Alimentação de RNAi em cultura líquida: um método de alto rendimento para derrubar a expressão gênica em C. elegans

- Para começar, adicione carbenicilina e um IPTG milimolar para controlar e testar frascos de cultura contendo meio basal S. Gire um tubo contendo larvas no estágio de crescimento um, também chamado de larvas L1, por alguns minutos. Agora remova o sobrenadante e coloque dois microlitros de L1s em uma placa de ágar. Coloque a placa sob um microscópio de dissecação e conte o número de larvas.

Adicionar bactérias de RNAi portadoras de um plasmídeo de RNAi não específico ao balão de controlo e bactérias com RNAi direcionado para genes ao balão de ensaio. A quantidade de bactérias adicionadas deve ser proporcional ao número de vermes.

Deixe as larvas crescerem com agitação contínua para garantir a oxigenação adequada. As larvas se alimentam das bactérias. Dentro da larva, o pequeno RNA interferente se liga ao mRNA complementar produzido pelo gene alvo e inibe a expressão da proteína. Finalmente, examine os vermes para o seu fenótipo de interesse.

No protocolo de exemplo, trataremos larvas L1 com RNAi direcionado ao gene daf-2, em cultura líquida.

- Para iniciar o tratamento, adicione 207,45 mililitros de meio basal S com reagentes adicionais, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha, a um frasco de cultura de Fernbach de 2.800 mililitros. Adicionar uma concentração final de 50 microgramas por mililitro de carbenicilina e 1 milimolar de IPTG e fechar o balão com uma tampa de rosca de membrana.

Retire os L1s da incubadora de 25 graus Celsius e transfira-os para tubos de 15 mililitros. Centrifugue os L1s a 1.900 vezes g por três minutos. Depois de girar, remova o sobrenadante. Sob um microscópio, conte os L1s por dois microlitros e calcule a média dos números obtidos de pelo menos nove gotas.

Em seguida, adicione 50.000 minhocas para a coleção de minhocas jovens e 100.000 minhocas para a coleção de minhocas envelhecidas em quatro frascos de cultura de Fernbach preparados na etapa anterior. Em seguida, adicione bactérias de RNAi de controle e bactérias de RNAi para o gene de interesse proporcionalmente ao número de vermes.

Depois de adicionar bactérias, complete a cultura de vermes com S basal para trazer o volume total para 300 mililitros. Incubar a cultura de minhocas a 25 graus Celsius em uma incubadora agitada com 150 RPM até a coleta.