Name: Culturas primárias neuronais do cérebro de Tarde Stage Drosophila pupas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Aprenda a preparar culturas primárias neuronais do cérebro de pupas de Drosophila em estágio tardio. Este método demonstra crescimento de neuritos e imagem de cálcio para estudar desenvolvimento neural.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH para conceder NS27501 DKOD. Suporte adicional para este trabalho foi fornecida por uma concessão para a UC Irvine em apoio DKOD através do Programa Professor HHMI.

Preparações antes do dia da cultura: <ol><li> Fazer a solução de dissecar estéril. </li><li> Faça DMEM estéril e manter em alíquotas de 10 ml a 4 ° C por 2 semanas. </li><li> Tornar estéril DDM2 suplementos e congelar em 50 ou 100 mL alíquotas de 1 mês. </li><li> Faça ConA / laminina. </li><li> Lamínulas casaco. Opcional: Faça CNBM estéril e armazenar congelado por até 4 meses. </li></ol> No dia da cultura I. Preparar solução enzimática (ES), em capela de fluxo laminar <ol><li> Coloque 5 ml de solução de dissecação (DS) em um tubo de centrífuga de 15 ml. </li><li> Pesar 0,8 mg de L-cisteína em um eppendorf 0,6 ml e adicionar 150 mL de DS. Pipeta para cima e para baixo até que os cristais são ido. </li><li> Adicione 150 ml de DS / Cisteína aos 5 DS ml e misture bem. </li><li> Adicionar 50 U (unidades) de papaína. </li><li> Adicionar 7 ml de 0,1 N Na OH e misture bem. Solução clara dentro de 30 min. quando ativado. </li><li> Solução enzimática de filtro com 0,2 milímetros filtro de seringa de 1,5 ml em um tubo de microcentrífuga estéril parafuso cap Papaína: Quer 50 U em 5 ml DS. Cada lote é um pouco diferente, por isso deve calcular quanto: 37,3 mg / ml e 28,3 U / mg 37,3 x 28,3 = 1055,59 U / ml (1000 ml) 50 U = 47,4 ml </li></ol> II. Faça DDM2 media No dia da cultura: adicione os seguintes suplementos para fazer DDM2 A 10 ml de DMEM adicionar os suplementos, pouco antes de cultivo: <ol><li> 100μl Transferrina </li><li> 100μl Putrescine </li><li> 100μl Selenium </li><li> Progesterona 100μl </li><li> Insulina 50μl </li><li> 10μl 20-Hydroxyecdysone </li></ol> Nota: Faça o suficiente para todas as culturas DDM2 planejado (cada cérebro banhado em uma lamela em um único prato de 35 milímetros individuais Petri, 1,5 ms dos meios de comunicação / cultura) Etapa III-VI pode estar em uma bancada de laboratório feito não estéreis e devem ser concluídas em 45 minutos ou menos. III. Pupas Colecção <ol><li> Selecione 15/10 pupas de lados do frasco com um microscópio de dissecação. </li><li> Pupas lugar na tampa de um prato de 35 milímetros seco Petri. </li></ol> Nota: Nós usamos geralmente cérebros de pupas entre 55-78 horas após a formação pupário (APF). É ligeiramente mais difícil de dissecar o cérebro dos mais jovens pupas, as cápsulas cabeça tendem a entrar em colapso, enquanto o nível geral de crescimento de neuritos é ligeiramente mais baixa desde o mais velho pupas. Na cepa do tipo selvagem Canton-S, estes estágios são reconhecidos pelos olhos que são pigmentadas castanho claro a ligeiramente avermelhado, com pouco pigmento em outros lugares. IV. Decapitação sob microscópio de dissecação <ol><li> Coloque duas gotas de solução estéril em dissecar tampa da placa de Petri, ao lado de pupas. </li><li> Suavemente realizar uma única pupa com uma pinça fina na mão esquerda e usar um medidor de 27 agulha da seringa conectada a uma seringa cc 1 na mão direita para remover a cutícula na extremidade anterior de pupa. </li><li> Squeeze pupa ligeiramente com uma pinça e emerge como chefe use agulha de calibre 27 para cortar o pescoço. </li><li> Com a ponta da agulha ou a pinça, a transferência de cabeça para queda de dissecar solução. </li><li> Repita até que você tenha 10-15 cabeças em uma única gota. </li></ol> V. A remoção do cérebro de cabeça sob microscópio de dissecação <ol><li> Em cada mão segurar uma seringa de 1 cc com uma agulha de calibre 27. </li><li> Use-os para a posição da cabeça voar em uma gota de solução para dissecar a probóscide é voltado para você ea superfície dorsal da cabeça é o norte. </li><li> Inserir a agulha esquerda para a probóscide para fixar a cabeça para baixo e use a agulha direita para fazer uma fenda no olho direito que vai da superfície ventral para dorsal. </li><li> Inserir a agulha direita perto do lado esquerdo na região da tromba e depois usar a agulha esquerda para a acione a cutícula sobre o olho esquerdo, empurrando o cérebro na direção da fenda no olho direito. O cérebro deve emergir da fenda do lado direito, relativamente intacta, muitas vezes com ambos eis ópticabes ainda ligado e por vezes, o tecido ocular, bem pigmentada. </li><li> Empurrar o cérebro na parte traseira da agulha e transfira para uma gota de solução salina estéril em dissecar um novo estéril 35 mm, placa de Petri. </li><li> Coletar 15/10 cérebros para cada