Protocolo para infecções por dengue em mosquitos (A. aegypti) e Determinação Fenótipo Infecção

Eu sou George Dimopoulos, e agora vamos mostrar um procedimento sobre como infectar o mosquito Aidas GTI com o vírus da dengue. E a primeira coisa que precisamos fazer é propagar o vírus em uma linhagem celular Aidas Aus. Meu nome é Jose Luis Ramirez e sou estudante de doutorado no laboratório ous.

Para este procedimento, precisaremos de uma instalação BSL two com uma capa de cultura de tecidos, uma incubadora de CO2 ajustada a 37 graus Celsius. Precisamos de tubos cônicos de plástico de 50 ml. Precisamos de soro humano, precisamos de um banho-maria, de 37 graus Celsius, de uma centrífuga.

Precisamos de placas de 96 poços e outras biologias moleculares e bioquímicas, reagentes e consumíveis padrão. Portanto, este é um capuz de cultura de tecidos regular em uma instalação BSL dois, e o primeiro passo é retirar as células que cresceram até uma fluência de 80% em um frasco de 75 centímetros quadrados. Trata-se de um meio MEM com 10% de calor, calor e soro fetal bovino ativado suplementado com 1% de L-glutamina e aminoácidos não essenciais.

Ok, agora vamos adicionar o vírus da dengue às células. Retiramos o estoque de vírus do freezer de menos 80 e o descongelamos em uma incubadora de 37 graus. Adicionamos cerca de 0,5 mililitros de vírus estoque às células para atingir uma concentração de cerca de 1,5 partículas de vírus por célula.

As células são então colocadas em um agitador por cerca de 15 minutos a uma taxa de agitação lenta. Em seguida, as células são colocadas em uma incubadora de CO2 por cerca de 45 minutos. A 37 graus Celsius, a concentração de CO2 é de 5%Após a incubação de 45 minutos, retiraremos as células e adicionaremos 30 ml de meio, e então colocaremos as células na incubadora novamente e incubaremos por mais cinco dias.

Agora vamos preparar as partículas de vírus para infecção. Primeiro, precisamos separar as células do frasco com um raspador e, em seguida, transferi-las junto com um meio para um tubo cônico de 50 ml. Agora temos células centrífugas a 12.000 RPMs por 10 minutos para pelletá-las.

No fundo desta garrafa, você pode ver o pellet. Em seguida, removeremos o sobrenadante e deixaremos apenas um ml com as células para liberar o vírus das células. Vamos congelá-los.

Isso vai romper as células, e então vamos descongelá-las e depois congelá-las novamente e vamos repetir esse procedimento três a quatro vezes e o congelamento é feito em gelo seco. Após o congelamento, o pellet celular é colocado em um banho-maria de 37 graus para descongelá-los e, em seguida, eles são congelados novamente nos olhos secos entre cada etapa de congelamento, o WEP suspende as células por meio de vórtice. Agora estamos coletando o vírus contendo sobrenadante e adicionando-o ao sobrenadante da centrifugação anterior, que também contém partículas de vírus.

Esta preparação de vírus está agora pronta para ser combinada com uma quantidade igual de sangue humano total E soro. Aqui combinamos a preparação do vírus com sangue humano total suplementado com 15% de soro humano. Esta solução para vírus do sangue será usada agora para alimentar os mosquitos e infectá-los.

Vamos adicionar esse sangue em um alimentador de membrana e esse alimentador de membrana será colocado em um copo contendo os mosquitos e deixaremos os mosquitos se alimentarem desse sangue por cerca de 25 minutos. Colocamos um clipe no alimentador de membrana para estabilizá-lo. Ele pesa basicamente na rede, e agora vamos adicionar o sangue ao alimentador.

Em algumas ocasiões, esse experimento pode funcionar melhor quando é feito no escuro, já que naturalmente os mosquitos freqüentemente se alimentam no escuro. Isso depende, é claro, de como a colônia de mosquitos foi condicionada. Os mosquitos já se alimentaram por cerca de 25 a 30 minutos, e podemos remover o alimentador de membrana e colocá-lo em um recipiente seguro para descontaminação.

Após a colocação do sangue, os mosquitos impróprios devem ser removidos dos mosquitos alimentados. Para fazer isso, derrubamos os mosquitos colocando os pequenos copos contendo os mosquitos alimentados com sangue na câmara fria por cinco a 10 minutos. Como podemos ver, os mosquitos já estão caídos no frio.

Abrimos a tampa e transferimos os mosquitos para um pequeno prato de gasolina, que é mantido em um balde de gelo para que os mosquitos fiquem frios o tempo todo e não possam escapar. Lembre-se, estes são mosquitos infectados, portanto, todo cuidado deve ser tomado para não deixá-los soltos. Uma vez que os mosquitos estão na câmara fria, que transferem os mosquitos para o setor normal, que é mantido à temperatura ambiente, mas colocamos os mosquitos sempre na placa de petróleo, que é mantida no balde de gelo, para que eles estejam lá para que estejam sempre caídos.

