Name: Protocolo CUBIC Visualiza Protein Expression na resolução única célula em preparações e peles, inteiros Mount (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprenda o protocolo CUBIC para clarificação de biópsias de pele de espessura total em camundongos, permitindo visualização tridimensional de padrões de expressão proteica e células proliferantes em resolução de célula única.

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Agradecemos Australian Bio-Resources (Instituto Garvan, Austrália), o Centro de Recursos Biológicos (UNSW Austrália) e Animal Care &amp; Comissão de Ética para o apoio à experimentação animal. Este trabalho foi financiado pelo Health and Medical Research Council Nacional da Austrália (Project Grant APP1062720). Dr. Cesar P. Canales é beneficiários de uma bolsa de estudos CONICYT-Becas Chile (# 72.101.076). Mr. Bassem Akladios é um receptor da Universidade Prêmio Internacional de Pós-Graduação por UNSW Austrália.

Declaração de Ética: Todos os procedimentos envolvendo indivíduos animais siga as orientações do Comitê de Cuidados com Animais e Ética (ACEC) em UNSW Austrália sob protocolo aprovado ACEC 13 / 64B. 1. Preparação da Transparente tecido da pele do rato Nota: Todos os ratos utilizados neste estudo eram de um C57BL / 6 fundo genético <ol><li> Coleção de tecido da pele do rato. <ol><li> Humanamente eutanásia os ratos por deslocamento cervical. </li><li> Remova cuidadosamente os pêlos da área relevante pele com um cuidar trimmer não ferir a pele. </li><li> Lavar a pele para descontaminar com etanol 70% em tampão fosfato salino (PBS). </li><li> Levante a pele do pescoço dorsal com uma pinça e fazer a incisão com uma tesoura. </li><li> Dissecar uma grande área de pele do rato dorsal (aproximadamente 1,5 x 4 cm). </li><li> Achatar pele derme-lado para baixo em um papel de filtro, e anote a orientação anterior-posterior da amostra. </li><li> tripapel m de filtro em torno da pele dissecada, e coloque em um tubo de 15 ml cheio com recém-preparados paraformaldeído a 4% solução (PFA) em PBS. </li><li> Fix durante 1 h à temperatura ambiente, ou durante a noite no frigorífico a 4 ° C. </li><li> Lavar a pele 2 x 5 min em PBS em um tubo de 15 ml. Nota: O seguinte (1.1.10 - 1.1.12) são passos opcionais para armazenamento a longo prazo do tecido. </li><li> Desidratar pele dissecados em PBS com o aumento da concentração de etanol (25%, 50%, 70%) num tubo de 15 ml durante os passos de lavagem de 1-hora à temperatura ambiente. </li><li> Armazenar pele desidratadas em etanol a 70% em PBS num tubo de 15 ml a 4 ° C até uso posterior. </li><li> 4 horas antes da limpeza, re-hidratar o tecido da pele em PBS com a diminuição da concentração de etanol (70%, 50%, 25%, 0%) num tubo de 15 ml durante os passos de lavagem de 1-hora à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Limpando as biópsias da pele do rato <ol><li> Preparar a solução de compensação CUBIC1 por dissolução de 3,85 g de ureia e 3,85 g de N, N, N &#39;, N&#39;tetraquis (2-hidroxipropil) etilenodiamina em 5,38 ml de água destilada em um aquecedor definido para 60 - 70 ° C. Use um agitador quente. </li><li> Adicionar 2,31 g de polietileno-glicol mono-p-isooctylphenyl éter / Triton X-100 à solução, uma vez que é clara e foi arrefecida até à temperatura ambiente. </li><li> Cortar a pele do rato com uma lâmina afiada em biópsias de dimensões aproximadas de 0,2 x 0,5 cm, e submergir em 5 ml de solução CUBIC1 clareira em um tubo de 15 ml. Para optimizar a visualização de folículos de cabelo, assegurar que o lado mais longo da biópsia é cortada ao longo da direcção ântero-posterior da amostra. </li><li> Colocar numa plataforma rotativa num forno de hibridação a 37 ° C. </li><li> Mudar a solução de compensação após 7 dias. Preparar solução fresca CUBIC1 antes da utilização. </li><li> Verifique a transparência do tecido após 7 dias. Se necessário, deixe biópsias em solução compensação CUBIC1 até que o tecido é completamente transparente. </li><li> Uma vez que a biópsia da pele é transparente,remover a solução CUBIC1, e adicionar 4 ml de 1 x PBS para lavar o tecido 4 vezes durante 6 h a 37 ° C. </li><li> Lavar o tecido da pele em 20% w / v de sacarose em PBS num tubo de 15 ml durante 4 h a 37 ° C. </li><li> Congelar o tecido em forma de montagem Composto temperatura óptima de corte (OCT) num tubo de 15 ml durante a noite num congelador a -80 ° C. Nota: Este passo irá aumentar a permeabilidade da biópsia para a penetração do anticorpo em passos subsequentes. </li></ol></li></ol> 2. Imunofluorescência Coloração <ol><li> Descongelar o tecido de 1.2.9) à temperatura ambiente durante 2-3 h. </li><li> tecido de lavagem no tubo de 15 ml com 5 ml de PBS durante 8 horas à temperatura ambiente para remover outubro Composto. </li><li> Transferência de biópsias para um tubo de 2 ml, e