Administração oral de rotenona usando um Gavage e Análise de Imagem de Alpha-sinucleína Inclusões no sistema nervoso entérico

Os sintomas da doença de Parkinson, incluindo disfunção motora e da fala, resultam da atividade reduzida das células secretoras de dopamina no cérebro. O sistema nervoso entérico e o bulbo olfatório são as estruturas nervosas mais expostas e as primeiras a serem afetadas. A doença de Parkinson tem sido associada à exposição a pesticidas.

Para analisar os efeitos dos pesticidas no sistema nervoso entérico, o pesticida roone é administrado a camundongos por gavagem oral. Os camundongos são então perfundidos intracardíacos com 4% de paraforme, aldeído cerebral e sistema nervoso entérico. O tecido é extraído, preparado e imunomarcado para as proteínas associadas à DP.

Imagens de beta-três tubulinas e alfa-sinucleína adquiridas por microscopia confocal demonstram o acúmulo de alfa-sinucleína no interior dos neurônios do sistema nervoso entérico em animais expostos a pesticidas. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a administração sistêmica de rotenona, é que, usando esta técnica, é garantido que o efeito da rotenona esteja confinado ao sistema nervoso entérico. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na doença de Parkinson, como sua etiologia e mecanismos subjacentes à sua progressão.

As implicações dessa técnica ampliam a terapia com torre e o diagnóstico da doença de Parkinson, pois permitirão o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos e métodos diagnósticos. Embora esse método possa fornecer informações sobre a fisiopatologia da doença de Parkinson, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como o estudo do efeito de outras toxinas ambientais nos sistemas nervosos entérico, simpático e parassimpático, bem como na parede intestinal. Geralmente, os indivíduos novos nesses métodos terão dificuldades porque leva um tempo para dominar a gavagem.

Tive a ideia desses métodos pela primeira vez quando li sobre a ligação entre pesticidas e doença de Parkinson. Também foi útil ver a conferência de altos CORAs no Congresso Mundial de Parkinson em Berlim em 2005. A demonstração pacífica deste método é necessária.

O método para administrar ol com a gavagem é difícil, pois os camundongos têm uma anatomia diferente dos humanos do outro lado, a análise da imagem foi feita com etapas personalizadas para essas imagens. Comece o protocolo pesando o animal. Calcule o volume apropriado de rotenona.

São necessários 0,01 mililitros por grama de peso do animal, o que corresponde a uma dose de cinco miligramas por quilograma. Carregue uma seringa de um mililitro com a solução roone e, em seguida, carregue uma segunda seringa com a solução do veículo. Pegue o mouse e segure a cauda do mouse com uma mão.

Estique a pele do pescoço puxando-a com os dois primeiros dedos da outra mão. Assim que a cabeça estiver fixada entre os dois dedos, encoste-a na palma da mão e vire-a de cabeça para baixo. Conserte a cauda.

Usando o quarto e o quinto dedos, mantendo a cabeça voltada para trás, pressione o palato para abrir a boca do rato. Introduza suavemente a gavagem na boca. Mova lentamente a gavagem na direção do estômago até que seu comprimento total seja inserido.

Para evitar a entrada de material nos pulmões, administre a solução ou veículo de Roone pressionando suavemente o êmbolo. Quando concluído, extraia lentamente a gavagem, coloque o animal de volta em outra gaiola até que todos os animais de uma gaiola estejam prontos. Após o tratamento, os camundongos são profundidos intracardíacos com aldeído paraforme a 4%.

No PBS, as entranhas são então extraídas por dissecção e colocadas em 15% de sacarose durante a noite. No dia seguinte, o tecido é transferido para 30% de sacarose e incubado novamente durante a noite a quatro graus Celsius. O tecido é então colocado em um freezer de 80 graus Celsius negativos e armazenado até o uso usando um criostato intestino de 20 mícrons.

As seções transversais são transferidas para lâminas rost, procedimentos de bloqueio e imunocoloração. Em seguida, são realizados anticorpos anti-beta três tubulina e anti-sinucleína. Recomenda-se que uma pessoa externa realize uma análise cega dos dados.

Para iniciar a análise, abra o software Fiji. Abra o arquivo de imagem confocal. Em seguida, divida os canais para que seja possível trabalhar em cada canal de forma independente.

Feche os canais que não serão usados e selecione, analise, defina, dimensione e defina o tamanho do pixel para um. Defina a distância conhecida para 0,13 e clique em global. O tamanho da imagem agora será mostrado em mícrons.

Selecione o canal de alfa-sinucleína e selecione o gânglio. Certifique-se de que a seleção envolve o gânglio em todas as fatias. Duplique a imagem com o gânglio selecionado apenas uma imagem do tamanho do gânglio será duplicada.

Pressione editar claro fora da parte da imagem fora da região selecionada ficará preta. Duplique a imagem novamente para determinar o quão bem o procedimento foi. Imagens com uma relação sinal-ruído de fundo baixa não devem ser usadas para análise de imagens.

Selecione o limite de ajuste de imagem. Em seguida, selecione entropia máxima. Em seguida, passe sobre as fatias na imagem cortada e a original para garantir que o procedimento correu bem.

