Name: Detecção de modificações pós-translacionais sobre Native Nucleossomos Intact por ELISA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprenda a detectar modificações pós-translacionais em nucleossomos inteiros usando NU-ELISA. Este método sensível permite analisar estados globais de cromatina em células de mamíferos para pesquisas em epigenética.

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Desenvolvimento do método NU-ELISA foi apoiado pelo NIH conceder RO1AG023687.

1. Cultura de células de mamíferos NU-ELISA pode ser realizado em qualquer tipo de células de mamíferos que podem ser cultivadas em cultura. Nós preferimos preparar moderada a grandes lotes de células para que nucleossomos podem ser isoladas em quantidade suficiente para preparar vários pratos idênticos carregados ELISA, permitindo assim que os testes com vários anticorpos diferentes (Abs). As escalas cultura a seguir fornecem amplo material: De células-tronco do mouse embyronic, crescer um ou dois pratos de 15 cm de células sem células alimentadoras. Para fibroblastos, crescer 5-10 cm para 15 placas de confluência. 2. Isolamento de Núcleos Nota: Todos os passos estão no gelo com pré-refrigerados buffers, excepto quando indicado. <ol><li> Trypsinize células com 3 ml de tripsina por placa, combinar e adicionar 20 ml de PBS gelado / butirato. Centrifugar a 1000 rpm por 5 min. </li><li> Ressuspender as células em 10 ml PBS / butirato e centrifugar a 1000 rpm por 5 min. </li><li> Ressuspender em 4 ml tampão de lise com inibidores da protease (Sigma-Aldrich P-8340). Dounce homogeneizar 20 cursos com pilão tipo B no gelo. </li><li> Centrifugar a 2000g por 10 min a 4 ° C. (O sobrenadante contém citoplasma, o que não é necessário para este protocolo, mas pode ser economizada para outros usos, se desejar). </li><li> Ressuspender o sedimento em 2 ml de gelo frio tampão de lavagem C (com inibidores da protease). </li><li> Camada do material ressuspenso mais de 5 ml almofada sacarose 30%, então centrifugue a 2400g por 5 min em um rotor de caçamba móvel. Núcleos migram através almofada, e os restos permanece na interface. </li><li> Retire todo o volume de líquido com cuidado e ressuspender os núcleos em 250 mL de tampão de lavagem gelada C + inibidores da protease. </li></ol> 3. Isolamento de Nucleossomos por in situ Micrococcal Nuclease Digestão (MNase) Usamos um procedimento em que a cromatina é digerida in situ dentro de núcleos, infundindo-lhes MNase, seguido por um tratamento hipotônico para livre no disco nucleossomos intactos no sobrenadante. <ol><li> Adicionar 3 mL 0,1 M CaCl 2 para a amostra. Coloque em 37 ° C em bloco de calor. Permitem assumir 37 ° C de temperatura. </li><li> Adicione 2 unidades MNase (Micrococcal Nuclease, Sigma-Aldrich, dissolvido em 2 units/10μl em tampão MNase), então incubar a 37 ° C por 12 min, com mistura freqüentes usando a ponta da pipeta. </li><li> Adicionar 6 mL de 0,5 M pH Na-EDTA, 8,0 para parar a reação. Coloque sobre o gelo. </li><li> Centrifugar a 2000g por 4 min, elimine o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 300 mL 0,2 mM Na-EDTA. Loja em gelo por 1 h com pipetagem suave ocasionais. (Estas condições hipotônica libertar nucleossomos livre de núcleos). </li><li> Centrifugar a 3000 g por 4 min a 4 ° C. Salve o sobrenadante, que contém nucleossomos livre, no gelo. </li><li> Ressuspender o sedimento novamente com 300 mM 0,2 mL de Na-EDTA. Loja em gelo por 1 h com pipetagem suave ocasionais. </li><li> Centrifugar