incuba-se o tecido em 1 ml de coelho anti-Keratin14 ou anticorpo anti-Ki67 de coelho, ambos diluídos 1: 100 em PBST (PBS + 0,1% de Triton-X100) durante 3 dias num agitador numa 37 multidão. </li><li> biópsias transferência para um tubo de 15 ml, umaND lavar o tecido 4 vezes durante 6 horas em 5 mL de PBST num agitador num forno de 37 ° C. </li><li> Transferência de biópsias para um tubo de 2 mL, mais 1 ml de coelho anti-Alexa594 anticorpo secundário diluído 1: 100 em PBST e incubar 3 dias num agitador numa estufa de 37 ° C. </li><li> Transferência de biópsias para um tubo de 15 mL e lavar tecidos 4 vezes durante 6 horas em 5 mL de PBST num agitador num forno de 37 ° C. </li><li> Transferência de biópsias para um tubo de 2 mL, adicionar 1 ml de 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) solução contracoloração nuclear (1: 1000) em PBST e incubar durante a noite num agitador num forno de 37 ° C. </li><li> Remover solução contracoloração DAPI, e adicionar 1 ml de PBST para o tubo de 2 mL para lavar o tecido 4 vezes durante 6 horas num agitador num forno de 37 ° C. Nota: Passo opcional: Biopsias pode ser armazenada no escuro em 1x PBS com 0,02% de azida de sódio durante pelo menos 3 semanas. </li></ol> 3. Coloração Vermelho do Nilo <ol><li> Dissolve-se pó de Vermelho do Nilo em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração final de 1 mg / ml </li><li> Adicionar uma solução de Vermelho do Nilo ul de 1 ml de PBS a uma concentração final de 1 ug / ml. </li><li> Descongelar o tecido a partir de 1.2.9) à temperatura ambiente durante 2-3 h, e lavar com 5 ml de PBS durante 8 horas à temperatura ambiente. </li><li> Transferir biópsias para um tubo de 2 mL, e submergir o tecido em 1 ml de solução corante Vermelho do Nilo durante 2,5 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lavam-se as biópsias de pele em tubo 2 ml com 1 ml de PBST 4 vezes durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Remoção da solução de PBST a partir do tubo de 2 mL, mais 1 ml de solução DAPI contracoloração nuclear (1: 1000) em PBST e incubar durante a noite à temperatura ambiente. </li><li> Remover solução contracoloração DAPI, e adicionar 1 ml de PBST no tubo de 2 mL para lavar o tecido da pele 4 vezes durante 6 horas à temperatura ambiente. Nota: Passo opcional: Biopsias pode ser armazenada no escuro em 1x PBS com 0,02% de azida de sódio durante pelo menos 3 semanas. </li></ol> 4. Criação de Imagens <ol><li> Preparar a solução CUBIC2 compensação, que contém 50% De sacarose, 25% (w / v) de ureia, 10% (v / w) (w / v) de 2,2 &#39;, 2&#39; &#39;- nitrilotriethanol, e 0,1% (v / v) de Triton X-100. </li><li> Incubar o tecido da pele em 1 ml de solução CUBIC2 num tubo de 2 mL num agitador durante 24 horas num forno a 37 ° C. Este passo irá igualar o índice de refracção do tecido. </li><li> Verifique a clareza do tecido. Uma vez que é claro, posicionar toda a biópsia de pele (0,2 x 0,5 cm) no seu lado mais longo para uma lamela de vidro, de tal modo que a direcção do comprimento dos folículos pilosos é paralelo à superfície da lamela (# 1 24 x 60 mm) Nota: Passo opcional: biópsias Anticorpo-coradas podem ser guardadas em solução CUBIC2 durante cerca de 7 dias. biópsias Vermelho do Nilo-coradas só podem ser armazenados em solução CUBIC2 para até 1 dia, e deve ser trabalhada o mais rapidamente possível. </li><li> Prepare câmara de imagem (Figura 1) Nota: consumíveis necessários para a preparação da câmara de imagem são: azul aderência, massa de modelar ou similar, e 2 lamelas (24 x 50 mm) (Figura 1A). <ol><li> Prepare duas tiras finas de aderência azul (diâmetro cerca de 1 mm x 2 cm), e duas lamelas (Figura 1B). </li><li> Coloque aderência tiras azuis em um deslizamento de cobertura, permitindo espaço suficiente para biópsia da pele (Figura 1C). 4.4.3) </li><li> Coloque biópsia da pele em tiras entre a lamela em uma gota de solução CUBIC2 (Figura 1C). </li><li> Cubra biópsia da pele com a segunda lamela (Figura 1D). </li></ol></li><li> Coloque a câmara de imagem com a biópsia da pele montada na plataforma de um microscópio confocal e mover o tecido para a via de luz. </li><li> Digitalizar a amostra usando uma fonte de luz de mercúrio ou de halogéneo e filtros de epifluorescência padrão (por exemplo, DAPI / GFP / CY3 / Cy5) para identificar regiões fluorescente manchadas de interesse. </li><li> Regiões imagem de interesse usando uma objetiva de 10X e 20X (NA 0,75) e técnicas padrão de imagem confocal de fluorescência (ex., Com DAPI manchado amostras iluminar com um laser de 405 nm e recolher sinal de fluorescência entre 425-475 nm, e com Alexa Fluor 594 ou amostras Nile manchado de vermelho iluminar com um laser de 561 nm e recolher sinal de fluorescência entre 570-620 nm). </li><li> Gerar imagem Z-pilhas de cada região de interesse usando microscópio Z-stack software