Culturas primárias neuronais do cérebro de Tarde Stage Drosophila pupas

Meu nome é Diana Dowd e sou professora nos departamentos de Anatomia e Neurobiologia e biologia celular e do desenvolvimento aqui na UC Irvine. Hoje vou falar sobre a preparação de culturas neuronais de Drosophila Pupi. Isso envolve a remoção do cérebro de pupi em estágio avançado e geralmente cultivamos apenas a região central do cérebro.

E nesta fase, as principais estruturas anatômicas que estão presentes no cérebro adulto já estão formadas. Isso inclui os lóbulos da antena, onde há neurônios de projeção que enviam seus axônios até a região do corpo do cogumelo e os neurônios do corpo do cogumelo, células quenianas, que enviaram seus axônios para seus neurônios-alvo através dos lobos Alfa, beta e gama. No dia da cultura, a primeira coisa que fazemos é entrar na capela de fluxo laminar e preparar estéril, a solução enzimática que vamos usar para dissociar o tecido.

E também constituímos o meio que vamos usar para cultivar as células. E isso é feito de talos que preparamos com antecedência. O próximo passo é coletar os pupi que vamos usar para essa dissociação ou para a dissecação.

E isso é feito fora do capô porque eles são cultivados em frascos que contêm fermento e todos os tipos de outras coisas. E assim, na verdade, fazemos os estágios iniciais de nossa dissecação fora do capô. Estes são peepee que acabei de tirar das laterais de um frasco, e nesta fileira da esquerda temos animais que têm olhos vermelhos e são um bom palco para cultivo.

Esses são um pouco, esses PPP aqui são um pouco mais jovens. Eles têm olhos laranja ou amarelos, e esta é uma linha 1 0 7 boa. Eles têm olhos ligeiramente mais brilhantes do que os tipos selvagens regulares, onde a cor nesses estágios seria um pouco mais marrom.

Todos esses estágios são bons para cultivar, para tornar as pessoas culturas cerebrais. Ok, o primeiro passo aqui é colocar algumas gotas de solução de dissecação ao lado do pupi que eu retirei e alinhei na minha placa de Petri. Usamos os topos de placas de Petri de 35 milímetros.

Em seguida, pego um par de pinças sem número cinco na mão esquerda e uma seringa de tuberculina CC com uma agulha de calibre 27 no final. Estas são minhas duas ferramentas de dissecação. E para remover a cabeça do estojo da pupila ou do pupi, basicamente eu tenho que usar o i, eu seguro o pupi com minha pinça na mão esquerda, e então eu uso a agulha na minha mão direita para remover a frente do estojo da pupila.

Em seguida, coloquei o puxão para trás na cobertura da cutícula e a cabeça sai pela frente. Eu uso minha agulha para cortar o I na região do pescoço e pego a cabeça e coloco na gota de solução salina dissecante. Vou repetir esse procedimento de 10 a 15 vezes porque, para fazer uma boa cultura, gosto de ter de 10 a 15 animais de cada genótipo.

Tudo bem, vou remover o cérebro da cabeça do animal. Para fazer isso, uso duas seringas de tuberculina, cada uma segurando uma agulha de calibre 27. A agulha esquerda eu coloco através da psis do animal para prender a cabeça no fundo da placa de Petri.

E então eu uso minha agulha direita para abrir uma fenda no lado direito, e é aí que vou empurrar o cérebro para fora. Ok, e eu sou, o próximo passo é colocar minha agulha esquerda sobre o olho esquerdo. E agora eu vou realmente empurrar ex e o cérebro deve sair do lado direito através da fenda.

Aí vem. Você pode vê-lo no lado direito, e agora posso simplesmente usar minha agulha direita para separá-lo do resto da cápsula da cabeça e dos olhos. Okey. Agora, antes de fazer a dissecção final, que é remover os lobos ópticos, transfiro o cérebro para uma gota limpa de solução salina.

Eu posso usar um eman de cachimbo para fazer isso, e eu o pego na ponta de um eman de cachimbo de 20 microlitros, e eu o uso ajustado em cinco microlitros, ou posso realmente transferi-lo nas agulhas também. Esta é a última etapa do procedimento de dissecação. É feito em uma gota fresca de solução salina e, geralmente, eu teria cerca de 10 a 15 cérebros aqui.

Em seguida, removo os lobos ópticos de cada um usando as agulhas de calibre 27 como ferramentas de corte, e apenas corto o lobo óptico esquerdo e depois corto o lobo óptico direito em cada cérebro. E neste ponto, todos os cérebros que foram processados dessa maneira serão transferidos para um tubo que contém a solução enzimática, que será usada para a dissociação enzimática. Todos os cérebros de um único genótipo são colocados em um único tubo einor com tampa de rosca epi que contém um moinho da solução enzimática.

E então nós apenas os colocamos em um suporte de tubo de ensaio e os colocamos em um rotador onde ficam por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente. E esse é o tempo real da Dissociação. Para completar a etapa de dissociação enzimática, na verdade temos que remover a enzima.

Então, levamos os tubos para uma centrífuga EOR, colocamos os tubos na centrífuga e vamos girá-los por três minutos a 3000 RPM. Depois de girarmos os cérebros para baixo, nós os trazemos agora para nossa capela de fluxo laminar. É aqui que começa a parte estéril do procedimento.

