Name: Contando células-tronco neurais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Aprenda a contar células-tronco neurais humanas usando hemocitômetro e corante azul de tripano para diferenciar células vivas e mortas. Este método é essencial para experimentos de cultura de tecidos.

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Os autores gostariam de agradecer o Dr. Philip H. Schwartz da Célula de Recursos Humanos Neural Stem Nacional do Hospital Infantil s, Orange County Instituto de Pesquisa para a prestação de culturas hNSPC.

Passaging células-tronco neurais Nota: Consulte o <a href="/index/details.stp?ID=263">Neural Stem Passaging células</a> artigo sobre como separar e ressuspender as células. https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 Preparar a suspensão de células de Contagem <ol><li> ML 25 lugar de 0,4% solução azul Trypan e 20 l de mídia celular em um tubo eppendorf. </li><li> Ressuspender as células a serem contadas batendo o tubo que contém as células em um volume conhecido de mídia para criar uma suspensão homogênea. Colocar 5 mL de células dentro do tubo eppendorf da etapa anterior. Esta etapa dilui a concentração de células por um fator de 10. </li><li> Coloque a tampa de vidro sobre o hemocitômetro e carregar sobre 11-12 mL da suspensão de células. <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_4/262_Figure-01.png" alt="01-262_Figure" width="511" height="139"> </li></ol> Contagem de células no hemocitômetro <ol><li> Observar toda a grade do hemocitômetro em um microscópio de contraste de fase. Concentre-se em um quadrante da grade (como a de vermelho). <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_5/262_Figure-02.png" alt="262_Figure-02" width="492" height="278"> </li><li> Células mortas ou morrendo aparecerá azul por causa de sua membrana foi danificado e não são capazes de excluir o corante azul Trypan. Células viáveis ​​não aparecerá azul e será rodeado por um "halo" de luz em contraste de fase (será "fase brilhante"). </li><li> Contar o número de células viáveis ​​em um quadrante (área 1 mm 2). Você também pode determinar a viabilidade celular pela divisão do número de células viáveis ​​pelo número total de células. Contagem de células em 04/03 quadrantes aleatórios e determinar o número médio de células por quadrante. Como o volume de um quadrante é conhecido por ser 10 ml ou 0,1 mL -4, a concentração de células pode ser determinada <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_6/262_Figure-03.png" alt="262_Figure-03" width="741" height="165"> </li><li> Você pode usar o atalho a seguir para determinar as células # / mL: <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_7/262_Figure-04.png" alt="262_Figure-04" width="368" height="69"> Número total de células em tubos = # células / mL X mL em tubo </li></ol>

<ol><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 
 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> (2007).</li>
<li>Caprette, D. avidR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+Hemacytometer%5BTitle%5D)+AND+%22BioEd+Online%22%5BJournal%5D)">Using a Hemacytometer.</a> BioEd Online. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3">http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3</a> (2008).</li>
<li>Caprette, D. avidR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Chamber+%28Hemacytometer%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioEd+Online%22%5BJournal%5D)">Counting Chamber (Hemacytometer).</a> BioEd Online. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2
">http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2
</a> (2008).</li>
</ol>

Este protocolo descreve uma maneira simples e rápida para determinar a concentração de células para uma variedade de experiências envolvendo células. Usando o atalho descritas em 3d, pode-se rapidamente e determinar com precisão a concentração de células eo número total de células em um determinado volume.

<table><tbody><tr><td>Hemocitômetro de contraste de fase</td><td>Ferramenta</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td>Distribuído pela Fisher sob o número de catálogo indicado</td></tr><tr><td>Corante Azul de Tripano 0,4%</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Distribuído pela Invitrogen sob o número de catálogo indicado</td></tr></tbody></table>

contando células-tronco neurais

Counting Human Neural Stem Cells

Conhecimento do número exato de células viáveis ​​em um determinado volume de uma suspensão de células é necessária para muitas manipulações de rotina de cultura de tecidos, como células de revestimento para imunocitoquímica ou para transfections celular. Este protocolo descreve um método simples e rápido para a diferenciação entre as células vivas e mortas e quantificar a concentração de células eo número total de células usando um hemocitômetro. Este primeiro procedimento requer destacando as células de uma superfície de crescimento e ressuspensão na mídia. Em seguida, as células são diluídas em uma solução de Trypan azul (de preferência a uma concentração que vai dar 20-50 células por quadrante) e colocado no hemocitômetro. Finalmente, a média das contagens de células viáveis ​​em vários quadrantes selecionados aleatoriamente, dividindo a média do volume de um quadrante 1 mm 2 (0,1 mL) e multiplicando pelo fator de diluição dá o número de células por l. Multiplicando este concentração celular pelo volume total em mL dá o número total de células. Este protocolo descreve contando-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), mas também pode ser usado para muitos outros tipos celulares.

Conhecimento do número exato de células viáveis ​​é necessário para muitos manipulações cultura de tecidos. Este protocolo descreve como diferenciar entre células vivas e mortas e quantificar as células usando um hemocitômetro. Embora contando descreve-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), ele pode ser usado para outros tipos celulares.

Contando células-tronco neurais

O conhecimento do número exato de células viáveis em um determinado volume de uma suspensão celular é necessário para muitas manipulações rotineiras de cultura de tecidos, tais como...