Você pode ver como os mosquitos Fed podem ser removidos dos UNFI. Os Fed têm sangue neles. Eles estão totalmente ingurgitados.

Alguns deles se alimentaram parcialmente de sangue, então não estão totalmente ingurgitados. Eles têm um pequeno sangue no abdômen, mas outros têm muito sangue no abdômen. Os UNFI não têm sangue no abdômen e, portanto, você pode facilmente distinguir entre os Fed e os inaptos.

Então, vamos transferir esses mosquitos do prato de gasolina para os copos de papelão da linha de cera. O próximo passo é testar a infecção pelo vírus da dengue no mosquito. Se quisermos testar a infecção do vírus no intestino médio do mosquito, devemos dissecar os mosquitos por volta do sétimo dia após terem tomado a refeição de sangue.

E se você quiser testar a infecção do vírus na glândula sali, devemos dissecar os mosquitos em torno de 14 dias após a alimentação do sangue, Jose agora mostrará como dissecar o intestino do mosquito. Os mosquitos já foram anestesiados no gelo e vamos matá-los por meio de uma incubação em etanol a 70% por cerca de um minuto. Em seguida, transferimos os mosquitos para dois banhos-maria sucessivos.

Um minuto cada. Isso é para lavar o etanol dos mosquitos. Agora vamos dissecar os mosquitos em PBS em lâminas de microscópio.

A melhor maneira de dissecar o intestino médio de um mosquito gyp time é colocar o mosquito de cabeça para baixo em suas asas e agarrar a parte abdominal com uma pinça e o tórax com outra pinça e, em seguida, puxar o mosquito. Agora José está separando o mosquito e o intestino aparecerá entre o abdômen e a parte torácica do mosquito. Agora, o intestino é o tecido semitransparente que apareceu na parte superior do mosquito.

Agora vamos transferir o intestino dissecado para um meio de linha celular e trazê-lo para a capa de cultura de tecidos para isolar as partículas de vírus do intestino. Trazemos os intestinos médios dissecados para a sala de cultura de tecidos e homogeneizamos com um pilão para liberar as partículas do vírus. Após a homogeneização do intestino médio, adicionamos meio ao homogeneizado para obter uma diluição de um a 100 das partículas do vírus.

Em seguida, continuamos a diluir isso ainda mais para um para 10, um para 101 para 1000. Na placa de 96 poços, preparamos a linhagem celular Alba picto para 80% de fluência em uma placa de 24 poços. Em seguida, removemos o suplante das células do picto do hiato alba e a essas células, adicionamos as partículas virais diluídas para determinar a concentração de partículas virais em cada diluição.

Isso nos permitirá determinar o nível de infecção do vírus. No intestino médio do mosquito, as células são agitadas lentamente por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, colocamos as células por 45 minutos na incubadora de CO2 de 37 graus.

Em seguida, adicionamos um ml de sobreposição de 1% de metilcelulose a cada poço, e a placa é incubada novamente a 37 graus de incubadora de CO2 por cinco dias. Após a incubação de cinco dias, Adicionamos um ml de um fixador de acetona metanol a cada poço. Em seguida, incubamos a placa a quatro graus Celsius na geladeira por uma hora.

Em seguida, removemos o fixador e lavamos cada poço uma vez com PBS. Em seguida, fazemos uma diluição de um a 1000 do anticorpo primário anti-dengue em uma solução de sangue a 5%. Em seguida, adicionamos 200 microlitros dessa solução de anticorpos.

Para cada um, bem Mova sua cabeça. Obrigado. Em seguida, incubamos a placa por uma hora a 37 graus Celsius. Em seguida, removemos o fluido hiperimune e lavamos cada poço com um XPBS.

Em seguida, repetimos o procedimento exatamente da mesma maneira com um anticorpo secundário. Estamos preparados 20 ml do substrato de acordo com o protocolo e adicionamos a um recipiente. Em seguida, adicionamos 200 microlitros do substrato a cada poço.

Em seguida, paramos a reação removendo o substrato e adicionamos um ml de água destilada a cada poço. Em seguida, descartamos a água do prato e deixamos o prato secar. Cada ponto colorido representa uma placa de vírus e, contando essas placas, podemos estimar o número de partículas de vírus que estavam no intestino médio original do mosquito que homogeneizamos.

Acabamos de mostrar o procedimento de como realizar uma infecção pelo vírus da dengue no mosquito aegypti. Este protocolo envolve a produção de vírus na linha de células do mosquito. As partículas do vírus são então purificadas da linha celular e isoladas, e são misturadas com sangue total humano e fornecidas aos mosquitos.

O vírus infectará os mosquitos e, uma vez estabelecida a infecção, mostramos como isolar o tecido do intestino médio do mosquito e como determinar o nível de infecção desse intestino médio. Basicamente, homogeneizamos o intestino médio e usamos o procedimento para liberar as partículas de vírus desse intestino médio. Em seguida, usamos essas partículas de vírus para infectar a linha de células do mosquito novamente, a fim de determinar o nível de infecção do intestino médio, o número de partículas de vírus que infectaram o intestino do mosquito