Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro

A migração de linfócitos T ocorre durante o retorno aos órgãos linfoides, saída da vasculatura e entrada nos tecidos periféricos. Este processo envolve a interação adesiva da superfície da célula T com outras células. Para examinar esse fenômeno in vitro, os linfócitos T humanos são isolados, cultivados e colocados em placas de cultura de tecidos revestidas com a proteína adesiva.

ICAM um e quimiocina SDF um. Imagens da migração de linfócitos T podem então ser adquiridas e analisadas. Olá, sou Craig LeFort e o laboratório de Minsu Kim no Centro de Biologia e Imunologia de Vacinas da Universidade de Rochester.

Hoje vamos mostrar-lhe um procedimento para o isolamento e cultura de linfócitos humanos adolescentes, uma análise da sua migração in vitro. Usamos este ensaio em nosso laboratório para estudar o papel das integrinas e da migração de células T. A principal integrina na célula T é o antígeno um associado à função dos linfócitos ou LFA.

Os ligantes específicos para LFA são os icas, como o ICAM. Além disso, um sinal de parentesco é necessário para que a migração de células T forneça um sinal de direcionalidade e ative as integrinas. Em nosso ensaio, usamos ICAM um humano e CX CL 12 ou SDF um como substratos para a migração de células T.

Então vamos começar. Depois de obter sangue humano de um doador saudável, deixe o sangue esfriar até a temperatura ambiente. Isso leva cerca de 30 minutos.

Assim que o sangue for resfriado, pipete suavemente três mililitros de meio de gradiente de densidade polimórfica em temperatura ambiente em um tubo de poliestireno de fundo redondo de oito mililitros. Em seguida, adicione delicadamente três mililitros de sangue total por cima. É importante evitar qualquer mistura.

Coloque os tubos em uma centrífuga e gire 500 G por 45 minutos. À temperatura ambiente após a centrifugação, as células mononucleares do sangue periférico ou P BMCs foram separadas dos outros componentes do sangue. A camada PBMC aparece como a primeira banda nublada a partir do topo.

Em condições estéreis, remova e descarte cuidadosamente a fase superior de cor amarela clara. Em seguida, use uma micropipeta P 1000 para transferir a camada de PBMC para um novo tubo cônico. Lavar o PBMC duas vezes com células de centrifugação PBS a 500 G durante cinco minutos.

Cada vez que o sobrenadante ficará um pouco turvo Após cada lavagem. Suspenda novamente as células em 20 mililitros de meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS, 1% de estreptomicina de penicilina e um micrograma por mililitro. A incubação de fito hemaglutinina ou PHA na presença de PHA induz a ativação e expansão de linfócitos T.

Com uma pipeta, transferir o pbmc para um balão de cultura T 75. Em seguida, incubado 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma a 24 horas. Esta etapa permite que os monócitos, que aderirão à superfície do frasco, sejam separados dos linfócitos que permanecem em suspensão.

Após a incubação, remova cuidadosamente todos os meios que contêm principalmente linfócitos e transfira-os para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar a 500 g durante cinco minutos. Reese foi o pellet celular em RPMI 1640 e transferiu as células para um novo frasco T 75 contendo 25 mililitros de RPMI 1640 com FBS, penicilina, estreptomicina e PHA incubados a 37 graus Celsius.

Após 24 horas de crescimento, pode ser necessário adicionar 15 a 20 mililitros de meio fresco e transferir para um balão T 1 75 maior. Continue incubando por três dias ou dois dias. Se a incubação inicial do PBMC foi durante a noite após três dias, use uma pipeta para remover o meio, que conterá linfócitos suspensos e transfira-o para uma centrífuga de tubo cônico de 50 mililitros a 500 G por cinco minutos.

Reese foi o pellet celular e transferiu as células para um novo T 75 contendo 25 mililitros de RPMI 1640. Com FBS, penicilina, estreptomicina e IL humana dois ou IL 15 coloque as células na incubadora. Se iniciar um balão T 75, a cultura terá de ser expandida e transferida para um balão T 1 75.

Após um a dois dias, cresça os linfócitos por um total de quatro a sete dias. Um dia antes do ensaio de migração, cubra um prato de 0,17 milímetro com fundo de vidro com 20 microgramas por mililitro de proteína A ou G em PBS, incube durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Lave o prato extensivamente com PBS e, em seguida, adicione ICAM one FC e SD F1 humano em solução PBS ao prato.

Incubar durante quatro horas à temperatura ambiente para imobilizar as moléculas. Determine a densidade das células cultivadas usando um hemocitômetro. Em seguida, lave os linfócitos duas vezes com PBS e ressuspenda-os em um mililitro de meio L 15 contendo glicose D após a incubação, lave o prato revestido com ICAM um FC e SDF um extensivamente com PBS transfira os linfócitos T em um mililitro de meio para o prato, aproximadamente duas a cinco vezes 10 para a quinta célula devem ser usados por prato para obter uma densidade celular apropriada para análise de migração.

Para obter imagens da migração celular, coloque a placa no microscópio em um ambiente com temperatura controlada, como uma câmara aquecida a 37 graus Celsius. Abra o software de elementos NIS no menu de configurações de imagem. Escolha o binning dois a dois como o modo para imagens ao vivo e captura de imagens.

Vá para o menu de aplicativos e escolha, defina, execute, experimente. Escolha o período de tempo entre as imagens e o tempo total. Para a sequência de captura de imagem, pressione o botão de execução para iniciar a aquisição da imagem após a aquisição.

Os parâmetros de migração, como velocidade, comprimento do caminho e deslocamento, podem ser quantificados usando um pacote de software como Image J, Auto Quant ou veloc. Para gerar um gráfico de teia de aranha, colete as coordenadas XY para cada célula e ponto de tempo e projete-as em um gráfico com um ponto de partida comum para cada célula na origem. Os linfócitos T mostrados aqui foram cultivados em placas ICAM e SDF e imagens a cada 10 segundos por 30 minutos.

Este filme mostra a migração aleatória de linfócitos T a uma velocidade de aproximadamente 15 mícrons por minuto usando as coordenadas XYT para cada célula. 15 células foram escolhidas aleatoriamente e plotadas com um ponto de partida comum na origem. A comparação de gráficos de teia de aranha fornece uma rápida representação visual das diferenças na migração entre diferentes condições experimentais.

Os gráficos para a migração de linfócitos T sob condições de controle são mostrados à esquerda, enquanto os gráficos para a migração de linfócitos T na presença de um anticorpo bloqueador de ligante anti LFA um são mostrados à direita. Esses dados demonstram que os linfócitos T utilizam integrina LFA um para migrar em um substrato ICAM one. Acabamos de mostrar como fazer um ensaio de migração usando linfócitos T humanos cultivados durante o procedimento.

É importante lembrar de adicionar um número apropriado de células ao prato revestido do ICAM para que o rastreamento celular e a análise da migração sejam simplificados. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.