Name: Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprenda o isolamento e cultura de linfócitos T humanos para análise da migração in vitro usando proteínas adesivas e quimiocinas. Este método permite estudar a dinâmica celular em imunologia.

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Este projecto foi apoiado pelo National Institutes of Health Grants HL087088 (MK) e HL18208 (MK).

1. Isolamento de linfócitos T humanos <ol><li> Obter sangue humano a partir de um doador saudável. Permitir que o sangue esfriar até a temperatura ambiente (~ 30 min) antes de prosseguir para a próxima etapa. </li><li> Suavemente pipeta de 3 mL de temperatura ambiente Polymorph media gradiente de densidade em um tubo de poliestireno 8 mL de fundo redondo. Delicadamente adicionar 3 mL de sangue total em cima da mídia Polymorph. É importante evitar a mistura dos dois reagentes. </li><li> Centrifugar os tubos a 500 xg por 45 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Após a centrifugação, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) já separado de outros componentes do sangue para a camada de células superior. A camada de PBMC aparece, de cima para baixo, como a primeira banda nublado. </li><li> Remova cuidadosamente a fase de cor amarela clara superior do sangue, acima da camada de PBMC, e então usar uma micropipeta P1000 para transferir a camada CMSP para um mL 15 mL ou 50 tubo cônico. </li><li> Lave o PBMC duas vezes com PBS, centrifugação a 500 xg células por 5 minutos cada tempo. O sobrenadante será um pouco nublado depois de cada lavagem. </li></ol> 2. Cultura de linfócitos humanos T <ol><li> Com uma pipeta, transferir o CMSP para um balão T-75 da cultura em 20 mL de mídia RPMI 1640 contendo 10% FBS, 1% de penicilina / estreptomicina, e 1 mg / mL fitohemaglutinina (PHA). </li><li> Incubar a 37 ° C e 5% CO 2 por pelo menos uma hora, e até 24 horas. Esta etapa permite que os monócitos, que será aderente à superfície balão, ser separada da linfócitos que permanecem em suspensão. Se um de incubação curto (1 hora) é usado nesta etapa, é aceitável a utilização de meios RPMI 1640 contendo 10% FBS e 1% de penicilina / estreptomicina, sem suplementação com PHA, conforme especificado no passo 2.1. </li><li> Remova cuidadosamente toda a mídia do frasco, adicione-o a um tubo cônico de 50 mL, e centrifugar a 500 xg por 5 minutos. </li><li> Ressuspender o pellet celular, que agora contém principalmente linfócitos, as células e transferência para um balão T-75 novo contendo 25 mL de mídia RPMI 1640 contendo 10% FBS, 1% de penicilina / estreptomicina, e 1 mg / mL PHA. </li><li> Incubar a 37 ° C por 3 dias (2 dias se a incubação inicial de PBMC foi durante a noite). Após 24 horas de crescimento, pode ser necessário adicionar mL 15-20 de mídia fresco e transferir para um maior T-175 frasco. </li><li> Após 3 dias, use uma pipeta para remover a mídia e os linfócitos suspenso a partir do frasco e transferir para um tubo cônico de 50 mL. Centrifugar a 500 xg por 5 minutos. </li><li> Ressuspender o pellet celular e células transferir para um balão T-75 ou T-175 nova contendo 25 mL (T-75) ou 50 mL (T-175) RPMI 1640 com 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina, e 20 ng / mL humana IL-2 ou IL-15. </li><li> Crescer linfócitos para 4-7 dias. Se começar com um frasco de T-75, a cultura terá de ser ampliado e transferido para um balão T-175, após 1-2 dias. </li></ol> 3. Ensaio in vitro de migração de linfócitos <ol><li> Um dia antes do ensaio de migração, um casaco com fundo de vidro prato de 0,17 milímetros, com 20 Protein mcg / ml A ou G, em PBS overnight a 4 ° C. </li><li> Lavar o prato extensivamente com PBS. </li><li> Imobilizar ICAM-1/Fc humano (10 mg / mL) e humanos SDF-1 (2 mg / mL), adicionando estes reagentes em solução PBS para o prato e incubação de quatro horas à temperatura ambiente. </li><li> Prepare linfócitos T pela primeira determinação da densidade de células em cultura no frasco T-175 utilizando um hemocitômetro. Cerca