O limite trópico seleciona um nível de sinal de intensidade com base no histograma da imagem, e apenas os pixels com intensidades superiores a esse limite serão exibidos em um processo de seleção de imagem branco sobre preto. Em seguida, clique em suave. Esta etapa transforma as bordas pixeladas das imagens em um processo de seleção de bordas suaves.

Em seguida, clique em binário e escolha Tornar binário. A imagem será exibida como uma imagem duplicada de imagem preta sobre branca para executar a próxima etapa na imagem duplicada, clique em analisar, analisar partículas. Em seguida, selecione mostrar contornos e clique em resumir.

O restante da configuração deve ser deixado no padrão. Esta função reconhece o número total de pixels com um sinal e aqueles que são agrupados juntos a superfície total de pixels com sinal. Além disso, o número de grupos de pixels e o tamanho médio são relatados.

Compare e selecione a fatia com a maior área total que se ajusta bem. A fatia será marcada. Copie a tabela de dados com a superfície total de alfa-sinucleína, o número de inclusões e o tamanho médio das partículas.

Cole os dados em uma planilha do Excel ou anotados em outro lugar. Retorno a Fiji. Encontre a fatia selecionada anteriormente no canal de beta tubulina e selecione-a.

Selecione a área do gânglio e clique em analisar. Em seguida, selecione medir. Outra tabela aparecerá mostrando a superfície total do gânglio.

Extraia os dados da tabela para uma planilha do Excel próxima à medição de alfa sinucleína ou copie-os para outro lugar usando o Excel. Divida os diferentes parâmetros obtidos na medição da alfa-sinucleína pela superfície do gânglio para obter a superfície total da alfa-sinucleína e o número de inclusão normalizado pelo tamanho do gânglio para analisar os efeitos da rona atuando localmente no sistema nervoso entérico, cinco miligramas por quilograma da podridão do pesticida conhecida foi administrada por gavagem oral a camundongos C 57 pretos de 1 ano de idade. O cromatograma mostrado aqui mostra a presença de um pico conhecido de rotana uma hora após a administração: camundongos de controle tratados com 20 miligramas por quilograma de rotenona, 10 e cinco miligramas por quilograma de rotenona.

Os níveis de rotenona foram determinados para extrações de sangue e cérebro e tronco encefálico por HPLC, conforme mostrado aqui. A administração de cinco miligramas por quilograma de podre por gavagem oral não resulta em níveis mensuráveis no sangue uma, duas ou três horas após o tratamento, conforme determinado pela H plc. Este gráfico mostra os níveis de podridão no cérebro e no tronco cerebral de camundongos tratados.

Uma hora após a extração, a administração de 10 miligramas por quilograma ou menos de rotenona mostra que não há níveis de roton no cérebro ou nas amostras do tronco encefálico. Uma hora após a administração do complexo mitocondrial, uma atividade foi avaliada em amostras musculares e cerebrais de camundongos tratados com 1,5 mês. Não há diferença significativa entre os grupos que não mostram inibição do complexo mitocondrial um, confirmando assim que não houve rone nessas regiões.

A análise da doença de Parkinson, componente do corpo de Lewy, alfa-sinucleína, após a administração de rone, permite a determinação confiável da quantidade total de superfície de alfa-sinucleína, a presença de inclusões de alfa-sinucleína e o padrão de alfa-sinucleína na célula. Esta figura mostra a coloração anti-beta três tubulina, alfa-sinucleína e DAPI em cortes de duodeno e íleo, como pode ser visto aqui. O tratamento de 1,5 meses com barata conhecido induziu um aumento do padrão pontilhado de alfa-sinucleína dentro dos gânglios do sistema nervoso entérico, mesmo um em comparação com três meses de controles.

Esse padrão pode ser visto tanto no íleo quanto no duodeno. Após três meses de tratamento, a formação de inclusões maiores de alfa-sinucleína pode ser observada na coloração imunofluorescente usando anti-alfa sinucleína, theof, flavina e DPI demonstra agregação de maiores acúmulos de alfa-sinucleína apenas aos três meses. Este experimento foi analisado usando segmentação automática e métodos de limiar baseados em entropia.

No gráfico à esquerda, cada coluna representa a superfície total da alfa-sinucleína à superfície do gânglio. No gráfico à direita, cada coluna representa o número total de inclusões de alfa-sinucleína por superfície ganglionar tomada. Juntos, esses dados sugerem que a administração local de rotenona induz fosforilação, acúmulo e agregação de alfa-sinucleína com gliose nos gânglios do sistema nervoso entérico Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em um minuto por animal, se realizada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante introduzir a gavagem suavemente e, se algum obstáculo for encontrado, é melhor retirá-la e introduzi-la novamente seguindo esses procedimentos. Outros métodos como HPLC, imunocoloração e análise de imagem podem ser realizados. Isso permitirá analisar outras regiões, os efeitos da substância ou mesmo a presença da substância no sangue após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para os neurocientistas investigarem os efeitos das neurotoxinas ambientais no sistema nervoso entérico. Depois de assistir a este vídeo, você poderá aplicar o medidor corretamente e analisar as imagens provenientes da imunoquímica. Não se esqueça de que trabalhar com podres pode ser extremamente perigoso.

Portanto, recomendamos o uso de luvas e máscaras durante a realização deste procedimento. O.