de aquisição de imagem (por exemplo., Utilizando elementos NIS imaging software 4,13, conforme descrito abaixo). <ol><li> Garantir potência do laser ideal e PMT HV / Offset configurações foram selecionadas para recolher fluorescência da amostra. </li><li> Abra a barra de ferramentas &quot;ND Aquisição&quot; de &quot;Controles de Aquisição&quot;. </li><li> Selecione a aba &quot;Configuração série Z&quot; (garantir que todas as outras abas são desmarcados). </li><li> Durante a digitalização ao vivo, o foco para o topo da amostra e pressione o botão &quot;Top&quot;. </li><li> Concentre-se para a parte inferior da amostra e pressione o botão &quot;Bottom&quot;. </li><li> Input tamanho necessário passo (ou pressione otimizado botão de tamanho do passo). </li><li> Préss &quot;Executar agora&quot;. </li><li> Salve Z-stacks resultante como pilhas de imagens TIFF individuais (1 fluorocromo por imagem Z-stack). </li></ol></li><li> Use imagem Z-pilhas para reconstruir as regiões volume 3D de interesse usando o software de análise 3D (por exemplo., Usando Imaris x64 7.2.3 conforme descrito abaixo). <ol><li> Inicie o software de análise. </li><li> Escolha o botão &quot;Ultrapasse&quot; na barra de ferramentas para a geração de volume 3D. </li><li> Abrir primeira imagem colorida Z-stack (por exemplo., DAPI). </li><li> Use o &quot;adicionar canal &#39;ferramenta para adicionar canais de cores adicionais, um canal por fluorocromo. Assim, uma amostra contendo tanto DAPI e fluorocromos Alexa Fluor 594 irá requerer dois canais. </li><li> Use o &quot;Propriedades da imagem&quot; ferramenta para definir as dimensões de pixel correta (voxel) (XYZ), conforme determinado no ponto 4.7 acima. </li><li> Use a ferramenta de &quot;Display de ajuste&quot; para alterar as cores de canal, conforme necessário (por exemplo, ajustar o canal DAPI para azul, Alexa Fluor 594 canal a vermelho). </li><li> para posição do volume 3D na janela de imagem, use o mouse para clicar e arrastar o volume conforme necessário. </li><li> Use a ferramenta &quot;Snapshot&quot; na barra de ferramentas para gerar capturas de ecrã da imagem em 3D. </li><li> Use a ferramenta &quot;Animação&quot; na barra de ferramentas para gerar filmes de rotação da amostra 3D. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratching+the+surface+of+skin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).</li>
<li>Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells: an update.</a> Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).</li>
<li>Hardy, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secret+life+of+the+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The secret life of the hair follicle.</a> Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).</li>
<li>Lim, X., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+skin+development%2C+homeostasis%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+controls+stem%2Fprogenitor+cell+proliferation+in+the+mouse+postnatal+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis.</a> J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).</li>
<li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li>
<li>Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment%3A+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li>
<li>Hamilton, E., Potten, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+hair+plucking+on+the+turnover+time+of+the+epidermal+basal+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Kinet%22%5BJournal%5D)">Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer.</a> Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).</li>
<li>Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+a+slowly+cycling+subpopulation+of+adult+murine+epidermal+cells+retains+carcinogen%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen.</a> Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).</li>
<li>Schweizer, J., Marks, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+study+of+the+distribution+and+frequency+of+Langerhans+cells+in+relation+to+formation+of+patterning+in+mouse+tail+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis.</a> J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).</li>
<li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. (88), e51749(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Os mecanismos reguladores que controlam o desenvolvimento de pele e homeostase são mais comumente estudada em 2D usando o seccionamento de tecidos e coloração histológica ou rotulagem com anticorpos, que permite apenas uma apreciação restrito da morfologia da pele, populações de células ou a expressão da proteína. Um número de métodos foram desenvolvidos para melhorar a visualização da organização espacial das células e proteínas com uma resolução de uma única célula em 3 dimensões em peças inteiras epidérmicas 10-...