a 3000g por 4min a 4 ° C. Manter o sobrenadante e combinar com o primeiro sobrenadante da etapa 5. Os preparativos resultando mononucleosome pode ser aliquotado e estocado a -80 ° C. </li></ol> Nota: A quantidade de cromatina pode ser grosseiramente quantificada pela medição da absorvência a 260 nm de uma amostra de 10 ml adicionadas a 990 mL de água. A 260 = 10 (após o ajuste para a diluição 1 / 100) corresponde a cerca de 1mg/ml de cromatina. Além disso, durante o procedimento acima, pequenas amostras podem ser retidos e posteriormente analisadas por seu conteúdo de DNA para monitorar a qualidade ea extensão da digestão MNase, que deve conter predominantemente DNA de 146 bp de comprimento. Laddering é indicativo de digestão MNase incompleta. Nota: Fig.1 contém um resumo diagramado de isolamento nuclear e as etapas de digestão MNase. 4. Nucleossomo-ELISA (NU-ELISA) Detectamos PTMs em frações contendo nativa intacta nuclesosomes que foram imobilizados em 96 placas de ELISA bem microtitulação. Para cada amostra, fazemos uma série de duas diluições, e estes são revestidos em poços em triplicado. <ol><li> Revestir as placas Maxisorp overnight a 4 ° C com 50 ul / poço de nucleossomos diluída em tampão de revestimento. Sugeriu diluições de série do nucleossomos são preparados a partir de linha superior a linha de fundo pela adição de 0,1 mg, 0,05 mg, 0,025 mg, 0,0125 g, 0,00625 mg, 0,00313 mg, 0,00156 mg, com tampão de revestimento apenas (0 cromatina mg) no fundo linha. (Nota: cobre placa são necessários para esta etapa.) </li><li> De manhã, lave os pratos 4 vezes com 200 mL / poço PBS/0.5% Tween-20 em temperatura ambiente (RT) para um total combinado de 10 min com uma máquina de lavar prato. </li><li> Bloco 1 hora em temperatura ambiente com 100 ul / poço PBS/0.05% BSA Tween-20% / 5. </li><li> Remova o tampão de bloqueio, agitando a placa invertida rapidamentesobre uma pia. Cubra e guarde as placas a -20 ° C, ou ir diretamente para a próxima etapa. </li><li> Adicionar 1 ° Abs em um volume de 50 l / bem diluído 1:1000 (ou conforme necessário) em PBS/0.05% Tween-20% / 5 BSA, incubar a RT por 1 hora em um rotador. </li><li> Lavar as placas 4 vezes com 200 mL / poço PBS/0.5% Tween-20 em RT e para um total combinado de 10 min em uma máquina de lavar prato. </li><li> Adicionar peroxidase de rábano (HRP) conjugado com 2 ° Abs, diluído 1:5000 (ou quando necessário) em PBS/0.05% Tween-20% / 5 BSA em temperatura ambiente por uma hora em um rotador. </li><li> Lavar as placas 4 vezes com 200 mL / poço PBS/0.5% Tween-20. Cada lavagem é de RT e para um total de 10 minutos com uma máquina de lavar prato. </li><li> Desenvolver as placas, adicionando 50 ul de substrato TMB em cada poço por 10 min em temperatura ambiente. Pare a reação adicionando 50 ul / poço de 2N H 2 SO 4 e ler as placas de 450 nm. (Dica: Centrifugar a 1500 rpm por 2 min usando uma placa de rotor para dissipar as bolhas de ar nos poços antes absorbâncias leitura). </li><li> Export as leituras de arquivos de planilhas para análises quantitativas e estatísticas. </li></ol> Reagentes <table border="1"><tbody><tr><td> PBS / butirato </td></tr><tr><td> 135 mM NaCl </td></tr><tr><td> 2,5 mM KCl </td></tr><tr><td> 8 mM Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1,5 mM KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-butirato </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Tampão de Lise </td></tr><tr><td> 250 mM de