Visualização de replicação do DNA mitocondrial em células individuais por Edu amplificação de sinal

O objetivo geral deste procedimento é rotular e visualizar a replicação M-T-D-N-A em neurônios cultivados. Isso é feito primeiro incubando neurônios com o EDU análogo da timidina por duas a 24 horas. A segunda etapa do procedimento é rotular o EDU que contém uma alcina com a azida verde orgon fluorescente 4 88 por meio de uma reação covalente catalisada por cobre.

A etapa final do procedimento é amplificar o sinal verde do orgon com a etapa de amplificação do sinal de aramida, a fim de visualizar o EDU que foi incorporado no DNA MT recém-sintetizado. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a replicação do DNA MT em compartimentos subcelulares específicos de neurônios por meio da combinação da química clicka EDU e subsequente amplificação do sinal da mente lacrimal. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a marcação BRDU, é que a marcação EDU é mais fácil e suave, permitindo a coloração imunofluorescente adicional de marcadores neuronais.

Este método pode responder a questões-chave na regulação do número de mitocôndrias, como a forma como os neurônios atendem às mudanças nas cargas de energia em seus compartimentos subcelulares, incluindo corpos celulares, axônios, dendritos e terminais sinápticos. Portanto, este método pode fornecer informações sobre os mecanismos subjacentes à patogênese de várias doenças neurológicas mitocondriais, incluindo neuropatia e neurodegeneração. Mas, o mais importante, também pode ser aplicado a outros sistemas onde as alterações na cópia do DNA mitocondrial provavelmente estão subjacentes à patogênese do estado da doença, incluindo toxicidade de drogas, câncer e envelhecimento.

Este vídeo demonstrará como rotular o DNA mitocondrial recém-sintetizado abreviado como MTDNA em neurônios ganglionares da raiz dorsal que foram cultivados em lamínulas de vidro estéreis de 12 milímetros. Em uma placa de cultura de 24 poços, diluir o estoque de 10 milimolares de cinco etanol e duas uridinas doxi, abreviado EDU do kit de ensaio de microplaca Clicka EDO de um a 100 em meio de cultura para um estoque de 10 XEDU. O estoque de 10 XEDU é então adicionado diretamente ao meio em cada poço, incubar os neurônios tratados por duas a 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma capela de exaustão.

Fixe os neurônios em aldeído paraforme a 2% por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente. Lave duas vezes em um XPBS por dois a cinco minutos cada lavagem. Os neurônios fixos podem ser armazenados em um XPBS fresco a quatro graus Celsius por até um mês.

Prepare uma câmara úmida conforme descrito no texto anexo. Use pinças de ponta fina para transferir 28 lamínulas fixas, incluindo controles EDU positivos e negativos para folhas de paraforme hidrofóbico M dentro da câmara úmida. Reaplique 200 a 300 microlitros de um XPBS para cobrir a superfície de cada lamínula.

Prepare o kit de ensaio click it conforme descrito no texto e os fabricantes e instruções para rotular o DNA mitocondrial em 75 a 80 microlitros de uma solução permeável contendo 0,1% de tritton X em um XPBS para cada cobertura, deslizamento, cobertura e incubação em temperatura ambiente por 10 minutos. Use uma pipeta de transferência de bulbo com uma ponta de 200 microlitros afixada na extremidade. Para remover suavemente o líquido sem perder células.

Use uma pipeta de bulbo para inundar suavemente a tampa. Deslize com 200 a 300 microlitros de um XPBS para lavar completamente a solução anterior. Lave cada lamínula duas vezes.

Pipete 75 a 80 microlitros de peróxido de hidrogênio fresco a 1% em um XPBS em cada lamínula. Incubar coberto por 30 minutos em temperatura ambiente para extinguir a atividade da peroxidase endógena. Enxágüe duas vezes com um XPBS como antes, prepare o coquetel de reação de clique conforme detalhado no texto anexo.

Canalize para cima e para baixo para misturar. Não vórtice pós-fixar os neurônios com 75 a 80 microlitros de clique no fixador EDU por lamínula incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Durante a incubação do postfix, dilua o coquetel de reação com um volume igual de fixador clicka EDU.

Adicione o coquetel de reação a cada capa de lamínula para proteger da luz e incube-o em temperatura ambiente por 25 minutos. Remova suavemente o coquetel de reação duas vezes com um tampão de bloqueio diluído de um x sob um microscópio epifluorescente. Verifique se há coloração verde orgon nos núcleos quando a coloração EDU estiver completa.

Comece a amplificação do sinal de cupins ou TSA, adicione uma solução de bloco de 1% de TSA a cada lamínula e incube a temperatura ambiente por 30 minutos. Gire brevemente o estoque de anticorpos conjugados com peroxidase de rabanete verde antiona Preparado duas a 24 horas antes do TSA, dilua o anticorpo primário um a 300 em solução de bloqueio TSA e inverta ou pipete para misturar o vórtice de nó de sintonia. Adicione 75 microlitros a cada tampa, deslize e incube a quatro graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, enxágue três vezes com um XPBS em temperatura ambiente. Incube as lamínulas na lavagem final por mais 30 a 60 minutos para garantir que o anticorpo primário não ligado seja removido. Prepare a reação IDE de acordo com a parte de texto deste protocolo imediatamente antes do uso.

Incube as lamínulas com a reação IDE por 15 minutos à temperatura ambiente. Lave três vezes com um XPBS incubando na lavagem final por 30 a 60 minutos como antes ao microscópio. Verifique se há neurônios corados com sucesso na montagem de DNA MT em lâminas de vidro com um meio de montagem ANTIFA contendo DPI mostrado aqui estão imagens representativas de contraste de interferência diferencial de neurônios do gânglio da raiz dorsal embrionários e adultos que são normalmente usados para análise.

Esses diagramas esquemáticos representam o procedimento para rotular EDU em MTD NA com um sinal fluorescente verde. As células de neuroblastoma F 11 mitoticamente ativas servem como um controle positivo e ilustram o padrão de marcação de EDU que foi incorporado no DNA nuclear e mitocondrial nessas imagens de fluorescência representativas sobrepostas ao campo claro. Os sinais pontilhados verdes mostram o sinal EDU amplificado incorporado ao MDDNA recém-sintetizado de neurônios do gânglio da raiz dorsal embrionária e adulta.

O procedimento de marcação EDU permite a coloração imunofluorescente subsequente de marcadores neuronais, como neurofilamento em vermelho. Esses diagramas esquemáticos representam o procedimento para rotular EDU e MTD NA com um sinal fluorescente vermelho. As células de neuroblastoma F 11 mitoticamente ativas servem como um controle positivo e ilustram o padrão de marcação de EDU que foi incorporado no DNA nuclear e mitocondrial.

Este diagrama esquemático representa o procedimento para rotular BRDU em MTDNA recém-sintetizado com um sinal fluorescente verde ou vermelho. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de executar controles usando células mitoticamente ativas para verificar a marcação bem-sucedida de EDU e núcleos celulares antes de prosseguir para as etapas de amplificação para visualizar a marcação de DNA MT Seguindo este procedimento. Outros métodos, como a imunofluorescência padrão, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como a síntese de DNA mitocondrial é regulada em subpopulações específicas de neurônios ou compartimentos neuronais Devido ao seu desenvolvimento, essa técnica abrirá caminho para pesquisadores no campo da neurobiologia explorarem a regulação do número mitocondrial em modelos de cultura de fisiologia normal e modelos de cultura que simulam doença prejudicada.

Estados neurológicos.