genótipo. </li></ol> VI. Remoção dos lobos óptica e tratamento enzimático <ol><li> Em cada mão segurar uma seringa de 1 cc com uma agulha de calibre 27 e usá-los para coletar todos os cérebros em uma pequena área da gota de solução de dissecação </li><li> Use seringas como ferramentas de corte para remover os lobos ótica de cada um cérebro de modo que o tecido remanescente para a cultura é a região do cérebro central. </li><li> Use um Pipetman 20 l, fixado em 5 mL, para transferir todos os cérebros de um genótipo único para um tubo eppendorf contendo 1 ml de solução de papaína estéril. </li><li> Cérebros incubadas em papaína por 10-15 minutos em um conjunto rotador em 60 rpm. </li><li> Centrifugar a 3000 rpm por 3 minutos. </li></ol> Dentro capô estéril de fluxo laminar - todas as etapas onde o tecido é exposto ao ar deve ser feito em capela de fluxo laminar para as etapas restantes. VII. Lavagem <ol><li> Remover e substituir solução enzimática com solução estéril de dissecação. </li><li> Centrifugar a 3000 rpm por 3 minutos. </li><li> Lave com uma solução estéril dissecar um total de 3 vezes. </li><li> Remover salina dissecar e substituir com DDM2. </li><li> Centrifugar e lavar um total de 2 vezes com DDM2. </li><li> Transferência de cérebros e de mídia para um prato de 35 milímetros estéril Petri. </li></ol> VIII. Trituração e Plating sob microscópio de dissecação <ol><li> Lugar de 5 ul DDM2 no centro de uma lamela. </li><li> Transferência de um cérebro para essa queda de DDM2 com uma ponta amarela. </li><li> Sob o microscópio, use 27 agulhas de dados até o cérebro em pedaços pequenos (devem ter &lt;1 minuto). </li><li> Sob a orientação visual, quebrar a ponta de uma pipeta de vidro que foi puxado para uma ponta fina para que as peças maiores podem ser delicadamente sugado para a ponta da pipeta e expulsos de volta para o meio. Usamos tubos de boca de sucção que vêm de fábrica com 100 mL de vidro hematócrito capilar. Nota: Tome cuidado para não ficar bolhas na mídia e você precisará determinar empiricamente a pipeta melhor tamanho para usar. Bons permitem dissociar o cérebro com algumas células individuais e ainda algumas grandes aglomerações, em cerca de 30 segundos / cérebro. Quando você olha para estes em maior potência, aproximadamente 10-20% dos neurônios ainda deve ter alguns processos remanescentes e ainda haverá alguns grandes aglomerações. Se você dissociar demais, então todas as células serão rodada e terão sofrido danos tanto que eles não vão sobreviver. Esta etapa requer prática e deve ser feito rapidamente, pois há uma relação superfície-volume grande ea osmolalidade e pH da gota de DDM2 podem mudar rapidamente. Tecido precisa ser colocado em incubadora de CO 2 o mais rápido possível. </li><li> Escrever sobre a tampa placa de Petri: &quot;O genótipo, data e hora&quot;. </li><li> Coloque a placa de Petri 35 milímetros em um prato de 100 milímetros de Petri (com kimwipe molhado) e deixe se instalar na incubadora de CO 2 por 30 min. </li><li> Inundar o prato de 35 mm com 1,5 ml de DDM2. </li><li> Manter culturas na incubadora a 5% incubadora de CO 2 (23 ° C). Nota: Se você não tem acesso a um resfriamento incubadora de CO 2, use um padrão de cultura de tecidos de mamíferos incubadora e quer colocá-lo em uma sala fria e calor a 23 ° C, ou colocar no laboratório, desligue temp, e usar gelo em uma bandeja na parte inferior da incubadora para regular a temperatura em torno de ambiente. </li></ol> IX. Células de alimentação <ol><li> No 1 º dia (dia seguinte), adicionar 0,5 ml de CNBM/B27 (Media condicionado) para fazer 03:01 DDM2: CNBM/B27. </li><li> No dia 5 substituir 1 ml de mídia para 03:01 DDM2: CNBM/B27. </li><li> Manter as células de alimentação com 03:01 DDM2: CNBM/B27 cada 4-5 dias. Nota: As culturas podem ser cultivadas sem a mídia não-neuronal condicionado, mas os neurônios parecem um pouco mais frágil e são mais difíceis para uso em experimentos de eletrofisiologia. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. (1991).</li>
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<li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J. Neurophysiol. 94, 491-500 (2005).</li>
<li>Campusano, J. M., Su, H., Jiang, S. A., Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nAChR-mediated+calcium+responses+and+plasticity+in+Drosophila+Kenyon+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">nAChR-mediated calcium responses and plasticity in Drosophila Kenyon cells.</a> Develop Neurobiol. 67, 1520-1532 (2007).</li>
<li>Oh, H. -W., Campusano, J. M., Hilgenberg, L. G. W., Sun, X., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+chemical+synapses+and+gap+junctions+between+Drosophila+brain+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of chemical synapses and gap junctions between Drosophila brain neurons in culture.</a> Develop Neurobiol. , (2007).</li>
</ol>

