Name: Protocolo para infecções por dengue em mosquitos (A. aegypti) e Determinação Fenótipo Infecção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T21:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 25 s
Description: Aprenda a infectar mosquitos Aedes aegypti com vírus da dengue para estudar genes de resistência viral. Este protocolo demonstra propagação viral, alimentação de mosquitos e titulação em glândulas salivares e intestino médio.

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A. Propagar vírus na linhagem de células C6/36. <ol><li> Células crescem a 80% confluência em 75 frasco cm 2; </li><li> Remova a mídia com 3-4 ml que fica no frasco; </li><li> Tomar 0,5 ml do vírus estoque e adicionar na célula acima, com a multiplicidade de infecção de 1,5 partículas de vírus por célula. Agitar o frasco durante 15 minutos lentamente na temperatura ambiente. </li><li> Incubar por 45 minutos em 5% CO 2 e 37 ° C </li><li> Adicionar 30 ml de mídia, e incubar por 5 dias. </li></ol> B. Prepare a mistura de vírus e de sangue <ol><li> Retire a célula com o raspador e transferir o celular e mídia para os 50 mL tubos cônicos; </li><li> Centrifugado a 800g por 10 minutos; coletar o sobrenadante, mas deixar 1ml do sobrenadante com o pellet celular; </li><li> Congelar o pellet celular acima das emissões de CO 2 e, em seguida, secar descongelar em banho-maria 37 ° C, repita duas a três vezes; </li><li> Centrifugado a 800g por 10 minutos, retirar o sobrenadante, e combinam com o sobrenadante do passo 3; </li><li> Coletar sangue humano total com o mesmo procedimento (passo 3) para a preparação da cultura gametócitos para infectar mosquitos Anopheles com Plasmodium falciparum; </li><li> Combinar a quantidade igual de todo o sangue acima do humano com o vírus sobrenadante do passo 4, e adicionar soro humano (10% do volume total). </li><li> Incubar a mistura acima de sangue humano e vírus da dengue durante 30 minutos a 37 ° C banho de água </li></ol> Alimentação mosquitos C. Este procedimento é quase idêntico ao que foi descrito na seção de infecções Plasmodium falciparum em mosquitos. Nós ensaio a infecção do intestino médio no dia 7, ea infecção salivar em 14 dias após a sangue-feeding. Todo o material que entrou em contato com o vírus são tratados pela primeira vez com etanol 75% e depois com lixívia a 10%. D. Ensaio o título do vírus no tecido mosquito <ol><li> Dois ou três dias antes da dissecação de tecido mosquito, crescer C6/36 célula em uma placa de 24 poços de tal forma que a célula de chegar a 80% confluência no dia em que o ensaio é realizado; </li><li> Os mosquitos são anestesiados a 4 ° C, sacrificados e surgiu estéril, mergulhando-os em etanol 75% por 1 minuto. Em seguida, os mosquitos foram lavados com água estéril duas vezes antes de dissecção da glândula salivar do intestino médio ou sob o microscópio de dissecação. A partir deste passo, todo o procedimento a seguir deve ser conduzido em um ambiente estéril, como uma cabine de segurança biológica. Estes tecidos são transferidos para um tubo contendo 150 mL de mídia e homogeneizados com uma pelota Kontes pilão do motor por 90 segundos; </li><li> Fazer uma diluição de 1:100, adicionando 10 ml do homogenato em media 990 mL; </li><li> Fazer mais um: 10, 1:100 e 1:1000 de diluição com o meio na placa de 96 poços; </li><li> Remova a mídia na placa de 24 poços, e adicione 100 ml de cada uma das diluições acima de quatro em cada cavidade correspondente; </li><li> Agite a placa lentamente por 15 minutos na temperatura ambiente, em seguida, incubar por 45 minutos em 5% CO 2 e 37 ° C; </li><li> Adicionar 1 ml de Metilcelulosa overlay (1%) a cada poço; </li><li> Incubar as placas a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 5 dias; </li><li> Os passos a partir daqui não requerem um ambiente estéril, mas como com qualquer outro cuidado deve ser tomado patógeno em todos os momentos. Descartar overlay Metilcelulosa de cada prato e blot para remover excesso de mídia </li><li> Adicionar 1 ml de metanol / acetona fixador (1:1) a cada poço. Manter a 4 ° C por 1 h; </li><li> Deitar fora o fixador, e lave uma vez com 1X PBS; </li><li> Faça 1:1000 diluição para o anticorpo primário contra o vírus com Blotto 5%; </li><li> Adicionar 200 mL de líquido hiperimune diluído a cada C bem, incubar a 37 ° para 1 hora; </li><li> Remover o líquido hiperimune e placa de lavagem com PBS 1 X </li><li> Prepare uma diluição 1:1000 do conjugado de cabra anti-rato (KPL Cat # 074-1806) em 5% dopada (5g de leite em pó desnatado em 100 ml de PBS 1 X), e depois adicionar 200 mL em cada poço e incubar a 37 ° C por 1 h; </li><li> Prepare substrato da seguinte forma: adicionar 1 comprimido de 3&#39;-diaminobenzidina terrahydrochloride (Sigma Cat # D5905) em 20 ml de PBS 1 X, depois de dissolvido, e então adicionar 8 mL de peróxido de hidrogênio 30% </li><li> Adicionar 200 mL do substrato acima para cada poço. Deixe descansar em temperatura ambiente por 10 minutos </li><li> Remover substrato e parar a reação pela adição de 1ml de água destilada para cada poço </li><li> Despeje em pratos de água e secar para secar </li><li> Contar a partícula do vírus </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td><td></td><td>com 5% de CO₂, 37 °C</td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 50 ml</td><td></td><td></td><td></td><td>plástico</td></tr><tr><td>Ponteira de pipeta</td><td></td><td></td><td></td><td>para cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Pipetador</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Pasteur</td><td></td><td></td><td></td><td>vidro, estéreis</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td></td><td></td><td></td><td>37 °C</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafina plástica (parafilm)</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banho de água com circulação</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alimentadores com membrana de vidro</td><td></td><td></td><td></td><td>com tubo de borracha para adaptar aos alimentadores</td></tr><tr><td>Copos para mosquitos</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol 75%</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água sanitária 10%</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos</td><td></td><td></td><td></td><td>placas de 6 poços, 24 poços e 96 poços</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td></td><td></td><td></td><td>vidro</td></tr><tr><td>Lâminas</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de ponta fina</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td><td>1X, estéril</td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico</td><td>Microscópio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células C6/36</td><td>células</td><td></td><td></td><td>Para propagação de vírus</td></tr><tr><td>Meio C6/36</td><td></td><td></td><td></td><td>MEM com 10% de FBS inativado pelo calor, 1% de L-glutamina e aminoácidos não essenciais e 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina.</td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;-Diaminobenzidina tetrahidrocloridrato</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>1 comprimido em 20 ml de PBS 1X, dissolver e depois adicionar 8 &amp;#x03BC;l de peróxido de hidrogênio a 30%</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio a 30%</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A. aegypti</td><td>Animal</td><td></td><td></td><td>mosquito</td></tr></tbody></table>

