Contando células-tronco neurais
22 de agosto de 2007
Conhecimento do número exato de células viáveis é necessário para muitos manipulações cultura de tecidos. Este protocolo descreve como diferenciar entre células vivas e mortas e quantificar as células usando um hemocitômetro. Embora contando descreve-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), ele pode ser usado para outros tipos celulares.
Agora vou mostrar como contar células neuroprecursoras humanas e você contaria suas células quando quisesse colocá-las para imunoquímica ou quando quisesse fazer uma transfecção com máquina de fator nuclear. Eu uso um hemocitômetro de contraste de fase que tem uma grade de borda e também usamos um corante chamado trip e azul. E o corante é útil porque pode diferenciar entre células vivas e mortas.
As células mortas ou moribundas absorvem esse corante e aparecem azuis. Quando você olha para as células no hemo, o citômetro e as células vivas são capazes de excluir esse corante e elas, elas, elas não aparecem azuis. Dessa forma, você pode determinar a viabilidade de suas células para preparar uma solução de viagem e azul e meio.
Vou adicionar 20 microlitros de armadilha e solução azul neste tubo epi de 0,5 mil. E então vou adicionar 25 microlitros de mídia. Dessa forma, agora eu tenho 45 microlitros de uma panela de armadilha azul e solução de mídia para que, quando eu adicionar cinco microlitros de suspensão celular, eu tenha uma diluição de um a 10.
E agora vou adicionar cinco microlitros de suspensão celular. Primeiro, vou me certificar de que as células sejam bem ressuspensas por vórtice de dedos. Então, agora eu quero ter certeza de que essa solução está bem misturada.
Então, vou colocar a cama para cima e para baixo algumas vezes. E, finalmente, vou carregar cerca de 12 microlitros dessa suspensão celular em um hemocitômetro. Tem, tem duas portas e você pode, você pode usar qualquer uma.
Então, tudo o que você precisa fazer é introduzir a solução nesta porta e o líquido será sugado por uma ação capilar. E agora estou pronto para contar. Aqui está uma olhada no hemocitômetro em 10 x e aqui temos um quadrante que contém 16 quadrados.
E como você pode ver, podemos observar aqui células vivas e mortas. Aqui temos células vivas como esta e esta e esta. E também temos algumas células mortas como esta.
Se você notar, a célula morta aparece em azul escuro, enquanto as células vivas têm uma espécie de granizo ao seu redor. Então agora vou contar todas as células vivas. Então, vou da esquerda para a direita e de cima para baixo.
1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. Portanto, temos três seis células no total neste quadrante. Então, quando vejo células que estão na borda do quadrante, como ao longo dessa linha aqui, para ser consistente, conto as células que estão na borda esquerda e na borda superior.
E eu conto consistentemente as células nessas bordas para todos os quadrantes do hemocitômetro. Então, agora vamos calcular quantas células temos por microlitro. E para fazer isso, vou pegar a média das células por quadrante, que é 38, e multiplicar por 10, que é um fator determinado pelas dimensões da câmara.
E também vamos multiplicar por 10, que é nosso fator de diluição neste caso. E no final, vamos obter o número de células por microlitro. Então, neste caso, temos 3.800 células por microlitro.
E como suspendemos novamente nosso palete de células em 500 microlitros de solução, você pode calcular quantas células no total você tem. E estamos prontos.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para contagem de células-tronco/precursoras neurais humanas (hNSPCs) usando um hemacitômetro. Ele enfatiza a importância de diferenciar entre células vivas e mortas para várias aplicações de cultura de tecidos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Cultura de Tecidos
Fundamentos
- A contagem de células viáveis é crucial para manipulações de cultura de tecidos.
- Células vivas podem excluir certos corantes, enquanto células mortas não podem.
- O hemacitômetro é uma ferramenta padrão para contagem de células.
- O corante azul de Trypan é comumente usado para avaliar a viabilidade celular.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para contagem de hNSPCs.
- Diferenciar efetivamente células vivas e mortas.
- Auxiliar pesquisadores na preparação de experimentos adicionais, como imunoquímica ou transfecção.
Métodos Utilizados
- Uso de um hemacitômetro de contraste de fase.
- Aplicação do corante azul de Trypan para distinguir a viabilidade celular.
- Contagem de células sob um microscópio.
- Preparação de uma solução de azul de Trypan e meio de cultura.
Principais Resultados
- Diferenciação bem-sucedida entre células vivas e mortas.
- Quantificação precisa de hNSPCs.
- Demonstração da eficácia do corante azul de Trypan.
- Validação do hemacitômetro como um método de contagem confiável.
Conclusões
- O protocolo fornece uma abordagem direta para a contagem de células.
- É aplicável a vários tipos de células além das hNSPCs.
- Entender a viabilidade celular é essencial para experimentos bem-sucedidos de cultura de tecidos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of viable human neural stem/precursor cells (hNSPCs) is essential for reproducible tissue culture workflows in neuroscience drug discovery. This protocol enables reliable cell viability assessment and concentration measurement, supporting consistent experimental seeding for downstream applications such as immunocytochemistry and transfection. By standardizing live/dead discrimination using Trypan blue and hemacytometer-based counting, the method enhances predictive confidence in early-stage target validation and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise seeding of hNSPCs for target engagement and pathway modulation studies.
- Operational Value: Reduces variability in cell-based assays by ensuring consistent input of viable cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, reproducible cell concentration data critical for assay standardization.
- Operational Value: Supports scalable preparation of cell suspensions for high-content screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains cellular input consistency across discovery-to-preclinical transition stages.
- Operational Value: Facilitates cross-functional collaboration through standardized cell counting practices.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, supporting reliable cell preparation from target validation through assay optimization and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Ensures accurate cell dosing for target validation experiments involving hNSPCs.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable cell inputs necessary for reproducible assay performance.
- Analytics: Generates viable cell concentration and total count outputs used to normalize experimental conditions.
- Translational Research: Supports continuity in cell handling between in vitro discovery and preclinical models.
- Enterprise Reuse: Represents a transferable, low-complexity capability applicable across multiple cell types and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence by minimizing variability in cell-based experimental inputs.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories and teams.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions through reliable assay foundations.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by ensuring data quality in early efficacy screening.
Implementation Considerations
- Requires basic tissue culture technique and microscopy proficiency.
- Dependent on hemacytometer availability and proper cleaning to avoid contamination.
- Necessitates consistent operator training for unbiased quadrant selection and border-counting rules.
- Limited by manual counting throughput; not suited for high-throughput automation without adaptation.
- Relies on correct dilution and mixing to ensure representative sampling of cell suspension.