Neurônios colhidos os cérebros de roedores embrionárias / pós-natal podem ser cultivadas em cultura de células primária onde se estendem neurites e formam conexões sinápticas funcionais. Métodos para a preparação dessas culturas estão bem estabelecidas e estudos em culturas de roedores neuronal têm desempenhado um papel fundamental na identificação de genes e fatores ambientais envolvidos na regulação da formação de sinapses e função (Banker e Goslin, 1991). Enquanto os neurônios do inseto a partir de uma variedade de espécies também podem ...

Lamelas revestimento: Coloque lamínulas autoclavado numa placa de Petri 60 mm. Ul pipeta 5 de Con A / mix laminina em centro de cada lamela. Lugar em 37 C incubadora por 2 horas. Enxágüe lamínulas 3x com 100 ul de água autoclavada cada. Use a vácuo ligado a uma pipeta Pasteur estéril. Durante o último enxaguamento, pegar a lamela com uma pinça e seco ambos os lados. Transferência a lamela e uma placa de Petri de 35mm. Conservar à temperatura ambiente por até um mês.

culturas primárias neuronais do cérebro de tarde stage drosophila pupas

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

Neste vídeo, demonstramos a preparação de culturas primárias de neurônios do cérebro de final de estágio Drosophila pupas. O procedimento começa com a remoção dos cérebros de animais em 70-78 horas após a formação pupário. Os cérebros isolados são mostrados após incubação em breve papaína seguido por várias lavagens em soro livre de meio de crescimento. O processo de dissociação mecânica de cada cérebro em uma queda de 5 ul de mídia em uma lamela é ilustrado. Os axônios e dendritos dos neurônios pós-mitóticas são cisalhado off perto da soma durante a dissociação, mas os neurônios começam a regenerar os processos dentro de algumas horas de placas. Imagens mostram culturas vivas em dois dias. Neurônios continuar a desenvolver processos durante a primeira semana de cultura. Populações neuronais específicas podem ser identificadas em cultura usando GAL4 linhas a dirigir expressão tecido específico de marcadores fluorescentes, como GFP ou RFP. Gravações de células inteiras têm demonstrado que os neurônios cultivados forma funcional, espontaneamente ativa sinapses colinérgicas e GABAérgica. Um segmento pequeno vídeo ilustra a dinâmica do cálcio nos neurônios cultivados usando Fura-2 como um corante indicador de cálcio para monitorar transientes de cálcio espontânea e nicotina respostas evocadas de cálcio em um prato de neurônios cultivados. Estas culturas cérebro pupal são um sistema modelo útil em que as ferramentas genéticas e farmacológicas podem ser usados ​​para identificar os fatores intrínsecos e extrínsecos que influenciam a formação ea função de sinapses central.

Este vídeo demonstra a preparação de culturas primárias de neurônios do cérebro de final de estágio Drosophila pupas. Pontos de vista de culturas vivas mostram crescimento de neuritos e imagem dos níveis de cálcio usando Fura-2.

Culturas primárias neuronais do cérebro de Tarde Stage Drosophila pupas

Neste vídeo, demonstramos a preparação de culturas neuronais primárias a partir de cérebros de pupas de Drosophila em estágio tardio. O procedimento começa com o...