sacarose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-butirato </td></tr><tr><td> 4 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0,1% Triton X-100 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Tampão de lavagem C </td></tr><tr><td> 250 mM de sacarose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-butirato </td></tr><tr><td> 4 mM MgCl 2 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Almofada sacarose </td></tr><tr><td> 30% (w / v) sacarose em tampão de lavagem C </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Microccocal Nuclease buffer </td></tr><tr><td> 5 mM NaPO 4 tampão, pH 7,0 </td></tr><tr><td> 0,025 mM CaCl 2 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Buffer de revestimento </td></tr><tr><td> Solução 80ml A + B + Solução 170ml 250ml dH 2 O </td></tr><tr><td> A solução: 0,2 M Na 2 CO 3 </td></tr><tr><td> Solução B: 0,2 M NaHCO 3 </td></tr></tbody></table> 5. Resultados representante Utilizando o método ELISA-NU, uma série de várias placas idênticas são preparados que podem ser carregados com cromatina preparada na forma de mononucleosomes. Normalmente, prepare série de idêntica-carregado placas de modo que cada um pode ser sondado com diferentes anti-PTM anticorpos específicos (Abs). Nós também sempre preparar um prato que pode ser sondado com uma Ab que detecta histonas sem levar em conta a sua alteração de controle de carga total do Estado de cromatina. Este controle é essencial para depois comparar quantitativamente o conteúdo PTM de nucleossomos preparados a partir de amostras diferentes. Para quantificar os níveis de PTMs dentro de uma amostra cromatina dado que corrigir os valores de absorbância primas usando esta abordagem: Primeiro, nós subtrair qualquer sinal de fundo usando os valores obtidos a partir de poços de controlo que não contém cromatina (fundo é geralmente insignificante). Em seguida, padronizar PTM específicos sinais para NU-ELISA resultados obtidos a partir de uma placa idêntica carregado que foi ensaiada com Ab que detecta nucleossomos independente de seu estado de modificação. (Nós usamos Abs policlonal específico para histonas H2A ou H2B para esta finalidade). Nós, então, determinar médias e variâncias para cada diluição da cromatina, e utilizar os dados obtidos a partir da porção linear do ensaio ELISA. Exemplos detalhados de NU-ELISA análises matemáticas e estatísticas têm sido relatados anteriormente 4 <img src="/files/ftp_upload/2593/2593fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esquemática diagam de NU-ELISA passos. Células A. mamíferos são colhidas; Núcleos B. são separados a partir de células por Dounce homogenization, C. Disrupted células são carregadas em cima de uma almofada de sacarose 30% w / v, D. Após a centrifugação, os núcleos são depositados no sedimento; E, F. Chromatin são digeridos in situ para mononucleomes predominantemente por MNase; G, H , eu. mononucleosomes solúveis são extraídos por tratamento hipotônico e centrifugação repetida de material nuclear residual. Mononucleosomes J. a partir de amostras diferentes (rotulado samp. 1 e 2, neste caso) são revestidos em poços da microplaca em série de forma idêntica-carregado com placas e interrogado PTM específicos Abs e PTM independente Abs para determinar o carregamento cromatina total. K. Representação dos níveis de diferencial sinal de detecção em duas amostras que diferem em seu conteúdo PTM, mas tem conteúdo cromatina global semelhante, como julgado por anti-H2B imunorreatividade.