Agora vou mostrar como contar células precursoras neurais humanas. Você contaria suas células quando quisesse utilizá-las para imunoquímica ou quando quisesse realizar uma transfeção com fator nuclear máquina. Utilizo um hemocitômetro de contraste de fase que possui uma grade de borda e também usamos um corante chamado azul de trip. O corante é útil porque pode diferenciar entre células vivas e mortas.Células mortas ou morrendo absorvem este corante e aparecem azuis. Quando você observa as células no hemocitômetro, as células vivas são capazes de excluir este corante e, portanto, não aparecem azuis. Dessa forma, é possível determinar a viabilidade das suas células para preparar uma solução de trip e azul em meio.Vou adicionar 20 microlitros da solução de azul de pantrapa a este tubo eppendorf de 0,5 ml. Em seguida, vou adicionar 25 microlitros de meio. Dessa forma, agora tenho 45 microlitros de uma solução de azul de pantrapa e meio, de modo que, ao adicionar cinco microlitros de suspensão celular, obterei uma diluição de um para 10.E agora vou adicionar cinco microlitros de suspensão celular. Primeiro, vou garantir que as células estejam bem ressuspendidas por meio de vortexagem c

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Introdução de um gene de interesse em uma célula é um método poderoso para elucidar a sua função in vivo. Este protocolo descreve um método eficiente de uma cultura de transfecting-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), utilizando o aparelho de eletroporação Nucleofector feita por Amaxa.

Transfecting células-tronco neurais com o Nucleofector Amaxa

A capacidade de manipular-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs) in vitro permite investigar a sua utilidade como transplantes de células para fins terapêuticos e para explorar o desenvolvimento neural humano. Este protocolo apresenta um método de cultivo e hNSPCs passaging na esperança de reprodutibilidade crescente de pesquisas sobre células estaminais humanas.

Passaging células-tronco neurais

Imunocitoquímica é um poderoso método para determinar a presença, localização subcelular e abundância relativa de um antígeno de interesse em células em cultura. Este protocolo apresenta um fácil de seguir série de medidas que permitirão uma anticorpos para conservar e tirar o máximo proveito da própria coloração.

Imunocitoquímica: células-tronco neurais

Este protocolo vídeo demonstra como discriminar e enumerar bona fide células-tronco neurais em uma população mista de células precursoras neurais utilizando o ensaio de célula neural formadoras de colônias.

Neurais Colony-Forming Assay Cell: um ensaio para Discriminar Bona Fide células-tronco neurais de células progenitoras neurais

Um método simples e confiável sobre o isolamento e cultura de células-tronco neurais de tecido fetal humano descartado cortical é descrito. Derivados de culturas humanas conhecidas doenças neurológicas podem ser usados ​​para a caracterização de processos patológicos celular e molecular, bem como fornecer uma plataforma para avaliar a eficácia farmacológica.

Geração de células-tronco neurais de Discarded tecido fetal humano Cortical

Células-tronco neurais colhidas a partir do cérebro de adultos estão aumentando utilizado em aplicações que vão desde a pesquisa básica do desenvolvimento do sistema nervoso para explorar potenciais aplicações clínicas em medicina regenerativa. Isso faz com que o controle rigoroso das condições de isolamento e cultivo utilizados para cultivar essas células críticas a soar os resultados experimentais.

Crescer a partir de células-tronco neurais convencionais e não convencionais Regiões do cérebro adulto de roedores

Este protocolo descreve um método de desbastamento mecânico novela que permite a expansão de células progenitoras e estaminais neurais agregados esféricos sem dissociação de uma única suspensão de células. Manter contato célula / célula permite um crescimento rápido e estável por mais de 40 passagens.

Um Método de Expansão cGMP-aplicável para Agregados de Neural Humano-tronco e células progenitoras derivadas de células-tronco pluripotentes ou tecido cerebral do feto

Foi desenvolvido um método para derivar directamente células estaminais neurais humanos a partir de células progenitoras hematopoiéticas enriquecidas de células do sangue periférico.

Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

Com a intenção de caracterizar mudanças em miRNAs em células-tronco neurais humanas diferenciadas (hNSCs), descrevemos a diferenciação de hNSC em um sistema tridimensional, a avaliação de mudanças na expressão de microRNAs por matriz de PCR de miRNA e análise computacional para predição de alvos de miRNAs e sua validação por ensaio de luciferase dupla.

Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo

A medula espinhal de mamíferos adultos contém células-tronco neurais/progenitoras (NSPCs) que podem ser isoladas e expandidas em cultura. Este protocolo descreve a coleta, isolamento, cultura e passagem de NSPCs geradas a partir da região periventricular da medula espinhal adulta do rato e de doadores de transplante de órgãos humanos.

Isolamento de Neural Stem / células progenitoras da Região Periventricular do rato adulto e Medula Espinhal Humano

células-tronco neurais (NCCC) referem-se a células que podem auto-renovar e diferenciar em três linhagens neurais. Aqui, descrevemos um protocolo para determinar a freqüência NSC em uma população de células determinado usando neurosphere formação e diferenciação em condições clonais.

Enumeração de células-tronco neurais Usando clonais Ensaios

Aprenda a contar células-tronco neurais humanas usando hemocitômetro e corante azul de tripano para diferenciar células vivas e mortas. Este método é essencial para experimentos de cultura de tecidos.

Contando células-tronco neurais

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