Meu nome é Diana Dowd e sou professora nos departamentos de Anatomia e Neurobiologia e Biologia do Desenvolvimento e Celular aqui na UC Irvine. Hoje vou falar sobre o preparo de culturas neuronais a partir de pupas de Drosophila. Isso envolve a remoção do cérebro de pupas em estágio avançado, e geralmente cultivamos apenas a região do cérebro central.E nesta fase, as principais estruturas anatômicas presentes no cérebro adulto já estão formadas. Isso inclui os lobos antenais, onde há neurônios projetores que enviam seus axônios até a região do corpo pedunculado e os neurônios do corpo pedunculado, as células de Kenyon, que enviaram seus axônios até os neurônios-alvo através dos lobos alfa, beta e gama. No dia do cultivo, a primeira coisa que fazemos é entrar na câmara de fluxo laminar e preparar, de forma estéril, a solução enzimática que será usada para dissociar o tecido.E também preparamos o meio que vamos usar para cultivar as células. Este meio é feito a partir de hastes que preparamos previamente. O próximo passo é coletar as pupas que vamos usar para essa dissociação ou para a dissecação.E isso é feito fora da câmara de fluxo laminar porque estes são cultivados em frascos que contêm levedura e todo tipo de outras substâncias. Portanto, realizamos as etapas iniciais de nossa dissecação fora da câmara de fluxo laminar. Estes são peepee que acabei de retirar das laterais de um frasco, e nesta fileira à esquerda temos animais com olhos vermelhos e que estão em um bom estágio para cultivo.Estes são ligeiramente mais jovens, esses PPP aqui são um pouco mais novos. Eles têm olhos laranja ou amarelos, e esta é uma linhagem 1 0 7 aceitável. Eles possuem olhos ligeiramente mais brilhantes do que os tipos selvagens comuns, nos quais a cor nesses estágios seria um pouco mais marrom.Todas essas etapas são adequadas para o cultivo, para produzir culturas cerebrais. Ok, o primeiro passo aqui é colocar algumas gotas de solução de dissecação bem ao lado das pupas que retirei e alinhei na minha placa de Petri. Utilizamos as tampas de placas de Petri de 35 milímetros.Em seguida, pego um par de pin&ccedil;as n&uacute;mero cinco na m&atilde;o esquerda e uma seringa de tuberculina de um CC com agulha de calibre 27 na ponta. Essas s&atilde;o minhas duas ferramentas de disseca&ccedil;&atilde;o. Para remover a cabe&ccedil;a do caso do pupilo ou do pupi, basicamente preciso usar a pin&ccedil;a: seguro o pupi com a pin&ccedil;a na m&atilde;o esquerda e ent&atilde;o uso a agulha na m&atilde;o direita para remover a parte frontal do caso do pupilo.Em seguida, puxo para trás a cutícula de revestimento e a cabeça sai pela frente. Uso então minha agulha para seccionar o I na região do pescoço e pego a cabeça, colocando-a na gota de salina de dissecação. Repetirei este procedimento de 10 a 15 vezes, pois, para obter uma boa cultura, gosto de ter de 10 a 15 animais de cada genótipo.Tudo bem, vou remover o cérebro da cabeça do animal. Para isso, utilizo duas seringas tuberculínicas, cada uma com uma agulha de 27 graus. A agulha esquerda é colocada diretamente através do psis do animal para fixar a cabeça ao fundo da placa de Petri.Em seguida, uso minha agulha direita para abrir uma fenda no lado direito, e é aí que vou empurrar o cérebro para fora. Ok, e o próximo passo é colocar minha agulha esquerda sobre o olho esquerdo. Agora vou realmente empurrar para fora, e o cérebro deve sair pelo lado direito através da fenda.Aqui está. Você pode vê-lo no lado direito, e agora posso usar minha agulha direita para separá-lo do restante da cápsula