Contando células-tronco neurais

Agora vou mostrar como contar células neuroprecursoras humanas e você contaria suas células quando quisesse colocá-las para imunoquímica ou quando quisesse fazer uma transfecção com máquina de fator nuclear. Eu uso um hemocitômetro de contraste de fase que tem uma grade de borda e também usamos um corante chamado trip e azul. E o corante é útil porque pode diferenciar entre células vivas e mortas.

As células mortas ou moribundas absorvem esse corante e aparecem azuis. Quando você olha para as células no hemo, o citômetro e as células vivas são capazes de excluir esse corante e elas, elas, elas não aparecem azuis. Dessa forma, você pode determinar a viabilidade de suas células para preparar uma solução de viagem e azul e meio.

Vou adicionar 20 microlitros de armadilha e solução azul neste tubo epi de 0,5 mil. E então vou adicionar 25 microlitros de mídia. Dessa forma, agora eu tenho 45 microlitros de uma panela de armadilha azul e solução de mídia para que, quando eu adicionar cinco microlitros de suspensão celular, eu tenha uma diluição de um a 10.

E agora vou adicionar cinco microlitros de suspensão celular. Primeiro, vou me certificar de que as células sejam bem ressuspensas por vórtice de dedos. Então, agora eu quero ter certeza de que essa solução está bem misturada.

Então, vou colocar a cama para cima e para baixo algumas vezes. E, finalmente, vou carregar cerca de 12 microlitros dessa suspensão celular em um hemocitômetro. Tem, tem duas portas e você pode, você pode usar qualquer uma.

Então, tudo o que você precisa fazer é introduzir a solução nesta porta e o líquido será sugado por uma ação capilar. E agora estou pronto para contar. Aqui está uma olhada no hemocitômetro em 10 x e aqui temos um quadrante que contém 16 quadrados.

E como você pode ver, podemos observar aqui células vivas e mortas. Aqui temos células vivas como esta e esta e esta. E também temos algumas células mortas como esta.

Se você notar, a célula morta aparece em azul escuro, enquanto as células vivas têm uma espécie de granizo ao seu redor. Então agora vou contar todas as células vivas. Então, vou da esquerda para a direita e de cima para baixo.

1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. Portanto, temos três seis células no total neste quadrante. Então, quando vejo células que estão na borda do quadrante, como ao longo dessa linha aqui, para ser consistente, conto as células que estão na borda esquerda e na borda superior.

E eu conto consistentemente as células nessas bordas para todos os quadrantes do hemocitômetro. Então, agora vamos calcular quantas células temos por microlitro. E para fazer isso, vou pegar a média das células por quadrante, que é 38, e multiplicar por 10, que é um fator determinado pelas dimensões da câmara.

E também vamos multiplicar por 10, que é nosso fator de diluição neste caso. E no final, vamos obter o número de células por microlitro. Então, neste caso, temos 3.800 células por microlitro.

E como suspendemos novamente nosso palete de células em 500 microlitros de solução, você pode calcular quantas células no total você tem. E estamos prontos.