Detecção de modificações pós-translacionais sobre Native Nucleossomos Intact por ELISA

O objetivo geral deste procedimento é determinar com precisão os níveis relativos de modificações pós-traducionais em preparações de nucleossomos celulares totais obtidos de um milhão de células. Isso é feito preparando primeiro culturas homogêneas de células de mamíferos de alta qualidade. Em seguida, os núcleos são isolados das células por meio de ruptura mecânica com downs, homogeneizador e centrifugação.

O próximo passo é obter nucleossomos intactos digerindo a cromatina presente nos núcleos e realizando uma série de extrações hipotônicas. Por fim, os nucleossomos são interrogados usando um ensaio ELIZA com os controles apropriados para identificar modificações pós-traducionais específicas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram os níveis relativos de modificações específicas presentes nas amostras de nucleossomos.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como western blotting e imunoprecipitação da cromatina, é que uma imagem global de vários estados de modificação de nucleossomos pode ser prontamente determinada. O método é muito mais sensível e preciso do que o western blotting e pode ser realizado na maioria dos laboratórios equipados para experimentação geral de biologia molecular. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das células-tronco e da epigenética, como o que acontece quando ocorrem grandes eventos de diferenciação e reprogramação.

Para iniciar o procedimento, primeiro tripse as células com três mililitros de tripsina por placa de 15 centímetros para células recém-tripsizadas. Adicione 20 mililitros de butirato PBS gelado. Transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros e centrifugue o tubo para coletar as células a 1000 RPM por cinco minutos, aspire o sobrenadante e adicione 10 mililitros de butirato PBS gelado para lavar a centrífuga da suspensão celular novamente a 1000 RPM por cinco minutos.

Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em quatro mililitros de tampão de lise com inibidores de protease, conforme descrito no protocolo escrito. Em seguida, pipete as células para um homogeneizador de pilão tipo B em gelo homogeneizado com 20 golpes. Em seguida, transferir o homogeneizado para um tubo de centrifugação sobre gelo.

Centrifugar a amostra a 2000 g durante 10 minutos. A quatro graus Celsius. Remova o super nomeado, que contém o material citoplasmático e resus.

Suspenda o pellet em dois mililitros de tampão de lavagem a frio C Com inibidores de protease, coloque suavemente o material ressuspenso em uma almofada de cinco mililitros e 30% de sacarose em um tubo de centrífuga fria. Para isolar a centrífuga de núcleos a 2.400 G por cinco minutos em um balde oscilante, os núcleos do rotor migrarão através da almofada e os detritos celulares permanecerão na interface. Após a centrifugação, remova cuidadosamente todo o volume de líquido e ressuspenda os núcleos em 250 microlitros de tampão de lavagem a frio C com inibidores de protease, transfira os núcleos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Para iniciar o isolamento dos nucleossomos, adicione três microlitros de cloreto de cálcio 0,1 molar aos núcleos e coloque em um bloco de calor de 37 graus Celsius até que a temperatura esteja equilibrada. Em seguida, adicione duas unidades de micronuclease cocal em 10 microlitros de micronuclease cocal, tampão e incube por 12 minutos a 37 graus Celsius. Misture frequentemente com uma ponta de pipeta.

Após a incubação, pare a reação com seis microlitros de 0,5 molar de sódio E-D-T-A-P-H oito e coloque no gelo para esfriar. Em seguida, centrifugar a amostra a 2000 G durante quatro minutos após a centrifugação, rejeitar o snat e ressuspender o sedimento. Em 300 microlitros de 0,2 milimol ou EDTA de sódio, incube a amostra no gelo por uma hora com pipetagem suave ocasional para misturar.

Após centrifugação a 3000 g durante quatro minutos. A quatro graus Celsius, colete o sobrenadante, que contém os nucleossomos livres em um novo tubo de Fuge e armazene no gelo nucleossomos adicionais deliberados reus. Suspenda o pellet em 300 microlitros de 0,2 milimol ou EDT de sódio como antes e incube no gelo por uma hora com uma mistura suave ocasional.

Após a incubação, centrifugue a amostra. Novamente, combine o snat resultante com a amostra restante no tubo de micro fuga no gelo. Para iniciar o ensaio de Eliza de nucleossomo, carregue uma placa Eliza de 96 poços com uma série descendente de cinco diluições seriais duplas de nucleossomos e tampão de revestimento, começando com 0,1 microgramas por 50 microlitros no poço superior, todas as séries de diluição devem ser carregadas em triplicata.

Lembre-se de incluir poços com tampão de revestimento apenas como controles. Incube a placa durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Use uma lavadora de placas para lavar as placas com 200 microlitros por poço de 0,5% entre 20 em PBS em temperatura ambiente quatro vezes para um total combinado de 10 minutos.

Agora adicione 100 microlitros por poço de solução de bloqueio e incube por uma hora em temperatura ambiente em um rotador. Após a incubação, remova o tampão de bloqueio sacudindo a placa invertida rapidamente sobre uma pia. Em seguida, adicione o anticorpo primário diluído em um volume de 50 microlitros por poço em uma solução de 5% PSA em 0,05% entre 20 em PBS incube a solução por uma hora em um rotador à temperatura ambiente.

Após a incubação do anticorpo primário, lave as placas como antes usando a lavadora de placas. Uma vez concluído o procedimento de lavagem, adicione 50 microlitros por poço de anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano diluído em PBS com 5% BS, A e 0,5% 20 incubar em temperatura ambiente por uma hora em um rotador após a incubação de anticorpos secundários. Lave os pratos como antes.

Usando a arruela de placa para desenvolver a placa. Adicione 50 microlitros de substrato TMB Eliza a cada poço e incube por 10 minutos. À temperatura ambiente, os poços da placa ELIZA ficarão azuis e a intensidade é proporcional à quantidade de modificações de nucleossomos presentes em cada um.

Bem, então pare a reação. Adicionando 50 microlitros por poço de dois ácidos sulfúricos normais. A cor mudará para marrom, centrifugue a placa a 1500 RPM por dois minutos para dissipar quaisquer bolhas de ar.

A placa agora está pronta para quantificação em um leitor de placa métrica colorida. Por fim, leia a placa a 450 nanômetros e exporte os resultados para análise. Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em dois dias se for executada corretamente Após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu as portas para pesquisadores no campo da pesquisa com células-tronco explorarem respostas epigenéticas a eventos de diferenciação e reprogramação no nível de todo o epiproteoma.