cefálica e dos olhos. Pronto. Agora, antes de realizar a dissecção final, que consiste na remoção dos lobos ópticos, transfiro o cérebro para uma gota limpa de solução salina.Posso usar uma pipeta automática para fazer isso, pegando-a na ponta de uma pipeta de 20 microlitros, ajustada em cinco microlitros, ou posso transferi-la diretamente nas agulhas também. Esta é a última etapa do procedimento de dissecação. É realizada em uma nova gota de solução salina, e geralmente haveria cerca de 10 a 15 cérebros aqui.Em seguida, removo os lóbulos ópticos de cada um utilizando agulhas de 27 gauge como ferramentas de corte, cortando primeiramente o lóbulo óptico esquerdo e depois o lóbulo óptico direito em cada cérebro. Neste momento, todos os cérebros que foram processados dessa maneira serão transferidos para um tubo contendo a solução enzimática, que será utilizada para a dissociação enzimática. Todos os cérebros de um único genótipo são colocados em um único tubo epi com tampa de rosca que contém um mililitro da solução enzimática.Em seguida, colocamos simplesmente em um suporte para tubos de ensaio e os colocamos em um rotador, onde permanecem por 10 a 15 minutos à temperatura ambiente. Esse é o tempo real de dissociação. Para concluir a etapa de dissociação da enzima, precisamos efetivamente remover a enzima.Então levamos os tubos para uma centrífuga EOR, colocamos os tubos na centrífuga e vamos centrifugar por três minutos a 3000 RPM. Após centrifugar os cérebros, levamos-nos agora para nossa cabine de fluxo laminar. É aqui que começa a parte estéril do procedimento.Agora não abrimos o tubo a menos que estejamos na cabine de fluxo laminar, e removeremos a solução enzimática. Vamos substituí-la pela solução de dissecação e, em seguida, centrifugaremos e lavaremos várias vezes com a solução de dissecação, terminando com um meio Definido, que é o meio no qual cultivamos as células. Muito bem.A primeira coisa que preciso fazer aqui é colocar uma gota de cinco microlitros de solução salina em cada lamínula que tenho nestas placas de Petri. Há uma única lamínula por placa de Petri, e ela foi revestida com con a laminina; portanto, coloco uma gota de cinco microlitros exatamente no centro da lamínula. É aí que está minha gota de laminina.É muito importante porque você quer concentrar suas células exatamente no centro do campo, já que obtemos cerca de 10.000 células por cérebro, e é isso que utilizamos para fazer uma cultura única. Ok, então observando pelo microscópio, aqui estão nove cérebros que já passaram pelo procedimento de dissociação enzimática. Você pode ver que ainda estão bastante intactos.Eles não têm seus lobos ópticos. Eles foram removidos, mas temos apenas a região do cérebro central e agora vou pipetar um único cérebro e transferi-lo para a gota de cinco microlitros sobre uma lamínula. E faço isso quatro vezes.Eu pego duas seringas de um CC com agulhas de 27 graus. Novamente, é muito importante observar que essas são ferramentas de dissecação muito baratas e descartáveis, de modo que estudantes de graduação podem realizá-las sem se preocupar com o orçamento. Ok, agora tenho as duas agulhas e vou realizar a dissociação mecânica inicial, que consiste em cortar este cérebro em vários pedaços, o que me permitirá aspirar esses fragmentos para dentro de uma pipeta de vidro em apenas um minuto para completar a dissociação final.Quando faço isso, não os reduzo a pedaços minúsculos; apenas quero diminuir o tamanho total para que eu consiga obter um pouco de tecido, de modo que a pipeta, durante a dissociação, aspire