Agora não abrimos o tubo a menos que estejamos na capela de fluxo laminar, e agora removeremos a solução enzimática. Vamos substituí-lo por uma solução de dissecação e, em seguida, vamos girar e lavar várias vezes com a solução de dissecação e terminando com um meio definido, que é o que cultivamos as células. Está bem.

A primeira coisa que preciso fazer aqui é colocar uma gota de cinco microlitros de solução salina em cada uma das lamínulas que tenho nessas placas de Petri. Há uma única lamínula por placa de Petri, e ela foi revestida com laminina, então coloquei uma gota de cinco microlitros bem no meio da lamínula. É aí que está minha gota de laminina.

É muito importante porque você quer concentrar suas células bem no meio do campo, porque obtemos cerca de 10.000 células por cérebro, e é com isso que fazemos uma única cultura. Ok, agora olhando no microscópio, aqui estão nove cérebros que já passaram pelo procedimento de dissociação enzimática. Você pode ver que eles ainda estão praticamente intactos.

Eles não têm seus lobos ópticos. Esses foram removidos, mas temos apenas a região central do cérebro e agora vou pipetar um único cérebro e movê-lo para a queda de cinco microlitros em uma lamínula. E eu faço isso quatro vezes.

Eu pego duas seringas de um CC colocadas nas agulhas de calibre 27. Novamente, é muito importante observar que essas são ferramentas de dissecação muito baratas e descartáveis, para que os alunos de graduação possam fazer isso sem se preocupar com seu orçamento. Ok, agora eu tenho as duas agulhas e vou fazer a dissociação mecânica inicial, que é apenas cortar esse cérebro em vários pedaços, o que me permitirá realmente sugar esses pedaços em uma pipeta de vidro em apenas um minuto para completar a dissociação final.

Quando estou fazendo isso, não os reduzo a pedaços minúsculos, só quero aumentar a diminuição do tamanho total para que eu possa obter um pouco para que a pipeta, quando eu fizer a dissociação, traga pedaços um pouco menores do que o cérebro inteiro. Eu também quero fazer isso de forma relativamente rápida porque você vê que as gotas de mídia são pequenas. Isso significa que temos uma alta relação superfície/volume e tanto o pH quanto a osmolaridade da solução podem mudar se eu deixá-la parada por qualquer período de tempo.

Quando eu estava fazendo isso pela primeira vez, eu só fazia dois cérebros de cada vez, duas culturas de cada vez. Agora eu costumo fazer quatro, e agora vou quebrar a pipeta, mas não posso falar sobre isso nem nada, certo? Este eu acabei de terminar.

A dissociação, o tamanho da pipeta era muito bom. Consegui sugar o tecido para cima e para cima e para baixo algumas vezes, e você pode ver células individuais e essas, ainda temos aglomerados, mas tudo bem. Eles vão embora.

Agora, as culturas, assim que são plaqueadas, são colocadas em uma segunda placa de Petri e são colocadas na incubadora de CO2 em alguns minutos, porque queremos ter certeza de que mantemos o pH e a osmolaridade em um nível que suporte sua sobrevivência. Então, nós os colocamos aqui por 30 minutos antes de inundarmos o prato. Essas culturas foram preparadas a partir dos cérebros de pupi em estágio avançado.

A cultura foi cultivada por dois dias em uma incubadora de CO2 e você pode ver células individuais que têm processos prolongados. A extensão da elaboração do processo é menor do que você veria em cinco dias e maior do que o que você veria em um dia. Meu nome é Jorge Ano.

Eu trabalho no laboratório de Dúvidas. Vou mostrar agora como fazemos o experimento, o experimento de imagem de cálcio nas culturas de pessoas que acabamos de preparar. Este é um vídeo de um experimento de imagem de cálcio onde você vê células azuis mostrando níveis baixos, indicando baixos níveis de cálcio e glóbulos vermelhos indicando altos níveis de cálcio.

Veremos que existem algumas células que ficam vermelhas e isso indica níveis intracrescentes de cálcio intracelular. E esses são espontâneos e transitórios. Eles voltam aos níveis de cálcio de Baal ao longo do tempo e, depois de um tempo, vamos aplicar uma droga, neste caso, nicotina, e você verá as células aumentarem os níveis de cálcio intracelular.

Aplicamos nicotina por 100 segundos, depois tomamos cuidado com a nicotina e as células voltam aos níveis basais de cálcio. Portanto, a verdadeira vantagem desse sistema de cultura é que somos capazes de fazer nossas culturas a partir de linhagens transgênicas e mutantes de moscas, diferentes nas quais diferentes subpopulações de neurônios são marcadas com GFP. Este é o cérebro de uma das linhas que usamos em que a GFP é expressa no corpo do cogumelo, células quenianas, neurônios envolvidos na mediação de comportamentos complexos, incluindo aprendizado e memória.

Os corpos celulares estão localizados na face dorsal do cérebro ao redor da região onde estão as setas vermelhas. E essas estruturas em forma de L que são GFP positivas são, na verdade, as projeções axonais dessas células quenianas do corpo do cogumelo. A dissociação posterior deste tecido cerebral.

Os neurônios regeneram seus processos em cultura, e você pode identificar facilmente as células quenianas positivas para GFP neste caso. Estes são acessíveis tanto para o registro eletrofisiológico padrão quanto para estudos de imagem de cálcio. Portanto, essas culturas são ferramentas realmente úteis para explorar os fatores genéticos e ambientais que são importantes na regulação da função dos neurônios que sabemos serem importantes na mediação de comportamentos complexos no animal adulto.