Protocolo CUBIC Visualiza Protein Expression na resolução única célula em preparações e peles, inteiros Mount

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a proliferação celular e os padrões de expressão de proteínas no nível de uma única célula em três dimensões e avaliar com precisão a anatomia e a patologia da pele. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre como os mecanismos celulares e moleculares controlam o desenvolvimento e a regeneração epidérmica e como esses mecanismos são perturbados durante a doença de pele. A principal vantagem dessa técnica é que ela é um protocolo tecnicamente simples para visualizar células individuais em biópsias de pele de espessura total em três dimensões com uma precisão sem precedentes.

O método também facilita a investigação das interações entre a epiderme e a derme em amostras de pele completa. Geralmente, os pesquisadores novos nesse método podem ter um pouco de dificuldade na preparação das pequenas biópsias de pele plana sem danificar os folículos pilosos. Demonstrando o procedimento estará Betty Maclarios, Ph.D. estudante da Unidade de Dermatologia Regenerativa e do Desenvolvimento da UNSW Austrália.

Comece usando aparadores para raspar o cabelo do pescoço de um camundongo sacrificado, tomando cuidado para não ferir a pele. Em seguida, descontamine a pele com etanol 70% e PBS. Em seguida, levante a pele dorsal do pescoço com uma pinça e use uma tesoura para remover uma área de aproximadamente 1,5 por 4 cm da pele dorsal do rato.

Em seguida, alise a derme da pele com o lado voltado para baixo em um pedaço de papel de filtro, anotando a orientação ântero-posterior da amostra e apare o papel ao redor da pele dissecada. Para uma imagem ideal, as amostras de pele precisam permanecer planas com orientação consistente do folículo piloso. Para manter as amostras na posição ântero-posterior adequada, fixamos os pedaços de pele no papel filtro em biópsias retangulares.

Transfira as amostras para um tubo de 15 mL cheio de 4% PFA e PBS recém-preparados. Então, quando estiverem firmemente fixados ao papel de filtro, transfira as amostras para um novo tubo de 15 mL de PBS para duas lavagens de cinco minutos. Para limpar as biópsias de pele, após a segunda lavagem, use uma lâmina de barbear afiada para cortar os tecidos em pedaços de aproximadamente 0,2 por 0,5 cm, tomando cuidado para que os lados mais longos das amostras sejam cortados ao longo da direção ântero-posterior das amostras.

Cortar ao longo do lado da biópsia paralelo à orientação dos folículos pilosos também ajuda a evitar danos extensos ao folículo piloso. Eles submergem as biópsias em 5 mL de uma solução cúbica recém-preparada em um novo tubo de 15 mL e colocam o tubo em uma plataforma rotativa em um forno de hibridização a 37 graus Celsius. Uma vez que os pedaços de tecido estejam transparentes, lave as biópsias em 4 mL de PBS por quatro lavagens de seis horas a 37 graus Celsius, seguidas de uma lavagem de quatro horas e 37 graus Celsius em 20% de peso por volume de sacarose e PBS.

No final da incubação, congele cada amostra em composto de temperatura de corte ideal em tubos individuais de 15 mL durante a noite a 80 graus Celsius para aumentar a permeabilidade dos tecidos à penetração de anticorpos. Na manhã seguinte, core as amostras de pele com os anticorpos apropriados e corantes vitais de interesse. Em seguida, incube as amostras em 1 mL de solução cúbica de limpeza de dois recém-preparada em tubos de 2 mL em um agitador por 24 horas no forno a 37 graus Celsius para uniformizar o índice de refração dos tecidos.

Quando os tecidos estiverem limpos, posicione as biópsias ao longo do lado mais longo das lamínulas de vidro individuais, de modo que a direção do crescimento do folículo piloso seja paralela à superfície da lamínula. Coloque uma gota de solução cúbica de dois sobre o tecido. Coloque duas tiras de 1 mL por 2 cm de aderência azul em uma lamínula e, em seguida, cubra a biópsia com uma segunda lamínula.

Em seguida, coloque a câmara de imagem em um estágio de microscópio confocal e mova o tecido para o caminho da luz. Usando a fonte de luz apropriada e filtros de epifluorescência padrão, escaneie a amostra para identificar regiões de interesse coradas com fluorescência e, em seguida, adquira imagens confocais fluorescentes das regiões de interesse. Usando este método, ambas as biópsias de pele dorsal de camundongos adultos do tipo selvagem podem ser esclarecidas e coradas com anticorpos contra o marcador basal de queratinócitos queratina 14.

Núcleos positivos são visíveis em toda a amostra e permitem a apreciação de algumas das características anatômicas, como as papilas dérmicas. A coloração K14 é aparente na camada basal de uma célula espessa da epiderme interfolicular. Delineando as glândulas sebáceas e as bainhas radiculares externas dos folículos pilosos e nos germes capilares secundários com apenas baixos níveis de expressão de K14 detectados na área de protuberância dos folículos pilosos.

Para visualizar as células em proliferação, biópsias de pele dorsal de espessura total no telógeno de camundongos adultos do tipo selvagem podem ser esclarecidas e coradas, conforme demonstrado, revelando a presença de queratinócitos em proliferação na epiderme interfolicular basal e no istmo, mas não na região da protuberância dos folículos pilosos. Para visualizar as glândulas sebáceas, biópsias de pele dorsal de espessura total no antígeno de camundongos adultos do tipo selvagem podem ser esclarecidas e coradas, facilitando a detecção das glândulas sebáceas na região do istmo dos folículos pilosos. Para visualizar alterações morfológicas na epiderme e animais transgênicos, biópsias de pele dorsal de espessura total podem ser esclarecidas e coradas, revelando hiperplasia da epiderme interfolicular e folículos pilosos anormais com massas celulares marcadas com K14 estendendo-se proximalmente para a derme, representando as populações de células-tronco transgênicas aumentadas.

Depois de assistir a este vídeo, devemos ter uma boa compreensão de como preparar e clarificar amostras de pele e visualizar padrões de expressão de proteínas na resolução de uma única célula em três dimensões. Este método é simples de executar e usa reagentes relativamente seguros e baratos. No futuro, mais anticorpos serão testados quanto à sua compatibilidade com este método, permitindo que esta análise seja estendida para visualizar mais proteínas e certos tipos de interesse.

Outros métodos de imagem, como microscopia de folha de luz, podem ser realizados para visualização da anatomia da pele e padrões de expressão de proteínas de amostras de pele maiores em três dimensões. Após seu desenvolvimento, esta técnica abrirá caminho para pesquisadores no campo da dermatologia explorarem as interações celulares e moleculares entre a derme e a epiderme na homeostase da pele, em modelos de camundongos geneticamente modificados e em um de nossos modelos de doenças de pele.