Por que o isolamento de células positivas para CD133 é importante para a validação de alvos no melanoma?

O isolamento de células positivas para CD133 permite a realização de testes funcionais das capacidades tumorigênicas e de autorrenovação, que são fundamentais para validar alvos de células-tronco do câncer no melanoma. Essa purificação reduz o ruído proveniente de células não-tronco, aumentando a confiança nos ensaios de dependência de alvo. O método favorece a desmistificação mecanicista ao associar a expressão de CD133 ao potencial de iniciação tumoral.

Como a separação magnética ativada de células permite o isolamento de variáveis independentes na pesquisa com células-tronco?

A triagem celular ativada por campo magnético isola frações positivas e negativas para CD133 marcando apenas a população-alvo com anticorpos biotinilados e microesferas, criando grupos experimentais definidos. O isolamento da variável independente (estado do CD133) permite aos pesquisadores atribuir diferenças funcionais especificamente ao enriquecimento de células-tronco. A técnica garante que os fenótipos observados nos ensaios estejam ligados à variável isolada e não a populações mistas.

Quais medidas quantitativas da variável dependente são possíveis ao isolar frações de melanoma definidas por CD133?

Frações isoladas permitem medidas quantitativas, como eficiência de formação de esferoides, frequência de iniciação tumoral in vivo e taxas diferenciais de resposta a fármacos. Essas variáveis dependentes fornecem leituras numéricas para comparar fenótipos associados à potência de células-tronco entre células positivas e negativas para CD133. O método permite a análise estatística da frequência de células-tronco e da potência funcional em diferentes condições experimentais.

Por que os requisitos de replicação são importantes para o isolamento confiável de células de melanoma positivas e negativas para CD133?

A replicação garante que o isolamento produza frações definidas por CD133 com pureza e viabilidade consistentes entre experimentos, o que é essencial para ensaios funcionais reprodutíveis. A variabilidade na eficiência de separação pode confundir comparações entre populações de células-tronco e não tronco, comprometendo os esforços de validação de alvos. Protocolos padronizados com execuções em replicata ajudam a estabelecer limites robustos de pureza e recuperação em ambientes industriais.

Quais são as capacidades de análise estatística necessárias antes de implementar o isolamento de CD133 em protocolos para células-tronco de melanoma?

A implementação exige a capacidade de quantificar pureza e rendimento por citometria de fluxo ou métodos semelhantes para avaliar a eficiência de separação. A comparação estatística de ensaios funcionais (por exemplo, formação de tumor, proliferação) entre frações isoladas exige ferramentas para calcular significância e tamanho do efeito. O acesso a software para análise de dados replicados garante que as diferenças observadas nos fenótipos de células-tronco sejam estatisticamente válidas e não decorrentes da variabilidade do isolamento.

Isolamento de células-tronco de melanoma: um método para obter células de melanoma CD133 positivas e negativas usando classificação de células ativadas por magnetismo

JoVE Encyclopedia of Experiments

Pesquisa sobre o Câncer

0 vistas • 5:40 min • April 30th, 2023

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- O melanoma abriga uma pequena subpopulação de células-tronco cancerígenas que possuem capacidades de auto-renovação e iniciação tumoral. CD133 ou Prominina-1, uma glicoproteína transmembrana pentaspan, é um dos principais marcadores expressos por células-tronco cancerígenas de melanoma metastático. Para isolar células CD133-positivas, comece com uma suspensão de células primárias de melanoma em um tampão apropriado.

Incubar com um reagente bloqueador contendo proteínas que bloqueiam locais de ligação não específicos na superfície celular. Trate as células com anticorpos primários CD133 biotinilados. Esses anticorpos se ligam a antígenos CD133 expressos em células CD133 positivas. Agora, adicione microesferas magnéticas anti-biotina à suspensão. Incube para que as microesferas se liguem às células marcadas com biotina.

Por fim, passe a suspensão incubada por uma coluna colocada em um campo magnético. Com influência magnética, todas as células CD133-positivas marcadas com as microesferas aderem à coluna, enquanto as células não marcadas passam. Colete essas células CD133-negativas não marcadas. Remova a coluna do campo magnético. Lave o conteúdo usando um tampão adequado para eluir e coletar células CD133-positivas.

No protocolo a seguir, mostraremos o isolamento de células-tronco cancerígenas CD133-positivas e negativas de uma cultura de melanoma primário obtida de tecido tumoral. Lave 80% das células confluentes com PBS pré-aquecido. Adicione a quantidade apropriada de Accutase e incube até que as células se desprendam da superfície da cultura. Colha as células em meio Quantum 263 e transfira para um tubo de 50 mililitros.

Enumere as células. Em seguida, centrifugue o número necessário de células por 5 minutos a 300 x g e 4 a 8 graus Celsius. Aspire completamente o sobrenadante e ressuspenda até 1 vezes 10 elevado às oitavas células em tampão MACS de 350 microlitros. Adicione 100 microlitros de Reagente de Bloqueio FcR e 50 microlitros de CD133/1-Biotina. Misture bem e incube a 4 graus Celsius por 10 minutos.

Lave as células com tampão MACS de 10 mililitros, seguido de centrifugação por 5 minutos a 300 x g e 4 a 8 graus Celsius. Aspirar completamente o sobrenadante. Após uma segunda lavagem, ressuspenda o pellet celular em 400 microlitros de tampão MACS. Adicione 100 microlitros de microesferas anti-biotina e misture bem. Incube a 4 a 8 graus Celsius por 15 minutos.

Enquanto isso, para preparar o separador MACS para a separação magnética, conecte o QuadroMACS ao MACS Separator Multi Stand. Insira o número necessário de colunas LS com as asas da coluna para a frente no campo magnético do QuadroMACS. Coloque um filtro de pré-separação em cada coluna LS e um tubo de coleta apropriado sob cada coluna.

Enxágue o filtro e a coluna com tampão MACS de 3 mililitros e descarte o fluxo. Depois de lavar as células no tampão MACS conforme descrito anteriormente, ressuspenda as células no tampão MACS de 500 microlitros e aplique a suspensão da célula na coluna LS preparada. Lave três vezes com 3 mililitros de tampão MACS por coluna. Colete o efluente total da fração de células CD133 negativas não marcadas.

Em seguida, descarte o filtro de pré-separação, remova a coluna do separador e coloque-a em um tubo de coleta adequado. Aplique 5 mililitros de tampão MACS. Lave imediatamente as células CD133-positivas marcadas empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna. Para aumentar a pureza da fração negativa, aplique a suspensão celular em uma nova coluna LS equilibrada e colete a fração CD133 negativa do efluente.