<ol><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+and+an+epigenetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation and an epigenetic code.</a> Bioessays. 22, 836-845 (2000).</li>
<li>Dai, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epiproteomic+signatures+distinguish+embryonic+stem+cells+from+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stem cells from differentiated cells.</a> Stem Cells. 25, 2567-2574 (2007).</li>
<li>Tanasijevic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+accumulation+of+epigen+etic+heterogeneity+during+human+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Progressive accumulation of epigen etic heterogeneity during human ES cell culture.</a> Epigenetics. 4, 330-338 (2009).</li>
<li>Thomas, J. O. Isolation and fractionation of chromatin and linker histones. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThomas%2C+JO+%22Chromatin%3A+a+practical+approach%22">Chromatin: a practical approach</a>. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 12-14 (1998).</li>
<li>Thorne, A. W., Cary, P. D., Crane-Robinson, C. Extraction and separation of core histones and non-histone chromosomal proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThorne%2C+AW+%22Chromatin%3A+a+practical+approach%22">Chromatin: a practical approach</a>. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 38-39 (1998).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

NU-ELISA fornece um método para determinar o status global de PTMs nucleosome presente dentro de um tipo particular de célula. NU-ELISA estudos têm mostrado que estados globais modificação nucleosome diferem em comparações de tipos de células diferentes 4. Além disso, os perfis de NU-ELISA PTM mudar quando as células são expostas a agentes moduladores epigenéticas, como tricostatina-A ou quando as células-tronco do mouse embyronic são diferenciadas 4. O método também tem sido aplicada com sucesso para estudar a cromatina de células-tronco embrionárias humanas 5. É importante notar a NU-ELISA, na sua forma actual, pode detectar apenas a assinatura do composto de PTMs presentes na soma total do epigenoma celular. Isso difere marcadamente de genome-wide imunoprecipitação da cromatina, que pode determinar a distribuição de um PTM específicos através específicas loci genéticos. Os passos iniciais dos procedimentos NU-ELISA são adaptados a partir de métodos anteriores para isolar mononucleosomes de núcleos de mamíferos 6,7. Estes métodos adaptados fornecem uma maneira conveniente de obter alta qualidade mononucleosomes intacta a partir de células de mamíferos, e as frações resultantes são abrangentes em seu conteúdo cromatina, mas contêm uma grande quantidade de material nuclear adicional. Desde Abs específicos são usados, contaminando não nucleosomal material é bem tolerado no ensaio NU-ELISA, ao contrário de massa-spec abordagens que exigem uma maior pureza. No entanto, NU-ELISA é mais sensível e quantitativa de western blotting 4, proporcionando assim uma boa alternativa aos westerns e especificação de massa para a detecção de PTMs nucleosomal.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Micrococcal Nucleae </td><td> Sigma </td><td> N3755 </td><td> Faça alíquotas de buffer de 2 U/10μl, armazenadas a -20 ° C </td></tr><tr><td> Nunc Maxisorp placas de microtitulação </td><td> Pescador </td><td> 12-565-135 </td><td> Cobre placa adesiva também podem ser encomendados através Fisher </td></tr><tr><td> Louça Placa automatizado </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 Passo-substrato TMB-ELISA </td><td> Perfurar </td><td> 34028 </td><td> Armazenar a 4 ° C pré-aquecido a RT antes da utilização ou conforme indicado na folha de especificações </td></tr><tr><td> Placa de microtitulação Leitor </td><td> Bio-Rad leitora de microplacas (modelo: 680) </td><td></td><td> A maioria dos modelos leitor colorimétrico placa são adequados </td></tr></tbody></table>

detecção de modificações pós-translacionais sobre native nucleossomos intact por elisa

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

O genoma dos eucariotos existe como cromatina, que contém DNA e proteínas. A unidade fundamental da cromatina é o nucleossomo, que contém 146 pares de bases de DNA associados a cada uma das duas histonas H2A, H2B, H3, H4 e 1. As caudas N-terminal de histonas são ricas em lisina e arginina e são modificados pós-transcricionalmente por acetilação, metilação e outras modificações pós-translacionais (PTMs). A configuração PTM de nucleossomos podem afetar a atividade transcricional de DNA associados, proporcionando assim um modo de regulação do gene que é epigenética na natureza 2,3. Nós desenvolvemos um método chamado nucleosome ELISA (NU-ELISA) para determinar quantitativamente assinaturas PTM global de nucleossomos extraído de células. NU-ELISA é mais sensível e quantitativa de western blotting, e é útil para interrogar o estado epiproteomic de tipos específicos de células. Este artigo de jornal vídeo mostra os procedimentos detalhados para realizar NU-ELISA análise.

Nucleossomo ELISA (NU-ELISA) é um método sensível e quantitativa para detectar padrões globais de modificações pós-translacionais em preparações de natal, nucleossomos intactos. Essas modificações incluem methylations, acetylations e fosforilações em específico histona resíduos de aminoácidos e, portanto, NU-ELISA fornece um ensaio global de proteômica do total estados de modificação da cromatina de tipos específicos de células.