de 2-5 x 10 5 células deve ser usado por prato para conseguir uma densidade celular adequada para a análise de migração. </li><li> Lavar linfócitos T duas vezes com PBS e, em seguida ressuspender em 1 mL L-15 meios contendo 1 mg / mL D-glicose. </li><li> Lavar o prato revestido com ICAM-1/Fc e SDF-1 extensivamente com PBS. </li><li> Transferência de linfócitos T em 1 mL de mídia para o prato e mantê-las a 37 ° C. </li></ol> 4. Capturar uma seqüência de imagem usando NIS Elements Software <ol><li> Abra NIS Elements software. </li><li> No menu de configurações da câmera, escolha "binning 2x2" como o modo para ambas imagens ao vivo e captura de imagem. </li><li> Vá ao menu Aplicações e escolha Definir / Run Experiment. </li><li> Escolher o comprimento de tempo entre as imagens eo comprimento total da seqüência de captura de imagem. </li><li> Pressione o botão "Executar" para começar a aquisição da imagem. </li><li> As células podem ser rastreados e os parâmetros de migração (velocidade, comprimento do caminho, deslocamento, etc) quantificados usando um dos vários pacotes de software, incluindo ImageJ, Autoquant ou Volocity (Figura 1). </li><li> Para gerar um "complô teia de aranha", o coordenadas xy para cada célula e timepoint são coletados (Figura 2) e projetada em um gráfico com um ponto de partida comum para cada célula na origem (Figura 3). </li></ol> 5. Resultados representante No dia 6 de cultura na presença de ambos os linfócitos IL-2 ou IL-15, Tcompõem&gt; 98% de células, conforme determinado pela coloração CD3 positivos, bem como CD4 positivos e / ou CD8 coloração. Para IL-2, encontramos 83% CD4 + células, 15% CD8 + e &lt;1% CD4 + CD8 +. Para IL-15, encontramos 88% CD4 + células, 11% CD8 + e &lt;1% CD4 + CD8 +. Durante a migração de linfócitos T em ICAM-1/SDF-1 substratos, as células apresentaram uma velocidade de aproximadamente 15 mm / min, que pode ser sustentado ao longo de um período de tempo de 1 hora. Migração de linfócitos T em ICAM-1/SDF-1 é dependente de LFA-1 mediada por adesão, como um anti-LFA-1-ligante bloqueio anticorpo inibe fortemente a migração. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Rastreamento de celular de migração de linfócitos T. Linfócitos T isolados do sangue total e cultivadas na presença de IL-2 ou IL-15 para seis dias foram autorizados a aderir e migrar em pratos de vidro de fundo revestido com 10 mg / mL ICAM-1 e 2 mg / mL SDF-1. Imagens foram obtidas a cada 10 segundos por 30 minutos. As células foram identificadas em cada imagem e monitorados ao longo do tempo usando o software Volocity. Este filme mostra a migração aleatória de linfócitos T a uma velocidade de ~ 15 mm / min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2017/2017_Kim_Movie1.mov">Clique aqui para ver o vídeo.</a> Filme de rastreamento Cell 1. Migrando de linfócitos T. Linfócitos T isolados do sangue total e cultivadas na presença de IL-2 ou IL-15 para seis dias foram autorizados a aderir e migrar em pratos de vidro de fundo revestido com 10 mg / mL ICAM-1 e 2 mcg / mL SDF-1 . Imagens foram obtidas a cada 10 segundos por 30 minutos. As células foram identificadas em cada imagem e monitorados ao longo do tempo usando o software Volocity. Este filme mostra a migração aleatória de linfócitos T a uma velocidade de ~ 15 mm / min. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Spatiotemporal posição da célula. As coordenadas XY de cada célula foram obtidos para cada ponto de tempo usando software Volocity. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. "Spider enredo web." Usando o XYT coordenadas para cada célula, 15 células foram escolhidos aleatoriamente e plotados com um ponto de partida comum na origem. Comparando parcelas teia de aranha dá uma representação visual rápida das diferenças na migração entre diferentes condições experimentais. Parcelas para migração de linfócitos T em condições controle (painel esquerdo) e na presença de um anti-LFA-1 anticorpo ligando-blocking (painel direito).