pedaços ligeiramente menores do que o cérebro inteiro. Também quero fazer isso relativamente rápido porque vejo que as gotas do meio são pequenas. Isso significa que temos uma alta relação superfície/volume, e tanto o pH quanto a osmolaridade da solução podem mudar se eu deixá-la exposta por qualquer período de tempo.Quando eu comecei a fazer isso, eu realmente fazia apenas dois cérebros por vez, duas culturas por vez. Agora eu geralmente faço quatro, e agora vou quebrar a pipeta, mas não posso falar sobre isso nem nada, certo? Esta aqui eu acabei de finalizar.A dissociação, o tamanho da pipeta estava bem adequado. Consegui aspirar o tecido para cima e para baixo algumas vezes, e é possível observar células individuais; ainda temos agregados, mas isso é normal. Eles serão removidos na lavagem.Agora, as culturas, assim que são semeadas, são colocadas em uma segunda placa de Petri e introduzidas no incubador de CO2 em poucos minutos, pois queremos garantir que o pH e a osmolaridade sejam mantidos em níveis que suportem sua sobrevivência. Assim, deixamos-nas aqui por 30 minutos antes de inundar a placa. Essas culturas foram preparadas a partir dos cérebros de pupas em estágio avançado.O cultivo foi mantido por dois dias em uma incubadora de CO2, e é possível observar células individuais que desenvolveram prolongamentos. O grau de elaboração dos prolongamentos é menor do que o observado em cinco dias e maior do que o observado em um dia. Meu nome é Jorge Ano.Eu trabalho no laboratório Doubts. Vou mostrar agora como realizamos o experimento, o experimento de imagem de cálcio em culturas celulares que acabamos de preparar. Este é um vídeo de um experimento de imagem de cálcio no qual você vê células azuis indicando baixos níveis de cálcio e células vermelhas indicando altos níveis de cálcio.Veremos que há algumas células que ficam vermelhas, indicando o aumento dos níveis intracelulares de cálcio. Esses aumentos são espontâneos e transitórios. Com o tempo, os níveis voltam aos valores basais de cálcio, e após certo período, aplicaremos uma droga, neste caso nicotina, e você observará que as células aumentam os níveis intracelulares de cálcio.Aplicamos nicotina por 100 segundos, depois removemos a nicotina e, em seguida, as células retornam aos níveis basais de cálcio. Assim, a verdadeira vantagem desse sistema de cultura é que somos capazes de preparar nossas culturas a partir de linhagens transgênicas e mutantes de moscas, diferentes entre si, nas quais subpopulações distintas de neurônios são marcadas com GFP. Este é o cérebro de uma das linhagens que utilizamos, na qual o GFP é expresso no corpo pedunculado, nas células de Kenyon, neurônios envolvidos na mediação de comportamentos complexos, incluindo aprendizado e memória.Os corpos celulares estão localizados na região dorsal do cérebro, aproximadamente na área onde estão as setas vermelhas. E essas estruturas em forma de L que são positivas para GFP são, na verdade, as projeções axônicas dessas células de Kenyon do corpo pedunculado. Após a dissociação desse tecido cerebral.Os neurônios regeneram seus processos em cultura, e você pode identificar facilmente as células quenianas positivas para GFP neste caso. Essas células são acessíveis tanto para gravações eletrofisiológicas padrão quanto para estudos de imagem de cálcio. Portanto, essas culturas são ferramentas realmente úteis para explorar os fatores genéticos e ambientais importantes na regulação da função de neurônios que sabemos serem importantes na mediação de comportamentos complexos no animal adulto.