Detecção de modificações pós-translacionais sobre Native Nucleossomos Intact por ELISA

O genoma dos eucariotos existe como cromatina, a qual contém tanto DNA quanto proteínas. A unidade fundamental da cromatina é o nucleossomo, que contém 146 ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar com precisão os níveis relativos de modificações pós-traducionais em preparações de nucleossomos celulares totais obtidos a partir de um milhão de células. Isso é realizado primeiramente preparando culturas homogêneas de alta qualidade de células de mamíferos. Em seguida, os núcleos são isolados das células por meio de disruptura mecânica com um homogeneizador Dounce e centrifugação.O próximo passo é obter nucleossomos intactos digerindo a cromatina presente dentro dos núcleos e realizando uma série de extrações hipotônicas. Por fim, os nucleossomos são analisados utilizando um ensaio ELIZA com os controles apropriados para identificar modificações pós-traducionais específicas. Em última instância, podem-se obter resultados que mostram os níveis relativos de modificações específicas presentes nas amostras de nucleossomos.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o western blot e a imunoprecipitação de cromatina, é que uma visão global de diversos estados de modificação de nucleossomos pode ser facilmente determinada. O método é muito mais sensível e preciso do que o western blot e pode ser realizado na maioria dos laboratórios equipados para experimentação geral em biologia molecular. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de células-tronco e epigenética, como o que ocorre durante eventos importantes de diferenciação e reprogramação.Para iniciar o procedimento, primeiro tripsinize as células com três mililitros de tripsina por placa de 15 centímetros para obter células recém-tripsinizadas. Adicione 20 mililitros de PBS butirato gelado. Transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros e centrifugue o tubo para recolher as células a 1000 RPM durante cinco minutos, aspire o sobrenadante e adicione 10 mililitros de PBS butirato gelado para lavar; centrifugue novamente a suspensão celular a 1000 RPM durante cinco minutos.Remova o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular em quatro mililitros de tampão de lise com inibidores de protease conforme descrito no protocolo escrito. Em seguida, pipete as células para um homogeneizador com pistilo tipo B e homogeneíze com 20 movimentos sobre gelo. Depois, transfira o homogeneizado para um tubo de centrífuga sobre gelo.Centrifugue a amostra a 2000 ×g por 10 minutos. A quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante, que contém o material citoplasmático e as resus.Suspenda o pellet em dois mililitros de tampão de lavagem frio C com inibidores de protease, sobrepondo suavemente o material ressuspenso em um coxim de cinco mililitros de sacarose a 30% em um tubo de centrífuga frio. Para isolar os núcleos, centrifugue a 2.400 ×g durante cinco minutos em um rotor com rotor de balde oscilante; os núcleos migrarão através do coxim e os detritos celulares permanecerão na interface. Após a centrifugação, remova cuidadosamente todo o volume líquido e ressuspenda os núcleos em 250 microlitros de tampão de lavagem frio C com inibidores de protease, transferindo os núcleos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Para iniciar o isolamento de nucleossomos, adicione três microlitros de cloreto de cálcio 0,1 molar aos núcleos e coloque-os em um bloco térmico a 37 graus Celsius até que a temperatura esteja equilibrada. Em seguida, adicione duas unidades de nucleases microcócica em 10 microlitros de tampão de nucleases microcócica e incube por 12 minutos a 37 graus Celsius. Misture frequentemente com a ponteira de uma pipeta.Após a incubação, interrompa