<ol><li>Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+integrin+VLA-4+localizes+to+the+lamellipodia+and+mediates+t+cell+migration+on+VCAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1.</a> J Immunol. 183, 359-369 (2009).</li>
<li>Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmuscle+myosin+heavy+chain+IIA+mediates+integrin+LFA-1+de-adhesion+during+T+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration.</a> The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).</li>
<li>Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+integrins+and+their+ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+research%22%5BJournal%5D)">Leukocyte integrins and their ligand interactions.</a> Immunologic research. , (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste experimento, nós fornecemos detalhes sobre um sistema simples para analisar a motilidade do principal linfócitos T humanos. Ensaios de migração in vitro têm sido usadas para dissecar os papéis de muitas moléculas e vias de sinalização envolvidas na locomoção de vários tipos de células. Alguns controles fundamentais para manter em mente ao projetar sua própria experiência de nosso protocolo incluem: 1) não-adesiva ou não-integrina revestimentos adesivos, substratos tais como albumina de soro bovin...

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>SFB</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH300070.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>1-Step Polymorphs</td><td>Accurate Chemical &amp;amp; Scientific Corporation</td><td>AN221725</td><td></td></tr><tr><td>PHA</td><td>Remel, Thermo Fisher Scientific</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humana recombinante</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>202-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-15 humana recombinante</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>247-IL</td><td></td></tr><tr><td>Proteína G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19459</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1/Fc humana recombinante</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>720-IC</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1 humano recombinante</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>350-NS</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento t de linfócitos humanos, cultura e análise da migração in vitro</em

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

A migração de linfócitos T envolve a interação adesivo de integrinas da superfície celular com ligantes expressos em outras células ou com proteínas da matriz extracelular. A ativação das integrinas preciso espaço-temporal de um estado de baixa afinidade para um estado de alta afinidade no limite da célula líder é importante para a migração de linfócitos T<sup&gt; 1</sup&gt;. Da mesma forma, a retração da borda das células à direita, ou uropod, é um passo necessário na manutenção persistente integrina-dependente motilidade linfócitos T<sup&gt; 2</sup&gt;. Muitas abordagens terapêuticas para auto-imunes ou inflamatórias integrinas doenças-alvo, como forma de inibir o recrutamento excessivo e migração dos leucócitos<sup&gt; 3</sup&gt;. Para estudar os eventos moleculares que regulam a migração de linfócitos T humanos, nós utilizamos um<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para analisar a migração de células em um substrato bidimensional que imita o ambiente que um linfócito T encontra durante o recrutamento da vasculatura. Linfócitos T são os primeiros isolados de doadores humanos e são, então, estimulado e cultivado por sete a dez dias. Durante o ensaio, os linfócitos T estão autorizados a aderir e migrar sobre um substrato revestido com uma molécula de adesão intercelular (ICAM-1), um ligante de integrina LFA-1, eo fator-1 de células derivadas do estroma (SDF-1). Nossos dados mostram que os linfócitos T apresentam uma velocidade de migração de ~ 15 mm / min. Migração de linfócitos T podem ser inibidos pelo bloqueio integrina<sup&gt; 1</sup&gt; Ou por inibidores da máquina actomyosin celular que regula a migração celular<sup&gt; 2</sup&gt;.

Migração de linfócitos T ocorre durante homing para órgãos linfóides, saia do vasculatura, e entrando em tecidos periféricos. Aqui, nós descrevemos um protocolo que pode ser usado para analisar migração de linfócitos T<em&gt; In vitro</em&gt;.

Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro</em

A migração de linfócitos T envolve a interação adesiva de integrinas da superfície celular com ligantes expressos em outras células ou com a matriz extracelular...