A pele é essencial para a nossa sobrevivência. É composto por três camadas principais, a epiderme exterior, a derme e hipoderme. A epiderme é um tecido altamente regenerativa. É um epitélio escamoso estratificado, que consiste principalmente de queratinócitos. Queratinócitos nascem na camada basal, e mover-se para cima através das camadas suprabasais diferenciando, e, eventualmente, eles são eliminados na camada córnea exterior cerca de um mês após o seu nascimento. A epiderme se desenvolve uma série de apêndices, incluindo os folículos pilosos e glândulas sebáceas. Os folículos pilosos também regenerar de forma cíclica ao longo da vida 1. A capacidade de regeneração da epiderme é activado pela presença de células estaminais e progenitoras que estão localizados na camada basal da epiderme e folículo capilar interfoliculares 2. Muitas das vias de sinalização têm sido implicados no desenvolvimento e regeneração epidérmica. Alguns destes ocorrem dentroapenas a epiderme, tais como a via hedgehog. Outros eventos de sinalização ocorrem entre derme e epiderme 3. Por exemplo, os sinais de Wnt da derme são considerados como sendo importantes para o desenvolvimento do folículo de cabelo, e que são segregadas por a papila dérmica no início da fase anágena para activar a proliferação de células estaminais / progenitoras do folículo de cabelo e crescimento protuberância folículo piloso 4. É importante compreender os mecanismos celulares e moleculares que controlam o desenvolvimento epidérmica e regeneração para entender melhor como eles podem ser perturbado na doença de pele regenerativa, como câncer de pele. Este artigo descreve um lear C, U nobstructed B chuva Eu cocktails maging e C análise omputational protocolo de 5-7 (cúbico) para esclarecer preparações para a pele de montagem integrais, e visualizar os padrões de expressão de proteína em 3 dimensões com resolução de uma única célula por microscopia confocal. O método envolve a imersão de CUBIC peletecido em dois cocktails químicos à base de aminoálcool. Estas soluções ajustar os índices de refracção da amostra da pele, deixando o tecido transparente e as proteínas intactas, permitindo a imunodetecção de resolução de célula única. Usando este protocolo cúbicos, a proliferação basal e populações de queratinócitos na epiderme interfoliculares e no folículo de cabelo foram fotografadas em biópsias de pele de espessura total de ratinhos de tipo selvagem utilizando anticorpos anti-Keratin14 (K14) e anticorpos anti-Ki67. As glândulas sebáceas em biópsias de pele de tipo selvagem também foram visualizados usando Nile Red coloração. Por último, as populações de queratinócitos basais em tipo selvagem e biópsias de pele YAP2-5SA-Sc hiperplásicos foram comparados 8. Este protocolo permite CUBIC avaliação visual da expressão da proteína em biópsias de pele de espessura total com resolução de uma única célula, e é uma ferramenta importante para apreciar a anatomia da epiderme e defeitos morfológicos na pele de organismos geneticamente modificadosratos, e investigar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao desenvolvimento da epiderme e regeneração.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P6418</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96% (não desnaturado)</td> <td>Chem-supply</td><td>UN1170</td><td></td></tr><tr><td>Nile Red</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>72485-100MG</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N' -tetrakis (2-hidroxipropil) etilenodiamina</td><td>Merck Millipore</td><td>821940</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol mono-p-isooctilfenil éter</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Composto de Temperatura de Corte Ótima (OCT)</td><td>Anticorpo anti-Queratina14 Tecido-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Anticorpo anti-Ki67 Covance</td><td>PRB-155P</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-coelho Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Merck Millipore</td><td>66612</td><td></td></tr><tr><td>2,2&prime;,2&prime; '-nitrilotrietanol</td><td>Merck Millipore</td><td>137002</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal</td><td>Nikon Instruments Inc</td><td>Nikon A1 - Microscópio Confocal</td><td></td></tr><tr><td>cruZer6 Face Trimmer</td><td>Braun Braun</td><td>cruZer6 Face</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>438456</tr></tbody></table>