a reação com seis microlitros de E-D-T-A de sódio 0,5 molar, pH 8, e coloque no gelo para resfriar. Em seguida, centrifugue a amostra a 2000 ×g por quatro minutos; após a centrifugação, descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet em 300 microlitros de EDTA de sódio 0,2 milimolar. Incube a amostra no gelo por uma hora, com pipetagem suave ocasional para misturar.Após uma centrifugação a 3000 ×g por quatro minutos, a quatro graus Celsius, colete o sobrenadante, que contém os nucleossomos livres, em um novo tubo Fuge e mantenha em gelo para um reuso deliberado de nucleossomos adicionais. Suspenda o precipitado em 300 microlitros de 0,2 milimol por litro de EDTA de sódio, como anteriormente, e incube em gelo por uma hora com mistura suave ocasional.Após a incubação, centrifugue a amostra. Novamente, combine o sobrenadante resultante com a amostra restante no tubo de microcentrífuga em gelo. Para iniciar o ensaio de nucleossomos por ELISA, carregue uma placa de ELISA de 96 poços com uma série descendente de cinco diluições seriadas em duplicata de nucleossomos e tampão de revestimento, começando com 0,1 micrograma por 50 microlitros no poço superior; todas as séries de diluição devem ser carregadas em triplicata.Lembre-se de incluir poços apenas com tampão de revestimento como controles. Incube a placa durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Use uma lavadora de placas para lavar as placas com 200 microlitros por poço de 0,5% entre 20 em PBS à temperatura ambiente, quatro vezes, por um tempo total combinado de 10 minutos.Agora, adicione 100 microlitros por poço da solução bloqueadora e incube por uma hora à temperatura ambiente em um agitador rotativo. Após a incubação, remova o tampão bloqueador agitando vigorosamente a placa invertida sobre uma pia. Em seguida, adicione o anticorpo primário diluído em um volume de 50 microlitros por poço em uma solução de 5% PSA em 0,05% entre 20 em PBS e incube a solução por uma hora em agitador rotativo à temperatura ambiente.Após a incubação com o anticorpo primário, lave as placas como anteriormente utilizando o lavador de placas. Uma vez concluído o procedimento de lavagem, adicione 50 microlitros por poço do anticorpo secundário conjugado à peroxidase de rábano-forrageiro diluído em PBS com 5% de BSA e 0,5% de Tween 20, e incube à temperatura ambiente por uma hora em agitador rotativo após a incubação com o anticorpo secundário. Lave as placas como anteriormente.Utilizando o lavador de placas para desenvolver a placa. Adicione 50 microlitros de substrato TMB Eliza a cada poço e incube por 10 minutos. À temperatura ambiente, os poços da placa ELIZA ficarão azuis e a intensidade é proporcional à quantidade de modificações de nucleossomos presentes em cada um.Bem, então pare a reação. Adicione 50 microlitros por poço de ácido sulfúrico 2 normal. A cor mudará para marrom; centrifugue a placa a 1500 RPM por dois minutos para dissipar quaisquer bolhas de ar.A placa está agora pronta para quantificação em um leitor de placas colorimétrico. Por fim, leia a placa a 450 nanômetros e exporte os resultados para análise. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em dois dias, se for executada corretamente após o seu desenvolvimento.Essa técnica abriu portas para pesquisadores na área de pesquisa com células-tronco explorarem respostas epigenéticas a eventos de diferenciação e reprogramação no nível de todo o epiproteoma.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ubiquitinação é uma modificação fundamental posttranslational realizado por um conjunto de três enzimas. Mutações dos genes envolvidos nesta modificação estão associadas com diferentes tipos de doenças humanas. Aqui, descrevemos os protocolos para detectar ubiquitinação de proteínas em células...

