Um ensaio para detectar autoanticorpos em soro humano usando uma cultura neuronal do hipocampo

Veja o hipocampo de embrião de rato.

Adicione tripsina. Incubar para mediar a quebra da matriz tecidual, afrouxando as células do hipocampo.

Diluir com um tampão. Incubar para digestão enzimática contínua com tripsina.

Em seguida, transfira a massa de tecido para um tubo contendo meio. Pipetar repetidamente para dissociação mecânica em células individuais.

Células-semente em lamínulas revestidas de poli-L-lisina dentro de placas de cultura.

incubar. As células do hipocampo aderem às superfícies revestidas. Os neurônios desenvolvem uma lamela e estendem neuritos menores.

Além disso, os neuritos crescem com processos axonais e dendríticos, formando uma rede neuronal.

Os neurônios maduros expressam receptores excitatórios sinápticos, receptores N-metil-D-aspartato ou NMDARs.

Após a incubação, lave as lamínulas com meios.

Adicione um soro diluído para pacientes com encefalite autoimune. Os autoanticorpos se ligam a NMDARs neuronais.

Lave com tampão e depois fixe as células.

Adicione anticorpos secundários marcados com fluoróforo que se ligam aos autoanticorpos ligados ao NMDAR.

Lave com tampão. Coloque a lamínula sobre a mídia de montagem contendo DAPI para manchar os núcleos.

Observe microscopicamente os sinais de fluorescência nos neurônios, indicando a presença de autoanticorpos no soro.

Para a dissociação enzimática do hipocampo a 1 mililitro de tripsina a 2,5% no tubo de 50 mililitros contendo o hipocampo, após trazer o volume no tubo para 5 mililitros com HBSS, incubar o tubo por 15 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius. Para diluir ainda mais a tripsina, adicione 10 mililitros de HBSS pré-aquecido e coloque o tubo de volta no banho-maria a 37 graus Celsius por 5 minutos.

Em seguida, use uma micropipeta de 1.000 microlitros para transferir o hipocampo que aparece como uma massa mucosa para um tubo de 50 mililitros e incube o tecido com 6 mililitros de HBSS pré-aquecido por 5 minutos, conforme demonstrado. Para dissociar o tecido mecanicamente, transfira a massa hipocampal para um tubo de 2 mililitros com fundo cônico. Depois de adicionar 1 mililitro de meio DMEM pré-aquecido, homogeneizar o pellet com uma micropipeta de 1.000 microlitros, aspirando suavemente para cima e para baixo.

Certificando-se de não criar bolhas, repita a aspiração para cima e para baixo 10 a 20 vezes com uma pipeta de vidro pré-puxada, com a ponta em contato com o fundo cônico do tubo, até que a mistura fique translúcida. Conte as células antes de distribuí-las uniformemente em um prato de 3,5 centímetros com movimentos cruzados. Uma vez feito isso, coloque o prato na incubadora com 5% de dióxido de carbono.

Para imunocoloração fluorescente de células in vitro de 14 dias, adicione a amostra contendo anticorpos anti-NMDAR às lamínulas e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após uma hora, tratar a amostra com formaldeído a 4% em PBS, como solução de fixação, à temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida, lave a amostra três vezes com PBS por 5 minutos cada, seguido pela adição de anticorpo secundário cabra anti-humano Alexa Fluor 488 na diluição de 1 a 1.000 por 1 hora em temperatura ambiente. Em seguida, montar as lamínulas que contêm a amostra com um meio de montagem de líquido e aspirar o líquido restante.