protocolo cubic visualiza protein expression na resolução única célula em preparações e peles, inteiros mount

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

A pele é essencial para a nossa sobrevivência. A camada epidérmica exterior consiste da epiderme interfolicular, que é um epitélio escamoso estratificado que cobrem a maior parte do nosso corpo, e apêndices epidérmicos, como os folículos pilosos e glândulas sudoríparas. A epiderme é submetido a regeneração e ao longo da vida em resposta a lesão. Isso é ativado por K14-expressando populações / células progenitoras-tronco epidérmicas basais que são fortemente regulados por múltiplos mecanismos reguladores ativos dentro da epiderme e entre epiderme e derme. Este artigo descreve um método simples para esclarecer rato espessura biópsias de pele cheios, e visualizar os padrões de expressão de proteína K14, Ki67 rotulados células em proliferação, Nile Red marcado sebócitos e rotulagem nuclear DAPI em resolução de uma única célula em 3D. Este método permite uma avaliação precisa e quantificação da anatomia da pele e patologia, e de fenótipos epidérmicas anormais nas linhas de rato geneticamente modificados. O protocolo cúbica é the melhor método disponível no momento para investigar as interações moleculares e celulares em biópsias de pele de espessura total com resolução de uma única célula.

Espessura dorsal biopsias completas de pele de ratinhos de tipo selvagem adultos foram esclarecidas, coradas com uma ligação de queratinócitos basais marcador Keratin14 (K14) de anticorpo, e os núcleos foram contrastadas com solução de coloração de DAPI (Figura 2 e um filme). Núcleos DAPI-positivos eram visíveis em toda a amostra (Figura 2A, C), e K14 coloração era visível exclusivamente na camada basal de espessura de uma célula da epiderme...

Este relatório descreve um protocolo cúbicos para esclarecer rato espessura biópsias de pele cheios, e visualizar os padrões de expressão de proteínas, células em proliferação e sebócitos com a resolução única célula em 3D. Este método permite uma avaliação precisa da anatomia da pele e patologia, e de fenótipos epidérmicas anormais nas linhas de rato geneticamente modificados.