protocolo para infecções por dengue em mosquitos (a. aegypti) e determinação fenótipo infecção

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

O objetivo deste procedimento é para infectar o mosquito Aedes com o vírus da dengue em uma condição de laboratório e examinar o nível de infecção e dinâmica do vírus nos tecidos do mosquito. Este protocolo é utilizado rotineiramente para o estudo de interações mosquito-vírus, especialmente para a identificação de novos fatores de host que são capazes de determinar a competência vetorial. Todo o experimento deve ser realizado em um laboratório BSL2. Semelhantes às infecções Plasmodium falciparum, traje apropriado, incluindo luvas e jaleco deve ser usado em todos os momentos. Após o experimento, todos os materiais que entraram em contato com o vírus precisam ser tratados com etanol 75% e branqueadas antes de prosseguir com a lavagem normal. Todos os outros materiais devem ser autoclavados antes de descartá-los.

Uma vez que um gene é identificada como potencialmente refratário para o vírus da dengue, deve ser avaliado para o seu papel na prevenção de infecções virais dentro do mosquito. Este protocolo ilustra como a extensão das infecções por dengue de mosquitos podem ser ensaiadas. As técnicas para crescer o vírus em cultura, alimentando-se membrana de sangue os mosquitos humanos e assaying títulos viral no intestino médio do mosquito são demonstradas.

Protocolo para infecções por dengue em mosquitos (A. aegypti) e Determinação Fenótipo Infecção

O objetivo deste procedimento é infectar o mosquito Aedes com o vírus da dengue em condições de laboratório e examinar o nível e a dinâmica da infecção de ...