Detecção de Ubiquitinação Protein

Ao combinar nativa e reticulação da cromatina imunoprecipitação com alta resolução de Espectrometria de Massa, ChroP abordagem permite a dissecar a arquitectura proteómica composto de histonas modificações, variantes e proteínas não-histonic sinergia na cromatina domínios funcionalmente distintos.

A Abordagem ChroP Combina chip e Espectrometria de Massa dissecar proteômica Paisagens Locus específicas da cromatina

Aqui descrevemos ensaios bioquímicos que podem ser usados para caracterizar enzimas de remodelação da cromatina dependentes de ATP por suas habilidades de 1) catalisar o deslizamento do nucleossomo dependente de ATP, 2) envolver-se com substratos de nucleossomos e 3) hidrolisar ATP de maneira dependente de nucleossomo ou DNA.

Os ensaios bioquímicos para analisar as actividades de ATP-dependente cromatina remodelação Enzimas

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho totalmente integrado para a caracterização de histonas modificações pós-traducionais, utilizando espectrometria de massa (MS). O fluxo de trabalho inclui a purificação histona de culturas de células ou tecidos, derivação histona e digestão, análise de MS utilizando cromatografia líquida de nano-fluxo e instruções para a análise de dados. O protocolo é projetado para a conclusão dentro de 2 - 3 dias.

Fluxo de trabalho completo para Análise de histona modificações pós-traducionais Usando Bottom-up Espectrometria de Massa: De histona Extração de Análise de Dados

Este protocolo descreve a reconstituição de nucleossomas contendo histonas irmã isotopicamente marcados diferencialmente. Ao mesmo tempo, nucleossomas assimetricamente pós-translacionalmente modificados pode ser gerado após o uso de uma cópia da histona premodified. Estas preparações podem ser prontamente usadas para estudar os mecanismos de modificação de diafonia, simultaneamente em ambas as histonas irmã, utilizando espectroscopia de RMN de alta resolução.

Reconstituição de Nucleosomes com Histones irmã diferencialmente Isotope-rotulados

Apresentamos um método eficaz e reprodutível para isolar e cultura de células progenitoras neurais do tecido do cérebro embrionário e pós-natal por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de histona 3 lisina 79 laboratório (H3K79me2) - uma marca do histone localizada dentro do domínio globular de histona 3.

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

Investigando várias, modificações borne-translational endógenas para uma proteína do alvo podem ser extremamente desafiadoras. Técnicas descritas aqui utilizam um sistema de buffer e filtro de Lise otimizado desenvolvido com PTM-direcionamento específico, matrizes de afinidade para detectar as modificações fosforilação acetilação, ubiquitination, SUMOylation 2/3 e tirosina para um destino proteína, usando um sistema único e simplificado.

Utilizando um sistema de enriquecimento de imunoprecipitação abrangente para identificar um perfil endógena modificação pós-traducional de proteínas alvo

A ubiquitinação é uma modificação pós-translacional que desempenha papéis importantes em processos celulares e é fortemente coordenada pela deubiquitinação. Os defeitos em ambas as reações fundamentam patologias humanas. Nós fornecemos protocolos para a realização de ubiquitinação e reação de deubiquitinação in vitro usando componentes purificados.

Ensaios de Ubiquitinação e Deubiquitinação in vitro de histonas Nucleossomal

O presente protocolo destaca um método modificado para detectar e quantificar ligações cruzadas DNA-proteína (DPCs) e suas modificações pós-traducionais (MPTs), incluindo ubiquitilação, SUMOilação e ADP-ribosilação induzida por inibidores de topoisomerase e por formaldeído, permitindo assim o estudo da formação e reparo de DPCs e suas MPTs.

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

Um fluxo de trabalho analítico baseado em cromatografia líquida, espectrometria de mobilidade iônica aprisionada e espectrometria de massa por tempo de voo (LC-TIMS-ToF MS/MS) para alta confiança e análise "bottom-up" altamente reprodutível de modificações e identificação de histonas com base em parâmetros principais (tempo de retenção [TR], seção transversal de colisão [CCS] e relação massa-carga [m/z] precisa).

Triagem de modificação de histona usando cromatografia líquida, espectrometria de mobilidade iônica aprisionada e espectrometria de massa por tempo de voo

Variantes genéticas no Membro da Família Spindlina 4 (SPIN4) humano foram recentemente identificadas em pacientes com crescimento ósseo, um novo distúrbio do desenvolvimento. Um protocolo e novos resultados descrevendo a identificação bioquímica de histonas modificadas no contexto de nucleossomos como substratos de ligação ao SPIN4 são apresentados.

Identificação de histonas modificadas como substratos de ligação do membro humano da família spindlina 4 (SPIN4) por matrizes peptídicas e pulldown nativo de nucleossomos

Aprenda a detectar modificações pós-translacionais em nucleossomos inteiros usando NU-ELISA. Este método sensível permite analisar estados globais de cromatina em células de mamíferos para pesquisas em epigenética.

Detecção de modificações pós-translacionais sobre Native Nucleossomos Intact por ELISA

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