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Biologia

Este vídeo demonstra a preparação de culturas primárias de neurônios a partir de embriões midgastrula estágio Drosophila. Pontos de vista de culturas vivas mostram as células de 1 hora após o plaqueamento e neurônios diferenciados após 2 dias de crescimento em um meio de bicarbonato baseado definido. Os neurônios são eletricamente excitáveis ​​e formam conexões sinápticas.

Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila

Este artigo descreve um método pelo qual se pode...

A cultura Ex vivo de todo, o desenvolvimento cerebral de Drosophila

Este vídeo demonstra um protocolo para identificar fatores exógenos que iniciam a reativação das células-tronco neurais cerebrais da Drosophila de seu estado quiescente. As larvas recém-eclodidas são dissecadas para isolar seus cérebros, que são então cultivados em meio com ou sem um hormônio de teste para avaliar o potencial do hormônio para induzir a reativação e proliferação de células-tronco neurais.

Analisando a reativação de células-tronco neurais em explantes cerebrais de Drosophila cultivados

Um paradigma lesão utilizando a Drosophila larval cordão nervoso ventral para investigar a regeneração do sistema nervoso central e de reparação é descrito. Stabbing seguido por varredura a laser microscopia confocal em amostras de lapso de tempo e fixa, combinada com a análise quantitativa, com software desenvolvido propositadamente e genética, são utilizados para investigar os mecanismos moleculares do CNS regeneração e reparo.

Um Paradigma para Investigar Lesão de reparação do sistema nervoso central em<em&gt; Drosophila</em

Células Drosophila S2 e neurônios cultivados são grandes sistemas para a imagem latente de transporte organela motorizado in vivo. Aqui nós descrevemos protocolos detalhados para o cultivo de ambos os tipos de células, a sua imagem e análise de transporte.

Transporte Organelle em Cultivadas Drosophila Células: Linha celular S2 e primário neurônios.

A imunocoloração é uma técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células e proteínas dentro dos tecidos. Ao utilizar a sonicação, o protocolo descrito aqui alivia a necessidade de dissecar tecidos de Drosophila melanogaster de embriões e larvas em estágio avançado antes da imunocoloração. Fornecemos uma metodologia eficiente para a imunocoloração de larvas de montagem inteira fixadas em formaldeído.

Facilitou-Sonication Imunofluorescência Coloração de Late-estágio embrionário e larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos<em&gt; In Situ</em

Este protocolo detalha um método simplificado utilizado para conduzir imagem de células vivas, no contexto de um cérebro de larvas intacta. Abordagens imagens de células vivas são de valor inestimável para o estudo de células-tronco neurais divisões assimétricas, bem como outros processos neurogênicas e de desenvolvimento, de forma consistente descobrir mecanismos que anteriormente eram negligenciados.

Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larval Neuroblastos

Este protocolo descreve a dissecção e imunocoloração de adultos Drosophila melanogaster tecidos do cérebro. Especificamente, este protocolo destaca o uso da Drosophila cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios como subconjuntos neuronal de exemplo que podem ser usados com precisão para descobrir princípios gerais subjacentes a muitos aspectos do desenvolvimento neuronal.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

O objetivo do presente protocolo é estabelecer ex vivo da drosófila cultura larval cérebro otimizada para monitorar circadianos ritmos moleculares com imagem de lapso de tempo a longo prazo da fluorescência. A aplicação deste método de ensaios farmacológicos também é discutida.

Fluorescência de célula única resolução vivo Imaging de Drosophila relógios circadianos em cultura cérebro Larval

Este artigo fornece protocolos detalhados para infligir Lesão Cerebral Traumática Penetrante (PTBI) à Drosophila adulta e examinar a neurogênese resultante.

Estimulando e analisando neurogênese adulta no cérebro central de Drosophila

Um método para reativar células-tronco neurais quiescentes em explantas cerebrais de Drosophila cultivadas foi estabelecido. Usando este método, o papel dos sinais sistêmicos pode ser desacoplado a partir de sinais intrínsecos teciduais na regulação da quiescência de células-tronco neurais, entrada e saída.

Reativação de células-tronco neurais em explantes cerebrais de Drosophila cultivadas

Aprenda a preparar culturas primárias neuronais do cérebro de pupas de Drosophila em estágio tardio. Este método demonstra crescimento de neuritos e imagem de cálcio para estudar desenvolvimento neural.

Culturas primárias neuronais do cérebro de Tarde Stage Drosophila pupas

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