletrodos na parte inferior do poço e conecte-os ao gerador de pulsos. Para obter uma eletrofusão ideal e manter a viabilidade celular, devem ser utilizados parâmetros adequados de pulsos elétricos. Esses parâmetros dependem da linhagem celular e devem ser determinados em experimentos preliminares. Remova o meio de cultura e lave as células com um mililitro de tampão fosfato de potássio ISO omu em 350 microlitros de tampão fosfato de potássio hypos Miller, a fim de induzir o inchaço celular.Deixe as células em tampão hiperosmótico por dois minutos antes de aplicar os pulsos elétricos. Os pulsos elétricos devem ser aplicados quando as células estiverem próximas aos seus volumes máximos, ou seja, antes de iniciarem a regulação do volume.Diminuição em nosso experimento. Uma série de oito pulsos retangulares com duração de 100 microssegundos a um hertz foi aplicada. Após a entrega do pulso.Deixe as células indisturbadas por 10 minutos após 10 minutos. Determine o rendimento de difusão por meio de microscopia de contraste de fase e fluorescência. E adquira três imagens, contraste de fase, fluorescência vermelha e verde, em cinco campos de visão escolhidos aleatoriamente.Em cada um, criaremos imagens de três canais a partir de cada tríade de imagens no software ImageJ, a fim de melhorar a qualidade visual das imagens para que etapas de pré-processamento possam ser aplicadas às imagens originais, como subtração de fundo e realce de contraste com conjuntos de parâmetros padrão. Por fim, as imagens de três canais são compostas utilizando o plugin RGB para cinza do ImageJ. Nessa imagem, o citoplasma em repouso pode ser observado juntamente com as membranas celulares.Assim, poucas células podem ser facilmente identificadas na contagem de imagens de três canais, que inclui os três tipos de células: vermelhas, verdes e duplamente fluorescentes. Determine a porcentagem de células duplamente fluorescentes dividindo o número de células duplamente fluorescentes pelo número total de células em cada imagem. O rendimento de fusão é então definido como a porcentagem de células duplamente fluorescentes multiplicada por dois.Como metade das células de visualização não é detectada quando as visualizações são de células da mesma cor.

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