Alimentação de RNAi em cultura líquida: um método de alto rendimento para derrubar a expressão gênica em C. elegans

- Para começar, adicione carbenicilina e um IPTG milimolar para controlar e testar frascos de cultura contendo meio basal S. Gire um tubo contendo larvas no estágio de crescimento um, também chamado de larvas L1, por alguns minutos. Agora remova o sobrenadante e coloque dois microlitros de L1s em uma placa de ágar. Coloque a placa sob um microscópio de dissecação e conte o número de larvas.

Adicionar bactérias de RNAi portadoras de um plasmídeo de RNAi não específico ao balão de controlo e bactérias com RNAi direcionado para genes ao balão de ensaio. A quantidade de bactérias adicionadas deve ser proporcional ao número de vermes.

Deixe as larvas crescerem com agitação contínua para garantir a oxigenação adequada. As larvas se alimentam das bactérias. Dentro da larva, o pequeno RNA interferente se liga ao mRNA complementar produzido pelo gene alvo e inibe a expressão da proteína. Finalmente, examine os vermes para o seu fenótipo de interesse.

No protocolo de exemplo, trataremos larvas L1 com RNAi direcionado ao gene daf-2, em cultura líquida.

- Para iniciar o tratamento, adicione 207,45 mililitros de meio basal S com reagentes adicionais, conforme descrito no protocolo de texto que