Isolamento de células-tronco de melanoma: um método para obter células de melanoma CD133 positivas e negativas usando classificação de células ativadas por magnetismo

- O melanoma abriga uma pequena subpopulação de células-tronco cancerígenas que possuem capacidades de auto-renovação e iniciação tumoral. CD133 ou Prominina-1, uma glicoproteína transmembrana pentaspan, é um dos principais marcadores expressos por células-tronco cancerígenas de melanoma metastático. Para isolar células CD133-positivas, comece com uma suspensão de células primárias de melanoma em um tampão apropriado.

Incubar com um reagente bloqueador contendo proteínas que bloqueiam locais de ligação não específicos na superfície celular. Trate as células com anticorpos primários CD133 biotinilados. Esses anticorpos se ligam a antígenos CD133 expressos em células CD133 positivas. Agora, adicione microesferas magnéticas anti-biotina à suspensão. Incube para que as microesferas se liguem às células marcadas com biotina.

Por fim, passe a suspensão incubada por uma coluna colocada em um campo magnético. Com influência magnética, todas as células CD133-positivas marcadas com as microesferas aderem à coluna, enquanto as células não marcadas passam. Colete essas células CD133-negativas não marcadas. Remova a coluna do campo magnético. Lave o conteúdo usando um tampão adequado para eluir e coletar células CD133-positivas.

No protocolo a seguir, mostraremos o isolamento de células-tronco cancerígenas CD133-positivas e negativas de uma cultura de melanoma primário obtida de tecido tumoral. Lave 80% das células confluentes com PBS pré-aquecido. Adicione a quantidade apropriada de Accutase e incube até que as células se desprendam da superfície da cultura. Colha as células em meio Quantum 263 e transfira para um tubo de 50 mililitros.

Enumere as células. Em seguida, centrifugue o número necessário de células por 5 minutos a 300 x g e 4 a 8 graus Celsius. Aspire completamente o sobrenadante e ressuspenda até 1 vezes 10 elevado às oitavas células em tampão MACS de 350 microlitros. Adicione 100 microlitros de Reagente de Bloqueio FcR e 50 microlitros de CD133/1-Biotina. Misture bem e incube a 4 graus Celsius por 10 minutos.

Lave as células com tampão MACS de 10 mililitros, seguido de centrifugação por 5 minutos a 300 x g e 4 a 8 graus Celsius. Aspirar completamente o sobrenadante. Após uma segunda lavagem, ressuspenda o pellet celular em 400 microlitros de tampão MACS. Adicione 100 microlitros de microesferas anti-biotina e misture bem. Incube a 4 a 8 graus Celsius por 15 minutos.

Enquanto isso, para preparar o separador MACS para a separação magnética, conecte o QuadroMACS ao MACS Separator Multi Stand. Insira o número necessário de colunas LS com as asas da coluna para a frente no campo magnético do QuadroMACS. Coloque um filtro de pré-separação em cada coluna LS e um tubo de coleta apropriado sob cada coluna.

Enxágue o filtro e a coluna com tampão MACS de 3 mililitros e descarte o fluxo. Depois de lavar as células no tampão MACS conforme descrito anteriormente, ressuspenda as células no tampão MACS de 500 microlitros e aplique a suspensão da célula na coluna LS preparada. Lave três vezes com 3 mililitros de tampão MACS por coluna. Colete o efluente total da fração de células CD133 negativas não marcadas.

Em seguida, descarte o filtro de pré-separação, remova a coluna do separador e coloque-a em um tubo de coleta adequado. Aplique 5 mililitros de tampão MACS. Lave imediatamente as células CD133-positivas marcadas empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna. Para aumentar a pureza da fração negativa, aplique a suspensão celular em uma nova coluna LS equilibrada e colete a fração CD133 negativa do efluente.