Sou George Dimopoulos, e agora vamos mostrar um procedimento sobre como infectar o mosquito Aidas GTI com o vírus da dengue. E a primeira coisa que precisaremos fazer é propagar o vírus em uma linhagem celular Aidas Aus. Meu nome é Jose Luis Ramirez, e sou aluno de doutorado no Laboratório ous.Para este procedimento, precisaremos de uma instalação BSL 2 com uma capela de cultura de tecidos, um incubador de CO2 ajustado a 37 graus Celsius. Precisamos de tubos cônicos plásticos de 50 ml. Precisamos de soro humano, de um banho-maria a 37 graus Celsius e de uma centrífuga.É necessário ter placas de 96 poços e outros reagentes e consumíveis padrão de biologia molecular e bioquímica. Esta é uma capela de cultura tecidual convencional em uma instalação BSL 2, e o primeiro passo é retirar as células que cresceram até uma confluência de 80% em um frasco de 75 centímetros quadrados. Este é um meio MEM com 10% de soro bovino fetal aquecido e ativado, suplementado com 1% de L-glutamina e aminoácidos não essenciais.Ok, agora vamos adicionar o vírus da dengue às células. Retiramos o estoque do vírus do congelador a menos 80 e o descongelamos em um incubador a 37 graus. Adicionamos cerca de 0,5 mililitros do vírus estoque às células para atingir uma concentração de aproximadamente 1,5 partículas virais por célula.As células são então colocadas em um agitador durante cerca de 15 minutos, em velocidade baixa de agitação. Em seguida, as células são colocadas em uma incubadora de CO₂ por aproximadamente 45 minutos. A 37 graus Celsius, a concentração de CO₂ é de 5%. Após a incubação de 45 minutos, retiraremos as células e adicionaremos 30 ml de meio, e então colocaremos as células novamente na incubadora e as incubaremos por mais cinco dias.Agora vamos preparar as partículas virais para infecção. Primeiro, precisamos destacar as células do frasco com um espátula e, em seguida, transferi-las junto com o meio para um tubo cônico de 50 ml. Agora precisamos centrifugar as células a 12.000 RPM por 10 minutos para formar o pellet.No fundo deste frasco, você pode ver o pellet. Em seguida, removeremos o sobrenatante e deixaremos apenas um ml com as células, a fim de liberar o vírus das células. Em seguida, congelaremos as amostras.Isso irá romper as células, e então nós as descongelaremos e em seguida as congelaremos novamente, repetindo este procedimento de três a quatro vezes, sendo o congelamento realizado em gelo seco. Após o congelamento, o pellet celular é colocado em banho-maria a 37 graus para descongelá-lo, e então é congelado novamente no gelo seco; entre cada etapa de congelamento, ressuspendemos as células por vortex. Agora estamos coletando o sobrenadante contendo o vírus e adicionando-o ao sobrenadante da centrifugação anterior, que também contém partículas virais.Esta preparação viral está agora pronta para ser combinada com uma quantidade igual de sangue humano total e soro. Aqui, combinamos a preparação viral com sangue humano total suplementado com 15% de soro humano. Esta solução de sangue e vírus será usada agora para alimentar os mosquitos e infectá-los.Vamos adicionar este sangue a um alimentador com membrana, e este alimentador será colocado sobre um copo contendo os mosquitos; permitiremos que os mosquitos se alimentem desse sangue por cerca de 25 minutos. Colocamos um clipe no alimentador com membrana para estabilizá-lo. Basicamente, ele serve para pesar a membrana sobre a tela, e agora vamos adicionar o sangue ao alimentador.Em algumas ocasiões, este experimento pode funcionar melhor quando realizado no escuro, já que naturalmente os mosquitos costumam se alimentar no escuro. Isso depende, é claro, de como a colônia de mosquitos foi condicionada. Os mosquitos se alimentaram por cerca de 25 a 30 minutos, e podemos remover o alimentador com membrana e colocá-lo em um recipiente seguro para descontaminação.Após a alimentação com sangue, os mosquitos não alimentados precisam ser removidos dos que se alimentaram. Para isso, imobilizamos os mosquitos colocando os copos pequenos contendo os mosquitos alimentados em sangue na câmara fria por cinco a dez minutos. Como podemos observar, os mosquitos já estão imobilizados devido ao frio.Abra a tampa e transfira os mosquitos para um pequeno recipiente de petróleo, que é mantido em um balde de gelo para que os mosquitos permaneçam frios durante todo o processo e não possam escapar. Lembre-se, esses são mosquitos infectados, portanto, todos os cuidados devem ser tomados para não deixá-los soltos. Uma vez que os mosquitos estejam imobilizados na câmara fria, transfira-os para o insetário comum, que é mantido à temperatura ambiente, mas coloque sempre os mosquitos no recipiente de petróleo, o qual é mantido no balde de gelo, para que permaneçam imobilizados.