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- A pele é um órgão complexo que consiste em populações de células variadas dispostas em várias camadas. CUBIC, uma técnica de imagem tridimensional baseada em limpeza de tecidos, ajuda a visualizar padrões de expressão de proteínas dentro dessas células da pele usando biópsias de pele inteira. Comece pegando um camundongo sacrificado e removendo os pelos da região dorsal do pescoço. Extirpe um pedaço de pele e corte-o em pedaços pequenos.
Mergulhe as peças em uma solução de limpeza CUBIC1 e incuba. As células da pele não são transparentes, devido à presença de cromóforos e lipídios que causam dispersão de luz. Os produtos químicos na solução CUBIC removem essas moléculas, reduzindo assim a dispersão da luz e tornando o tecido transparente.
Em seguida, trate o tecido com os anticorpos primários desejados que se ligam especificamente às proteínas intracelulares alvo expressas nas células da pele. Além disso, trate com anticorpos secundários marcados com fluorescência que se ligam aos complexos de anticorpos primários de proteína. Contra-core o tecido com um corante de ligação ao DNA que mancha o núcleo.
Finalmente, mergulhe a amostra em uma solução CUBIC2. A solução reduz ainda mais a dispersão da luz dentro do tecido, tornando-o mais transparente para imagens. Observe sob um microscópio confocal para visualizar regiões de interesse marcadas com fluorescência na amostra tridimensional. O protocolo a seguir permite a visualização da expressão dos marcadores de proliferação de queratinócitos em biópsias de pele com montagem total usando o protocolo CUBIC.
- Comece usando aparadores para raspar o cabelo do pescoço de um camundongo sacrificado, tomando cuidado para não ferir a pele. Em seguida, descontamine a pele com etanol 70% em PBS. Em seguida, levante a pele dorsal do pescoço com uma pinça e use uma tesoura para remover uma área de aproximadamente 1,5 por 4 centímetros da pele dorsal do rato. Em seguida, alise a pele, com a derme voltada para baixo, em um pedaço de papel de filtro, anotando a orientação ântero-posterior da amostra e apare o papel ao redor da pele dissecada.
- Para uma imagem ideal, as amostras de pele precisam permanecer planas com orientação consistente do folículo piloso. Para manter as amostras em uma posição ântero-posterior adequada, fixamos os pedaços de pele em papel de filtro em biópsias retangulares.
- Transfira as amostras para um tubo de 15 mililitros cheio de PFA a 4% recém-preparado em PBS. Em seguida, quando estiverem firmemente fixados ao papel de filtro, transfira as amostras para um novo tubo de 15 mililitros de PBS para duas lavagens de 5 minutos.
Para limpar as biópsias de pele após a segunda lavagem, use uma lâmina de barbear afiada para cortar os tecidos em pedaços de aproximadamente 0,2 por 0,5 centímetros, tomando cuidado para que os lados mais longos das amostras sejam cortados ao longo da direção ântero-posterior das amostras.
- Cortar o lado mais comprido da biópsia paralelo à orientação dos folículos pilosos também ajuda a evitar danos extensos ao folículo piloso.
- Em seguida, mergulhe as biópsias em 5 mililitros de solução de limpeza CUBIC1 recém-preparada em um novo tubo de 15 mililitros e coloque o tubo em uma plataforma rotativa em um forno de hibridização a 37 graus Celsius. Quando os pedaços de tecido estiverem transparentes, lave as biópsias em 4 mililitros de PBS por quatro lavagens de 6 horas a 37 graus Celsius, seguidas de uma lavagem de 4 horas e 37 graus Celsius em 20% do peso por volume de sacarose em PBS.
No final da incubação, congele cada amostra em composto de temperatura de corte ideal em tubos individuais de 15 mililitros durante a noite a 80 graus Celsius negativos para aumentar a permeabilidade dos tecidos à penetração de anticorpos.
Na manhã seguinte, manche as amostras de pele com os anticorpos apropriados e corantes vitais de interesse. Em seguida, incube as amostras em 1 mililitro de solução de limpeza CUBIC2 recém-preparada em tubos de 2 mililitros em um agitador por 24 horas no forno a 37 graus Celsius para uniformizar o índice de refração dos tecidos.
Quando os tecidos estiverem limpos, posicione as biópsias ao longo do lado mais longo das lamínulas de vidro individuais, de modo que a direção do crescimento do folículo piloso seja paralela à superfície da lamínula. Coloque uma gota de solução CUBIC2 sobre o tecido. Coloque duas tiras de 1 milímetro por 2 centímetros de tachinhas azuis em uma lamínula. Em seguida, cubra a biópsia com uma segunda lamínula.
Em seguida, coloque a câmara de imagem em um estágio de microscópio confocal e mova o tecido para o caminho da luz. Usando a fonte de luz apropriada e filtros de epifluorescência padrão, escaneie a amostra para identificar regiões de interesse coradas com fluorescência. Em seguida, adquira imagens confocais fluorescentes das regiões de interesse.
