$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Comece com tubos contendo o estágio persistente não replicante, ou NRP, de Mycobacterium tuberculosis, que possui uma camada externa espessada.
Adicione esferas de vidro a um tubo e agite-o para desestabilizar mecanicamente a camada externa das micobactérias, aumentando a permeabilidade.
Em seguida, transfira a suspensão micobacteriana batida pela esfera para um tubo novo.
Adicione rifampicina marcada fluorescente, um antibiótico antituberculose, tanto às suspensões celulares não tratadas quanto às batidas por estalas.
Incube com agitação para permitir que a rifampicina marcada fluorescente entre nas micobactérias.
Com o tempo, mais rifampicina entra nas micobactérias.
Centrifuge as amostras para separar as células e remover o sobrenadante contendo rifampicina não ligada.
Resuspenda as micobactérias em meio fresco.
Analise as amostras usando citometria de fluxo. À medida que as células passam por um feixe de laser, elas emitem fluorescência proporcional à rifampicina fluorescente intracelular.
Em diferentes momentos de tempo, células NRP não tratadas apresentam menor fluorescência do que as células batidas por contas.
Isso indica que a camada externa espessada restringe a entrada de rifampicina, apoiando a persistência bacteriana durante a interação hospedeiro-patógeno.