A migração dos linfócitos T ocorre durante a homing para órgãos linfoides, a saída da vasculatura e a entrada em tecidos periféricos. Esse processo envolve a interação adesiva da superfície dos linfócitos T com outras células. Para examinar esse fenômeno in vitro, linfócitos T humanos são isolados, cultivados e colocados em placas de cultura celular revestidas com a proteína adesiva.ICAM um e quimiocina SDF um. Em seguida, podem ser adquiridas e analisadas imagens da migração de linfócitos T. Olá, sou Craig LeFort e do laboratório de Minsu Kim no Centro de Biologia de Vacinas e Imunologia na Universidade de Rochester.Hoje vamos mostrar um procedimento para o isolamento e cultivo de linfócitos de adolescentes humanos e uma análise de sua migração in vitro. Utilizamos este ensaio em nosso laboratório para estudar o papel das integrinas e da migração de linfócitos T. A principal integrina em linfócitos T é o antígeno associado à função linfocitária um, ou LFA-1.Os ligantes específicos para a LFA um são as ICAs, como a ICAM um. Além disso, um sinal químico é necessário para a migração de linfócitos T, fornecendo tanto um sinal de direcionalidade quanto a ativação de integrinas. Em nosso ensaio, utilizamos ICAM um humana e CX CL 12 ou SDF um como substratos para a migração de linfócitos T.Então vamos começar. Após obter sangue humano de um doador saudável, deixe o sangue esfriar até a temperatura ambiente. Isso leva cerca de 30 minutos.Uma vez que o sangue esteja resfriado, pipete cuidadosamente três mililitros de meio de gradiente de densidade de polimorfo à temperatura ambiente em um tubo de poliestireno redondo de oito mililitros. Em seguida, adicione cuidadosamente três mililitros de sangue total por cima. É importante evitar qualquer mistura.Coloque os tubos em uma centrífuga e gire a 500 G por 45 minutos. À temperatura ambiente, após a centrifugação, as células mononucleares do sangue periférico ou PBMCs foram separadas dos demais componentes sanguíneos. A camada de PBMCs aparece como a primeira faixa turva a partir do topo.Em condições estéreis, remova e descarte cuidadosamente a fase superior de cor amarela clara. Em seguida, utilize uma micropipeta P 1000 para transferir a camada de PBMC para um novo tubo cônico. Lave os PBMC duas vezes com PBS, centrifugando as células a 500 G por cinco minutos.Toda vez que o sobrenatante ficará um pouco turvo após cada lavagem. Suspender novamente as células em 20 mililitros de meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina e um micrograma por mililitro. A incubação com fito-hemaglutinina ou PHA na presença de PHA induz a ativação e expansão dos linfócitos T.Usando uma pipeta, transfira os PBMCs para um frasco de cultura T 75. Em seguida, incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por um a 24 horas. Este passo permite que os monócitos, que aderirão à superfície do frasco, sejam separados dos linfócitos que permanecem em suspensão.Após a incubação, remova cuidadosamente todo o meio, que contém principalmente linfócitos, e transfira-o para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue a 500 ×g durante cinco minutos. Resuspenda o pellet celular em RPMI 1640 e transfira as células para um novo frasco T-75 contendo 25 mililitros de RPMI 1640 com FBS, penicilina, estreptomicina e PHA, incubado a 37 graus Celsius.Após 24 horas de crescimento, pode ser necessário adicionar de 15 a 20 mililitros de meio fresco e transferir para um frasco T 1 75 maior. Continue a incubação por três dias ou dois dias. Se a incubação inicial dos PBMC foi durante a noite após três dias, use uma pipeta para remover o meio, que conterá linfócitos suspensos, e transfira para um tubo cônico de 50 mililitros, centrifugando a 500 G por cinco minutos.Resuspendeu o pellet celular e transferiu as células para um novo frasco T75 contendo 25 mililitros de RPMI 1640 com FBS, penicilina, estreptomicina e IL-2 humana ou IL-15. Coloque as células no incubador. Se iniciar um frasco T75, a cultura precisará ser expandida e transferida para um frasco T175.Após um a dois dias, cultive os linfócitos por um total de quatro a sete dias. Um dia antes do ensaio de migração, recubra uma placa com fundo de vidro de 0,17 milímetro com 20 microgramas por mililitro de proteína A ou G em PBS e incube durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Lave a placa extensivamente com PBS, depois adicione ICAM um FC e SD F1 humano em solução de PBS à placa.Incube por quatro horas à temperatura ambiente para imobilizar as moléculas. Determine a densidade das células cultivadas utilizando um hemocitômetro. Em seguida, lave os linfócitos duas vezes com PBS e re-suspenda-os em um mililitro de meio L 15 contendo D glucose. Após a incubação, lave a placa revestida com ICAM one FC e SDF one extensivamente com PBS, transfira os linfócitos T em um mililitro de meio para a placa; aproximadamente de duas a cinco vezes 10 à quinta célula devem ser utilizadas por placa para obter uma densidade celular apropriada para análise de migração.Para obter imagens da migração celular, coloque a placa na platina do microscópio em um ambiente controlado termicamente, como uma câmara aquecida a 37 graus Celsius. Abra o software NIS Elements no menu de configurações de imagem. Escolha o modo de binning dois por dois tanto para a aquisição de imagens em tempo real quanto para a captura de imagens.Vá ao menu de aplicações e escolha, defina, execute, experimente. Escolha o intervalo de tempo entre as imagens e o tempo total. Para a sequência de captura de imagens, pressione o botão executar para iniciar a aquisição de imagens após a aquisição.Parâmetros de migração, como velocidade, comprimento do trajeto e deslocamento, podem ser quantificados utilizando um pacote de software como Image J Auto Quant ou veloc. Para gerar um gráfico de teia de aranha, colete as coordenadas XY para cada célula e ponto temporal e projete-as em um gráfico com um ponto inicial comum para cada célula na origem. Os linfócitos T mostrados aqui foram cultivados em placas com ICAM e SDF um e imageados a cada 10 segundos durante 30 minutos.Este vídeo mostra a migração aleatória de linfócitos T com uma velocidade de aproximadamente 15 mícrons por minuto, utilizando as coordenadas XYT para cada célula. Quinze células foram escolhidas aleatoriamente e representadas graficamente com um ponto inicial comum na origem. A comparação de gráficos em formato de teia de aranha fornece uma representação visual rápida das diferenças na migração entre diferentes condições experimentais.Os gráficos da migração de linfócitos T sob condições de controle são mostrados à esquerda, enquanto os gráficos da migração de linfócitos T na presença de um anticorpo bloqueador do ligante anti-LFA-1 são mostrados à direita. Esses dados demonstram que os linfócitos T utilizam a integrina LFA-1 para migrar sobre um substrato de ICAM-1. Acabamos de mostrar como realizar um ensaio de migração utilizando linfócitos T humanos cultivados durante o procedimento.É importante lembrar de adicionar um número apropriado de células ao recipiente revestido com ICAM-1 para que o rastreamento celular e a análise da migração sejam simplificados. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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