Protocolo CUBIC Visualiza Protein Expression na resolução única célula em preparações e peles, inteiros Mount

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar padrões de proliferação celular e de expressão proteica ao nível de célula única em três dimensões e avaliar com precisão a anatomia e a patologia da pele. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre como mecanismos celulares e moleculares controlam o desenvolvimento e a regeneração epidérmicos e como esses mecanismos são perturbados durante doenças da pele. A principal vantagem desta técnica é que se trata de um protocolo tecnicamente simples para visualizar células individuais em biópsias de pele de espessura total em três dimensões, com uma precisão sem precedentes.O método também facilita a investigação das interações entre a epiderme e a derme em amostras completas de pele. Em geral, pesquisadores novos nesse método podem ter alguma dificuldade ao preparar pequenas biópsias planas de pele sem danificar os folículos pilosos. O procedimento será demonstrado por Betty Maclarios, aluna de doutorado na Unidade de Dermatologia Regenerativa e do Desenvolvimento da UNSW Australia.Inicie utilizando tesouras para aparar os pelos do pescoço de um camundongo eutanasiado, tomando cuidado para não ferir a pele. Em seguida, descontamine a pele com etanol 70% e PBS. Depois, levante a pele dorsal do pescoço com pinça e use tesoura para remover uma área de aproximadamente 1,5 por 4 cm da pele dorsal do camundongo.Em seguida, aplainar a derme da pele com o lado voltado para baixo sobre uma folha de papel filtro, anotando a orientação anterior-posterior da amostra, e cortar o papel ao redor da pele dissecada. Para uma imagem ideal, as amostras de pele precisam permanecer planas, com orientação consistente dos folículos pilosos. Para manter as amostras na posição anterior-posterior correta, fixamos os fragmentos de pele no papel filtro em biópsias retangulares.Transfira as amostras para um tubo de 15 mL contendo PFA a 4% recém-preparado em PBS. Em seguida, quando estiverem firmemente fixadas no papel filtro, transfira os espécimes para um novo tubo de 15 mL com PBS para duas lavagens de cinco minutos cada. Para clarear as biópsias de pele, após a segunda lavagem, use uma lâmina de barbear afiada para cortar os tecidos em pedaços de aproximadamente 0,2 por 0,5 cm, tomando cuidado para que os lados mais longos das amostras sejam cortados ao longo da direção anterior-posterior das amostras.Realizar o corte ao longo do lado da biópsia paralelamente à orientação dos folículos capilares também ajuda a evitar danos extensivos aos folículos capilares. Em seguida, submergir as biópsias em 5 mL de solução de clareamento cúbica um recém-preparada em um novo tubo de 15 mL e colocar o tubo em uma plataforma rotativa em forno de hibridização a 37 graus Celsius. Assim que os fragmentos de tecido ficarem transparentes, lavar as biópsias em 4 mL de PBS por quatro lavagens de seis horas cada a 37 graus Celsius, seguidas por uma lavagem de quatro horas a 37 graus Celsius em sacarose 20% peso por volume em PBS.No final da incubação, congele cada amostra em composto de temperatura de corte ideal em tubos individuais de 15 mL durante a noite a 80 graus Celsius para aumentar a permeabilidade dos tecidos à penetração de anticorpos. Na manhã seguinte, marque as amostras de pele com os anticorpos apropriados e corantes vitais de interesse. Em seguida, incube os espécimes em 1 mL de solução de clareamento cúbico dois recém-preparada em tubos de 2 mL em agitador durante 24 horas no forno a 37 graus Celsius para equalizar o índice de refração dos tecidos.Quando os tecidos estiverem transparentes, posicione as biópsias ao longo do lado maior de lamínulas de vidro individuais de modo que a direção do crescimento do folículo piloso seja paralela à superfície da lamínula. Coloque uma gota da solução cúbica dois sobre o tecido. Coloque duas tiras de massa adesiva azul de 1 mL por 2 cm sobre uma lamínula e, em seguida, cubra a biópsia com uma segunda lamínula.Em seguida, coloque a câmara de imagemação no estágio de um microscópio confocal e posicione o tecido no trajeto da luz. Usando a fonte de luz apropriada e os filtros padrão de epifluorescência, escaneie a amostra para identificar regiões de interesse marcadas com fluorescência e, então, adquira imagens confocais fluorescentes das regiões de interesse. Com este método, biópsias de pele dorsal espessas de camundongos adultos do tipo selvagem podem ser clareadas e marcadas com anticorpo contra o marcador de queratinócitos basais queratina 14.Núcleos positivos para Dappy são visíveis em toda a amostra e permitem a apreciação de algumas características anatômicas, como as papilas dérmicas. A marcação para K14 é evidente na camada basal do epitélio interfolicular, que possui uma célula de espessura. Essa marcação delimita as glândulas sebáceas e as bainhas radiculares externas dos folículos pilosos, bem como os germes pilosos secundários, com apenas baixos níveis de expressão de K14 detectados na região do bulbo dos folículos pilosos.Para visualizar as células em proliferação, biópsias de pele dorsal com espessura total na fase telógena de camundongos adultos do tipo selvagem podem ser clareadas e coradas conforme demonstrado, revelando a presença de queratinócitos em proliferação na epiderme interfolicular basal e no istmo, mas não na região da bolsa dos folículos pilosos. Para visualizar as glândulas sebáceas, biópsias de pele dorsal com espessura total na fase anágena de camundongos adultos do tipo selvagem podem ser clareadas e coradas, facilitando a detecção das glândulas sebáceas na região do istmo dos folículos pilosos. Para visualizar alterações morfológicas na epiderme e em animais transgênicos, biópsias de pele dorsal com espessura total podem ser clareadas e coradas, revelando hiperplasia da epiderme interfolicular e folículos pilosos anormais com massas celulares marcadas por K14 estendendo-se proximalmente para dentro da derme, representando populações aumentadas de células-tronco transgênicas.Após assistir a este vídeo, deveremos ter uma boa compreensão de como preparar e clarificar amostras de pele e visualizar padrões de expressão proteica com resolução de única célula em três dimensões. Este método é simples de executar e utiliza reagentes relativamente seguros e de baixo custo. No futuro, mais anticorpos serão testados quanto à sua compatibilidade com este método, permitindo que esta análise seja expandida para visualizar mais proteínas e certos tipos de interesse.Outros métodos de imagem, como a microscopia de folha de luz, podem ser realizados para visualizar a anatomia da pele e os padrões de expressão proteica de amostras cutâneas maiores em três dimensões. Após seu desenvolvimento, esta técnica abrirá caminho para pesquisadores na área de dermatologia explorarem as interações celulares e moleculares entre a derme e a epiderme na homeostase da pele, em modelos de camundongos geneticamente modificados e em um de nossos modelos de doença cutânea.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo descreve a técnica de visualização baseada em CUBIC, uma técnica de imagem dependente de limpeza de tecido para avaliação visual da expressão de proteínas em biópsias de pele de montagem total em resolução de célula única em 3D. Este protocolo tecnicamente simples permite a visualização de proteínas da pele sem preparar cortes de pele.