É possível observar como os mosquitos alimentados podem ser separados dos não alimentados. Os alimentados possuem sangue em seu interior. Eles estão completamente ingurgitados.Alguns deles se alimentaram parcialmente de sangue, portanto não estão totalmente ingurgitados. Eles têm uma pequena quantidade de sangue em seu abdômen, enquanto outros têm uma grande quantidade de sangue em seu abdômen. Os não alimentados não possuem qualquer sangue em seu abdômen, e assim você pode facilmente distinguir entre os alimentados e os não alimentados.Então, transferiremos esses mosquitos do recipiente de Petri para copos de papel revestidos com cera. O próximo passo é analisar a infecção pelo vírus da dengue no mosquito. Se quisermos analisar a infecção viral no intestino médio do mosquito, devemos dissecar os mosquitos por volta do sétimo dia após eles terem ingerido a refeição sanguínea.E se você quiser analisar a infecção viral na glândula salivar, devemos dissecar os mosquitos cerca de 14 dias após a alimentação com sangue. Agora José mostrará como dissecar o intestino do mosquito. Os mosquitos foram agora anestesiados em gelo e os mataremos mediante uma incubação em etanol 70% por cerca de um minuto. Em seguida, transferimos os mosquitos para dois banhos sucessivos de água.Um minuto cada. Isso serve para remover o etanol dos mosquitos. Agora vamos dissecar os mosquitos em PBS sobre lâminas de microscópio.A melhor maneira de dissecar o intestino médio de um mosquito gyp time é colocar o mosquito de cabeça para baixo sobre as asas e segurar a parte abdominal com uma pinça e o tórax com outra pinça, puxando então o mosquito. Agora José está puxando o mosquito para separá-lo, e o intestino aparecerá entre o abdômen e a parte torácica do mosquito. Agora o intestino é o tecido semitransparente que apareceu na parte superior do mosquito.Agora, transferiremos o intestino dissecado para um meio de linhagem celular e o levaremos para a cabine de cultura de tecidos para isolar as partículas virais do intestino. Levamos os intestinos médios dissecados para a sala de cultura de tecidos e os homogeneizamos com um pistilo para liberar as partículas virais. Após a homogeneização do intestino médio, adicionamos meio ao homogeneizado para obter uma diluição de 1 para 100 das partículas virais.Em seguida, continuamos a diluir isso ainda mais na proporção de um para 10, um para 101, um para 1000. Na placa de 96 poços, preparamos a linhagem celular Alba picto até 80% de confluência em uma placa de 24 poços. Então, removemos o sobrenadante das células Alba picto e adicionamos a essas células as partículas virais diluídas, a fim de determinar a concentração de partículas virais em cada diluição.Isso nos permitirá determinar o nível de infecção do vírus. No intestino médio do mosquito, as células são então agitadas durante 15 minutos, lentamente, à temperatura ambiente. Em seguida, colocamos as células por 45 minutos no incubador de CO₂ a 37 graus.A seguir, adicionamos um ml de cobertura de metilcelulose a 1% a cada poço, e a placa é então incubada novamente por cinco dias em incubadora com CO2 a 37 graus. Após a incubação de cinco dias, adicionamos um ml de um fixador de acetona-metanol a cada poço. Em seguida, incubamos a placa a quatro graus Celsius em uma geladeira por uma hora.Em seguida, removemos o fixador e lavamos cada poço uma vez com PBS. Em seguida, preparamos uma diluição de um para 1000 do anticorpo primário anti-dengue em uma solução de 5% de sangue. Em seguida, adicionamos 200 microlitros dessa solução de anticorpo.Para cada poço, mova a cabeça. Obrigado. Em seguida, incubamos a placa por uma hora a 37 graus Celsius. Depois removemos o fluido hipersensível e lavamos cada poço com um XPBS.Em seguida, repetimos o procedimento exatamente da mesma forma com um anticorpo secundário. Preparamos 20 ml do substrato de acordo com o protocolo e adicionamos a um recipiente. Então, adicionamos 200 microlitros do substrato a cada poço.Em seguida, interrompemos a reação removendo o substrato e adicionamos um ml de água destilada a cada poço. Depois descartamos a água da placa e deixamos a placa secar. Cada ponto colorido representa uma placa de vírus, e ao contar essas placas, podemos estimar o número de partículas virais que estavam no intestino médio original do mosquito que homogeneizamos.Acabamos de mostrar o procedimento para realizar uma infecção por vírus da dengue em mosquitos aegypti. Este protocolo envolve a produção do vírus em uma linhagem celular de mosquito. As partículas virais são então purificadas e isoladas a partir da linhagem celular, misturadas com sangue humano total e oferecidas aos mosquitos por alimentação.O vírus infectará os mosquitos e, uma vez que a infecção tenha sido estabelecida, mostramos como isolar o tecido do intestino médio do mosquito e como determinar o nível de infecção desse intestino médio. Basicamente, homogeneizamos o intestino médio e utilizamos o procedimento para liberar as partículas virais desse intestino médio. Em seguida, utilizamos essas partículas virais para infectar novamente a linhagem celular de mosquito, a fim de determinar o nível de infecção do intestino médio, ou seja, o número de partículas virais que infectaram o intestino médio do mosquito.

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Biologia

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