Visualização da expressão de proteínas baseada em CUBIC: um procedimento para visualizar a expressão de proteínas em biópsias de pele de camundongos de espessura total

Apresenta-se um protocolo para obter matrizes derivadas de células ricas em proteínas da matriz extracelular, utilizando Crowders macromoleculares (MMC). Além disso, apresentamos um protocolo que incorpora MMC na geração de co-cultura de pele organotï¿½ica 3D, o que reduz o tempo de cultura, mantendo a maturidade da construção.

Melhorar 2D e 3D Pele<em&gt; In Vitro</em&gt; Models Usando Macromolecular Crowding

A imuno-histoquímica é uma poderosa técnica de laboratório para avaliar a localização e expressão de proteínas nos tecidos. Os métodos semiautomatizados atuais de quantificação introduzem subjetividade e muitas vezes criam resultados irreproduzíveis. Aqui, descrevemos métodos para imuno-histoquímica multiplexada e quantificação objetiva da expressão e co-localização de proteínas usando imagens multiespectrais.

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Apresentamos uma solução de software para o rastreamento semi-automatizado da concentração relativa de proteína ao longo do comprimento de protrusões celulares dinâmicas.

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

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Aqui nós apresentamos gotículas endereçável microarrays (ADMs), um método de matriz com base gota capaz de determinar a abundância absoluta de proteínas em células únicas. Podemos demonstrar a capacidade de ADMs caracterizam a heterogeneidade na expressão do tumor supressor p53 de proteína em uma linhagem de células cancerosas humanas.

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Protocolo CUBIC Visualiza Protein Expression na resolução única célula em preparações e peles, inteiros Mount

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